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Methodenartikel

Effiziente Techniken für eine umfassende Probenahme von zugänglichem Gewebe bei adulten Xenopus

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DOI:

10.3791/68353

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10. Juni 2025

 ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dies ist der erste Teil eines umfassenden Xenopus-Sampling-Protokolls. Bei den entnommenen Geweben handelt es sich um den Herzventrikel, den arteriellen Stamm, den linken Leberlappen, die Gallenblase, die Lunge, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, den Kehlkopf, den Kehlkopf, die Speiseröhre, den Magen, den Darm, die Hoden, die Fettkörper, den Eileiter, die paarigen Nieren, den Ischiasplexus, die Haut, den Thymus und das ganze Auge.

Zusammenfassung

Xenopus ist seit langem ein zentraler Modellorganismus für die Erforschung der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren und bietet tiefe Einblicke in zelluläre Prozesse und Genfunktionen. Trotz der Fülle an Informationen über embryonale Xenopus gibt es nach wie vor eine erhebliche Lücke bei standardisierten Methoden für die Probenahme von adultem Gewebe, insbesondere bei modernen Ansätzen wie der quantitativen Proteomik. Diese Studie stellt ein umfassendes Protokoll für die schnelle, präzise und effiziente Probenahme mehrerer Gewebe bei adulten Xenopus vor. Das Protokoll befasst sich mit den Herausforderungen, die mit den subtilen anatomischen Unterschieden im Vergleich zu anderen Anuren verbunden sind, und gewährleistet die Reproduzierbarkeit auch für diejenigen mit begrenzter Erfahrung in der Froschdissektion. Dieses Protokoll ist für qualitativ hochwertige biochemische Analysen optimiert, indem die Frische der Probe im Vordergrund steht. Wir ermöglichen die schnelle Entnahme von bis zu 18 Geweben innerhalb einer Stunde. Darüber hinaus gelten die Methoden für perfundierte und nicht perfundierte Bedingungen, was Flexibilität für eine Reihe von experimentellen Anforderungen bietet. Diese Arbeit schließt nicht nur eine kritische methodische Lücke für Xenopus laevis und tropicalis , sondern dient auch als wertvolle Ressource für Forscher, die Techniken an ähnliche Amphibienmodelle anpassen und dadurch den Umfang und die Zuverlässigkeit vergleichender biologischer und evolutionärer Studien verbessern.

Einleitung

Xenopus bietet einzigartige Vorteile gegenüber Mäusen, Zebrafischen und anderen Modellorganismen bei der Erforschung menschlicher Krankheiten, insbesondere in entwicklungs- und evolutionären Kontexten. Die äußere Embryonalentwicklung und die großen, leicht manipulierbaren Embryonen ermöglichen Echtzeitbeobachtungen und experimentelle Eingriffe (z. B. Gewebetransplantation, Geneditierung), die bei Mäusen, die sich intern entwickeln und invasive Eingriffe erfordern, eine Herausforderung darstellen. Darüber hinaus stellen die dreikammerigen Herz- und Tetrapodengliedmaßen von Xenopus eine direktere evolutionäre Brücke für die Untersuchung angeborener Defekte1, der Regeneration der Gliedmaßen2 und der Herzentwicklung3 dar. Im Gegensatz zu Mäusen können Xenopus-Kaulquappen Gliedmaßen und Organe regenerieren und so regenerative Prozesse modellieren, die bei Säugetieren fehlen, während ihr aquatisches Lebensstadium eine nicht-invasive Untersuchung der Auswirkungen von Umwelt- oder Toxinen ermöglicht. In Kombination mit schnellerer Züchtung, niedrigeren Kosten und weniger ethischen Einschränkungen ist Xenopus überlegen für mechanistische Hochdurchsatzstudien der Organogenese und Stressreaktionen, die in Säugetiersystemen schwer zu replizieren sind.

Diese Arbeit zielt darauf ab, eine klare Anleitung für eine präzise und reproduzierbare Organprobenahme von adulten Xenopus-Geweben zu bieten, wie sie für Xenopus-Kaulquappen verfügbar ist4. Es gibt zwar eine "digitale Dissektion"5 und eine "Mikro-CT-Bildgebung"6 von adulten Xenopus, aber ohne die detaillierten Anweisungen, die für andere adulte Modelle, wie z. B. Mäuse, wie z. B. Mäuse, bereitgestellt werden, bleibt es schwierig, eine konsistente Organ- und Gewebeprobenahme bei adulten Xenopus zu erreichen 7,8,9.

Obwohl ein Probenleitfaden für sechs wichtige Gewebe verfügbar ist10, ist derzeit kein spezifischer und umfangreicher Dissektions- und Probenahmeleitfaden für Xenopus verfügbar. Für Rana sp.11 existiert ein umfassender Präparierleitfaden und für andere Anuren12 sind verschiedene Präparierhandbücher für den Unterricht verfügbar. Für Personen, die in Probenahmetechniken oder Amphibienanatomie unerfahren sind, machen die feinen Unterschiede zwischen Xenopus und anderen Anuren die vorhandenen Ressourcen für eine konsistente und replizierbare Gewebeentnahme jedoch unzureichend.

Dieser Leitfaden wurde entwickelt, um die Frische des Gewebes für die Proteomik und Immunchemie zu priorisieren. Für einen erfahrenen Benutzer können alle Gewebe in weniger als einer Stunde von einer Person entnommen werden. Es wird empfohlen, dass ein Benutzer, wenn er keine Erfahrung hat, dieses Protokoll an Proben ausprobiert, die aus anderen Gründen eingeschläfert wurden, bevor er ein Tier opfert, das schwieriger zu ersetzen ist.

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Protokoll

Alle Versuche wurden von der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3) genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt. Wenn das Perfusionsprotokoll13 vor der Probenahme befolgt wird, fahren Sie mit Schritt 2.3 fort.

1. Zubereitung (ohne Perfusion)

  1. Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasietechnik genehmigt hat.
  2. Eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricain-Methansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat herstellen (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.
    HINWEIS: Das Volumen muss größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig abzudecken.
  3. Führen Sie die primäre Euthanasie durch, indem Sie den Xenopus in die MS-222-Lösung legen (aus Schritt 1.2) und das Tier insgesamt 1 h14 unter Wasser halten.
  4. Legen Sie die Sezierfläche (Schale oder Schaumstoffplatte) schräg in einen Sekundärbehälter oder ordnen Sie ihn anderweitig an, um den Blutabfluss zu erleichtern.
  5. Sobald sich der Frosch 1 Stunde lang in der Lösung befunden hat, ist die primäre Sterbehilfe abgeschlossen. Entfernen Sie den Strahl und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion, indem Sie einen Fuß kneifen.
  6. Notieren Sie das Alter (falls bekannt), das Geschlecht und den Gesundheitszustand des Tieres, das beprobt wird, sowie die Frage, ob es perfundiert wurde. Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie alle zusätzlichen Messungen vor, die vor der Probenahme erforderlich sind.
  7. Setzen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie die Vordergliedmaßen proximal zum Körper fest (Abbildung 1A).
  8. Schneide mit einer Präparierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, wobei du zwei Lappen machst.
  9. Identifizieren Sie die Linea alba (Abbildung 1B). Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Zölomhöhle weg. Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere in Richtung Kopf, durch die Muskulatur. Machen Sie zwei Laschen aus der Hohlwand und schneiden oder stecken Sie alle Laschen aus dem Weg.
  10. Identifiziere das Herz, das noch schlagen sollte. Wenn das Herz nicht leicht zugänglich ist, verwenden Sie eine Präparierschere, um die Coracoide-Knochen zu verkleinern (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Wenn das Herz vor der Probenahme aufgehört hat zu schlagen, ist die Frische der Probe beeinträchtigt.
  11. Falls gewünscht, führen Sie das Schnellperfusionsprotokoll9 aus.

2. Probenahme

HINWEIS: Wenn das Tier perfundiert wurde, fahren Sie mit Schritt 2.3 fort. Alle Ränder sollten ca. 25 mm betragen. Pinzette und Schere sollten zwischen den Proben abgewischt oder ausgetauscht werden. Alle Gewebe sollten innerhalb von 1 h nach der Euthanasie entnommen werden, um maximale Frische zu gewährleisten.

  1. Spülen Sie die Zölomhöhle mit einer Transferpipette mit gekühltem PBS oder 0,7x PBS15 , um das Blut zu reinigen und die Sicht zu erhalten.
  2. Identifizieren Sie das dünne Perikard (Abbildung 2A) und ziehen Sie es mit einer Gewebezange straff. Perforieren Sie sie vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu durchtrennen. Schälen Sie das Perikard von den drei Kammern des Herzens ab (Abbildung 2B).
  3. Schneiden Sie die Ohrmuscheln ab, indem Sie sie dort abschneiden, wo sie auf den Ventrikel und den Arterienstamm treffen.
  4. Fassen Sie den Ventrikel mit einer Pinzette an der Spitze und schneiden Sie ihn unterhalb der Stelle, an der er auf den Arterienstamm trifft, so dass ein Rand übrig bleibt (Abbildung 2C).
  5. Überprüfen Sie den Ventrikel visuell unter Vergrößerung, um sicherzustellen, dass kein unerwünschtes Gewebe anhaftet.
    HINWEIS: Die Mitte des Ventrikels kann helles Spiralklappengewebe enthalten; Dies darf beibehalten werden. Bei nicht durchbluteten Tieren kann die Entfernung des Ventrikels als sekundäre Euthanasie (auch terminale Anästhesie genannt) gelten.
  6. Unmittelbar nach der Probenahme werden die Gewebeproben je nach experimentellem Bedarf in gekühltem PBS oder 0,7x PBS gespült15.
    HINWEIS: Bei durchbluteten Tieren wird erwartet, dass alle Gewebe mit Ausnahme der Leber sauber gespült werden. Ist dies nicht der Fall, sollte eine Notiz gemacht werden. In nicht durchbluteten Geweben sind alle Spülmedien mit Blut gesättigt. Die Schritte 2.5 bis 2.6 sollten nach der Entnahme jedes Gewebes befolgt werden.
  7. Es ist zu beobachten, dass sich der arterielle Truncus in zwei Aortenstämme (auch Aorten lateralis genannt) gabelt und dass sich jeder in drei arterielle Bögen aufteilt (Abbildung 2D). Ziehen Sie den arteriellen Stamm straff und schneiden Sie die Aortenstämme unmittelbar nach der Teilung dieser Bögen ab.
  8. Beobachten Sie die drei Leberlappen (Abbildung 3A). Fassen Sie die Lippe des linken Lappens (auf der rechten Seite des Betrachters) und heben Sie sie vorsichtig an, so dass die Leber- und Zystengänge sichtbar sind. Nehmen Sie Proben aus den unteren 2/3 des Lappens unterhalb dieser Ansätze (Abbildung 3B).
  9. Identifiziere die Gallenblase, deren Farbe drastisch variieren kann. Fassen Sie die Gallenblase, ziehen Sie sie vom rechten Leberlappen weg und durchtrennen Sie ihren Ansatz (Abbildung 3C). Wenn es nicht platzt, dann zerreißen Sie es mit einer Iridektomieschere.
  10. Fassen Sie die Spitze der Lunge und ziehen Sie sie straff. Notiere dir die Textur der Lungenbläschen und bestimme, wo diese Textur endet und der Bronchus beginnt. Schneiden Sie an diesem Rand ab (Abbildung 3D). Wenn die Lunge mit dem Bauchfell verschmolzen ist, lösen Sie sie vorsichtig.
  11. Identifiziere den Eierstock, der von einer Schicht aus viszeralem Peritoneum umhüllt ist, die als Keimepithel bezeichnet wird. Verschieben Sie die Lappen vorsichtig, bis sie auf den jeweiligen Seiten liegen, um den Befestigungsbereich sichtbar zu machen (Abbildung 4A). Diese Ansätze befinden sich direkt ventral der paarigen Niere. Entfernen Sie die Eierstöcke mit einer Schere so nah wie möglich an den Nieren, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 4B). Wenn während dieses Prozesses Eizellen austreten, nehmen Sie Proben und spülen Sie sie dann ab.
    HINWEIS: Die Entfernung des Eierstocks ist hilfreich, um einen besseren Zugang zum Gewebe eines weiblichen Frosches zu erhalten.
  12. Untersuchen Sie den vorderen Lappen (auch Medianlappen genannt) der Leber und beachten Sie, wie er durch das Mesenterium mit dem Magen und dem Zwölffingerdarm verbunden ist (Abbildung 3A und Abbildung 4C). Durchtrennen Sie das Mesenterium und das hepatoduodenale Band mit einer Iridektomieschere. Die verbleibende fleischige Masse besteht aus der Bauchspeicheldrüse und dem Gallengang.
  13. Durchtrennen Sie die Verbindung der Bauchspeicheldrüse und des Gallengangs communis mit dem vorderen Leberlappen und lassen Sie einen Rand übrig. Fassen Sie den Magen mit einer Zahnzange und ein Ende der Bauchspeicheldrüse mit einer Gewebezange. Unter Vergrößerung die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Magen abziehen (Abbildung 4D).
    1. Sollte sich die Bauchspeicheldrüse nicht sauber lösen, entfernen Sie das restliche Bauchspeicheldrüsengewebe. Alternativ können Sie die Bauchspeicheldrüse methodisch mit einer Iridektomieschere und einer Gewebezange lösen.
      HINWEIS: Es wird erwartet, dass neben dem Gallengang communis auch einige Mesenterien und der Pankreasgang in diese Probe einbezogen werden.
  14. Identifizieren Sie die Milz und entnehmen Sie eine Probe, indem Sie ihren Ansatz am Peritoneum durchtrennen (Abbildung 4E).
  15. Entfernen und entsorgen Sie das restliche Lebergewebe.
  16. Entferne die andere Lunge und den restlichen Bronchus an der Stelle, an der sie am Kehlkopf ansetzen. Fassen Sie den Kehlkopf an seinem unteren Ende und beginnen Sie, ihn aus der Höhle zu heben, wobei Sie klare Befestigungen durchtrennen, wenn sie sichtbar werden.
  17. Wenn der Kehlkopf angehoben wird, macht sich seine Befestigung an der Speiseröhre bemerkbar. Schälen Sie das Speiseröhrengewebe vorsichtig und schneiden Sie es mit einer gebogenen Iridektomieschere vom Kehlkopf ab (Abbildung 5A). Ziehen Sie dann den Kehlkopf nach unten und schneiden Sie ihn von der Mundhöhle weg. Schneiden Sie alle durchsichtigen Anhänge ab, die sichtbar werden.
  18. Beachten Sie die Krümmung des Magens, die ihn von der Speiseröhre unterscheidet, sowie die Pylorusrestriktion, die den Magen vom Darm unterscheidet (Abbildung 5B). Schneiden Sie den Verdauungskanal unmittelbar vor der Magenkrümmung und trennen Sie ihn von der Speiseröhre.
  19. Öffnen Sie die Mündung und identifizieren Sie die gemeinsame Öffnung der Eustachischen Röhren auf ihrem Dach16. Ziehen Sie bei geöffnetem Mund an der Speiseröhre, um ihren Ansatz zu notieren (Abbildung 5C). Hebe die Speiseröhre aus der Höhle und durchtrenne dabei die durchsichtigen Ansätze. Trennen Sie die Speiseröhre von der Mundhöhle unmittelbar unter der eustachischen Öffnung.
  20. Fassen Sie den Magen und schneiden Sie ihn dort, wo er auf den Zwölffingerdarm trifft, an der Pylorusrestriktion (Abbildung 5A,B).
  21. Ziehen Sie den Dickdarm straff und schneiden Sie ihn so nah wie möglich an der Kloake ab (Abbildung 5D). Ziehe den Darm heraus und durchtrenne alle durchsichtigen Peritonealansätze.
  22. Wenn es sich um einen männlichen Frosch handelt, identifizieren Sie die Hoden und entfernen Sie einen Hoden mit einer Iridektomieschere, wobei Sie darauf achten müssen, die darunter liegende Niere nicht zu beschädigen (Abbildung 6A).
  23. Toupieren Sie die Fettkörper auseinander, so dass sie auf ihren jeweiligen Seiten liegen; Der Bereich über der Niere, wo der Fettkörper mit dem Bauchfell verbunden ist, wird sichtbar sein. Fassen Sie die Basis eines der Fettkörper und schneiden Sie sie mit einer Schere vom Bauchfell ab, wobei Sie einen Spielraum lassen (Abbildung 6B).
  24. Identifizieren und entfernen Sie die Harnblase, indem Sie so nah wie möglich an der Kloake schneiden (Abbildung 6C).
  25. Wenn der Frosch weiblich ist oder einen ausgeprägten verkümmerten Eileiter hat, fassen Sie das untere Ende des Eileiters, ziehen Sie es von der Kloake weg und schneiden Sie es so nah wie möglich an der Kloake ab (Abbildung 6D). Ziehen Sie den Eileiter aus der Zölomhöhle und durchtrennen Sie alle peritonealen Ansätze, sobald sie sichtbar werden (Abbildung 6E).
  26. Entfernen und entsorgen Sie die verbleibenden Fettkörper und Hoden oder Eileiter.
  27. Fassen Sie die Nieren mit einer Pinzette an ihrer unteren Basis und beachten Sie, dass sie vom klaren Peritoneum (retroperitoneal) bedeckt sind17. Durchtrennen Sie das Peritoneum an der Basis der Niere (Abbildung 7A) und heben Sie dann die Nieren aus der Zölomhöhle (Abbildung 7B) an, wobei Sie das Peritoneum bei Bedarf mit einer Schere durchtrennen.
  28. Schneiden Sie unter Vergrößerung überschüssiges Peritoneum und restliches Fettkörper-, Eierstock- oder Hodengewebe weg.
  29. Beobachten Sie das Bündel peripherer Nerven, das den Endpunkt der Wirbelsäule an jedem Bein befestigt; Dies ist der Ischiasplexus. Fassen Sie das Nervenbündel mit einer Pinzette und durchtrennen Sie es an der Stelle, an der es aus der Zölomhöhle austritt (Abbildung 7C). Heben Sie das Bündel aus der Kavität und schneiden Sie es an der Stelle, an der die Nerven die Wirbelsäule verlassen (Abbildung 7D).
  30. Entferne die Stifte vom Tier, drehe es auf sein Ventrum und stecke die Gliedmaßen des Tieres wieder fest. Wählen Sie eine der hinteren Gliedmaßen aus, aus der die Probe entnommen werden soll, und stecken Sie den Fuß dieser Gliedmaße fest.
  31. Entfernen Sie einen mandelförmigen Hautlappen über dem Gastrocnemius/Tibiofibula (Abbildung 8A,B).
  32. Fassen Sie die Haut des Rückens und schneiden Sie seitlich ein, so dass um die Körpermitte des Tieres ein durchgehender Schnitt entsteht (Abbildung 8C).
  33. Entfernen Sie die Stifte, befestigen Sie die Beine in einer Hand und fassen Sie die vordere Rückenhaut mit einer Zahnzange an. Häuten Sie das Tier, indem Sie die Rückenhaut mit Gewalt über Kopf und Arme nach oben ziehen (Abbildung 8D).
  34. Identifizieren Sie die Fettmasse, die das Kiefergelenk bedeckt, trennen Sie den hinteren Rand der Masse, von der aus sie mit rosa Muskelgewebe verschmolzen ist, und schneiden Sie sie dann mit einer Iridektomieschere vom darunter liegenden Knochen ab (Abbildung 9A). Abhängig vom Alter und der Reife des Tieres wird eine Häufung von Melanophoren sichtbar (Abbildung 9B). Schneiden Sie die Masse so ab, dass keine Muskelansätze oder Knorpel anhaften.
  35. Stecke das Tier fest und wähle ein Auge aus. Führen Sie eine gebogene Iridektomieschere in die Augenhöhle um die Krümmung des Auges ein (Abbildung 9C). Schneiden Sie sanft um das Auge herum und durchtrennen Sie die Muskelansätze.
  36. Schieben Sie die Schere tiefer in die Augenhöhle und lösen Sie den Sehnerv hinter dem Auge. Verwenden Sie diese Schere, um das Auge aus der Augenhöhle zu entfernen und dann alle muskulären Ansätze weiter zu reduzieren.

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Ergebnisse

Durch Befolgung aller Schritte dieses Protokolls wurden der Herzventrikel, der arterielle Rumpf, der linke Leberlappen, die Gallenblase, die Lunge, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, der Kehlkopf, die Speiseröhre, der Magen, der Darm, die Hoden, die Fettkörper, der Eileiter, die paarigen Nieren, der Ischiasplexus, die Haut, der Thymus und das ganze Auge innerhalb einer Stunde nach der Euthanasie sauber herausgeschnitten (siehe Abbildung 1, Abbildung 2,

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll ist so konzipiert, dass es Anwendern auf verschiedenen Erfahrungsstufen Flexibilität bietet und gleichzeitig die rechtzeitige und effiziente Entnahme von essentiellem Gewebe gewährleistet. Neuen Anwendern wird empfohlen, jeden Schritt des Protokolls wie beschrieben zu befolgen, um eine systematische Gewebeentnahme zu gewährleisten. Erfahrenere Benutzer können sich jedoch dafür entscheiden, bestimmte Schritte zu überspringen und nur das Gewebe zu entnehmen,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant ODO31956 des NIH unterstützt. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert und Jill Ralston für ihre Hilfe und Unterstützung bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x PBS Corning21-040-CV
5x Lupe mit LED-Licht und Stativamazon.comB08QJ6J8P1 Licht darf keine Hitze erzeugen
Einweg-TransferpipettenVWR414004-036
Präparierzange mit feinerSpitze Fisher Scientific08-875
Präparierschere scharfer Piont, gerade 6,5"VWR76457-374
SezierschaleFisher Scientific14-370-284Styroporplatten sind eine akzeptable Alternative
Euthanasie-BehälterUS Plastic Artikel  2860alternative undurchsichtige Behälter akzeptabel
Euthanasie-BehälterdeckelUS Plastic Artikel  3047
Iridektomie-Schere 6"VWR470018-938Irisschere ist eine akzeptable Alternative
MS-222: Syncain (ehemals Tricain)Pentair AESTRS1
Rattenzahnzange 5,5 Zoll, EdelstahlFisher ScientificS08100
Natriumbicarbonat, Pulver, USPFisher Scientific18-606-333
Probenzange, gezahntVWR82027-442
T-Stifte zum PräparierenFisher ScinetificS99385

Referenzen

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