Ex vivo Einzelmolekül-Analyse der Assemblierung des Ryanodin-Rezeptors 2 in kardialem und neuronalem Gewebe

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine Vesikel-basierte Einzelmolekül-Bildgebungsmethode vorgestellt, die die native Rezeptororganisation bewahrt und so eine präzise Stöchiometrie-Quantifizierung und breite Anwendungen in der Rezeptorassemblierung, -funktion und -krankheitsforschung ermöglicht.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Rezeptorassemblierung ist entscheidend für die Aufklärung der Mechanismen, die ihrer Funktion und Regulation in physiologischen Prozessen zugrunde liegen. Während traditionelle In-vitro-Einzelmolekülstudien auf der Isolierung von Proteinen aus heterologen Expressionssystemen beruhen, können sie oft nicht die physiologische Komplexität in vivo erfassen, die an der Organisation und Assemblierung von Zelloberflächenproteinen beteiligt ist. Dieses Protokoll verwendet die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM), um GFP-markierte Ryanodinrezeptor 2 (RyR2)-Moleküle zu untersuchen, die in nanoskaligen Vesikeln eingekapselt sind. Diese Vesikel, die aus Organen erzeugt werden, die schnell aus dem Tier extrahiert werden, liefern effektiv eine Momentaufnahme des Assemblierungszustands des Rezeptors zum Zeitpunkt der Extraktion und ermöglichen eine detaillierte Analyse der Stöchiometrie der Untereinheiten und der Rezeptororganisation als Reaktion auf Veränderungen in der physiologischen Umgebung des Tieres. Dieser Ansatz nutzt TIRFM und schrittweise Photobleaching-Analyse, um eine Auslesung der Rezeptor-Stöchiometrie zu ermöglichen. Die Bildgebung von Rezeptoren auf Einzelmolekülebene erleichtert den Nachweis von Heterogenität innerhalb der Rezeptorpopulationen, die in einem lebenden Tier zusammengesetzt sind, und ermöglicht die Überwachung von Assemblierungsänderungen, die mit Krankheitszuständen verbunden sind. Damit bietet diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Verteilung von Rezeptoranordnungen und ihre Korrelation mit Veränderungen in ihrer physiologischen Umgebung zu bestimmen.

Einleitung

Membranrezeptoren spielen eine entscheidende Rolle bei physiologischen Prozessen im gesamten menschlichen Körper¹. Eine primäre Funktion besteht darin, die Kommunikation zwischen Zellen durch die Übertragung extrazellulärer Reize zu vermitteln, um intrazelluläre Signalereignisse zu initiieren. Aufgrund ihrer grundlegenden Rolle bei der Signalübertragung zielen fast 70 % der bestehenden Therapeutika auf Membranrezeptoren^{ab 2}. Sie sind oft oligomere Strukturen, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, die zu heteromeren Formen mit multiplen Stöchiometrien zusammengesetzt sind ^3,4. Das Verständnis, wie sich Rezeptoren zu funktionellen Komplexen organisieren, ist entscheidend für die Aufklärung ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit ^5,6. Traditionelle biochemische Methoden wie Immunpräzipitation und Western Blot liefern gemittelte Ensemble-Messungen, die die Heterogenität in Rezeptor-Subpopulationen verschleiern⁷. Im Gegensatz dazu ermöglichen Einzelmolekültechniken die direkte Beobachtung einzelner Rezeptoren und ermöglichen so die Quantifizierung der Heterogenität innerhalb von Rezeptorpopulationen ^8,9,10. Einzelmolekültechniken sind zum Standard geworden, um die Assemblierung von Membranrezeptoren, die Stöchiometrie und die Oligomerisierung zu quantifizieren^11,12. Dieser Ansatz wurde unter Verwendung von isolierten Protein- oder Zellkulturbedingungen auf viele physiologisch relevante Membranrezeptoren angewendet. Einzelmolekülstudien stützen sich hauptsächlich auf In-vitro-Expressionssysteme, bei denen Proteine aus einer zellulären Umgebung isoliert werden können. Die Komplexität innerhalb eines lebenden Systems spiegelt sich jedoch nicht vollständig in dieser Art von heterologen Expressionssystemen wider.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Ansatz entwickelt, der Membranrezeptoren in einem physiologisch relevanten Zustand isoliert und abbildet, indem sie in Nanovesikeln eingefangen werden, die direkt aus kardialem und neuronalem Gewebe stammen. Diese Methode bewahrt effektiv den Zustand der Rezeptorassemblierung zum Zeitpunkt der Vesikelbildung und ermöglicht die direkte Visualisierung der Stöchiometrie der Rezeptoruntereinheit, die ein zentraler Indikator für die Reaktion des Rezeptors in verschiedenen physiologischen Umgebungen ist. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die stöchiometrische Assemblierung von Membranrezeptoren zu untersuchen, die in der komplexen biologischen Umgebung lebender Tiere auftreten, ohne dass eine heterologe Expression oder Rekonstitution erforderlich ist. Durch den Einsatz der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) erreichen wir eine Einzelmolekül-Auflösung von Vesikel-verkapselten Rezeptoren und extrahieren Photobleichspuren, um die Zusammensetzung der Untereinheiten zu bestimmen.

TIRFM eignet sich gut für die Bildgebung von Einzelmolekül-Membranproteinen, da es selektiv Fluorophore innerhalb von ~150 nm um die Glasoberfläche anregt und so die Hintergrundfluoreszenz von Molekülen in Lösung ^3,10 reduziert. Dieser Einschluss verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich und ermöglicht eine genaue Detektion einzelner Membranrezeptorkomplexe. Durch die Analyse des schrittweisen Photobleachings von fluoreszenzmarkierten Rezeptoren können wir die Stöchiometrie der Untereinheiten direkt bestimmen und die potenzielle Heterogenität innerhalb der Rezeptorpopulationen beurteilen¹². Dies ist besonders relevant für den Ryanodin-Rezeptor 2 (RyR2), einen großen intrazellulären Ca²⁺-Freisetzungskanal, der eine entscheidende Rolle bei der Erregungs-Kontraktions-Kopplung im Herzen spielt, wo er sich nur als Homo-Tetramer zusammensetzt, und bei der synaptischen Funktion im Gehirn, wo seine Assemblierung nicht nachgewiesen wurde ^1,13,14. Angesichts des Vorhandenseins mehrerer RyR-Isoformen in neuronalen Geweben bleibt unklar, ob RyR2 im Gehirn rein hommere Tetramerkomplexe bildet, die aus vier identischen Untereinheiten bestehen, wie es im Herzen der Fall ist, oder ob heteromere Anordnungen mit RyR1 oder RyR3 in vivo auftreten 15,16,17,18.

Durch die Isolierung von Vesikeln aus bestimmten Regionen des Herzens und des Gehirns ermöglicht diese Methode die Untersuchung möglicher gewebespezifischer Unterschiede in der RyR2-Organisation. Wir nutzen die Eigenschaften von RyR2 in Herzgewebe, wo es nur Homotetramere bilden kann, um eine statistisch robuste Grundlage für die ex vivo Einzelmolekül-Untereinheiten-Stöchiometrie zu schaffen, und die bekannte Tetrameranordnung dient als Kontrolle für die Untersuchung unbekannter Anordnungen in anderen Organen. Die Fähigkeit, Rezeptoren in ihrem nativen Zustand abzubilden und gleichzeitig ihre physiologischen Wechselwirkungen zu erhalten, bietet einen robusten Rahmen für die Untersuchung der Rezeptorassemblierung in verschiedenen Organen und unter unterschiedlichen physiologischen Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Vesikelisolierung, Immobilisierung und Einzelmolekül-Bildgebung von GFP-markiertem RyR2 und ermöglicht eine präzise Charakterisierung der Rezeptorstöchiometrie. Diese Technik verbessert nicht nur unser Verständnis der RyR2-Organisation in kardialen und neuronalen Geweben, sondern bietet auch breitere Anwendungen für die Untersuchung der Rezeptorassemblierung und -regulation in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten 19,20,21.

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

1. Transkardiale Perfusion und Organextraktion
   1. Betäuben Sie die Maus mit CO₂, bis die Atmung aufhört.
   2. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen.
   3. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie entlang des Bauches und verlängern Sie ihn seitlich in Richtung Brustkorb, um die Brusthöhle freizulegen.
   4. Führen Sie vorsichtig eine Nadel in den linken Ventrikel ein und durchschneiden Sie den rechten Vorhof, um eine perfusierte Drainage zu ermöglichen.
   5. Zur Vesikelvorbereitung mit kaltem 1x PBS perfundieren, bis das Kreislaufsystem vom Blut befreit ist.
   6. Bei Kryosektionen setzen Sie nach der PBS-Perfusion die Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fort, um das Gewebe zu fixieren.
   7. Das Herz vorsichtig herausziehen und sofort auf Eis legen.
   8. Schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig entlang der Mittellinie der Kopfhaut und schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
   9. Machen Sie einen Schnitt an der Schädelbasis in der Nähe des Foramen magnum.
   10. Hebeln Sie den Schädel vorsichtig mit einer feinen Pinzette entlang der Längsfissur auf und entfernen Sie Knochenfragmente, um das Gehirn freizulegen.
   11. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einer gekrümmten Pinzette an und durchtrennen Sie die Hirnnerven, um es vollständig intakt zu extrahieren.
   12. Bei Verwendung für Kryosektionen das Gehirn 24 h lang in 4 % PFA bei 4 °C postfixieren.
   13. Wenn es zur Vesikelvorbereitung verwendet wird, legen Sie das Gehirn sofort ohne Fixierung für die weitere Verarbeitung auf Eis.
2. Kryosektion
   1. Entfernen Sie das Gehirn oder das Herz von 4% PFA und tupfen Sie es trocken.
   2. Betten Sie das gesamte Organ in eine OCT-Verbindung in einem Kryoformen ein.
   3. Frieren Sie das eingebettete Gewebe ein, indem Sie die Form in einen -80 °C Gefrierschrank legen, bis sie vollständig erstarrt ist.
   4. Vor dem Schneiden die Kryostatenkammer und den Probenkopf auf -20 °C äquilibrieren.
   5. Den gefrorenen OCT-Block aus dem -80 °C-Gefrierschrank in die Kryostatkammer überführen und 10 Minuten lang äquilibrieren lassen.
   6. Reinigen Sie das Probenfutter mit 70 % Ethanol, trocknen Sie es und tragen Sie eine dünne Schicht OCT als Klebstoff auf.
   7. Befestigen Sie den gefrorenen OCT-Block auf dem Futter und achten Sie dabei auf die richtige Ausrichtung.
   8. Setzen Sie das Spannfutter in den Kryostat-Probenhalter ein und stellen Sie die Klingenposition ein.
   9. Schneiden Sie überschüssige OCT ab, bis die Gewebeoberfläche freiliegt.
   10. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 10 μm und sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern.
   11. Nachdem die Profile 1 h lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet wurden, werden die Profile mit Eindeckmedien versehen und mit einem Deckglas versiegelt.
   12. Lassen Sie das Eindeckmedium aushärten, bevor Sie die Dias für die Bildgebung bei 4 °C lagern.
3. Vorbereitung der Vesikel
   1. Vorbereitung von Herzvesikeln
      1. Entnehmen Sie das Herz nach transkardialer Perfusion mit 1x PBS und legen Sie es auf Eis.
      2. Präparieren Sie mit einem sterilen Skalpell etwa 30 mg Ventrikelmuskel aus dem unteren Teil des Herzens.
      3. Übertragen Sie das Gewebe in ein Zentrifugenröhrchen mit 4-5 ml 10 mM NaHCO₃ und 5 mM NaN₃, um die Integrität der Vesikel zu erhalten.
      4. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator, bis es vollständig lysiert ist.
      5. Das Homogenat wird 20 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert, um große Rückstände zu entfernen und den Überstand aufzufangen.
      6. Führen Sie eine Ultrazentrifugation bei 37.000 × g für 65 min durch, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3-4 ml 20 mM Trismaleat-Puffer (pH 6,8) mit 0,6 M KCl.
      7. Wiederholen Sie die Ultrazentrifugation bei 37.000 × g für weitere 65 Minuten, um gelöstes Aktomyosin zu entfernen.
      8. Das fertige Pellet wird in 0,5 ml 20 mM Tris-Maleat-Puffer (pH 6,8) mit 50 mM KCl resuspendiert, um die Herzvesikellösung zu erhalten und bei -80 °C zu lagern.
   2. Vorbereitung der Hirnvesikel
      1. Entnehmen Sie das Gehirn nach transkardialer Perfusion mit 1x PBS und legen Sie es auf Eis.
      2. Schneiden Sie das Gehirn mit einer 1 mm großen koronalen Matrix des Mausgehirns in 1-mm-Abschnitte.
      3. Identifizieren Sie den dritten und vierten Abschnitt des Riechkolbens und zerlegen Sie sorgfältig: 1) die äußerste kortikale Schicht von beiden Hemisphären; 2) der Hippocampus, der sich in der zentralen Region des Schnitts befindet.
      4. Isolieren Sie das Kleinhirn vom hinteren Ende, indem Sie an seiner Basis einen Querschnitt machen.
      5. Poolen Sie die gleichen Hirnregionen von fünf Mäusen, um eine ausreichende Vesikelausbeute zu gewährleisten.
      6. Homogenisieren Sie das Gewebe sofort mit einem Dounce-Homogenisator in 2 mL kaltem Homogenisierungspuffer (0,32 M Saccharose, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, Proteasehemmer, pH 7,4).
      7. Fügen Sie 3 ml zusätzlichen Homogenisierungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 200 × g , um große Gewebefragmente zu entfernen.
      8. Der Überstand wird aufgefangen und bei 1.000 × g 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Kernfraktion zu entfernen.
      9. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 × g für 20 min bei 4 °C weiter, um Mitochondrien zu entfernen.
      10. Der resultierende Überstand wird bei 100.000 × g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugiert, um die Vesikel zu pelletieren.
      11. Resuspendieren Sie das endgültige Vesikelpellet in 1x PBS, um die Hirnbläschenlösung zu erhalten, und lagern Sie sie bei -80 °C.
4. Charakterisierung von Nanovesikeln mittels Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
   1. Montieren Sie die Detektionszelle gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie die kompatible Software.
   3. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit deionisiertem (DI) Wasser und spülen Sie den Systemschlauch manuell, bis der Hintergrund frei von Verunreinigungen ist.
   4. Bereiten Sie die Nanovesikelprobe vor, indem Sie sie in 1x PBS verdünnen.
   5. Laden Sie ~1 ml der verdünnten Nanovesikelprobe in eine saubere 1-ml-Spritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen.
   6. Injizieren Sie die Probe manuell in die Detektionszelle und stellen Sie den Fokus ein, bis die Vesikel deutlich sichtbar sind.
   7. Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate in der Hardware-Blende auf 200 μL/s ein.
   8. Stellen Sie im SOP-Panel die Messdauer auf 60 s und die Anzahl der Zyklen auf 5 ein und vergewissern Sie sich, dass die Temperaturregelung aktiviert und auf 25 °C eingestellt ist. Speichern Sie die Einstellungen als neue SOP, indem Sie auf SOP speichern klicken und die Datei entsprechend benennen (z. B. "nanovesicle_standard.sop").
   9. Konfigurieren Sie im Capture-Bedienfeld die Geräteeinstellungen, indem Sie eine Kamerastufe von 13 und einen anfänglichen Erkennungsschwellenwert von 3 auswählen.
   10. Klicken Sie auf Ausführen und wählen Sie die zuvor gespeicherte SOP aus. Die Software führt die Messung automatisch gemäß den Einstellungen durch.
   11. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren , um jedes Video zu verarbeiten. Passen Sie den Nachweisschwellenwert an, um sicherzustellen, dass alle Partikel deutlich sichtbar sind, und klicken Sie nach Abschluss der Stapelanalyse auf Fertig stellen . Exportieren Sie das Ergebnis, indem Sie auf Daten exportieren | Alle Messungen und speichern Sie sie als CSV-Datei zur späteren Verwendung.
   12. Spülen Sie das System nach Abschluss des Experiments mit ~ 2 mL DI-Wasser, bis keine verbleibenden Vesikel mehr übrig sind.
   13. Injizieren Sie Luft durch den Schlauch, um verbleibende Flüssigkeit zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass das System für den nächsten Gebrauch trocken ist.

2. Bildgebung

1. Konfokale Bildgebung von Gewebekryoschnitten
   1. Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop ein und öffnen Sie die verknüpfte Software.
   2. Wählen Sie das passende Objektiv (20x Luft oder 60x Öl) und legen Sie den vorbereiteten Kryoschnitt-Objektträger auf den Mikroskoptisch.
   3. Konfigurieren Sie die Lasereinstellungen für die GFP-Anregung mit einer 488-nm-Laserlinie mit einem 535/70-nm-Emissionsfilter.
   4. Optimieren Sie die Bildgebungsparameter, einschließlich der Lochblendengröße (28,9 μm), der Laserintensität (17 %) und der Detektorverstärkung (15,3), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und gleichzeitig das Photobleaching zu minimieren.
   5. Erwerben Sie bei Bedarf einen Z-Stapel, indem Sie die obere und untere Fokusebene festlegen und die entsprechende Schrittweite (0,275 μm) definieren.
   6. Aktivieren Sie das automatische Zusammenfügen von Bildern mit einer Bildüberlappung von 15 % bei der Aufnahme großflächiger Bilder.
   7. Passen Sie die Bildauflösung an und wenden Sie bei Bedarf die Rahmenmittelung an, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
   8. Nehmen Sie Bilder auf und speichern Sie sie im '.nd2'-Format für weitere Analysen.
2. Totalreflexionsfluoreszenz-Bildgebung (TIRF)
   1. Vesikelimmobilisierung über biokompatiblen Anker für Membran (BAM) Methode²²
      1. Reinigen Sie 35-mm-Glasbodenschalen, indem Sie sie 1 h lang bei 45 °C mit 5 M NaOH beschallen, gefolgt von drei gründlichen DI-Wasserspülungen.
      2. Die Schalen werden weitere 1 h bei 45 °C in 0,1 M HCl beschallt, gefolgt von drei weiteren DI-Wasserspülungen.
      3. Behandeln Sie die gereinigte Glasoberfläche 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 % 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in Ethanol, um funktionelle Amingruppen einzuführen.
      4. Spülen Sie die Schüssel 3x mit DI-Wasser und Ethanol aus, um überschüssiges APTES zu entfernen und trocknen zu lassen.
      5. Inkubieren Sie die Schale mit 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) in 1x PBS für 10 min.
      6. Spülen Sie das Geschirr mit PBS, um nicht umgesetztes Reagenz zu entfernen.
      7. Vesikel in der gewünschten Konzentration einführen und 15 Minuten inkubieren, um die Vesikelbindung zu ermöglichen.
      8. Spülen Sie die Schale vorsichtig mit PBS aus, um ungebundene Vesikel zu entfernen, während Sie sicherstellen, dass die immobilisierten Vesikel anhaften.
   2. Aufbau und Erfassung der TIRF-Bildgebung
      1. Schalten Sie das inverse Fluoreszenzmikroskop, die 488-nm-Laserquelle und die EMCCD-Kamera ein.
      2. Starten Sie die Metamorph- und CellSens-Software, um die Bildgebungssteuerung zu initialisieren.
      3. Reinigen Sie das 60x Ölimmersionsobjektiv (1,49 NA APO) mit Methanol, um Staub und Ölreste zu entfernen.
      4. Tragen Sie einen kleinen Tropfen Brechungsindex (RI) passendes Immersionsöl auf die Objektivlinse auf.
      5. Stellen Sie die vorbereitete Vesikelschale auf den Mikroskoptisch und stellen Sie sicher, dass sie für eine optimale Ausrichtung zentriert ist.
      6. Stellen Sie den Fokus des Laserstrahls ein, indem Sie den Anregungsstrahl im Epifluoreszenzmodus in der Mitte der hinteren Apertur des Objektivs zentrieren.
      7. Verwenden Sie den Schrittmotor, um den Lasereinfallswinkel bis zum Erreichen des kritischen Winkels einzustellen, um eine vollständige interne Reflexion an der Glasoberfläche zu gewährleisten.
      8. Identifizieren Sie die Fokusebene, indem Sie durch die Z-Achse scannen und Folgendes unterscheiden: 1) die erste Fokusebene, die der Glasbodenfläche entspricht; 2) die zweite Fokusebene, die der vesikelimmobilisierten Oberfläche entspricht.
      9. Sobald die Vesikel scharf gestellt sind, wenden Sie den Autofokus in CellSens an, um die Objektivposition in dieser Ebene zu fixieren und eine Drift während der Bildgebung zu verhindern.
      10. Schalten Sie den Laser vorübergehend aus und bringen Sie den Mikroskoptisch in ein neues Sichtfeld, das noch keinem Anregungslicht ausgesetzt war.
      11. Starten Sie die Aufnahme, während Sie gleichzeitig den Laser einschalten, um sicherzustellen, dass der gesamte Photobleaching-Prozess ohne vorherige Belichtung erfasst wird.
      12. Erfassen Sie Bilder mit den folgenden Parametern: Belichtungszeit: 100 ms pro Bild, Aufnahmemodus: 900 Serienbilder pro Sichtfeld, Verstärkungseinstellung: 1.400.
      13. Wiederholen Sie den Vorgang für mehrere Sichtfelder, um eine ausreichende Datenerfassung sicherzustellen.
      14. Speichern Sie Bildstapel im TIFF-Format für die weitere Verarbeitung.

3. Bildverarbeitung und Datenanalyse

1. Konfokale Bildverarbeitung
   1. Öffnen Sie die aufgenommenen konfokalen Bilder in der verknüpften Software.
   2. Passen Sie die Einstellungen für die Look-up-Tabelle (LUT) an, um Helligkeit und Kontrast zu optimieren.
   3. Wenden Sie die gleichen LUT-Anpassungen gleichmäßig auf alle Bilder an, um die visuelle Konsistenz zu wahren.
2. TIRF-Videoverarbeitung und Fluoreszenzintensitätsanalyse
   1. Videoverarbeitung zur Visualisierung
      1. Öffnen Sie die erfassten TIRF-Bildstapel (TIFF-Format) in ImageJ zur Visualisierung.
      2. Passen Sie Helligkeit und Kontrast an, um die Signalklarheit zu verbessern und sicherzustellen, dass fluoreszierende Vesikel leicht vom Hintergrund zu unterscheiden sind.
      3. Exportieren Sie angepasste Bilder zur Präsentation oder weiteren qualitativen Analyse.
   2. Analyse der Photobleaching-Schritte
      1. Extrahieren von Zeitspuren
         1. Öffnen Sie das MATLAB-Skript (siehe Ergänzende Datei 1) mit dem Namen "getTimeTraces.m" und führen Sie es aus. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) auf "Film laden " und wählen Sie die TIRF-Imaging-.tiff-Datei aus, um den Vesikel-Movie-Stack zu importieren.
         2. Klicken Sie auf Peaks suchen , um Einzelmolekül-Fluoreszenzsignale automatisch zu identifizieren. Signalbereiche werden im Vorschaufenster mit Kreisen markiert.
         3. Klicken Sie auf Daten füllen. Dadurch wird die Zeitintensitätskurve für jeden Punkt zur nachgelagerten Analyse in eine .xlsx Datei exportiert.
      2. Manuelle Schrittzählung
         1. Führen Sie das Skript "simpleGraph.m" aus (siehe Ergänzende Datei 1), um die GUI zu starten, klicken Sie auf Datendateien laden und wählen Sie die .xlsx Datei aus, die in Schritt 3.2.2.1.3 generiert wurde.
         2. Überprüfen Sie die Bleichschritte jeder Zeitspur, die im linken Bereich angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass nur Spuren, die die folgenden Kriterien erfüllen, für die Analyse akzeptiert werden: 1) Die Zeitspur enthält mindestens einen eindeutigen Bleichschritt. 2) Die Dauer eines Schritts beträgt mindestens 1 s. 3) Der Intensitätsunterschied zwischen den Stufen beträgt mindestens das 3-fache der Standardabweichung der Intensität nach dem Bleichen.
         3. Suchen Sie auf der rechten Seite das Feld Schritt # und geben Sie mit den Tasten + oder - die Anzahl der Photobleaching-Schritte für jede Spur ein.
         4. Nachdem Sie jeden Eintrag abgeschlossen haben, klicken Sie auf Weiter , um zum folgenden Trace zu wechseln. Sobald alle Ablaufverfolgungen verarbeitet sind, generiert und speichert die Software automatisch eine .txt Datei, in der die Schrittzahl jeder Ablaufverfolgung aufgezeichnet wird.
      3. Zusammenfassung der Schrittzahl
         1. Führen Sie das Skript "CombinedFiles.m" aus (siehe Ergänzende Datei 1), um die GUI zu öffnen.
         2. Geben Sie den gewünschten Namen für die Zusammenfassungsausgabe in das Textfeld ein.
         3. Klicken Sie auf Mehrere simpleGraph-Ergebnisse in einer Datei kombinieren. Wählen Sie im Dateibrowser eine oder mehrere gewünschte .txt Dateien aus, die aus Schritt 3.2.2.2.3 generiert wurden. Das Skript kompiliert automatisch alle Schrittzahldaten und generiert eine kombinierte .xlsx Datei, in der die Häufigkeit von 1-Schritt, 2-Schritt zusammengefasst ist,... Spuren.

Ergebnisse

Um die Anwendbarkeit dieser Methode zu bestätigen, haben wir zunächst die Expression und Lokalisation von GFP-RyR2 durch konfokale Bildgebung von kardialen und neuronalen Gewebekryoschnitten verifiziert (Abbildung 1). Das Fluoreszenzsignal im Herzgewebe zeigte ein quer gestreiftes Muster, das mit der erwarteten Lokalisation von RyR2 in Kardiomyozyten übereinstimmte, zeigte jedoch in bestimmten Regionen des Gehirns, nämlich Kortex, Hippocampus und Kleinhirn, e...

Diskussion

Diese Studie etabliert ein detailliertes und reproduzierbares Protokoll für die ex vivo Verkapselung und Einzelmolekül-Bildgebung von Membranrezeptoren unter Verwendung von GFP-markiertem RyR2 als Modellsystem. Das Protokoll verbessert die derzeitigen Methoden erheblich, indem es die stöchiometrische Analyse von Rezeptorkomplexen direkt aus nativem Gewebe ermöglicht, wobei der physiologische Kontext von Membranproteinen erhalten bleibt. Im Vergleich zu herkömmlichen In-vitro-Exp...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Schüssel | Nr. 1.5 Deckglas | 14 mm Glasdurchmesser	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Tissue-Tek Cryomold Formen/Adapter	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML(	3-Aminopropyl)triethoxysilan
Bio-Gen PRO200 Labor Homogenisator	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
EMCCD Kamera	Andor	n/a	iXon Ultra 897
Ethanol absolut ≥ 100% (v/v) Alleinstellungsmerkmal für Molekularbiologie (200 Proof)	VWR	71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	Kryostat
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300 (mit Nanosight NTA Software)	Malvern Panalytical	n/a
Nikon AXR Inverses Konfokales Mikroskop	Nikon	n/a
Olympus IX83 Motorisiertes Autofokus-Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus	n/a	TIRFM
Paraformaldehyd 4% in PBS gebrauchsfertiges Fixiermittel Reagenz	VWR	76221-378
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20x, ultrareine Qualität	VWR	97062-950
Natriumhydroxid, Kügelchen, Reagenz Klasse	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	M71484
VectaMount AQ Wässriges Eindeckmedium	Vektorlaboratorien	H-5501-60