Methodenartikel

Mit der Tröpfchentransfer-Methode lassen sich riesige unilamellare Vesikel zuverlässig präparieren

DOI:

10.3791/68340

⸱

19. September 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Leitfaden für Einsteiger stellt ein allgemeines Protokoll für die Herstellung von Riesen-Unilamellären Vesikeln (GUVs) mit der Tröpfchentransfermethode vor, diskutiert die kritischen Schritte und gibt Einblicke, um mögliche Anpassungen zu unterstützen, die für verschiedene Anwendungen, einschließlich synthetischer Biologie und Mikrorobotik, erforderlich sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Tröpfchentransfermethode, die auch als invertierte Emulsion, Doppelemulsion, Phasentransfer oder Emulsionstransfer bezeichnet wird, hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als vorteilhaft für die Herstellung von Riesen-Unilamellen-Vesikeln (GUVs) und insbesondere für deren Beladung mit unterschiedlichen Ladungen erwiesen und spielt damit eine entscheidende Rolle in der synthetischen Biologie. Aufgrund der Effizienz der Verkapselung und der einfachen Ausführung wurde es in großem Umfang für die Entwicklung künstlicher Zellen eingesetzt. In der Literatur ist eine große Variabilität bei mehreren Parametern zu beobachten, die zu extrem unterschiedlichen Ergebnissen führt. Dies ist zum Teil auf die Anpassungen zurückzuführen, die für die unterschiedlichen Bedürfnisse und Anwendungen dieser vielseitigen Methode erforderlich sind, kann sich jedoch für Forscher, die sich dieser Technik zum ersten Mal nähern, als verwirrend erweisen.

Um Anfängern ein grundlegendes Verständnis der Methode und der Rolle kritischer Parameter zu vermitteln, wird ein Protokoll vorgestellt und es werden Hinweise auf die grundlegenden physikalisch-chemischen Prinzipien gegeben, die der GUV-Bildung durch Tröpfchentransfer zugrunde liegen. Diese Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erstellung von GUVs enthält daher Überlegungen und praktische Anregungen, die auf Literatur und direkten Erfahrungen basieren.

Unter Berücksichtigung möglicher Variabilitätsquellen werden einige Aspekte als kritisch identifiziert: die Empfindlichkeit von Phospholipiden gegenüber Licht, Oxidation und Hydrolyse; die Wahl des Öls zum Auflösen von Phospholipiden (die Lipidlösung oder LS); und die Rückgewinnung von GUVs nach der Zentrifugation. Es werden kostengünstige Maßnahmen vorgeschlagen, um die Interferenz von Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu minimieren. Um geeignete Kombinationen von Öl und Phospholipiden zu identifizieren, wird das allgemeine Protokoll durch eine Diskussion über die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften des LS ergänzt. Um unpraktische Verfahren zu vermeiden, wird schließlich eine einfache und sichere Methode vorgeschlagen, um die Ölphase sofort vollständig zu entfernen und eine saubere GUV-Dispersion wiederherzustellen. Diese Maßnahmen beschleunigen die Umsetzung von Anpassungen an neue GUV-Zusammensetzungen und könnten deren Einführung in der synthetischen Biologie und angrenzenden Bereichen, einschließlich der Mikrorobotik, ausweiten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Implementierung einer zuvor beschriebenen Technik zur Herstellung von Liposomen1 etablierten Pautot et al. ein Protokoll zur Herstellung von Lipidvesikeln mit Durchmessern von 0,1 bis 1 μm Durchmesser2. Die Tröpfchentransfermethode hat sich schnell als effektiv bei der Herstellung noch größerer Vesikel (Durchmesser über 1 μm)3 erwiesen und gewinnt aufgrund der einfachen Ausführung und der hohen Verkapselungseffizienz zunehmend an Popularität. Tatsächlich reduziert dieses Protokoll im Vergleich zu Quellmethoden (wie Gelquellung oder Elektroformation) das Volumen der Frachtlösung, die zur Bildung einer vergleichbaren Anzahl von Vesikeln erforderlich ist, und den damit verbundenen Abfall4. GUVs können durch alternative Methoden mit vergleichbarer Verkapselungseffizienz aus fluiden Grenzflächen zusammengesetzt werden. Im Vergleich zu denen, die auf mikrofluidischen Chips 5,6 oder kontinuierlicher Droplet-Interface-Crossing-Verkapselung (cDICE)7 basieren, bietet der Tröpfchentransfer jedoch den einfachsten Aufbau, der in jedem Labor mit Grundausstattung erschwinglich ist. Darüber hinaus können mikrofluidische Verfahren zu GUVs mit unerwünschten Öleinschlüssen in der Membran führen. Aus diesen Gründen ist der Tröpfchentransfer die Methode der Wahl für die Beladung von GUVs mit wertvollen Ladungen in den Bereichen künstliche Zellen 3,8,9,10 und seit kurzem auch in der Mikrorobotik 11,12.

Die Methode basiert auf der Bildung von Membranblättchen durch die Stabilisierung von Wasser/Öl-Grenzflächen, die durch Phospholipide vermittelt wird. Zuerst werden Phospholipide in einem Öl (Lipidlösung, LS) gelöst, dann wird mit der wässrigen Lösung, die die gewünschte GUV-Fracht (innere Lösung, IS) enthält, im öligen LS eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt. Die Emulsion wird dann in ein Röhrchen überführt, in dem zuvor eine andere wässrige Lösung (äußere Lösung, OS) mit LS äquilibriert wurde, um eine Wasser-Öl-Grenzfläche zu bilden. GUVs entstehen, wenn Wassertröpfchen durch Zentrifugation gezwungen werden, diese OS/LS-Grenzfläche zu passieren: Das innere Segel von GUVs bildet sich auf der Oberfläche von IS-Tröpfchen, während das äußere Segel zwischen OS und LS gebildet wird (Abbildung 1).

Es wurden viele Protokollvarianten beschrieben, deren Parameter entsprechend dem jeweiligen experimentellen Bedarf angepasst wurden. Einen ersten umfangreichen Versuch zur Optimierung des Prozesses haben Moga et al.13 beschrieben, während Zhang et al. die meisten relevanten Beispiele in einer aktuellen Übersichtsarbeit zusammengetragenhaben 14. Trotz der vielen beschriebenen Parameter, die das Protokoll beeinflussen, gibt es weder Hinweise darauf, wie ein Optimierungsprozess für eine neue GUV-Formulierung durchgeführt werden könnte, noch auf die Best Practices für die Rückgewinnung und Manipulation von GUV nach der Produktion. Basierend auf der verfügbaren wissenschaftlichen Literatur und unserer direkten Erfahrung stellen wir hier ein allgemeines Protokoll zur Herstellung von GUVs zur Verfügung und diskutieren die Grundprinzipien. Auf diese Weise liefern wir nützliche Hinweise für die Optimierung neuartiger GUV-Formulierungen und zwei Vorsichtsmaßnahmen, die immer auf das Protokoll anwendbar sind: die Herstellung von LS in einer kontrollierten Umgebung und eine Methode zur einfachen Entfernung der oberen Ölphase für die Rückgewinnung einer sauberen GUV-Probe. Wir haben zwei Beispiele ausgewählt: eines mit 240 mM Saccharose als IS und 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 als LS (Zustand E [leer], siehe Tabelle 1) und das andere bestehend aus 0,2% 1,1 μm Polystyrol-Mikropartikeln in 240 mM Saccharose als IS und 3,18 mM DOPC in Mineralöl als LS (Zustand P [mit Partikeln], siehe Tabelle 1). Beide Proben wurden mit 240 mM Glukose als OS hergestellt. Wir wählten diese Osmolarität, um GUVs zu erhalten, die unter physiologischen Bedingungen eine entspannte Lipidmembran (niedrige Membranspannung) aufweisen.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Tröpfchentransferverfahrens. (A) Drei Lösungen werden in getrennten Durchstechflaschen hergestellt: Phospholipide in Öl (gelbe Phase) zu einer Lipidlösung, eine Saccharose-haltige Lösung (in Cyan) als innere Lösung und eine äquiosmolare Glukoselösung (weiß) als äußere Lösung. (B) LS wird dann mit dem IS gemischt, um eine stabile Emulsion zu bilden, dann (C) wird eine Grenzfläche zwischen OS und LS ausgleichen lassen, bevor (D) die Emulsion darüber gegossen wird. (E) Wassertröpfchen werden durch Zentrifugalkraft gezwungen, die LS/OS-Grenzfläche zu passieren, um (F) die Bildung von GUVs zu ermöglichen. Die Abbildung ist nicht maßstabsgetreu und soll nur ein Schema der Methode darstellen. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, werden die Prozesse bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

  1. Herstellung von wässrigen Lösungen (IS und OS)
    1. In zwei verschiedenen Wägeschiffchen werden 2,16 g Glukose und die in Tabelle 1 angegebene Menge Saccharose gewogen. Die Pulver in zwei 150-ml-Becher geben, 40 ml Reinstwasser hinzufügen und unter Rühren mischen.
    2. Die Lösungen werden in zwei 50-ml-Zylinder überführt und mit Reinstwasser bis zu 50 ml angereichert, um 240 mM Glukoselösungen und Saccharoselösungen mit den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen zu erhalten. Decken Sie die Zylinder mit einem Stück Parafilm ab und mischen Sie die Lösungen, indem Sie die Zylinder einige Male umdrehen.
    3. Filtrieren Sie die Lösungen mit 50-ml-Spritzen und 0,22-μm-Filtern, um eine Kontamination durch Mikroorganismen zu verhindern.
    4. Für Bedingung P ist folgende Mischung herzustellen: 2 μl 100 mg/ml, 1,1 μm Polystyrolpartikel-Dispersion, 24 μl Saccharoselösung, die in Schritt 1.1.1 hergestellt wurde, und Reinstwasser bis zu 100 μl (endgültige Suspension: 0,2 %ige Mikropartikel in 240 mM Saccharoselösung). Lagern Sie die Lösungen bis zu 1 Woche bei +4 °C oder bereiten Sie 1 mL Aliquote in 1,5 mL Röhrchen vor und lagern Sie sie bei -20 °C für die Langzeitlagerung.
  2. Einrichten einer Handschuhkammer zur Zubereitung von LS in einer kontrollierten Umgebung
    1. Schneiden Sie fünf Stücke Silikonrohr mit einem Innendurchmesser von 7 mm, einem Außendurchmesser von 13 mm und den in Tabelle 2 (Rohre 1 bis 5) angegebenen Längen ab.
    2. Schneiden Sie vier Stücke Silikonrohr mit einem Innendurchmesser von 3 mm, einem Außendurchmesser von 7 mm und den in Tabelle 2 angegebenen Längen (Rohre 6 bis 9).
    3. Verbinden Sie ein Ende von Rohr 1 mit einem Zweiwegeventil und das andere Ende mit einer Dreiwegeverbindung (Abbildung 2A).
    4. Verbinden Sie Rohr 2 mit den anderen Enden des Zweiwegeventils, verbinden Sie dann Rohr 3 und Rohr 4 mit der Dreiwegeverbindung, wobei Rohr 3 mit dem Ende gegenüber von Rohr 1 verbunden ist (Abbildung 2A).
    5. Verbinden Sie das freie Ende von Rohr 4 mit dem Einlass der Handschuhkammer (Einlaufrohr, Abbildung 2B).
    6. Schließen Sie das mit der Handschuhkammer gelieferte Dreiwegeventil an den Auslass an und verbinden Sie das Ventil dann mit Rohr 5 (Auslassrohr, Abbildung 2C).
    7. Verbinden Sie ein Ende von Rohr 6 mit einer 18-G-Nadel und das andere Ende mit einer Zwei-Wege-Verbindung. Wiederholen Sie dies mit Rohr 7 und der 21 G Nadel (Abbildung 2D).
    8. Führen Sie die beiden Nadeln in eine Fläschchenkappe mit Septum ein: Diese nadelgelagerte Kappe ermöglicht den kontrollierten Zufluss von Stickstoff und den Abfluss von Stickstoff und Chloroform. Bewahren Sie die Kappe in einem leeren 50-ml-Röhrchen ohne Kappe auf, um einen Kontakt mit den Nadeln zu vermeiden (Abbildung 2D).
    9. Drücken Sie die Rohre 8 bzw. 9 von der Innenseite des Handschuhfachs in die Einlass- und Auslassöffnungen und führen Sie sie ein (Abbildung 2E).
  3. Zubereitung von LS
    1. Bewegen Sie die Handschuhkammer in oder neben eine chemische Haube. Öffnen Sie die Handschuhkammer und setzen Sie einen mit Siliziumdioxidpartikeln gefüllten Kristallisator am Boden der Kammer ein (Abbildung 2F). Decken Sie den Kristallisator mit der weißen Auflagefläche ab und decken Sie ihn mit Küchenpapier ab.
    2. Legen Sie alle erforderlichen Materialien in die Handschuhkammer (Abbildung 2G): ein Hygrometer, das 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) in Chloroformlösung, das/die Öl(e) (Tabelle 1), saubere 20-ml-Durchstechflaschen aus dunklem Glas (geöffnet und mit den entsprechenden Kappen), eine Hamilton-Spritze (Tabelle 1), eine P10000-Mikropipette und Spitzen. Stellen Sie das Glasfläschchen mit der Chloroformlösung so nah wie möglich an der Bedienerseite auf einen Korkringhalter, ein 150-ml-Becherglas oder einen anderen geeigneten Halter.
      HINWEIS: Diese Vorsichtsmaßnahme verhindert das Kippen der Flaschen, das durch das Aufblasen und Entleeren der Handschuhe bei Vakuum- und Stickstoffströmen verursacht wird.
    3. Schließen Sie die Handschuhkammer, achten Sie darauf, dass die beiden Hälften nicht verrutschen können, und verschließen Sie sie mit den Kunststoffschrauben, die mit der Handschuhkammer geliefert werden.
    4. Schließen Sie das Auslassventil und tauchen Sie das Rohr 5 in ein 500-ml-Becherglas, das zur Hälfte mit Wasser gefüllt ist (Abbildung 2H).
    5. Verbinden Sie das ventilgeregelte Ende des Einlassrohrs (Rohr 2) mit der Unterdruckleitung und das andere Ende mit Stickstoff (Rohr 3, Abbildung 2A). Das Handschuhfach ist nun vollständig eingestellt, wie in Abbildung 2J gezeigt.
    6. Öffnen Sie das Ventil und die Vakuumleitung, bis die Handschuhe durch die Druckentlastung so weit aufgeblasen werden, dass sie zu starr sind, um sich zu biegen. Schließen Sie die Unterdruckleitung und das Ventil.
    7. Öffnen Sie den Stickstoff, bis der Druck die Luft aus den Handschuhen so weit ablässt, dass sie aus der Handschuhkammer austreten. Schließen Sie die Stickstoffleitung.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6 bis 1.3.7 mindestens 10x und achten Sie darauf, dass die innere Luftfeuchtigkeit unter 40 % fällt.
    9. Steuern Sie den Innendruck mit Vakuum und Stickstoff, um dem Bediener das Tragen von Handschuhen zu erleichtern.
    10. Übertragen Sie mit der Hamilton-Spritze das in Tabelle 1 angegebene Volumen von DOPC in Chloroformlösung in eine Durchstechflasche aus dunklem Glas. Die Durchstechflasche mit der in Schritt 1.2.9 vorbereiteten nadelgelagerten Kappe verschließen.
    11. Verbinden Sie Rohr 6 mit Rohr 8 und Rohr 7 über die bidirektionalen Verbindungen mit Rohr 9 (Abbildung 2I).
    12. Ziehen Sie die Handschuhe aus und öffnen Sie das Auslassventil.
      HINWEIS: Ein zweiter Bediener kann bei den Schritten 1.3.13 bis 1.3.15 helfen, um den Prozess zu beschleunigen.
    13. Öffnen Sie den Stickstoffstrom sehr langsam und kontrollieren Sie den Gasfluss, indem Sie Blasen im Becherglas beobachten, in dem sich zuvor Rohr 5 befand (Schritt 1.3.4). Passen Sie den Stickstofffluss schrittweise an, bis er eine relativ hohe Rate erreicht, bei der einzelne Blasen beobachtbar bleiben. Lassen Sie den Stickstoff 3 min fließen und schließen Sie dann die Stickstoffleitung.
      HINWEIS: Ein übermäßiger Stickstoffdruck kann dazu führen, dass sich die DOPC-Lösung in Chloroform im gesamten Fläschchen verteilt, wodurch die Menge an Phospholipid, die für die nachfolgende Lipidlösung (LS) zur Verfügung steht, verringert wird. Zusätzlich erhöht hoher Druck das Risiko, dass die Nadeln aus dem Fläschchen ausgestoßen werden. Daher ist es wichtig, den Stickstofffluss sorgfältig auf ein optimales Niveau einzustellen, das das Chloroform sanft rührt, ohne unkontrolliertes Spritzen zu verursachen.
    14. In der Zwischenzeit ein Wasserbad in einem Kristallisator zubereiten und auf einer heißen Platte auf 80 °C erhitzen.
    15. Warten Sie, bis die letzte Blase aus dem Becherglas ist, und schließen Sie dann das Auslassventil. Ziehen Sie die Handschuhe wieder an und trennen Sie die Rohre 8 und 9 von den Zweiwegeverbindungen.
    16. Vergewissern Sie sich, dass das gesamte Chloroform aus der dunklen Durchstechflasche verdampft ist, öffnen Sie sie und setzen Sie die Kappe wieder in das 50-ml-Röhrchen ein. Öffnen Sie die Ölflasche, füllen Sie die erforderliche Ölmenge (Tabelle 1) in das dunkle Fläschchen und verschließen Sie es mit dem Deckel. Ziehen Sie die Handschuhe aus und öffnen Sie das Handschuhfach.
    17. Versiegeln Sie den LS mit Parafilm. Wirbeln Sie das Fläschchen mindestens 30 s lang kräftig ein. Bei 80 °C für 30 min in dem in Schritt 1.3.14 vorbereiteten Wasserbad inkubieren. Wirbeln Sie das Fläschchen mindestens 30 s lang kräftig ein. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
    18. Fahren Sie mit der Zubereitung der GUVs fort oder lagern Sie sie bis zu 1 Woche bei +4 °C.
      ANMERKUNG: Bei asymmetrischen GUV-Präparationen können zwei verschiedene LS für die Grenzfläche und die Emulsion verwendet werden, um zwei verschiedene Membransegel15 zu erhalten.

2. GUV-Produktion

  1. Einrichten eines Behälters zur einfachen Entnahme von Öl
    1. Schneiden Sie mit einer Schere die Kappe von einem 5-ml-Röhrchen ab. Bohren Sie ein ~8 mm Loch in die Mitte der Kappe und prüfen Sie, ob das Loch breit genug ist, damit eine P1000-Spitze passen und verriegeln kann (Abbildung 3A). Wenn das Loch zu schmal ist, wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte. Wenn sie zu breit ist, verwerfen Sie die Kappe und starten Sie sie mit einer neuen Kappe aus Schritt 2.1.1 neu.
    2. Schneiden Sie ein 2 x 5 cm großes Stück Schleifpapier aus und schleifen Sie das Loch ab. Setzen Sie die gelochte Kappe wieder auf das 5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 3.000 × g , um alle Kunststoffreste aus dem Loch zu entfernen. Entfernen Sie die Kappe und entsorgen Sie die Tube.
    3. Schneiden Sie die Kappe von einem neuen 5-ml-Röhrchen ab und ersetzen Sie sie durch die gelochte Kappe. Setzen Sie einen O-Ring auf die Kappe und führen Sie eine P1000-Spitze durch das Loch. Verriegeln Sie den O-Ring zwischen der Spitze und der Kappe, und stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht weiter nach unten gedrückt werden kann (Abbildung 3B). Füllen Sie das 5-ml-Röhrchen mit 5,5 mL OS durch die Spitze.
  2. OS/LS-Schnittstellenbildung
    1. Bereiten Sie ein Wasserbad in einem Kristallisator vor und erhitzen Sie es auf einer heißen Platte auf 50 °C.
    2. Die in Abschnitt 1.3 hergestellte Durchstechflasche LS mindestens 30 s lang kräftig einreiben. Den LS bei 50 °C im Wasserbad 30 min erhitzen.
    3. Die in Abschnitt 1.1 hergestellten wässrigen Lösungen werden mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert.
    4. 300 μl OS in ein 1,5-ml-Röhrchen oder ein 5-ml-Röhrchen pipettieren, das gemäß Schritt 2.1 modifiziert wurde. Pipettieren Sie langsam 100 μl LS auf das OS und stellen Sie sicher, dass sich im Röhrchen zwei unterschiedliche und kontinuierliche Phasen bilden. Lassen Sie die Grenzfläche 10 Minuten lang ausgleichen.
      HINWEIS: Um die Bildung einer homogenen Monoschicht aus Phospholipiden zu ermöglichen, sollte das LS homogen auf dem OS verteilt sein (Abbildung 4A). Wenn die LS-Schicht nicht durchgehend ist, verteilen Sie das LS-Volumen mit einer Mikropipette neu oder erhöhen Sie das LS-Volumen (dies kann bei hochviskosen Ölen wie Paraffin sehr hilfreich sein).
  3. Bildung von Wasser-in-Öl-Emulsionen
    1. Pipettieren Sie in einem 2-ml-Röhrchen in dieser Reihenfolge 250 μl LS und 6,25 μl IS für eine 2,5%ige Wasser-in-Öl-Emulsion.
      HINWEIS: Unserer Erfahrung nach sorgt dieses Wasser-in-Öl-Verhältnis höchstwahrscheinlich für eine stabile Emulsion und erhöht somit die Erfolgsrate des Protokolls (Abbildung 5). Um die GUV-Ausbeute zu erhöhen, empfehlen wir, das Emulsionsvolumen anstelle des IS/LS-Verhältnisses zu erhöhen.
    2. Mischen Sie die beiden Phasen mit einer oder mehreren der folgenden Methoden, bis die Mischung homogen und stabil erscheint: Vortex, mechanisches Rühren über einem Standard-Mikroröhrchengestell oder Klopfen auf das Röhrchen mit einem Finger (siehe Abbildung 5 für Beispiele für homogene Emulsionen).
    3. 200 μl der Emulsion werden auf die in Abschnitt 2.2 vorbereitete OS/LS-Grenzfläche übertragen.
    4. Wenn Sie ein 1,5-ml-Röhrchen verwenden, schließen Sie das Röhrchen einfach; Wenn Sie das modifizierte 5-ml-Röhrchen aus Abschnitt 2.1 verwenden, setzen Sie eine Gummikappe auf die Spitze und überführen Sie das Röhrchen vorsichtig in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
  4. Tröpfchentransfer durch Zentrifugation
    1. Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur gemäß den Angaben in Tabelle 1 zentrifugiert. Am Ende der Zentrifugation ist das Vorhandensein eines undurchsichtigen Pellets am Boden des Röhrchens und einer klaren Ölphase im oberen Teil zu überprüfen.

3. GUV-Rückgewinnung

  1. Entölung
    HINWEIS: Je nach experimentellem Bedarf kann das Öl in drei verschiedenen alternativen Schritten entfernt werden.
    1. Wenn GUVs in Standard-1,5-ml-Röhrchen hergestellt wurden, entfernen Sie das Öl langsam mit Hilfe einer P1000-Pipette und einer P200-Pipette für die letzten Tropfen und achten Sie darauf, dass das Pellet nicht gestört wird.
      HINWEIS: Schmalere Spitzen helfen beim Entfernen des Öls, so dass das Einsetzen einer Spitze für kleinere Volumina (10-200 μl) in eine P1000-Spitze die Genauigkeit dieses Schritts verbessert.
    2. Wenn es sich um mehrere GUV-Präparate in unterschiedlichen 1,5-ml-Röhrchen handelt, entfernen Sie das Öl mit Hilfe eines Büchner-Kolbens. Schließen Sie ein Stück eines dicken Silikonrohrs (Innendurchmesser 7 mm, Außendurchmesser 13 mm) an die Unterdruckleitung an und führen Sie ein weiteres Rohr in die Kolbenöffnung ein und dichten Sie es mit einer Gummidichtung ab. Führen Sie am anderen Ende dieses Rohrs eine P1000-Spitze ein, wickeln Sie sie mit Parafilm ein, schneiden Sie etwa 3 mm der Spitze ab und stecken Sie sie in eine P200-Spitze. Öffnen Sie das Vakuum und saugen Sie das Öl mit der P200-Spitze an, schließen Sie dann das Vakuum und entfernen Sie die letzten Tropfen durch eine P200-Pipette.
    3. Wenn GUVs in dem in Schritt 2.1 beschriebenen Behälter hergestellt wurden, entfernen Sie die Spitze vom Schlauch und stellen Sie sicher, dass sich die Gummikappe nicht löst (Abbildung 3D). Entsorgen Sie dann die Spitze und bewahren Sie die Gummikappe, den O-Ring und die gelochte Kappe zur Wiederverwendung auf.
    4. Entfernen Sie mit Hilfe einer P1000-Mikropipette das OS aus dem Röhrchen (Abbildung 3E), wobei etwa 50 μl des Volumens übrig bleiben, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Pellet nicht gestört wird.
    5. Wechseln Sie die Spitze, suspendieren Sie das Pellet im übrig gebliebenen Volumen und geben Sie es in ein sauberes 2-ml-Röhrchen.
  2. GUV wäscht
    HINWEIS: Der Zweck dieser Schritte besteht darin, Spuren der Ölphase zu entfernen, die in Schritt 3.1 nicht entfernt wurden. Falls erforderlich, sollten die Schritte 3.2.1 und 3.2.2 wiederholt werden, bis kein Öltropfen mehr im Rohr zu beobachten ist.
    1. Füllen Sie das Röhrchen mit 2 mL OS und zentrifugieren Sie es bei 1.500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie das OS, wobei Sie etwa 50 μl des Volumens übrig lassen, und achten Sie darauf, dass das Pellet nicht gestört wird.
    3. Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte.
  3. Volumen-Äquilibrierung
    HINWEIS: Wir fügen diesen Abschnitt hinzu, um einen Vergleich der Erträge zwischen verschiedenen GUV-Präparaten zu ermöglichen.
    1. Mit einer P200-Mikropipette wird das Pellet in den 50 μl des Restvolumens von der letzten Wiederholung von Schritt 3.2.2 resuspendiert.
    2. Messen Sie dieses Volumen, indem Sie die Pipette auf 20 stellen und das Volumen erhöhen, indem Sie die Spitze in die GUV-Dispersion tauchen, ohne die Röhrchenwand zu berühren, damit die Flüssigkeit in der Spitze fließen kann.
    3. Fügen Sie OS hinzu, um das endgültige Volumen von 100 μl zu erreichen.

4. Beobachtung und Dimensionsanalyse

  1. Mikroskopische Bildaufnahme
    1. Mischen Sie die GUV-Dispersion vorsichtig, indem Sie mit einem Finger auf die Tube klopfen.
    2. Beladen Sie eine Burker-Kammer mit 10 μl der GUV-Probe und warten Sie mindestens 5 Minuten, bis die GUVs am Boden der Kammer sedimentieren können.
    3. Beobachten Sie die Probe unter einem Phasenkontrastmikroskop. Bewegen Sie sich mit den Burker-Linien als Referenz über die Probe und nehmen Sie mindestens 20 Bilder auf, wobei Sie darauf achten müssen, dass sich die Beobachtungsbereiche nicht überlappen.
  2. Dimensionale Analyse
    1. Laden Sie die Bilder auf ImageJ.
    2. Um den Pixel/μm-Umrechnungsfaktor zu berechnen, wählen Sie ein Bild aus, das ein 50 x 50 μm großes Quadrat der Burker-Kammer zeigt (zur korrekten Identifizierung siehe Datenblatt des Herstellers), wählen Sie dann das Auswahlwerkzeug für gerade Linien aus, zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ecken des Quadrats und messen Sie die Linie, indem Sie auf Analysieren | Messen. Wiederholen Sie dies 3x und berechnen Sie den Durchschnittswert.
    3. Stellen Sie den Umrechnungsfaktor ein, indem Sie auf Analysieren | Festlegen der Skalierung. Geben Sie den Wert aus Schritt 4.2.2 in das Feld Abstand in Pixel ein und geben Sie dann den Wert 50 in Bekannte Entfernung und μm in Längeneinheit ein.
    4. Klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest und wählen Sie das Feld Bereich aus. Wählen Sie das ovale Auswahlwerkzeug aus, klicken Sie mit der linken Maustaste und halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um den resultierenden Kreis um ein GUV zu überlappen. Messen Sie den Durchmesser, indem Sie auf Analysieren | Messen. Wiederholen Sie dies für jedes GUV in jedem Bild.
    5. Klicken Sie im Ergebnisfenster auf Datei | Speichern unter... , um die CSV-Datei des GUV-Bereichs zu exportieren, und analysieren Sie dann die Größenverteilung mit dem auf GitHub16 verfügbaren Skript.
      HINWEIS: Es ist möglich, Schritt 4.2.3 zu überspringen und das Skript auszuführen, das den Pixel/μm-Umrechnungsfaktor angibt. Um diesen Wert zu berechnen, dividieren Sie den in Schritt 4.2.2 ermittelten Wert durch 50.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine optimale GUV-Aufbereitung zeichnet sich durch die Bildung einer klaren Ölphase und eines ausgeprägten Pellets aus (Abbildung 4A). In Fällen, in denen Wassertröpfchen nicht in GUVs umgewandelt werden können, kollabieren sie in der Regel und hinterlassen Phospholipid-Ablagerungen an der OS/LS-Grenzfläche (Abbildung 4C). Dieser Effekt wird höchstwahrscheinlich durch die Aggregation von Phospholipiden und anderen Molekülen aus der Ölphase verursacht, die aus einer unzureichenden Äquilibrierung der Phospholipide an der Wasser/Öl-Grenzfläche resultiert. Trotz des Fehlens eines sichtbaren Pellets oder des Vorhandenseins von Schmutz an der Grenzfläche können sich dennoch GUVs bilden, so dass der Prozess fortgesetzt werden kann. Waschschritte sind zwar nicht vollständig wirksam, um alle Phospholipidrückstände zu entfernen, aber sie tragen erheblich zur Beseitigung von Öltröpfchen bei und verbessern die Gesamtqualität der Probe (vergleiche Abbildung 6A und Abbildung 6B).

Die Verwendung von altem LS oder LS, das unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit hergestellt wurde, führt häufig zu reduzierten GUV-Dispersionen mit geringerer Ausbeute und höherem Gehalt an ungeordneten Aggregaten, die höchstwahrscheinlich durch Phospholipide und andere Moleküle aus der Ölphase gebildet werden (Abbildung 6C). Bei LS, das unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit hergestellt wurde, beobachteten wir bei der GUV-Produktion Variationskoeffizienten von über 0,8 (mit Proben, die sehr wenige GUVs enthielten), während bei LS, das in der modifizierten Handschuhkammer hergestellt wurde, der Variationskoeffizient unter 0,5 lag.

Unterschiedliche Zentrifugationsbedingungen können sich auf die GUV-Ausbeute und -Qualität auswirken. In einer qualitativen Analyse wurden 20 min bei 3.300 × g als gute Bedingung für saccharosebeladene GUVs identifiziert (Probe E). Eine Verringerung der Drehzahl (45 min bei 500 × g) führte zu einer geringeren Ausbeute, während eine Erhöhung (5 min bei 16.600 × g) zu einer höheren Bildung von ungeordneten Phospholipidaggregaten führte. Eine schwache Zentrifugalkraft kann verhindern, dass viele Tröpfchen die OS/LS-Grenzfläche passieren, daher die verringerte Ausbeute, während eine starke Kraft möglicherweise nicht genügend Zeit für die Organisation der Phospholipide auf dem äußeren Segel während der Grenzflächenüberquerung bietet (Abbildung 7). Auch die Verkapselung von Mikropartikeln kann durch Anpassungen der Zentrifugationsparameter optimiert werden, sofern die Massendichte der Mikropartikel in etwa der des IS entspricht. Zu diesem Zweck ermöglicht die Verringerung der Zentrifugationsbeschleunigung (und damit die Erhöhung der Zentrifugationszeit) eine homogenere Verkapselung der Partikel, indem ein Bruch der Phospholipidmembran aufgrund der von den Feststoffpartikeln ausgeübten Kraft vermieden wird (ein Beispiel für eine gute Verkapselung ist in Abbildung 6D dargestellt, während die Untersuchung der optimalen Zentrifugationsparameter noch im Gangeist 17).

Da die Diffusion von Phospholipiden durch die Ölphase beeinflusst werden kann, kann ein einfacher qualitativer Test durchgeführt werden, um die Stabilität der Emulsion zu bewerten (Abbildung 5). Mit Hilfe eines im IS gelösten färbenden Farbstoffs (Brilliant Blue FCF) zur Verbesserung der Visualisierung können Emulsionen mit unterschiedlichen Wasser/Öl-Verhältnissen hergestellt und über die Zeit beobachtet werden. Der Stabilitätsverlust lässt sich durch die Aggregation von Wassertröpfchen und die daraus resultierende Trennung von der Ölphase sichtbar machen. Da große Tröpfchen (mit bloßem Auge sichtbar) weniger wahrscheinlich in GUVs umgewandelt werden, empfehlen wir, die Emulsionsbedingung zu verwenden, die die geringste Phasentrennung bietet.

Der Effekt von Variationen im Protokoll kann durch eine Größenverteilungsanalyse überprüft werden, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben: Die Durchmesser von GUVs können mit ImageJ aus Phasenkontrastmikroskopbildern gemessen werden, und die Größenverteilung kann mit einem auf GitHub16 verfügbaren Skript analysiert werden. Nach diesem Protokoll konnte beispielsweise eine Zunahme von GUVs mit größeren Durchmessern beobachtet werden, wenn Mineralöl gegenüber Silikonöl AR20 gewählt wurde (Abbildung 8).

figure-results-1
Abbildung 2: Aufbau der Handschuhkammer. Diese Abbildung zeigt die wichtigsten Modifikationen an der Handschuhkammer für die Herstellung der Lipidlösung. (A) Einlassanschluss mit Stickstoff und Vakuum; (B) Einlassverbindung mit der Handschuhkammer; (C) Auslassventil; (D) Nadellagerkappe für die Verdampfung des Lösungsmittels; (E) dünne Rohre für die Verdampfung von Lösungsmitteln; (F) Kieselsäurepartikel zur Aufnahme von Feuchtigkeit; (G) Gegenstände, die in die Handschuhkammer gelegt werden sollen: digitales Thermo-Hygrometer (1), Lipidlösung in organischem Lösungsmittel (2), Korkringhalter (3), Glasspritze (4), offene Kappe mit Septum und Nadeln (5), Öllösung (6), offenes dunkles Fläschchen mit Kappe (7), 10-ml-Spitzen (8), P10000-Pipette (9); (H) Ende des Auslassrohrs, das in Wasser getaucht ist; I) Durchstechflasche, verschlossen mit nadelgelagerter Kappe, die mit Ein- und Auslass verbunden ist; (J) Schematische Darstellung des modifizierten Handschuhfachs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 3: Behälter zur einfachen Ölentnahme. Wichtigste Schritte bei der Zubereitung von GUVs in einem Behälter zur einfachen Entnahme des Öls gemäß Protokollabschnitt 2.1. (A) In eine 5-ml-Röhrchenkappe wird ein Loch gebohrt, damit eine P1000-Spitze hineinpasst; dann (B) wird die Kappe auf ein leeres 5-ml-Röhrchen gesetzt, wobei die Spitze durch einen O-Ring in das Loch eingeführt wird. (C) Die Lösungen werden gemäß den Protokollabschnitten 2.2 und 2.3 in das Röhrchen gegeben, die Spitze wird verschlossen und das Röhrchen wird in ein 50-ml-Röhrchen gegeben. GUVs, die aus 0,2 mM DOPC in Silikonöl hergestellt wurden, wurden mit 230,7 mM Saccharose und 3,1 mM Brilliant Blue FCF beladen, um die Visualisierung zu verbessern. (D) Nach der Zentrifugation wird die obere Ölphase zusammen mit einem Teil des GUV-Puffers in der Spitze eingeschlossen (der cyan erscheint, weil ein Teil der Tröpfchen nicht in GUVs umgewandelt wird und der Farbstoff im OS freigesetzt wird). Dank der Gummikappe kann die Spitze zusammen mit dem Flüssigkeitsinhalt leicht aus dem 5 mL Röhrchen entnommen werden, was eine schnelle und einfache Entnahme der gesamten Ölphase ermöglicht. (E) Das GUV-Granulat kann leicht vom Boden eines Röhrchens in einer klaren Dispersion gesammelt werden, ohne offensichtliche Ölverunreinigung, wie durch Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen wurde (F). Maßstabsleiste = 20 μm. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 4: GUV-Bildung. Beispiele für (A) OS/LS-Grenzfläche, (B) ein sauberes GUV-Pellet mit einer klaren Ölphase und (C) ein GUV-Pellet mit Ablagerungen an der OS/LS-Grenzfläche (die Ablagerungen und Pellets erscheinen rötlich, da der IS dieser GUV-Population mit 1,65 mM New Coccin-Farbstoff ergänzt wurde, um die Visualisierung zu verbessern). Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 5: Emulsionsstabilität mit unterschiedlichen Öl- und Wasser-in-Öl-Verhältnissen. Die Abbildung zeigt die Stabilität von Emulsionen im Laufe der Zeit, abhängig von der Art des Öls und dem verwendeten Wasser/Öl-Verhältnis (w/o). Das IS bestand aus 230,7 mM Saccharose und 3,1 mM Brilliant Blue FCF, um die Visualisierung der Emulsionen zu verbessern. Mit Mineralöl hergestellte Emulsionen sind weniger stabil als ihre Gegenstücke, die mit Silikonöl AR20 hergestellt werden. Dieser Effekt wird durch zunehmende W/O-Verhältnisse noch verstärkt. Emulsionen im Silikonöl AR20 sind zwar deutlich stabiler, aber auch ihre Stabilität nimmt mit zunehmendem W/O-Verhältnis ab, wobei die Phasentrennung unmittelbar nach der Emulgierung sichtbar ist (Silikonöl AR20 bei 10%). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 6: Beobachtung von GUVs mit einem Phasenkontrastmikroskop. Eine 20-fache Vergrößerung von mit Saccharose beladenen GUVs, die aus einem LS hergestellt wurden, das aus 3,18 mM DOPC in Mineralöl besteht. (A) Probe, die nach der Ölentnahme entnommen wurde; (B) Probe, die nach den Waschschritten entnommen wurde; (C) schlechte GUV-Ausbeute aus einem LS, das in Umgebungen mit unreguliertem Sauerstoff und Feuchtigkeit hergestellt wurde; (D) mit Mikropartikeln beladene GUVs. Maßstabsleiste = 10 μm; Öltropfen sind eingekreist, und Beispiele für ungeordnete Aggregate von Phospholipiden und Ölmolekülen sind durch einen Pfeil gekennzeichnet. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; GUVs = riesige unilamelläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 7: Einfluss verschiedener Zentrifugationsbedingungen auf die GUV-Bildung. Phasenkontrastbilder von saccharosebeladenen GUVs, die mit einem LS aus 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 hergestellt wurden. Die Abbildung zeigt einen qualitativen Vergleich von GUVs bei (A) 16.600 × g für 5 min, (B) 3.300 × g für 20 min und (C) 500 × g für 45 min. Während eine hohe Zentrifugationsgeschwindigkeit zu einem höheren Gehalt an Phospholipid-Aggregaten führt, führt eine niedrige Zentrifugationsgeschwindigkeit zu einer geringeren Ausbeute. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-7
Abbildung 8: Analyse der Größenverteilung. Vergleich von zwei mit Saccharose beladenen GUV-Proben, die aus (A) 0,2 mM DOPC in Mineralöl und (B) 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 gewonnen wurden (*die Probe wurde 10x verdünnt, um eine klare Unterscheidung der GUVs unter einem Phasenkontrastmikroskop zu ermöglichen). Die Analyse nach Protokollabschnitt 4 zeigt eine Größenverteilung in Richtung höherer Durchmesser für die Mineralölprobe im Vergleich zu Silikonöl-AR20-Proben. Die Ausbeute der Silikonprobe ist jedoch fast 20x höher. Abkürzungen: GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

SchrittBedingung EBedingung PBeschreibung
1.1.14,11 gca. 17,11 GrammMasse an Saccharose
1.1.1ca. 2,16 gca. 2,16 gMasse der Glukose
1.1.2ca. 240 mMca. 1000 mMKonzentration von Saccharose
1.1.2ca. 240 mMca. 240 mMKonzentration von Glukose
1.3.2SilikonölMineralölÖlphase für LS
1.3.20,1 mL Glasspritze0,5 mL GlasspritzeGlasspritze zum Transfer von DOPC in Chloroformlösungen
1.3.1063 μL500 μLVolumen von DOPC in Chloroform-Lösung
1.3.1610 mL5 mLÖlvolumen
2.4.13300 g 20 Minuten500 g 45 MinutenBedingungen der Zentrifugation

Tabelle 1: Variationen im Protokoll. Die Tabelle zeigt die Variationen für verschiedene Schritte des Protokolls (in der ersten Spalte angegeben), um zwei verschiedene GUV-Populationen herzustellen: saccharosebeladene GUVs (Bedingung E) und mikropartikelbeladene GUVs (Bedingung P).

IDErforderliche SchritteInnendurchmesser (mm)Außendurchmesser (mm)Länge (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabelle 2: Rohre für Gas- und Vakuumanschlüsse in der Handschuhkammer. In der Tabelle sind die Abmessungen der Silikonrohre aufgeführt, die für die Verbindung der Handschuhkammer mit den Stickstoff- und Vakuumleitungen verwendet werden. Referenz-IDs werden bereitgestellt, um den Montageprozess zu erleichtern.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verfahren zur Herstellung von GUVs können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: Methoden, die auf der Quellung von Substraten durch Hydratation basieren, und solche, die auf der Assemblierung von flüssigen Grenzflächen basieren. Methoden aus der ersten Gruppe sind sehr effizient, um große GUV-Populationen für die biophysikalische Charakterisierung von Lipidmembranen oder Transmembranproteinen bereitzustellen. Im Gegensatz dazu werden Methoden wie der Tröpfchentransfer aufgrund des geringeren Ladungsverbrauchs und der höheren Verkapselungseffizienz in erster Linie für die Ladungsverkapselung gewählt18.

Aus diesem Grund wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Ladungen in GUVs verkapselt, was den Tröpfchentransfer zu einem Referenzprozess für künstliche Zellenmacht 3,8,9,10 und zu einer möglichen Lösung für den Bau neuartiger biomimetischer Mikroroboter11,12. Um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von GUV-Membranen zu modulieren, können verschiedene Moleküle einbezogen werden, wie z. B. ionische Phospholipide10, Fettsäuren19, Polymere wie PEG20 oder Cholesterin21 (obwohl hydrophobe Moleküle wie Cholesterin eine hohe Affinität zu Öl haben, was zu einer geringeren Kontrolle der Membranzusammensetzung in Bezug auf Quellmethodenführt 22). Das Protokoll ist vielseitig genug, um diese Änderungen zu ermöglichen, aber einige Schritte haben eine größere Wirkung als andere.

Um die Kritikalität der Methode zu erörtern, haben wir hier ein Protokoll für die Herstellung von zwei verschiedenen GUV-Populationen beschrieben: ein Präparat aus GUVs, das eine Saccharoselösung enthält, und ein Präparat aus GUVs, das Mikropartikel einkapselt. Die Unterschiede im Protokoll sind in Tabelle 1 als Bedingung E (leer) und Bedingung P (mit Partikeln) aufgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die Bildung von GUVs durch Überführung von Wassertröpfchen aus einer Ölphase in eine Wasserphase in einem bistabilen Prozess, der von Phospholipiden23 angetrieben und von den physikalisch-chemischen Eigenschaften aller drei beteiligten Phasen beeinflusst wird: IS, OS und LS.

Unter den dreien ist LS aufgrund der Anfälligkeit von Phospholipiden für Licht, Oxidation und Hydrolyse am empfindlichsten 24,25,26. Aus diesem Grund muss der erste Schritt des Verdampfens des organischen Lösungsmittels, das für die Langzeitlagerung von Phospholipiden bei -20 °C (typischerweise Chloroform oder Methanol) verwendet wird, in braunen Fläschchen unter Stickstoff- oder Argonfluss durchgeführt werden. Wenn in der Laborumgebung keine niedrige Luftfeuchtigkeit gewährleistet ist, können Phospholipide geschädigt werden13, 14, 27. Daher sollte LS in einer geschlossenen Umgebung wie einer Handschuhbox oder der in diesem Protokoll beschriebenen kostengünstigen modifizierten Handschuhkammer zubereitet werden. Sobald das Öl zum Lipidfilm hinzugefügt wurde, kann das LS aus der Handschuhkammer entfernt werden, und die vollständige Auflösung der Phospholipide erfolgt durch Vortexen und Erhitzen der Lösung.

Obwohl einige Protokolle die Beschallung in diesem Schritt13 einschließen, kann ein lokalisierter Temperaturanstieg bei einigen LS-Formulierungen zu noch unbeschriebenen Schäden führen. Aus diesem Grund kann das Erhitzen der Lösung in einem Wasserbad zu einem besser kontrollierten und homogenen Prozess führen. Um die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung des LS weiter zu verringern, schlägt dieses Protokoll die Verwendung von zwei verschiedenen Temperaturen vor: Da das Auflösen eines neu hergestellten LS eine höhere Energie erfordert als ein zuvor gelöstes LS (aufgrund einer dichteren Packung von Phospholipidmolekülen in dem auf der Oberfläche des Glasfläschchens verteilten Film), werden 80 °C für die erste Auflösung des Lipidfilms und 50 °C für das einfache Wiederauflösen von Phospholipiden kurz vor ihrer Verwendung angenommen. Da bei 3,18 mM DOPC in Mineralöl im Allgemeinen eine Zunahme der Leistungsvariabilität im Laufe der Zeit beobachtet wird (Abbildung 4C), wird die Verwendung von LS innerhalb einer Woche allgemein empfohlen. Nichtsdestotrotz können einige Kombinationen von Öl und Phospholipiden eine längere Lebensdauer haben, und die Verwendung einer Handschuhkammer scheint auch die Stabilität von LS im Laufe der Zeit zu verbessern.

Die Anpassung von GUV-Membranen mit spezifischen Kombinationen von Phospholipiden kann maßgeschneiderte Implementierungen des Protokolls erfordern. Um zwischen all den möglichen Variationen zu navigieren, kann man sich an den physikalisch-chemischen Eigenschaften des LS orientieren. Die kritischen mizellaren Konzentrationen (CMC) und die Diffusivität der Phospholipide in LS werden durch die chemischen Wechselwirkungen mit den Molekülen in Lösung28 beeinflusst. Die Bildung von Wassertröpfchen in der IS/LS-Emulsion wird daher davon beeinflusst, wie schnell Phospholipide in der Ölphase diffundieren und an Wasser/Öl-Grenzflächen gelangen können, um eine stabile Monoschicht (das innere Segel der Membran) zu bilden. Unterschiede in der Diffusivität wurden für die beiden in diesem Protokoll verwendeten Öle beobachtet, wobei das Silikonöl AR20 eine höhere Stabilität der IS/LS-Emulsion bietet (Abbildung 6). Da die stabilste Emulsion für beide Öle beobachtet wurde, wenn Wasser in einem Verhältnis von 2,5 % dispergiert wurde (in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen in Mineralöl13), haben wir dies als allgemein gültiges Verhältnis festgelegt.

Da jedoch höhere Verhältnisse nützliche Eigenschaften bieten könnten (z. B. zeigte POPC in Mineralöl eine Verschiebung hin zu größeren GUVs13), empfehlen wir, einen vorläufigen qualitativen Test wie den in Abbildung 6 dargestellten durchzuführen, um Einblicke in die Stabilität der Emulsion und damit die erwartete Effizienz der Verkapselung zu erhalten. An dieser Stelle raten wir den Lesern, sich nicht auf ein genaues Timing oder Iterationen von Verfahren zur Bildung der Emulsion zu verlassen, da die Wirksamkeit streng vom Bediener oder dem verwendeten Instrument abhängt. Stattdessen stellen wir einen Kontrollpunkt bereit, der dem Bediener hilft zu verstehen, wann die Qualität der Emulsion gut genug ist, um - zumindest theoretisch - die Chancen zu maximieren, Tröpfchen in GUVs umzuwandeln. Die Diffusivität der Phospholipide in Öl beeinflusst auch ihre Fähigkeit, sich während des Tröpfchentransfers neu zu ordnen und das äußere Segel der GUV-Membran zu bilden 2,7,18,29. Dieser Schritt wird durch eine korrekte Äquilibrierung der LS/OS-Schnittstelle begünstigt. Während die Inkubationszeit dieses Protokolls mit den allgemeinen Empfehlungen18 übereinstimmt, können GUVs, die mit unterschiedlichem LS hergestellt wurden, mit Grenzflächenspannungsmessungen aus früheren Berichten7 und unseren vorläufigen Experimenten von einer längeren Inkubationszeit profitieren.

Die Bildung des äußeren Segels wird auch durch die Geschwindigkeit der Wassertröpfchen beeinflusst, die die LS/OS-Grenzfläche passieren, ein Schritt, der mit der Dichte und Viskosität der drei Phasen30 zusammenhängt. Die Dichteunterschiede müssen immer der Reihenfolge IS > OS > LS folgen. Dies ist wichtig, um zunächst die Sedimentation von IS-Tröpfchen in Richtung der LS/OS-Grenzfläche, dann die Kreuzung der Grenzfläche für die Umwandlung in GUVs und deren Sedimentation zum Boden des Rohrs zu ermöglichen. Obwohl der Prozess auch dann spontan ablaufen kann, wenn deionisiertes Wasser sowohl als IS als auch als OS23 verwendet wird, wurde ein Dichteunterschied zwischen IS und OS eingeführt, um die GUV-Bildung zu begünstigen31. Das gebräuchlichste Paar für diesen Zweck ist Saccharose im IS und Glukose im OS: Bei äquiosmolaren Konzentrationen, die erforderlich sind, um eine Schädigung der sich bildenden GUVs durch osmotischen Stress zu verhindern, bietet Saccharose eine dichtere Lösung als Glukose. Da der Dichteunterschied mit der Osmolarität dieser Lösungen zunimmt, variiert die Ausbeute an GUVs entsprechend, wobei über 600 mOsm hinaus keine weitere Verbesserung beobachtet werdenkann 13.

Optimale Zentrifugationsbedingungen sind eng mit der Dichte und Viskosität der drei Phasen und der Diffusivität der Phospholipide verknüpft. In Ermangelung einer vollständigen Charakterisierung der drei Phasen müssen mehrere Bedingungen untersucht werden. Anhand qualitativer Tests (Abbildung 4E und Abbildung 5) und vorläufiger systematischer Analysen17 war es möglich, gute Zentrifugationsbedingungen für die beiden in diesem Protokoll beschriebenen Proben zu definieren; Die Qualität der Proben kann jedoch verbessert werden, wenn mehr Bedingungen untersucht werden. Wenn das Gleichgewicht zwischen der Phospholipid-Diffusivität im LS und der Dichte und Viskosität der drei Phasen nicht richtig aufrechterhalten wird, fehlt den Phospholipiden genügend Zeit, um sich an der LS/OS-Grenzfläche auszugleichen und sich korrekt neu anzuordnen, wenn sich Wassertröpfchen in Richtung des OS bewegen. Dies führt häufig zur Bildung eines weißlichen Niederschlags an oder knapp unter der Grenzfläche, der wahrscheinlich aus Phospholipiden und anderen Molekülen der Ölphase besteht, die von Tröpfchen mitgerissen werden, die sich während der Zentrifugation nicht zu GUVs zusammensetzen.

Die Verkapselung einer homogenen Lösung kann durch Erhöhung der IS-Dichte unter Beibehaltung eines osmotischen Gleichgewichts mit dem OS (wie für das Saccharose-Glukose-Paar) angetrieben werden, aber die Verkapselung einer Mikropartikeldispersion erfordert, dass die Dichte der wässrigen Phase der von Mikropartikeln32 entspricht. Die Effizienz der Ladungseinkapselung wird auch von der chemischen Zusammensetzung der Ladungslösung/-dispersion beeinflusst. Frühere Berichte zeigten einen negativen Effekt auf die GUV-Ausbeute, der durch viele Alkalimetallhalogenide33 oder pH-Schwankungen13 verursacht wurde, höchstwahrscheinlich aufgrund von Wechselwirkungen oder Verschiebungen in der Nettoladung von zwitterionischen hydrophilen Phospholipidköpfen. Daher erfordert die Verkapselung biologischer Reaktionen (wie z. B. enzymatische oder zellfreie Proteinsynthese) oft einen Kompromiss, da pH- und Salzkonzentrationen (wie KCl oder NaCl) auf Werte eingestellt werden müssen, die für die Reaktion selbst suboptimal sind. Nichtsdestotrotz können auch komplexe Reaktionsgemische wie die zellfreie Proteinsynthese modifiziert werden, um funktionsfähige GUV-basierte künstliche Zellen bereitzustellen34.

Aus praktischer Sicht bietet die Tröpfchenübertragungsmethode zwar einen sehr einfachen Prozess, aber die Wiederherstellung von GUVs vom Betriebssystem kann einige Einschränkungen mit sich bringen. Um das Öl nach dem Zentrifugationsschritt aus der oberen Phase zu entfernen, ist es möglich, zwei Pipettenspitzen für eine feinere Entnahme (Protokollschritt 3.1.1) oder einen Buchnerkolben für eine schnellere Entnahme bei der Vorbereitung mehrerer Proben (Protokollschritt 3.1.2) zu nutzen. Da das Öl jedoch nicht vollständig entfernt wird, ist es notwendig, einen Waschschritt durchzuführen, um eine saubere GUV-Dispersion zu erhalten (Protokollschritt 3.2). Obwohl die Waschschritte zu einer effektiven Entfernung von Restöltröpfchen ohne nennenswerten Verlust von GUVs führten (Abbildung 4A,B), kann dieser Durchgang bei hochviskosem Öl weniger einfach sein und kann sehr zeitaufwändig sein, wenn mehrere GUV-Formulierungen hergestellt werden. Es wurde ein alternatives Verfahren beschrieben, um die Ölentfernung zu umgehen und das GUV vom Boden des Rohres durch ein mit Hilfe einer Nadel35 durchbohrtes Loch zu bergen. Dieser Vorgang ermöglicht jedoch möglicherweise keine vollständige Rückgewinnung des GUV-Pellets, wenn das Rohr nicht in der richtigen Position durchstochen wird, und ist darüber hinaus potenziell schädlich für den Bediener.

Um die GUV-Rückgewinnung zu unterstützen, stellen wir hier einen neuen und einfachen Ansatz vor, um die Ölphase schnell zu entfernen. Diese basiert darauf, dass die obere, weniger dichte Ölphase in einer verdeckelten Pipettenspitze eingefangen wird, so dass die Spitze nach der Zentrifugation so entnommen werden kann, dass keine Flüssigkeit tropft. Diese einfache Strategie ermöglicht eine schnelle und einfache Entfernung der gesamten Ölphase auf einmal und vereinfacht diesen zeitaufwändigen Schritt konsequent.

Um die Effizienz des Protokolls zu bewerten, wurden einige Methoden für die automatische Erkennung von GUVs implementiert, um die Zählung und die Analyse der Größenverteilung zu beschleunigen. Die Markierung von GUVs mit Fluoreszenzsonden bietet eine einfache und effektive Strategie, die sowohl auf die Durchflusszytometrie36,37 als auch auf die mikroskopische Bildgebung in Kombination mit Kreisdetektionsalgorithmen 13,37,38,39 angewendet werden kann. In jüngster Zeit werden KI-basierte Werkzeuge zur Objekterkennung erforscht, um diesen Prozess zu verbessern40,41. Fluoreszenzfarbstoffe können jedoch möglicherweise die GUV-Eigenschaften beeinflussen und somit Artefakte in die Analyse einbringen. Wenn ein detektierbares Fluoreszenzsignal ausgeschlossen wird, bleibt die Mikroskopie die zuverlässigste Option, wobei die Phasenkontrastmikroskopie die bevorzugte Methode für eine optimale Visualisierung18 und die Anwendung von Kreisdetektionsalgorithmen38 ist.

Alternativ ist es möglich, besondere Eigenschaften bestimmter Formulierungen für einzigartige Nachweisstrategien auszunutzen. Hadorn et al. nutzten beispielsweise das Vorhandensein von Elektrolyten in IS, um GUVs mit einem impedanzbasierten Zellzähler33 zu detektieren. Wenn keine dieser automatisierten oder formulierungsspezifischen Methoden durchführbar ist, bleibt die manuelle Kreisannotation ein universell anwendbarer Fallback. In solchen Fällen bietet ImageJ ein praktisches Werkzeug, um den Prozess zu beschleunigen und Rohdurchmessermessungen einfach zu extrahieren, wie in diesem Protokoll beschrieben.

Trotz der weiten Verbreitung der Tröpfchentransfermethode wird den Optimierungsprozessen, die für neuartige GUV-Formulierungen erforderlich sind, wenig Aufmerksamkeit geschenkt. In dieser Arbeit haben wir die verfügbaren Informationen aus der Literatur zusammengetragen, um ein systematisches Protokoll zur Steuerung und Vereinfachung dieser Optimierung zu implementieren. Dieser praktische Leitfaden befasst sich mit den zugrunde liegenden Prinzipien bei der Herstellung neuartiger GUV-Formulierungen und bei der Rückgewinnung einer minimal ölkontaminierten Probe, einem oft übersehenen Aspekt des Protokolls13,14. Obwohl es nicht möglich ist, die Optimierung vorherzusagen, die für eine GUV-Formulierung erforderlich ist, bietet dieser Leitfaden nützliche Tipps und Einblicke, um die Implementierung neuartiger GUVs zu beschleunigen, was möglicherweise zu Anwendungen wie künstlichen Zellen und Mikrorobotern führen kann.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Ergebnisse sind Teil des Projekts CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots), das vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert wurde (Grant Agreement No. 948590). Diese Arbeit wurde teilweise von der Europäischen Kommission im Rahmen des NextGenerationEU BRIEF-Projekts unterstützt. Wir danken Michele Ibrahimi für die technische Unterstützung bei der Einrichtung der Handschuhkammer und für die nützliche Diskussion über die Implementierung des Behälters zur einfachen Entnahme von Öl.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; M gemischte Celluloseester Membran  Spritzen-FilterMerckSLGSVR255F
1,5 mL RöhrchenBioklasse06.0279.00
100 μ L GlasspritzeMerck20737
150 mL BecherglasAvantor 213-1123Mindestens 3
20 mL Fläschchen aus dunklem Glas ND24Avantor 548-9001A
2 mL RöhrchenBioklasse07.3534.99
50 mL ZylinderAvantor 612-3843
500 μ L GlasspritzeHamilton549-1166
50 mL Falcon RöhrchenMerckCLS352070
50 mL Spritze Fisher Scientific8SS50L1
5 mL RöhrchenGreiner bio-one622201
600 mL BecherglasAvantor 213-1126
Bü CHNER-KolbenMerckZ740682
Korkringe für RundkolbenAvantor 217-1000
KristallisatorDutscher080474A
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichNr. G8270
D-(+)-SaccharoseSigma-AldrichNr. S9378
Digitales Thermo-HygrometerBohlenderNr. V1863-07
DOPCAvanti Forschung850375C
BohrerDremel4000
Erioglaucin-Dinatriumsalz (Brilliant Blue FCF)Sigma-Aldrich861146
G18 SpritzennadelTerumoAN1838R1
G21 SpritzennadelTerumoAN2138R1
HandschuhkammerBel-KunstNr. F50030-0000Falls verfügbar, kann ein Handschuhfach verwendet werden, aber in Labors mit niedriger Luftfeuchtigkeit ist dies möglicherweise nicht erforderlich
Magnetrührer für HeizplattenLLG Laborbedarf6.263 448
Leichtes MineralölSigma-Aldrich330779
Neues CoccinSigma-Aldrich199737
Nitrilkautschuk O-Ring O-Ring, 8mm Bohrung, 12mm AußendurchmesserRS196-4863
Offene Schraubverschlüsse mit Septum ND24Avantor 548-0031A
P1000 MikropipetteFisher Scientific12346132
P10000 MikropipetteAvantor 89079-978
P200 MikropipetteFisher Scientific12326132
PapierhandtücherAvantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
Pipettenspitzen (1000)Eppendorf0030000919
Pipettenspitzen (10000)Eppendorf0030000765
Pipettenspitzen (200)Eppendorf0030000870
Polystyrolpartikel, 1.1 & Mikro; mSigma-AldrichLB11-1ML
GummikappeBioclass S.r.l.12.2300.05
Konische GummidichtungAvantor 217-0211
Schraubverschlüsse  ND24Avantor 548-0161A
Silikonöl AR20Sigma-Aldrich10836
Silikonrohr (Innendurchmesser 1,6 mm, Außendurchmesser 3 mm)RS667-8441
Silikonrohr (Innendurchmesser 6 mm, Außendurchmesser 12 mm)RS273-2541Mindestens 6 m
Drei-Wege-KreuzungRS795-405
Zwei-Wege-KreuzungRS419-7287
Zweiwege-VentilClaber91280
ReinstwasserThermo Fisher Scientific 22934Wenn verfügbar, kann dieses Produkt durch Wasser ersetzt werden, das durch Milli-Q-Systeme gereinigt wurde
Universal-SchereBochem4154

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

EmulsionstransferSynthetische BiologieVesikelverkapselungLipidsuspensionEntfernung der lphaseMikrorobotikZentrifugationsprotokollPhospholipidmembran

Verwandte Artikel