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Verabreichung von δ-9-Tetrahydrocannabinol (THC) bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen

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DOI:

10.3791/68358

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1. August 2025

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1Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Δ-9-Tetrahydrocannabinol (THC) ist der berauschende Bestandteil von Cannabis und in den Vereinigten Staaten eine kontrollierte Substanz. In diesem Artikel werden Standardverfahren für die Gewinnung, Lagerung und Verabreichung von THC an Mäuse beschrieben, die den geltenden gesetzlichen Vorschriften entsprechen, und es wird kurz eine Methode zur Beurteilung der grundlegenden pharmakodynamischen Wirkungen von THC bei Nagetieren vorgestellt.

Zusammenfassung

Δ-9-Tetrahydrocannabinol (THC) ist verantwortlich für die berauschende (psychotrope) Wirkung von Cannabis und aus Cannabis gewonnenen Produkten, die derzeit auf dem legalen und illegalen Markt erhältlich sind. Die psychotropen Wirkungen von THC werden durch die Aktivierung von CB1-Cannabinoidrezeptoren im Gehirn hervorgerufen, die normalerweise von endogenen Cannabinoid-Substanzen (Endocannabinoiden) aktiviert werden. Außerhalb des Gehirns trägt THC zur Regulierung einer Vielzahl physiologischer Prozesse bei, indem es die CB1- und CB 2-Rezeptoren aktiviert. Die physiologischen Funktionen, die von Endocannabinoid-Substanzen und Cannabinoid-Rezeptoren erfüllt werden - zusammen als Endocannabinoid-System bekannt - verändern sich im Laufe des Lebens erheblich, wobei die Adoleszenz eine Zeit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber den Beiträgen dieses Signalkomplexes ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung von THC für die parenterale Verabreichung und zur Bewertung seiner akuten pharmakodynamischen Wirkungen bei Mäusen beiderlei Geschlechts in zwei Entwicklungsstadien: Jugend und junges Erwachsenenalter. Anhand von drei Dosen, die in der Literatur weit verbreitet sind (1, 5 und 10 mg/kg) und dem intraperitonealen Weg, werden die bekannten Wirkungen der THC-Katalepsie-Induktion, der Hemmung der Bewegungsaktivität und der Unterdrückung der Nozizeption veranschaulicht. Angesichts des Status von THC als kontrollierte Substanz in den Vereinigten Staaten werden die Verfahren für die Gewinnung und Lagerung in Übereinstimmung mit den geltenden Rechtsvorschriften kurz beschrieben.

Einleitung

Die Prävalenz des Cannabiskonsums in der erwachsenen Bevölkerung der Vereinigten Staaten ist in den letzten Jahrzehnten kontinuierlich gestiegen und blieb auch im Jahr 2023 hoch. Von den Erwachsenen im Alter von 19 bis 30 Jahren gaben etwa 42 % an, im vergangenen Jahr Cannabis konsumiert zu haben, 29 % im letzten Monat und 10 % gaben an, täglich oder quasi täglich Cannabis konsumiert zu haben (20 oder mehr Mal in den letzten 30 Tagen)1. Bei Erwachsenen im Alter von 35 bis 50 Jahren liegen die Zahlen bei 29 %, 19 % bzw. 8 %. Obwohl sich diese Schätzungen statistisch nicht von denen aus dem Jahr 2022 unterscheiden, deuten sie auf einen Anstieg in den letzten 5 und 10 Jahren für beide demografischen Gruppenhin 1. Wichtig ist, dass aktuelle Erkenntnisse darauf hindeuten, dass etwa 9 % der Menschen, die Cannabis konsumieren, eine Toleranz und Abhängigkeit von der Droge entwickeln - eine Erkrankung, die als Cannabiskonsumstörung (SUD)2 bekannt ist und ein potenzielles Gesundheitsrisikodarstellt 3.

Wie bei anderen psychoaktiven Drogen beginnt der Cannabiskonsum in der Regel in den frühen Teenagerjahren und nimmt im Laufe der Jugend allmählich zu. Im Jahr 2023 gaben 8 % der Achtklässler in den Vereinigten Staaten, 18 % derZehntklässler und 29 % derZwölftklässler an, die Droge mindestens einmal konsumiert zu haben4. Obwohl diese Zahlen in den letzten Jahren relativ stabil geblieben sind, bleiben sie trotz einer geringeren Risikowahrnehmung 5,6 zu hoch. Zusätzlich zu seiner weit verbreiteten nicht-medizinischen Verwendung hat Cannabis therapeutisches Potenzial bei einer Reihe von Erkrankungen gezeigt 7,8. Eine synthetische Form seines berauschenden (psychotropen) Bestandteils, Δ-9-Tetrahydrocannabinol (THC) (Abbildung 1), wird seit mehr als 40 Jahren als verschreibungspflichtiges Medikament zur Behandlung von Übelkeit und Appetitlosigkeit bei HIV- und Krebspatienten verwendet, die sich einer Chemotherapie unterziehen 9,10. Sowohl THC als auch sein Analogon Cannabidiol (CBD) (Abbildung 1), das nicht psychotrop ist, wurden mit der Behandlung von Schmerzen, Entzündungen und verschiedenen neurologischen Störungen in Verbindung gebracht11,12. Daher führt die rasche Verbreitung von aus medizinischem Cannabis gewonnenen Produkten - z. B. bei Epilepsie und Autismus im Kindesalter - auch dazu, dass neue Gruppen junger Menschen mit der Droge in Berührung kommen. Diese Entwicklungen sind besonders besorgniserregend in einem sozialen Kontext, in dem Gesetzesänderungen und eine breitere Akzeptanz finanzielle Interessen schüren, die über Belange der öffentlichen Gesundheit und Sicherheit hinausgehen können13.

THC-haltiges Cannabis ("Marihuana") wird in verschiedenen Formen konsumiert, darunter Rauchen, Verdampfen, Esswaren, Tinkturen und Öle. Nach der Einnahme verteilt sich THC im ganzen Körper und gelangt in das Gehirn, wo es Euphorie, Entspannung, veränderte Sinneswahrnehmung und gesteigerten Appetit hervorruft, obwohl es bei manchen Personen auch Angstzustände und Paranoia verursachen kann14,15. THC interagiert mit dem Endocannabinoid (ECB)-System, indem es zwei Arten von Cannabinoid (CB)-Rezeptoren aktiviert, die sich sowohl innerhalb als auch außerhalb des Gehirns befinden15,16. Im Gehirn, woCB-1-Rezeptoren am häufigsten vorkommen, beeinflusst ihre Aktivierung unter anderem die Stimmung, die Schmerzwahrnehmung, den Appetit und die Kognition. THC aktiviert auch CB1- und CB 2-Rezeptoren in peripheren Organen und beeinflusst den systemischen Energiestoffwechsel - einschließlich Nährstoffaufnahme, -absorption und -speicherung - sowie die Schmerzauslösung, Entzündung und Immunität17,18.

THC übt sowohl akute als auch anhaltende Wirkungen aus, und es sind noch zusätzliche präklinische und klinische Untersuchungen zu den Langzeitfolgen des Cannabiskonsums erforderlich. Besonderes Augenmerk sollte auf die möglichen Nebenwirkungen von hochdosiertem THC gelegt werden, wenn man bedenkt, dass die durchschnittliche THC-Konzentration in dem in den Vereinigten Staaten verkauften Cannabis in den letzten Jahrzehnten von 8,9 % im Jahr 2008 auf 17,1 % im Jahr 201719 und in den letzten Jahren sogar noch gestiegen ist. "Hochpotente Cannabisprodukte" (Produkte, die hohe THC-Konzentrationen enthalten) sind auf vielen legalen Märkten in den Vereinigten Staaten üblich, wo der durchschnittliche THC-Gehalt in Cannabisblüten 20-35% beträgt, wobei einige extraktive Produkte bis zu 90% THC erreichen. Bei diesen hohen Dosierungen kann THC qualitativ andere Wirkungen haben als das traditionelle "niedrig potente Cannabis", das in den 1970er und 1980er Jahren verwendet wurde und 6% THC oder weniger enthielt20. Daher ist das Verständnis der Pharmakologie von hochwirksamen Cannabisprodukten von entscheidender Bedeutung, um Präventionsstrategien zu informieren und die Regulierungs- und Finanzpolitik zu leiten. Darüber hinaus kann das Verständnis, wie Faktoren wie Alter, Genetik und Vorerkrankungen die individuellen Reaktionen auf THC beeinflussen, dazu beitragen, Prävention und Behandlung auf bestimmte Bevölkerungsgruppen zuzuschneiden. Insbesondere sollten die Folgen des Cannabiskonsums von Teenagern und werdenden oder stillenden Müttern weiter untersucht werden, da die Cannabinoidexposition während der pränatalen/perinatalen und jugendlichen Phase, in der das EZB-System eine Schlüsselrolle für die neurologische Entwicklung spielt, zu anhaltenden negativen Folgen führen könnte21. Außerdem ist mehr Forschung erforderlich, um zu verstehen, wie THC mit anderen Medikamenten oder Substanzen interagiert. Umfassende Daten über die Sicherheit und Wirksamkeit von THC können regulatorische Entscheidungen und Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit beeinflussen und eine sichere Verwendung sowohl im medizinischen als auch im nicht-medizinischen Kontext gewährleisten.

Hier skizzieren wir Standardverfahren für die Gewinnung, Lagerung und Verabreichung von THC in einer Laborumgebung in Übereinstimmung mit der aktuellen Gesetzgebung der Vereinigten Staaten (dem Controlled Substance Act von 1971). Anhand von drei THC-Dosen, die in der wissenschaftlichen Literatur weit verbreitet sind (1, 5 und 10 mg/kg)22 und dem intraperitonealen (i.p.) Verabreichungsweg, wurden drei klassische Wirkungen auf THC veranschaulicht: Induktion von Katalepsie, Hemmung der Bewegungsaktivität und Antinozizeption. Dieses Protokoll kann auch nach mehreren THC-Injektionen verwendet werden, um die Folgen des chronischen THC-Konsums zu untersuchen, der zu Toleranz und einer Reihe von Folgen für die psychische Gesundheit führt, die bei akuter Verabreichung beim Menschen normalerweise nicht beobachtet werden.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der IACUC der University of California, Irvine, genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

1. Verfahren zur Gewinnung und Lagerung von THC

HINWEIS: In den Vereinigten Staaten erfordert die Verwendung von THC in einer akademischen Forschungsumgebung die Befolgung mehrerer Schritte, die vom rechtlichen Status von Cannabis verlangt werden. Sowohl Cannabis als auch aus Cannabis gewonnenes THC werden als kontrollierte Substanzen der Liste I eingestuft. Aus diesem Grund müssen Forscher, bevor Cannabis oder THC gekauft werden können, eine Lizenz der Drug Enforcement Administration (DEA) einholen. Einen Überblick über diesen Prozess, der bis zu 6 Monate oder länger dauern kann, finden Sie im Folgenden.

  1. Bestimmung des Forschungsumfangs: Definieren Sie den Zweck und die Ziele des Forschungsprozesses und geben Sie an, warum THC notwendig ist. Entwickeln Sie ein Forschungsprotokoll, in dem die benötigten Mengen an THC, seine kommerzielle Quelle und die Art und Weise, wie es gehandhabt und gelagert wird, detailliert aufgeführt sind. Fügen Sie so viele relevante Details wie möglich hinzu.
  2. Erhalt der institutionellen behördlichen Genehmigung: Reichen Sie den Forschungsvorschlag beim Animal Care and Use Committee (IACUC) (für vorklinische Arbeiten) oder beim Institutional Review Board (IRB) (für klinische Arbeiten) der lokalen Institution ein. Dieser Überprüfungsschritt schützt die Rechte der Probanden und stellt sicher, dass die Studie ethischen Standards entspricht.
  3. Einhaltung staatlicher Vorschriften: Achten Sie auf alle länderspezifischen Vorschriften in Bezug auf die Cannabisforschung, da diese erheblich variieren können. Holen Sie beispielsweise in Kalifornien die Genehmigung des Research Advisory Panel of California (RAPC)23 ein.
  4. Gewinnung von THC: Kaufen Sie Cannabis und THC von Züchtern oder Herstellern, die für diesen Zweck lizenziert sind.
    HINWEIS: Eine Liste der zugelassenen Anbauer finden Sie auf der Website der DEA. Das National Institute on Drug Abuse (NIDA) stellt THC über das NIDA Drug Supply Program24 zur Verfügung. Um sich für dieses Programm zu bewerben, müssen Informationen über eine Institution, ein detailliertes Forschungsprotokoll und die Dokumentation institutioneller Vorschriften wie IACUC- oder IRB-Genehmigungsschreiben bereitgestellt werden. Das Ausfüllen des DEA-Formulars 222, bei dem es sich um das einseitige Formular handelt, das speziell für jede DEA-Registrierungsnummer bestimmt ist, ist für den Kauf oder die Übertragung von kontrollierten Substanzen der Liste 1 erforderlich.
  5. Empfangen und Aufbewahren von THC
    1. Bewahre THC in einem sicher verschlossenen Safe oder Tresor auf, der einem von der DEA genehmigten Design folgt. Der Zugang zum Forschungsbereich sollte kontrolliert werden (z. B. sollten die Türen des Gebäudes und/oder des Labors verschlossen sein). Nur autorisiertes Personal sollte Zugang zu THC haben.
    2. Bereiten Sie eine Liste der Personen vor, die darauf zugreifen dürfen, und legen Sie sie fest, und halten Sie die Liste auf dem neuesten Stand. Beschriften Sie THC-Behälter deutlich mit Name, Konzentration, Empfangsdatum und Gefahrenwarnungen.
    3. Befolgen Sie die etablierten Entsorgungsverfahren, die eine spezifische Dokumentation und die Einhaltung von Bundes- und Landesvorschriften erfordern. Halte THC bei oder unter -20 °C.
  6. Bestandsverwaltung:
    1. Implementieren Sie ein robustes Inventarsystem, um die Menge, den Verbrauch und den Standort des THC zu verfolgen. Bereiten Sie ein Bindemittel für kontrollierte Substanzen vor, das eine Lizenz nach Anhang 1, autorisierte Personalinformationen, Aufzeichnungen über alle Einnahmen, Entsorgungen und den Verbrauch von Substanzen enthält (Abbildung 2).
    2. Führen Sie regelmäßige Audits der Lager- und Lagerpraktiken durch, indem Sie das halbjährliche Bestandsprotokoll ausfüllen, um die Einhaltung der gesetzlichen Anforderungen sicherzustellen. Überprüfen Sie regelmäßig Zugriffsprotokolle und Inventaraufzeichnungen.
  7. Schulungen und Protokolle: Alle Mitarbeiter, die mit THC umgehen, sollten geschult werden. Für die Lagerung, Handhabung und Entsorgung des Arzneimittels sollten klare Protokolle erstellt werden.
    HINWEIS: Durch die Implementierung dieser Praktiken können akademische Labore sicherstellen, dass sie die gesetzlichen Anforderungen einhalten und eine sichere Forschungsumgebung aufrechterhalten.

2. Verfahren zur Verabreichung von THC an Mäuse durch i.p. Injektion

HINWEIS: Beim Umgang mit THC ist es wichtig, die Temperatur zu kontrollieren und die Verbindung vor Licht zu schützen, um ihre Stabilität zu erhalten. THC reagiert empfindlich auf Hitze und sollte für eine Langzeitlagerung bei oder unter -20 °C gelagert werden. Für die kurzfristige Lagerung kann THC bei Raumtemperatur oder mehrere Stunden im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden. THC ist auch empfindlich gegenüber ultraviolettem (UV) und sichtbarem Licht, das zu einer Zersetzung durch Oxidation führen kann. Um dies zu verhindern, sollte THC in luftdichten Braunglasbehältern oder durchsichtigen Behältern gelagert werden, die in Aluminiumfolie eingewickelt und im Dunkeln gelagert werden. Es wird empfohlen, alle Proben mit Datum und Lagerbedingungen zu beschriften, um eine ordnungsgemäße Nachverfolgung und Stabilität zu gewährleisten.

  1. Materialien
    1. Bereiten Sie alle Lösungen mit Reinstwasser und Reagenzien in analytischer Qualität vor. Beziehen Sie THC von Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) oder RTI International (Research Triangle Park, NC) oder über das NIDA Drug Supply Program24.
  2. Ausrüstung und Zubehör
    1. Stellen Sie sicher, dass die in der Materialtabelle aufgeführten Elemente bereit sind, bevor Sie mit dem Vorgang beginnen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Glasfläschchen (8 mL oder ähnliches) und Behälter zu verwenden, wenn Sie mit THC arbeiten. Kunststoffe können mit hydrophoben Molekülen wie THC reagieren oder diese absorbieren, was zu Probenverlust oder inkonsistenten Konzentrationen führen kann. Glas ist chemisch stabil und nicht reaktiv, was dazu beiträgt, unerwünschte Wechselwirkungen mit hydrophoben Molekülen zu verhindern.
  3. Verfahren zur THC-Verabreichung bei Mäusen
    1. Nimm den THC-Behälter aus dem Sicherheitsschrank im Gefrierschrank.
    2. Halten Sie den Behälter auf Eis, entnehmen Sie mit einer Pipette eine angemessene Menge THC und geben Sie es vorsichtig auf den Boden eines 8-ml-Glasfläschchens. Berechnen Sie das Volumen basierend auf der Dosis (mg/kg) und dem Körpergewicht der Mäuse (g).
    3. Bringen Sie das Fläschchen in einen chemischen Abzug und verdampfen Sie das Lösungsmittel vorsichtig mit einem sanften Stickstoffgasstrahl bis zum Trocknen. Achten Sie darauf, die THC-haltige Lösung nicht auf die Seiten des Fläschchens zu spritzen, da dies zu schweren Verlusten führen kann. Dieser Vorgang dauert ca. 5-10 Minuten.
    4. Notieren Sie im Controlled Substance I Usage Log im Controlled Substance Binder, wie viel THC aus dem aktuell verwendeten Fläschchen entnommen wurde.
    5. Wenn das Lösungsmittel vollständig getrocknet ist, fügen Sie eine angemessene Menge Tween-80 hinzu. Dies ist das Volumen an Tween-80, das erforderlich ist, um eine endgültige Konzentration von 5 % Tween-80 in Kochsalzlösung zu erhalten, wie in Schritt 2.3.8 gezeigt.
    6. Die Durchstechflasche wird in einem Becherglas mit heißem Wasser auf oder unter 60 °C erwärmt. Wirbeln Sie das Fläschchen ein, um THC vollständig aufzulösen, und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.
    7. Fügen Sie nach und nach sterile Kochsalzlösung in kleinen Schritten hinzu: z. B. 200 μl, 300 μl, 500 μl und 1 ml. Vortexen und aufheizen.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.6 und 2.3.7, bis das Gesamtvolumen der Kochsalzlösung hinzugefügt wurde, das zur Herstellung einer endgültigen THC-Lösung in 5 % Tween-80 und 95 % Kochsalzlösung benötigt wird, und die Lösung vollständig aufgelöst ist.
    9. (FAKULTATIV) Das Fläschchen wird 5 Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad mit einer Leistung von ca. 100 % bei 40 kHz und 37 °C beschallt. Vergewissern Sie sich, dass die Lösung klar und frei von ungelösten Substanzen ist. Die Farbe der Flüssigkeit kann je nach verwendetem Fahrzeug variieren.
    10. Wiegen Sie die Maus und bestimmen Sie die geeignete Injektionsmenge. Das Injektionsvolumen sollte 10 ml/kg pro Maus betragen.
    11. Fahren Sie mit den intraperitonealen (i.p.) Injektionen fort. Stellen Sie sicher, dass die THC-Lösungen am Tag des Konsums frisch zubereitet werden.

3. Verfahren zur Bewertung der pharmakologischen Wirkungen von THC

  1. Tiere
    1. Verwenden Sie für diese Studie Mäuse beiderlei Geschlechts.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden jugendliche (postnataler Tag, PND, 30-35) und adulte (PND 70-75) C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts aus den Jackson Laboratories (Farmington, CT) verwendet.
      Das Verfahren ist auf andere Mausstämme anwendbar.
    2. Halten Sie die Mäuse in belüfteten Käfigen (4-5 pro Käfig), in denen Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung stehen. Ordnen Sie alters- und gewichtsangepasste Tiere nach dem Zufallsprinzip Behandlungsgruppen zu und lassen Sie sie mindestens 1 Woche vor den Versuchen akklimatisieren.
    3. Halten Sie die Wohnräume in einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus (Licht an um 6:30 Uhr) mit konstanter Temperatur (20 ± 2 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (55 %-60 %).
  2. Experimentelle Gruppen
    1. Unterteilen Sie jede Alters- und Geschlechtsgruppe in vier Behandlungsgruppen: eine Vehikel-Kontrollgruppe und drei THC-Behandlungsgruppen für Dosen von 1, 5 und 10 mg/kg.
  3. Verabreichung von Medikamenten
    1. Bereiten Sie THC wie oben beschrieben in einem Vehikel aus 95 % Kochsalzlösung und 5 % Tween-80 frisch vor und verabreichen Sie es durch i.p. Injektion.
  4. Verhaltenstests
    HINWEIS: In diesem Beispiel wurde jedes Tier den unten beschriebenen Tests unterzogen, um die Wirkung von THC zu verfolgen22. Die drei Verhaltenstests wurden nacheinander an derselben Kohorte von Tieren durchgeführt. Die Reihenfolge der Verfahren war: Fortbewegung (30 Minuten nach THC), Katalepsie (45 Minuten nach THC) und Eintauchen in den Schwanz (60, 180 und 300 Minuten nach THC) (Abbildung 3). Für die Experimente mit jugendlichen Frauen verwendeten wir dieselbe mit Vehikel behandelte Gruppe erneut und verabreichten dann entweder 1 mg/kg oder 10 mg/kg THC an dieselbe Kohorte, um die Katalepsie- und Schwanzimmersionstests durchzuführen. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erreichen und gleichzeitig die Anzahl der verwendeten Tiere in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien zu minimieren. Das Verhalten wurde mit einem Camcorder aufgezeichnet, und Filmdateien wurden mit einer Verhaltensverfolgungssoftware analysiert.
    1. Katalesie-Test
      HINWEIS: Katalesie bei Mäusen ist ein (patho)physiologischer Zustand, der durch einen Mangel an willkürlicher Bewegung, Starrheit der Haltung und Widerstand gegen extern induzierte Veränderungen der Körperposition gekennzeichnet ist. Es gilt als eine der vier Standardwirkungen von THC, zusammen mit der Hemmung des Bewegungsapparates, der Antinozizeption und der verringerten Körpertemperatur. In diesem Beispiel wurde das kataleptische Verhalten auf der Grundlage etablierter Verfahren22 bewertet, wie im Folgenden beschrieben:
      1. Aufbau: Bereiten Sie eine horizontale Stange (7 cm Länge) vor, die 4 cm über der Oberfläche eines sauberen Labortisches mit normaler Umgebungsbeleuchtung (160 Lux) angebracht ist. Stellen Sie eine elektronische Zeitschaltuhr in die Nähe, die einsatzbereit ist.
      2. Bringen Sie die Maus von den Haltungseinrichtungen in das Testlabor und akklimatisieren Sie sie vor dem Test 60 Minuten lang im Käfig. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel und kein Parfüm.
      3. Nehmen Sie die Maus mit sauberen Latexhandschuhen vorsichtig aus ihrem Käfig, verabreichen Sie sicher eine angemessene Menge THC oder Vehikel und setzen Sie sie wieder in den Käfig ein.
      4. Nehmen Sie die Maus zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der THC-Injektion (in diesem Fall 45 Minuten) aus dem Käfig und legen Sie ihre Vorderpfoten vorsichtig auf die horizontale Stange.
      5. Erfassen Sie die Immobilitätszeit mit dem elektronischen Timer.
        HINWEIS: Die Immobilitätszeit ist definiert als die Zeit, die zwischen dem Platzieren der Maus auf der Stange und dem Moment, in dem sie eine oder beide Pfoten entfernt, vergeht.
      6. Stoppt den Timer, wenn die Maus eine oder beide Pfoten von der Stange nimmt oder wenn die Cutoff-Zeit von 10 s erreicht ist.
      7. Wiederholen Sie den Test zweimal für jede Maus mit einem Ruheintervall von 2 Minuten zwischen den Versuchen.
      8. Verwenden Sie den Durchschnitt der beiden Immobilitätszeiten für die abschließende Datenanalyse.
      9. Ergebnismaß: Verwenden Sie die Immobilitätszeit (in Sekunden) als Indikator für Katalepsie.
    2. Freilandversuch (Lokomotorische Aktivität in einer neuartigen Umgebung)
      HINWEIS: Die THC-induzierte Hypolokomotion wird mit dem Freilandtest und nach einem festgelegten Protokoll beurteilt25.
      1. Aufbau: Verwenden Sie für diesen Test eine offene Arena, die mit Video-Tracking-Geräten ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass die Freifeldarena sauber und frei von Geruchshinweisen aus früheren Experimenten ist.
        HINWEIS: Eine effektive Reinigung kann mit handelsüblichen Produkten durchgeführt werden, die in der Materialtabelle beschrieben sind.
      2. Bringen Sie die Maus aus dem Gehäuse in das Testlabor und akklimatisieren Sie sie vor dem Test 60 Minuten lang in ihrem Käfig. Stellen Sie sicher, dass der Prüfraum über eine Beleuchtung mit geringer Intensität (10 Lux)25 verfügt. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel und verwenden Sie kein Parfüm.
      3. Nehmen Sie die Maus mit sauberen Handschuhen vorsichtig aus ihrem Käfig, verabreichen Sie sicher eine angemessene Menge THC oder Vehikel und setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein.
      4. Platzieren Sie die Maus zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der THC-Injektion (in diesem Fall 30 Minuten) vorsichtig in der Mitte der Arena und achten Sie darauf, den Handhabungsstress zu minimieren.
      5. Zeichnen Sie 10-minütige Sitzungen mit einem Camcorder und einer Verhaltensverfolgungssoftware auf.
      6. Bringen Sie die Maus nach dem Test wieder in ihren Heimatkäfig zurück und reinigen Sie die Arena gründlich mit der oben beschriebenen Reinigungslösung.
      7. Ergebnismessung: Berechnen Sie die zurückgelegte Gesamtstrecke, gemessen in Metern, als primären Parameter zur Quantifizierung der Bewegungsaktivität.
    3. Schwanzimmersionstest (Nozizeptive Schwellenwerte, auch als Heißwasser-Schwanzentnahmetest bezeichnet)
      HINWEIS: Die Nozizeption wird mit dem Schwanzimmersionstest bewertet, wie zuvor beschrieben26. Dieser Test wird verwendet, um die Wirksamkeit potenzieller Analgetika und die Toleranz gegenüber ihren Wirkungen zu bewerten. Während des Tests wird der Schwanz einer Maus als schmerzhafter Reiz mit Hitze beaufschlagt und die Zeit gemessen, in der der Schwanz von der Wärmequelle weggezogen wird.
      1. Aufbau: Bereiten Sie ein Wasserbad vor, das bei normaler Umgebungsbeleuchtung (160 Lux) bei 54 °C gehalten wird. Stellen Sie eine elektronische Zeitschaltuhr in die Nähe, die einsatzbereit ist.
      2. Halten Sie die Maus vorsichtig mit einer Weichteiltasche aus Haustier-Trainingspads (Glad) fest, um sicherzustellen, dass der Schwanz zugänglich bleibt.
      3. Tauchen Sie das distale Drittel des Schwanzes in das Wasserbad und starten Sie gleichzeitig den Timer.
      4. Zeichnen Sie die Latenz bis zum Rückzug des Schwanzes (in Sekunden) auf, definiert als das reflexartige Schlagen des Schwanzes.
      5. Stellen Sie eine maximale Cutoff-Zeit von 10 s ein, um Gewebeschäden und Beschwerden zu vermeiden.
      6. Wiederhole die Messung zweimal für jede Maus zu jedem Zeitpunkt (in diesem Fall 60, 180 und 300 Minuten nach der THC-Injektion), mit einem 5-minütigen Intervall zwischen den Versuchen.
      7. Mittelwerten Sie die beiden Latenzmessungen für die Datenanalyse.
      8. Ergebnismaß: Berechnen Sie die Latenzzeit bis zum Tail-Entzug, gemessen in Sekunden, als primäre Ergebnisvariable zur Bewertung antinozizeptiver Wirkungen.
  5. Statistische Auswertungen
    1. Bestimmen Sie ±die Signifikanz mit Hilfe der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt vom Šídák-Mehrfachvergleichstest oder der Drei-Wege-ANOVA, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Betrachten Sie die Unterschiede als signifikant, wenn P 0,05 <.
      HINWEIS: Für die Durchführung der Analyse wurde GraphPad Prism Version 10.4 verwendet.

Ergebnisse

Um das oben skizzierte Protokoll zu veranschaulichen, präsentieren wir Ergebnisse zu den akuten pharmakologischen Wirkungen von THC. Vier Gruppen von Mäusen (8 pro Gruppe), jugendliches Männchen, erwachsenes Männchen, jugendliches Weibchen und erwachsenes Weibchen, erhielten drei Dosen THC - 1, 5 und 10 mg/kg - zusammen mit einem Vehikel als Kontrolle. Dann wurden Katalepsie, Bewegungsaktivität und Nozizeption bewertet, wobei der Schwerpunkt auf der Dosisabhängigkeit der Effekte und den Unterschieden zwischen Geschlecht und Alter lag.

Erstens, für die akuten kataleptischen Wirkungen, führte THC bei jugendlichen und erwachsenen männlichen Mäusen zu einer dosisabhängigen Katalepsie (Abbildung 4A und Tabelle 1). Die Dauer des Ansprechens war dosisabhängig (P<0,0001, bidirektionale ANOVA), wobei 5 und 10 mg/kg in beiden Altersgruppen statistisch signifikante Effekte hervorriefen, verglichen mit Fahrzeugkontrollen in jeder Gruppe (P < 0,0001 durch den Šídák-Mehrfachvergleichstest). Bei der Dosis von 10 mg/kg führte THC sowohl bei jugendlichen als auch bei erwachsenen weiblichen Mäusen zu Katalepsie (Abbildung 4B und Tabelle 2), wobei erwachsene Weibchen im Vergleich zu jugendlichen Weibchen eine weniger ausgeprägte Reaktion zeigten (P < 0,0001 nach Šídáks Mehrfachvergleichstest). Die Datensätze wurden weiter analysiert, um festzustellen, ob das Geschlecht die THC-induzierte Katalepsie beeinflusst. Eine bescheidene, aber signifikante sexualdimorphe Reaktion wurde bei weiblichen Jugendlichen im Vergleich zu Männern beobachtet (P = 0,0204) (Abbildung 4C und Tabelle 3). Eine deutlich stärkere Wirkung des Geschlechts wurde bei weiblichen Erwachsenen festgestellt, die im Vergleich zu männlichen erwachsenen Mäusen signifikant weniger empfindlich auf die kataleptischen Wirkungen von THC reagierten (P < 0,0001) (Abbildung 4D und Tabelle 4).

Zweitens reduzierte THC bei den akuten lokomotorischen Effekten die lokomotorische Aktivität bei männlichen Mäusen (Abbildung 5A und Tabelle 5). Dieser Effekt war sowohl von der THC-Dosis als auch vom Alter der Tiere abhängig (P < 0,0001 bzw. P = 0,0042), wobei jugendliche Mäuse im Vergleich zu erwachsenen Mäusen empfindlicher auf die Wirkung von THC reagierten. Post-hoc-Vergleichstests zeigten, dass sich jugendliche Mäuse bei einer Dosis von 5 mg/kg THC signifikant weniger bewegten als erwachsene Mäuse (P < 0,0001). THC reduzierte die Bewegungsaktivität auch bei weiblichen Mäusen (Abbildung 5B und Tabelle 6). Die bidirektionale ANOVA zeigte auch bei weiblichen Mäusen signifikante Auswirkungen sowohl auf die Dosis als auch auf das Alter (P < 0,0001 bzw. P = 0,0103) (Abbildung 5B und Tabelle 6). Post-hoc-Mehrfachvergleichstests zeigten jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen jugendlichen und erwachsenen weiblichen Mäusen bei 0 oder 10 mg/kg THC-Dosen (Abbildung 5B). Diese Datensätze wurden weiter analysiert, um festzustellen, ob das Geschlecht die THC-induzierte Hypolokomotion beeinflusst. Geschlechtsdimorphismus wurde bei jugendlichen Mäusen nicht beobachtet (Abbildung 5C und Tabelle 7); adulte Mäuse wiesen jedoch einen statistisch signifikanten Sexualdimorphismus auf (P = 0,0046), wobei erwachsene Weibchen im Vergleich zu erwachsenen Männchen eine signifikant höhere Bewegung zeigten. Dennoch zeigten Post-hoc-Mehrfachvergleichstests keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Geschlechtern bei 0 oder 10 mg/kg THC-Dosen (Abbildung 5D und Tabelle 8).

Drittens reduzierte THC bei den akuten antinozizeptiven Wirkungen die Nozizeption des Schwanzimmersions bei männlichen Mäusen (Jugendliche, Abbildung 6A und Tabelle 9; Erwachsene, Abbildung 6C und Tabelle 11). Bei männlichen Jugendlichen zeigte THC bei 5 und 10 mg/kg signifikante antinozizeptive Wirkungen, die 60, 180 und 360 Minuten nach der Verabreichung getestet wurden (P < 0,0001 durch Šídáks Mehrfachvergleichstest im Verhältnis zur Schwanzschlaglatenz von Fahrzeugkontrollmäusen) (Abbildung 6A und Tabelle 9). Die bidirektionale ANOVA bestätigte die starken Auswirkungen der THC-Dosis auf die Tail-Flick-Latenz (P < 0,0001) und zeigte eine zeitabhängige Abnahme der antinozizeptiven Wirkungen, insbesondere bei der höchsten Dosis (P = 0,0133) (Abbildung 6A und Tabelle 9). Eine ähnliche dosisabhängige Wirkung von THC, aber nicht die Wirkung der Zeit, wurde bei weiblichen jugendlichen Mäusen beobachtet (P < 0,0001 bzw. P = 0,9923) (Abbildung 6B und Tabelle 10). Bei erwachsenen Männern zeigte THC nur bei der höchsten Dosis (10 mg/kg) und zum frühesten Zeitpunkt (60 Minuten nach der Verabreichung) signifikante antinozizeptive Wirkungen (P < 0,0001 im Šídák-Mehrfachvergleichstest im Vergleich zu Vehikelkontrollen) (Abbildung 6C und Tabelle 11). Die bidirektionale ANOVA zeigte einen signifikanten Effekt sowohl auf die Dosis als auch auf die Zeit (Dosis, P < 0,0001; Zeit, P = 0,0007) (Tabelle 11). Bei erwachsenen Frauen wurde eine signifikante antinozizeptive Wirkung nur bei der höchsten Dosis (10 mg/kg) und dem frühesten Zeitpunkt (60 Minuten nach der Verabreichung) beobachtet (P < 0,0012 im Šídák-Mehrfachvergleichstest im Vergleich zu Vehikelkontrollen) (Abbildung 6D und Tabelle 12). In Bezug auf die Auswirkungen von Geschlecht und Alter auf die THC-induzierte Antinozizeption zeigte die bidirektionale ANOVA, dass die Auswirkungen von THC auf die Latenz von Tail-Flicks sowohl vom Alter als auch vom Geschlecht beeinflusst wurden (Abbildung 6E, F, Tabelle 13 und Tabelle14). Der stärkste Effekt wurde bei männlichen Jugendlichen 60 Minuten nach der THC-Verabreichung beobachtet, obwohl alle vier Gruppen von Mäusen im Vergleich zu den entsprechenden Vehikelkontrollen zu diesem Zeitpunkt eine signifikante THC-induzierte Antinozizeption zeigten (Abbildung 6E). Interessanterweise wurde ein signifikanter Effekt von Sex bei jugendlichen, aber nicht bei erwachsenen Mäusen zu einem Zeitpunkt von 60 Minuten nach THC-Spiegel beobachtet ( Jugendliche, P = 0,0083; Erwachsene, P = 0,9919 nach Šídáks Mehrfachvergleichstest) (Abbildung 6E und Tabelle 13). 300 Minuten nach der THC-Einnahme wurden signifikante antinozizeptive Wirkungen nur bei jugendlichen Mäusen gefunden, sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen, nicht aber bei erwachsenen Mäusen (Abbildung 6F und Tabelle 14). Die Drei-Wege-ANOVA testete die drei Variablen Dosis, Alter und Geschlecht gleichzeitig und zeigte signifikante Effekte sowohl der Zeit und der Dosis (P = 0,0007 bzw. P < 0,0001) als auch der signifikanten Wechselwirkung zwischen Zeit und Dosis (P = 0,0022) (Tabelle 15).

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Abbildung 1: Chemische Strukturen von Phytocannabinoiden, THC und CBD, sowie Endocannabinoiden, Anandamid und 2-AG. Delta-9-Tetrahydrocannabinol (THC) wird im Blütenstand der weiblichen Cannabispflanze produziert und ist für ihre psychotrope Wirkung verantwortlich; THC wirkt, indem es an G-Protein-gekoppelte CB1- und CB2-Rezeptoren im Gehirn und anderen Geweben des Körpers bindet. Cannabidiol (CBD) ist ein nicht-psychotropes Cannabinoid mit antiepileptischen und möglicherweise antipsychotischen und entzündungshemmenden Eigenschaften. Zwei wichtige endogene Aktivatoren von CB-Rezeptoren, Anandamid und 2-Arachidonoyl-sn-glycerol (2-AG), sind lipidabgeleitete Botenstoffe im Gehirn und im peripheren Gewebe, die bei Bedarf produziert werden und an verschiedenen Signalprozessen mit kurzer Reichweite beteiligt sind, wie z. B. der Feinabstimmung der synaptischen Plastizität im ZNS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Beispiel für ein Verwendungsprotokoll für kontrollierte Substanzen I. Jeder Konsum von THC sollte in einem Ad-hoc-Konsumprotokoll für kontrollierte Substanzen I aufgezeichnet werden, das in dem Ordner für kontrollierte Substanzen aufbewahrt wird, der in einem verschlossenen Schrank oder einem sicheren Büroraum aufbewahrt wird. Dieses Formular sollte den Namen und die Zugehörigkeit des Hauptprüfers enthalten, der für eine Lizenz nach Anhang 1 registriert sein muss, Informationen über das geplante Medikament und die genaue Charge, die Protokollnummer, die autorisierte Person, die das Medikament verwendet, mit der Menge und dem Restbetrag für jede Verwendung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung der Reihenfolge von Verhaltenstestexperimenten. Die Reihenfolge der Verfahren war: Fortbewegung (30 Minuten nach THC), Katalepsie (45 Minuten nach THC) und Schwanzimmersion (60-, 180- und 300-minütige Zeit nach THC). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: THC-induzierte akute Katalepsie bei Mäusen. THC führt bei jugendlichen und erwachsenen (A) männlichen und (B) weiblichen Mäusen zu Katalepsie. Das Ansprechen wurde mit dem Bar-Test nach i.p. Injektion von THC in der angegebenen Dosis bewertet. Derselbe Datensatz wurde für die Auswirkungen von Sex auf THC-induzierte Katalepsie bei (C) jugendlichen und (D) erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die Signifikanz wurde mittels bidirektionaler ANOVA bestimmt, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05. P < 0,0001 im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle, ##P < 0,01 und ####P < 0,0001 im Vergleich zur jugendlichen 10 mg/kg-Gruppe in Panel B oder der männlichen 10 mg/kg-Gruppe in den Panels C und D. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: THC-induzierte akute Hypolokomotion bei Mäusen. THC reduziert die spontane Bewegungsaktivität bei jugendlichen und erwachsenen (A) männlichen und (B) weiblichen Mäusen. Das Ansprechen wurde anhand des Freilandversuchs nach i.p. Injektion von THC in der angegebenen Dosis bewertet. Derselbe Datensatz wurde auf die Auswirkungen von Sex auf die THC-induzierte Hylokomotion bei (C) jugendlichen und (D) erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die Signifikanz wurde mittels bidirektionaler ANOVA bestimmt, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle und ####P < 0,0001 im Vergleich zur jugendlichen 5 mg/kg-Gruppe in Panel A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: THC-induzierte akute Analgesie bei Mäusen. Akute antinozizeptive Wirkungen von THC wurden mit dem Schwanzimmersionstest bei (A) jugendlichen männlichen, (B) jugendlichen weiblichen Mäusen, (C) erwachsenen männlichen und (D) erwachsenen weiblichen Mäusen nach 60, 180 oder 300 Minuten nach der i.p. Injektion von THC in der angegebenen Dosis gemessen. Derselbe Datensatz wurde auf die Auswirkungen von Alter und Geschlecht auf die THC-induzierte Antinozizeption nach (E) 60 min oder (F) 300 min nach der THC-Verabreichung analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die Signifikanz wurde mittels bidirektionaler ANOVA bestimmt, gefolgt von Šídáks Mehrfachvergleichstest. Unterschiede wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05. *P < 0,05, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 im Vergleich zur Vehikelkontrolle und ##P < 0,01 zwischen der Gruppe der männlichen und weiblichen Jugendlichen mit 10 mg/kg und der Gruppe der weiblichen Jugendlichen und @P < 0,05 und @@P < 0,01 im Vergleich zur Gruppe mit 10 mg/kg bei erwachsenen Männern bzw. weiblichen Erwachsenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten Auswirkungen von THC bei der Entstehung von Katalepsie bei jugendlichen und erwachsenen männlichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 4A) (n = 7-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zu den akuten Auswirkungen von THC bei der Entstehung von Katalepsie bei jugendlichen und erwachsenen weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 4B) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zu den akuten Auswirkungen von THC bei der Entstehung von Katalepsie bei jugendlichen männlichen und weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 4C) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zu den akuten Auswirkungen von THC bei der Entstehung von Katalepsie bei erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 4D) (n = 7-10 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten Auswirkungen von THC auf die Fortbewegung bei jugendlichen und erwachsenen männlichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 5A) (n = 7-9 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse zu den akuten Auswirkungen von THC auf die Fortbewegung bei jugendlichen und erwachsenen weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 5B) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten Auswirkungen von THC auf die Fortbewegung bei jugendlichen männlichen und weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 5C) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten Auswirkungen von THC auf die Fortbewegung bei erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 5D) (n = 7-9 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 9: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei jugendlichen männlichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 6A) (n = 7-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 10: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei jugendlichen weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 6B) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 11: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei erwachsenen männlichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 6C) (n = 6-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 12: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei erwachsenen weiblichen Mäusen (bezogen auf Abbildung 6D) (n = 7-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 13: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei jugendlichen und erwachsenen, männlichen und weiblichen Mäusen, getestet nach 60 Minuten nach der Injektion von 10 mg/kg THC (bezogen auf Abbildung 6E) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 14: Zwei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei jugendlichen und erwachsenen, männlichen und weiblichen Mäusen, getestet nach 300 Minuten nach der Injektion von 10 mg/kg THC (bezogen auf Abbildung 6F) (n = 5-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 15: Drei-Wege-ANOVA-Analyse der akuten analgetischen Wirkung von THC bei jugendlichen und erwachsenen, männlichen und weiblichen Mäusen, getestet nach 60, 180 und 300 Minuten nach der Injektion von 10 mg/kg THC (bezogen auf Abbildung 6E und 6F) (n = 7-8 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Dieser Artikel gibt einen Überblick über die Verfahren zur Gewinnung und Lagerung von THC in Übereinstimmung mit den geltenden US-Vorschriften und skizziert ein Protokoll für die Vorbereitung von THC für die intraperitoneale Injektion und die Verabreichung an jugendliche (PND 30-35) und junge erwachsene Mäuse (PND 70-75). Es ist wichtig, THC aus einer legitimen Quelle zu beziehen und alle geltenden Vorschriften einzuhalten. In den Vereinigten Staaten müssen Forscher sowohl die behördlichen Anforderungen des Bundes als auch der Bundesstaaten erfüllen, selbst in Staaten, in denen Cannabis sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Zwecke legal ist. Die Verwendung einer zertifizierten Quelle gewährleistet den Zugang zu THC in Forschungsqualität, das unter strenger Kontrolle hergestellt wird und eine gleichbleibende Potenz und Reinheit garantiert. Im Gegensatz dazu gefährdet die Verwendung einer unregulierten oder nicht autorisierten Quelle die wissenschaftliche Integrität, birgt das Risiko der Ablenkung und setzt die Forscher rechtlichen Konsequenzen aus.

Wir untersuchten drei pharmakologische Standardreaktionen auf THC - Katalepsie, verminderte Fortbewegung und Analgesie. Wir haben umfangreiche Literaturdaten reproduziert (siehe z. B. Referenzen 27,28,29), die zeigen, dass THC diese Reaktionen dosisabhängig beeinflusst. Diese Tests werden in der präklinischen Forschung verwendet, um die pharmakologischen Eigenschaften von Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten zu bewerten, obwohl ihre Relevanz für die menschliche Erfahrung variieren kann. Katalesie bezieht sich auf einen Zustand, in dem das Subjekt eine verminderte Fähigkeit erfährt, sich zu bewegen oder normale motorische Funktionen auszuführen. Dies äußert sich in einer körperlichen Ruhigstellung oder Starrheit, wobei das Subjekt ungewöhnliche Haltungen einnimmt. Verminderte Fortbewegung (oder Hypolokomotion) bezieht sich auf eine Abnahme des Gesamtniveaus der horizontalen motorischen Aktivität, die sich in verlangsamten oder weniger häufigen Bewegungen äußert. Dies kann auf eine Sedierung, eine motorische Beeinträchtigung oder einfach auf einen Mangel an Motivation zur Bewegung zurückzuführen sein. In Tierversuchen wird dies häufig als Verringerung des Erkundungsverhaltens oder des allgemeinen Aktivitätsniveaus in einer neuen Umgebung beobachtet. Der dritte Test, die Antinozizeption, bezieht sich auf die Fähigkeit von THC, die Latenzzeit des Schwanzentzugs in einem Schwanzimmersionstest zu erhöhen. In Tiermodellen, in denen die Beurteilung der subjektiven Komponente der Analgesie spezielle Tests erfordert, bietet die Antinozizeption mit Schwanzimmersion einen nützlichen, wenn auch begrenzten Überblick darüber, wie Arzneimittel die nozizeptive Funktion beeinflussen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass THC unabhängig von Geschlecht und Alter dosisabhängig Katalepsie induziert, insbesondere bei den Dosen von 5 mg/kg und 10 mg/kg. Ein alters- und geschlechtsspezifischer Effekt wurde bei adulten weiblichen Mäusen beobachtet, die im Vergleich zu männlichen oder jugendlichen weiblichen Mäusen eine signifikant abgestumpfte Produktion von Katalepsie aufwiesen. Die THC-induzierte Hypolokomotion in einer neuen Umgebung war bei jugendlichen Mäusen im Vergleich zu erwachsenen Mäusen stärker, unabhängig vom Geschlecht. Dieser altersbedingte Unterschied unterschied sich von den adulten selektiven hypolokomotorischen Wirkungen von THC in ihrem Heimkäfig, einer vertrauten Umgebung30. In Bezug auf die akute antinozizeptive Wirkung von THC wurden statistisch signifikante Wirkungen sowohl bei 5 mg/kg als auch bei 10 mg/kg Dosen bei jugendlichen männlichen Mäusen gefunden, aber bei erwachsenen männlichen Mäusen war nur die Dosis von 10 mg/kg wirksam. Unter den drei hier getesteten Zeitpunkten war die antinozizeptive Wirkung von THC 60 Minuten nach der THC-Einnahme am höchsten und ließ danach nach. Jugendliche männliche Jugendliche reagierten unter den vier Alters- und Geschlechtsgruppen am empfindlichsten auf die antinozizeptiven Wirkungen von THC, und ein signifikanter Unterschied zwischen den Geschlechtern wurde in den Gruppen der jugendlichen Mäuse nach 60 Minuten nach der Injektion von 10 mg/kg THC beobachtet. Nach 300 Minuten THC-Verabreichung wurde ein deutlicher Effekt des Alters festgestellt, bei dem signifikante antinozizeptive Wirkungen bei Jugendlichen beobachtet wurden, nicht jedoch bei erwachsenen Mäusen, unabhängig vom Geschlecht. Im Allgemeinen zeigten jugendliche Mäuse im Vergleich zu Erwachsenen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber THC, insbesondere bei der Messung der Fortbewegung und Nozizeption. Alles in allem deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Adoleszenz eine empfindliche Zeit für die akuten pharmakologischen Wirkungen von THC ist, obwohl dies testabhängig sein kann30. Die Ergebnisse hier zeigen auch den Einfluss von Alter und Geschlecht auf die Wirkung von THC, was darauf hindeutet, dass erwachsene Frauen am wenigsten empfindlich auf THC reagieren.

Die Exposition gegenüber THC während der Pubertät – insbesondere wenn sie häufig und in hohen Dosen verabreicht wird – kann die Funktion des Endocannabinoid-Systems im gesamten Körper, einschließlich des Gehirns, stören31. Diese Störung kann zu lang anhaltenden Auswirkungen sowohl auf die geistige als auch auf die körperliche Gesundheit führen 32,33,34. Epidemiologische Studien der letzten drei Jahrzehnte haben durchweg Zusammenhänge zwischen jugendlichem Cannabiskonsum und langfristigen Beeinträchtigungen der Kognition, der Stimmung und der psychosozialen Funktion gezeigt, wobei sich diese Auswirkungen möglicherweise bis ins Erwachsenenalter erstrecken, auch nach Beendigung des Konsums 32,33,34,35,36. Darüber hinaus wurden langfristige Veränderungen des Körpergewichts, des Stoffwechsels und der Immunfunktion berichtet. Obwohl diese Zusammenhänge gut dokumentiert sind, ist es wichtig, einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Cannabiskonsum und seinen potenziellen gesundheitlichen Auswirkungen herzustellen. Verschiedene Methoden, darunter die Analyse diskordanter Zwillinge, Mendelsche Randomisierung und quasi-experimentelle Interventionen, können verwendet werden, um die Kausalität in menschlichen Populationen zu beurteilen. Aber auch Labortierversuche spielen eine wichtige Rolle bei der Aufklärung der Kausalität37. Die Ergebnisse unseres Labors, das vom National Institute on Drug Abuse finanziert wurde und ein Nagetiermodell einer moderaten, aber häufigen THC-Exposition während der Adoleszenz verwendet, unterstützen die Hypothese, dass die Adoleszenz eine anfällige Zeit für THC-Exposition ist 17,18,25,38,39,40. Selbst moderate Dosen des Medikaments während dieses kritischen Entwicklungsfensters können dauerhafte Auswirkungen auf verschiedene Komponenten des erwachsenen Endocannabinoid-Systems haben. Diese Effekte sind mit neurologischen Verhaltensänderungen sowie mit Beeinträchtigungen der Immunreaktionen und der Fähigkeit, mit psychosozialem Stress umzugehen, verbunden. Unsere früheren Forschungen deckten auch unerwartete Veränderungen in der Funktion des Fettgewebes auf, was eine mögliche molekulare Erklärung für die langfristigen metabolischen Veränderungen liefert, die bei regelmäßigen Cannabiskonsumenten beobachtet wurden18. Durch die unangemessene Aktivierung vonCB-1-Rezeptoren im Gehirn während wichtiger neurologischer Entwicklungsphasen wie der Adoleszenz kann THC das für die Gehirnreifung erforderliche Gleichgewicht stören, was zu strukturellen und funktionellen Veränderungen führt, die bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben können.

Beim Menschen sind Rauchen und Verdampfen die gebräuchlichsten Methoden des Cannabiskonsums in allen Altersgruppen. Unser aktuelles Protokoll beschreibt die Verabreichung von THC über den intraperitonealen (i.p.) Weg, der praktisch und reproduzierbar ist und bei Nagetieren pharmakokinetische und pharmakodynamische Reaktionen hervorruft, die in mehrfacher Hinsicht denen ähneln, die bei menschlichen Cannabiskonsumenten beobachtet werden. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass eine i.p.-Dosis von 5 mg/kg THC bei jugendlichen und erwachsenen männlichen Mäusen Spitzenkonzentrationen im Blut erzeugt, die mit denen vergleichbar sind, die bei erwachsenen menschlichen Konsumenten berichtet wurden. Die Aerosolabgabe von THC (umgangssprachlich als "Dampf" bezeichnet) wird als Ergänzung zur i.p. Injektion erforscht. Dieser Ansatz basiert auf der Prämisse, dass die passive Inhalation von aerosolisiertem THC, wie Rauchen oder Verdampfen, zu einer pulmonalen Absorption führt, was zu einem schnelleren Wirkungseintritt, einem reduzierten Leberstoffwechsel im ersten Durchgang und potenziell unterschiedlichen psychoaktiven Ergebnissen im Vergleich zur parenteralen Verabreichung führt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Ratten sich aerosolisierte Cannabisextrakte oder THC/Cannabidiol-Mischungen in operanten Verhaltensparadigmen selbst verabreichen, was das Potenzial dieser Methode für die Untersuchung der verstärkenden Eigenschaften von THC unterstreicht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll auf etablierten Methoden zur Bewertung des Cannabinoid-induzierten Tetradenverhaltens41,42 aufbaut, das von der Aktivierung neuronalerCB-1-Rezeptoren 43 abhängt, indem es mehrere wichtige Aktualisierungen und Verfeinerungen anbietet. Zunächst beschreiben wir Verfahren, die mit den aktuellen DEA- und institutionellen Vorschriften für die Beschaffung, Handhabung und Verabreichung von THC-kritischen Überlegungen für Personen ohne praktische Erfahrung übereinstimmen. Zweitens wenden wir das Tetraden-Paradigma auf jugendliche (PND 30-35) und junge erwachsene (PND 70-75) Mäuse an, zwei Entwicklungsstadien, die für die frühe und aufkommende Cannabisexposition bei Erwachsenen von großer Bedeutung sind, aber in der präklinischen Forschung unterrepräsentiert bleiben. Die Ergebnisse dieser Studie rekapitulieren die bekannten dosisabhängigen Wirkungen von THC auf Katalepsie, Fortbewegung und Analgesie und zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber THC bei jugendlichen Mäusen, insbesondere im nozizeptiven und lokomotorischen Bereich. Diese altersspezifischen Erkenntnisse und die regulatorische Ausrichtung machen dieses Protokoll besonders wertvoll für Neulinge in der Cannabinoidforschung und für Forscher, die die Auswirkungen von Cannabinoiden auf die Entwicklung untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen biomedizinischen finanziellen Interessen oder potenziellen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes on Drug Abuse unterstützt (Fördernummer 2P50DA044118 [an DP]).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL TB SpritzenBD309659200/Karton; Steril, zum Einmalgebrauch.
8 mL GlasfläschchenFisher Wissenschaftlich W224584144/Case, wird zur Herstellung von THC-Injektionslösung verwendet.
ANY-Labyrinth-SoftwareANY-labyrinth6000Wird verwendet, um Videos von Verhaltenstests aufzuzeichnen und Elemente der Tests für die Datenanalyse zu quantifizieren.
C57BL/6J MäuseJackson Laboratorien#000664Wildtyp-Mäuse, die für alle Experimente verwendet werden; Kann das genaue Alter und das gewünschte Geschlecht angeben.
Compass CX-WaageOhausNr. CR221Wird verwendet, um Mäuse zu wiegen, um die Menge an THC zu bestimmen, die injiziert werden soll; Maximal 220 g, d = 0,1 g.
Corning Pyroceram HeizplatteFisher Scientific11500151Wird zum Erhitzen des Wasserbades für den Tail Flick Test verwendet.
Delta-9-tetrahydrocannabinolKaiman-Chemie12068Aufbewahrt im sicher verschlossenen Tresor für Schedule 1 Drogen in einem -30 º C Gefrierschrank.
Fisherbrand Nitril-HandschuheFisher Scientific19-181-610100/Packung; Latexfreie Einweghandschuhe, die für die richtige persönliche Schutzausrüstung verwendet werden.
GraphPad Prism v10.4GraphPadn/aStatistische Analysesoftware zur Analyse von experimentellen Daten und zur Durchführung statistischer Tests.
Hochleistungs-BecherglasFisher ScientificNr. S81280Wird verwendet, um heißes Wasser für den Tail Flick Test zu halten.
Hochreines StickstoffgasAirgasUN1066  Wird verwendet, um Ethanol aus THC-Stammlösung zu verdampfen.
Logitech C920 WebkameraLogitech GmbH960-001055Wird verwendet, um Verhaltenstests von Tieren aufzuzeichnen; Carl Zeiss 1080p/30 fps HD USB.
Feld öffnenStoelting Co60101Kasten mit undurchsichtigen Seiten zur Durchführung von Feldtests im Freien; Die Seiten sind zur Reinigung leicht abnehmbar.
Trainingspads für HaustiereFrohB088G1N2H885/Packung; 22 Zoll &akut; 22 Zoll; Wird verwendet, um Mäuse für den Tail Flick-Test einzuwickeln und zu halten.
PrecisionGlide-NadelnBD305109100/Karton; 0,4 mm > 13 mm; Steril, zum Einmalgebrauch.
SalzhaltigFisher Scientific (Cytiva)Nr. Z13771 L Flaschen, USP Sterile Qualität.
SCOE 1xBioFOGR-SKReinigungslösung zur Reinigung von Materialien für Verhaltenstests.
Tween-80Sigma AldrichNr. P8074-500MLBioXtra, viskose Flüssigkeit; CAS # 9005-65-6.
Ultraschall-WasserbadFisher Scientific (Branson)CPX2800Temperaturregelung; Digitaler Ultraschallreiniger.
Vortex-MischerFisher Scientific2215365Wird verwendet, um den Inhalt der THC-Injektionslösung zu mischen, während sie zubereitet wird.

Referenzen

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