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Methodenartikel

Etablierung eines Co-Kultursystems aus patienteneigenen kolorektalen Tumororganoiden und tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs)

3.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/68346

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27. Juni 2025

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1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung eines von Patienten stammenden Darmkrebs-Organoidmodells (CRC), das mit tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) kokultiviert wird, um deren Wechselwirkungen und therapeutisches Potenzial zu untersuchen. Dieses Modell bietet eine präklinische Plattform zur Erforschung von Immunantworten in der Tumormikroumgebung und zur Vorhersage der Wirksamkeit einer TIL-basierten Therapie für eine personalisierte Darmkrebsbehandlung.

Zusammenfassung

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Krebserkrankung weltweit. Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) wurden als wichtiger prognostischer Marker bei Darmkrebs identifiziert. Die therapeutische Anwendung von TILs hat bereits vielversprechende Ergebnisse bei Melanomen und Gebärmutterhalskrebs gezeigt. Ihr Einsatz in der Darmkrebstherapie befindet sich jedoch noch in einer explorativen Phase. Ein geeignetes In-vitro-Modell zur Bewertung der Wirksamkeit von TIL ist derzeit nicht verfügbar, was weitere Fortschritte auf diesem Gebiet behindert. Patient-Derived Organoid (PDO)-Modelle, die die Eigenschaften des ursprünglichen Tumorgewebes genau beibehalten und die Heterogenität zwischen den Patienten widerspiegeln, bieten eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der Interaktion zwischen CRC und TILs. In dieser Arbeit wird eine Methode beschrieben, um ein patientenabgeleitetes Darmkrebs-Organoidmodell aus frisch reseziertem Tumorgewebe zu etablieren, gefolgt von der Isolierung und Expansion von TILs. Dieses System ermöglicht die Co-Kultivierung von Darmkrebs-Organoiden und TILs, was die Beurteilung der TIL-vermittelten Zytotoxizität und Immunantwort ermöglicht. Durch die Analyse der Wirksamkeit der TIL-Abtötung von Organoiden können die potenziellen Ergebnisse einer TIL-basierten Immuntherapie für die personalisierte Darmkrebsbehandlung vorhergesagt werden. Darüber hinaus kann die weitere Entwicklung von TILs ihre Wirksamkeit gegen Tumore verbessern, was eine vielversprechende Strategie für die Entwicklung wirksamerer zellulärer Therapien darstellt. Dieses PDO-TIL-Co-Kulturmodell bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die präklinische Bewertung von TIL-Therapien und personalisierten Behandlungsstrategien bei Darmkrebs.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist eine der weltweit häufigsten und tödlichsten Krebsarten und stellt eine große Herausforderung für die öffentliche Gesundheitdar 1. Trotz Fortschritten bei den Behandlungsmodalitäten, einschließlich Operation, Chemotherapie und Immuntherapie, bleibt die Prognose für Darmkrebspatienten - insbesondere für Patienten mit metastasierender Erkrankung - schlecht. Die Tumormikroumgebung (TME) spielt eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung des Fortschreitens der Krebserkrankung und des Therapieansprechens, wobei sich tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) als Schlüsselkomponente für die Beeinflussung der Immunantwort gegen Krebs herausstellen2. TILs, eine vielfältige Population von Immunzellen, die in Tumoren vorkommen, wurden als signifikante prognostische Marker bei Darmkrebs identifiziert, wobei ein hohes Maß an TIL-Infiltration oft mit besseren klinischen Ergebnissen verbunden ist3. Jüngste Studien haben auch das therapeutische Potenzial von TILs bei anderen Krebsarten wie Melanom4 und Gebärmutterhalskrebs5 hervorgehoben, bei denen die TIL-basierte Immuntherapie eine vielversprechende Wirksamkeit gezeigt hat.

Trotz des Erfolgs von TILs bei einigen Krebsarten bleibt ihre Anwendung bei Darmkrebs jedoch ein Bereich, der noch untersucht wird. Die Komplexität und Heterogenität von Darmkrebs, gepaart mit der immunsuppressiven Tumormikroumgebung, stellen eine Herausforderung für eine effektive TIL-basierte Immuntherapiedar 6. Darmkrebstumoren weisen häufig ein hochgradig immunsuppressives TME7 auf, das durch das Vorhandensein von regulatorischen T-Zellen (Tregs), myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) und tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) gekennzeichnet ist, die alle die TIL-Funktion aktiv hemmen. Darüber hinaus exprimieren Darmkrebszellen häufig Immun-Checkpoint-Moleküle wie PD-L1, die die TIL-vermittelte Abtötung weiter behindern können8. Darüber hinaus erschwert die genetische Heterogenität von Darmkrebstumoren in Verbindung mit einem immunsuppressiven Stroma die Fähigkeit von TILs, Tumorzellen effektiv zu bekämpfen und zu eliminieren, was es schwieriger macht, den gleichen Erfolg zu erzielen wie bei Melanomen und Gebärmutterhalskrebs9. Eine kritische Lücke in der aktuellen Forschung ist der Mangel an geeigneten In-vitro-Modellen , die die Wechselwirkungen zwischen Darmkrebs und TILs genau simulieren können. Solche Modelle sind unerlässlich, um das Potenzial von TILs in der Darmkrebstherapie zu bewerten und ihre Anwendung für personalisierte Behandlungsstrategien zu optimieren.

Patient-Derived Organoids (PDOs) haben sich als leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung menschlicher Krebserkrankungen erwiesen10. Diese 3D-Kulturen, die aus Tumorgeweben von Patienten gewonnen werden, ahmen die histologischen und genetischen Eigenschaften der ursprünglichen Tumoren genau nach und bieten eine genauere Darstellung der Tumorbiologie im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Zelllinien. PDO-Modelle behalten auch die Heterogenität zwischen den Patienten bei, was sie ideal für personalisierte medizinische Ansätze macht11. In der Darmkrebserkrankung wurden PDOs für das Wirkstoffscreening und die Untersuchung der Tumorbiologie eingesetzt12, aber ihre Verwendung bei der Bewertung von Immunantworten - insbesondere im Zusammenhang mit TILs - ist nach wie vor begrenzt. Das Design eines PDO-Immunzell-Co-Kulturmodells muss die Komplexität der Mikroumgebung mit der experimentellen Kontrollierbarkeit in Einklang bringen. Obwohl Komponenten wie Makrophagen und dendritische Zellen die Biomimikry verbessern können, sind mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aufgrund ihrer Zugänglichkeit zur Mainstream-Wahl geworden. PBMCs haben jedoch einen geringen Anteil an tumorspezifischen T-Zellen, und die Monozyten-Subpopulationen können die Stabilität der Mikroumwelt beeinträchtigen13. Im Gegensatz dazu reichern TILs tumorreaktive Klone auf natürliche Weise an und tragen einen in situ Erschöpfungsphänotyp, was sie zu einem überlegenen Modell für die präzise Analyse von Immunevasionsmechanismen bei Darmkrebs macht.

Das Ziel dieser Studie ist es, eine neuartige in vitro-Plattform zur Bewertung von TIL-vermittelten Antitumorreaktionen bei Darmkrebs zu entwickeln, indem ein Co-Kultursystem von Darmkrebs-PDOs und -TILs etabliert wird. Dieses Modell ermöglicht die direkte Bewertung der TIL-Zytotoxizität gegen CRC-PDOs und die Analyse von Immunantworten in einem patientenspezifischen Kontext. Die Nutzung dieses Systems kann tiefere Einblicke in das Potenzial von TIL-basierten Immuntherapien für Darmkrebs liefern und die Erforschung von Strategien zur Verbesserung der Wirksamkeit von TIL durch technische Ansätze unterstützen. Bisherige Methoden waren durch die geringe Anzahl von TILs14 begrenzt. In den meisten Fällen wurden PBMCs zunächst zwei Wochen lang mit PDOs cokultiviert, danach konnten tumorspezifische TILs aus den PBMCs expandiert und dann weiter mit PDOs cokultiviert werden, um zytotoxische Effekte zu beobachten15. Dieser Ansatz leidet jedoch auch unter der verlängerten Modellierungszeit und der geringen Gesamtausbeute. Im Gegensatz dazu ermöglicht die beschriebene Methode die Isolierung und Etablierung von PDOs und TILs aus kleineren Tumorgewebeproben, die dann direkt co-kultiviert werden können. Dieser Ansatz kann sowohl in Bezug auf die Methodik als auch auf die Effizienz einen höheren Komfort bieten. Letztendlich zielt dieses System darauf ab, ein leistungsfähiges Werkzeug für die präklinische Bewertung von TIL-Therapien bereitzustellen und den Weg für personalisierte Behandlungsstrategien zu ebnen, die die Ergebnisse für Darmkrebspatienten verbessern können.

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Protokoll

Alle Experimente mit Materialien menschlichen Ursprungs wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und im Voraus von der Ethikkommission des Zhongshan-Krankenhauses genehmigt, das der Universität Dalian angegliedert ist (Zulassungsnummern: KY2023-206-1). Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten eingeholt, die klinische Proben für diese Studie zur Verfügung stellten. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Einschlusskriterien waren pathologisch bestätigtes primäres kolorektales Karzinomgewebe, eine ausreichende Stichprobengröße (≥1 cm3), keine neoadjuvante Therapie (Radiochemotherapie oder zielgerichtete Therapie) in der Vorgeschichte und eine unterschriebene Einverständniserklärung. Zu den Ausschlusskriterien gehörten eine schlechte Probenqualität mit Nekrose oder Fibrose von mehr als 50 %, das Vorliegen einer gleichzeitigen schweren Infektion oder Autoimmunerkrankung, eine Vorgeschichte anderer bösartiger Erkrankungen und die Verweigerung der Teilnahme durch den Patienten.

1. Vorbereitung des Reagenzes für die Zellkultur

  1. Nährmedium für CRC PDOs: Bereiten Sie das CRC PDOs Complete Medium gemäß der in Tabelle 1 beschriebenen Zusammensetzung vor.
  2. Vollständiges Medium (CM) für TILs16: Ergänzen Sie RPMI1640 Medium mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, HEPES, 2-Mercaptoethanol und 3000 IE/ml IL-2.
  3. TILs-Expansionsmedium (EM): Ergänzen Sie RPMI1640 Medium mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, HEPES und 600 IE/ml IL-2.
  4. AdDMEM++++: Ergänzen Sie Advanced DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % HEPES, 1 % Glutamin und 5 mM Y-27632.
  5. CRC-Verdauungspuffer: Geben Sie 50 μl Kollagenase Typ IV und 10 μl Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Lösung zu AdDMEM++++.
  6. Waschlösung für Gewebe: Geben Sie 2% Penicillin-Streptomycin zu PBS.

2. Verarbeitung von patientenbezogenem Gewebe

  1. Das primäre Darmkrebstumorgewebe resezieren (von erfahrenen Chirurgen durchzuführen). Teilen Sie das Gewebe nach der Entnahme in zwei Teile. Legen Sie ein Teil in AdDMEM++++ in eine Eisbox und transportieren Sie es ins Labor zur Dissoziation und Kultur der Tumorzellen. Den anderen Teil für die histopathologische Analyse in 4%iges Paraformaldehyd legen17.
  2. Matrigel im 4 °C Kühlschrank langsam auftauen. Den Erythrozytenlysepuffer auf Raumtemperatur vorwärmen. Bereiten Sie eine Gewebeschere, eine Pinzette, AdDMEM++++ Medium und CRC-Verdauungspuffer vor.
  3. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale und spülen Sie es dreimal mit 5 mL PBS aus. Ersetzen Sie es durch ein neues Geschirr und spülen Sie es dreimal mit 5 ml Tissue-Waschpuffer aus, um die Kontamination zu minimieren.
  4. Das Gewebe mit einer Schere zerkleinern, in den Verdauungspuffer überführen und in einem 37 °C warmen Wasserbad 30 min bis zur vollständigen Dissoziation inkubieren.
  5. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Gewebeschere ab und geben Sie es in die Gewebeaufschlusslösung. Verdauen Sie das Gewebe in einem 37 °C warmen Wasserbad und überwachen Sie, bis die Dissoziation des Gewebes abgeschlossen ist.
  6. Fügen Sie ein gleiches Volumen AdDMEM++++ hinzu, um die Verdauung zu neutralisieren. Bei 380 × g 5 min bei 25 °C zentrifugieren.
  7. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Beobachten Sie die Anzahl der Erythrozyten im Pellet. 1-3 ml Erythrozytenlysat zugeben und 10 min bei 25 °C inkubieren.
    1. Beenden Sie die Lyse mit einem gleichen Volumen von AdDMEM++++. Bei 380 × g für 5 min bei ca. 25 °C zentrifugieren.
  8. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen AdDMEM++++.
  9. Quantifizieren Sie lebensfähige Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses, um eine Einzelzellsuspension von Tumorgewebe zu erhalten.

3. Etablierung des PDO-Modells und TILs-Kultur

  1. Teilen Sie die einzellige Suspension des Tumorgewebes in zwei Teile auf: Verwenden Sie einen für die Etablierung des PDO-Modells und den anderen für die TILs-Kultur.
  2. Mischen Sie nach der Zellzählung 80.000 Zellen pro Vertiefung der Zellsuspension mit Matrigel im Verhältnis 1:1 für die Etablierung des PDO-Modells.
  3. Resuspendieren Sie die verbleibende Zellsuspension in CM in einer 24-Well-Platte in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml für die TIL-Kultur.
  4. Täglich beobachten. Machen Sie Fotos, um den Status von g.U. und TILs festzuhalten. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.

4. Reinigung und Expansion von TILs

  1. Kultivieren Sie TILs für 10-20 Tage vor der Reinigung.
  2. Sammeln Sie TILs in einem Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Well-Platte mit frischem Medium aus und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen von der Well-Platte.
  3. Zentrifugieren Sie bei 125 × g für 5 min bei ca. 25 °C.
  4. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Mit 2 mL PBS waschen und erneut bei 125 × g für 5 min bei ca. 25 °C zentrifugieren.
  5. Führen Sie eine Zellzählung durch.
  6. Verwenden Sie CD3+ Magnetkügelchen zum Sortieren, um CD3+T-Zellen zu isolieren18.
  7. Inkubieren Sie den Antikörper mit der Zellsuspension bei 4 °C für 10-15 min.
  8. Inkubieren Sie die magnetischen Kügelchen mit der Antikörper-Zell-Suspension bei 4 °C für 10-15 min.
  9. Setzen Sie die Sortiersäule in den Sortiermagneten ein. Geben Sie die Zellsuspension in die Säule und lassen Sie nur die mit magnetischen Kügelchen markierten positiven Zellen in der Sortierspalte zurückhalten.
  10. Entfernen Sie die Sortiersäule aus dem Magnetfeld. Fügen Sie Pufferlösung hinzu, um die in der Säule zurückgehaltenen positiven Zellen zu eluieren. Die Zellen werden in 2 ml PBS resuspendiert und bei 195 × g für 5 min bei etwa 25 °C zentrifugiert.
  11. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte mit frischem EM-Medium in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml. Fügen Sie 5 μg/ml CD3-Antikörper hinzu. Passieren Sie die Zellen alle 3 Tage in neue Kulturflaschen.

5. Histologie und IHC-Charakterisierung von gDOs

  1. Aspirieren Sie das Kulturmedium, nachdem die Organoide auf eine Größe von 50 μm angewachsen sind.
  2. Fixieren Sie die Organoidkugeln direkt in 4% Paraformaldehyd. Die Organoide aspirieren, 5 min bei ca. 25 °C bei 195 × g zentrifugieren, in 2 % Agarose einbetten, aushärten lassen und zur Fixierung über Nacht auf 4 % Paraformaldehyd umfüllen.
  3. Führen Sie am nächsten Tag eine Gradientendehydrierung durch. Bereiten Sie Wachsblöcke vor, schneiden Sie 4-μm-Abschnitte, rehydrieren Sie mit einem Gradienten und führen Sie eine immunhistochemische Färbung mit CK7-, CK20-, Ki-67- und CDX-2-Antikörpern durch.

6. IF-Charakterisierung von TILs

  1. Reinigen Sie die TILs, kultivieren Sie sie, bis eine ausreichende Anzahl erreicht ist, und extrahieren Sie einen Teil zur Charakterisierung.
  2. Charakterisieren Sie die Suspensionszellen mit der Flockenmethode. Stellen Sie die Drehzahl des Zerspaners auf 343 × g für 4 min bei ca. 25 °C ein.
  3. Zählen und säen Sie die Zellen bei 1 × 104 pro Objektträger.
  4. Befestigen Sie die Zellen durch Zentrifugieren fest an den Objektträgern.
  5. Fixieren Sie die Zellen 15 min lang mit 4% Paraformaldehyd und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
  6. Mit Blockierungslösung (PBS mit 2 % FBS) 1 h inkubieren.
  7. Inkubieren Sie mit Primärantikörpern (CD45, CD3, EpCAM) für 1 h bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBS waschen.
  8. Bereiten Sie den Sekundärantikörper vor und inkubieren Sie ihn gemäß der vom Hersteller empfohlenen Konzentration für 1 h bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBS waschen.
    HINWEIS: Achten Sie auf die Antikörper-Homologie.
  9. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei ca. 25 °C mit DAPI.
  10. Betrachten Sie die gefärbten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

7. System der Gemeinschaftskultur von g.U. und TILs

  1. Fügen Sie dem Organoidmedium IFN-γ hinzu, um die Antigenpräsentation zu verbessern. Bei 37 °C mit 5 % CO2 24 h15 inkubieren.
  2. Verdünnen Sie den Anti-CD28-Antikörper mit PBS. Beschichten Sie eine 96-Well-Platte, indem Sie 50 μl der Antikörperlösung in jede Vertiefung geben. Die Platte mit Siegelfolie verschließen und bei 4 °C 24 h inkubieren.
  3. Nach 24 Stunden dissoziieren Sie die Organoide mit TrypLE in einzelne Zellen. Zählen Sie die Zellen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.
  4. Sammeln Sie die gepaarten TILs, zählen Sie die Zellen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.
  5. Organoide werden mit 1 × 104 Zellen pro Vertiefung und TILs mit 1 × 105 Zellen pro Vertiefung inokuliert, um ein Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) von 10:1 für die Co-Kultur zu erreichen.
  6. Führen Sie eine Co-Kultur in RPMI 1640-Medium durch, das mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 3000 U/ml IL-2 und 20 μg/ml Anti-PD-1-blockierendem Antikörper ergänzt wurde. Inkubieren Sie 3 Tage lang und nehmen Sie Bilder zur Beobachtung und Dokumentation auf.
    HINWEIS: Richten Sie Organoide ohne TILs als Kontrollgruppe ein.

8. Funktioneller Assay von TILs mittels Durchflusszytometrie

  1. Sammeln Sie die PDOs und TILs am Ende des Co-Kulturzeitraums.
  2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 300 × g für jeweils 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
  3. Bereiten Sie den Antikörpercocktail vor, der CD3-FITC, CD4-APC/Cyanin7, CD8-APC, CD107a-PE-Cyanin7, CD279-PE und 7-AAD enthält.
  4. Die Zellen werden in 100 μl des Antikörpercocktails resuspendiert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert.
  5. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS.
  7. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse durch. Die detaillierte Analysestrategie finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1 .

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Ergebnisse

Etablierung und Charakterisierung von CRC-g.U.
Tumorproben wurden von Darmkrebspatienten gewonnen. Frisch reseziertes CRC-Tumorgewebe wurde zur Etablierung von PDOs und TILs verwendet, die anschließend in PDO-TIL-Co-Kulturexperimenten eingesetzt wurden (Abbildung 1).

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Abbildung 1: S...

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Diskussion

In dieser Studie wird von Patienten stammendes Darmkrebsgewebe verwendet, um sowohl Tumorzellen als auch TILs zu gewinnen, aus denen PDOs etabliert und TILs erweitert werden. Das Zusammenspiel zwischen diesen beiden Komponenten wird dann durch ein Co-Kultur-System untersucht.

In früheren Studien wurden TILs mit Hilfe komplexer Instrumente19 oder direkt aus Tumorgewebesuspensionen20 extrahiert. Diese Methoden geli...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China [82172822]; Hochrangiges Programm zur Unterstützung von Talentinnovationen des Dalian Science and Technology Bureau [2021RD02]; Gemeinsamer Plan für das Wissenschafts- und Technologieprogramm der Provinz Liaoning [2024JH2/102600067]; Internationales Projekt für wissenschaftliche und technologische Zusammenarbeit der Provinz Liaoning [2024JH2/101900006].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Erweitertes DMEM/F-12Gibco12634028
2-MercaptoethanolSigma63689
4% ParaformaldehydBBIE672002-0100
7-AADBiolegende420403
Nr. A83-01Tocris2939
B27 BeilageGibco17504-44
CD107a-PE-Cyanin7Biolegende328618
CD279-PEBiolegende329906
CD3 monoklonaler Antikörper (OKT3)Invitrogen14-0037-82
CD3-FITCBiolegende300406
CD45 (Intrazelluläre Domäne) (D9M8I) CST13917S
CD4-APC/Cyanin7Biolegende300518
CD8-APCBiolegende344722
CDX-2MXBNr. RMA-0631
CK20MXBBausatz-0025
CK7MXBBausatz-0021
Dylight 488, Anti-Kaninchen-IgG für ZiegenAbbkineNr. A23220
Dylight 549, Anti-Maus-IgG für ZiegenAbbkineNr. A23310
EGFPeprotechAF-100-15
EpCAM (Englisch)CST36746T
Fötales Rinderserum (FBS)CellmaxSA211.02
FGF 10Peprotech100-26
Gastrin (Mensch)Tocris3006
GlutaMax 100xGibco35050-061
HepesSigmaNr. H4034
HEPESSigmaNr. H4034
Humanes CD3+-Zellseparationskit (RUO)RWDNr. K1201-10
Humanes rekombinantes IFN-gamma-ProteinPeproTech300-02-20UG
Ki-67CST9449er
MatrigelCorning354234
N-AcetylcysteinSigmaNr. A9165
NicotinamidSigmaNr. N0636
Nivolumab (Anti-PD-1)SellerkA2002 
Penicillin/StreptomycinSigmaV900929
Penicillin-StreptomycinNCM BiotechC100C5
PrimocinInvivogenAmeisen-pm-1
RBC-Lyse-PufferThermo-Invitrogen00-4300-54
Rekombinantes humanes IL-2 (trägerfrei)Biolegende589104
RPMI 1640Gibco
SB202190SellerkNr. S1077
Trypanblaue Beize 0,4 %Thermo-InvitrogenNr. T10282
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Human-CD28-AntikörperBiolegende302934
Ultra-LEAF Aufgereinigter Anti-Human-CD3-AntikörperBiolegende317325
Nr. Y-27632SellerkNr. S1049

Referenzen

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