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Methodenartikel

Automatisierung der Tumorimplantation in Zebrafischlarven für Krebsforschung und Medizin

1.6K Aufrufe

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DOI:

10.3791/68441

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19. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Norwegian Centre for Molecular Biosciences and Medicine (NCMBM), University of Oslo, 2Life Science Methods BV, 3BioReperia AB, 4ZeClinics SL, 5Division of Diagnostics and Specialist Medicine, Linköping University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die automatisierte Implantation von Tumor-Xenotransplantaten in Zebrafischlarven mit Hilfe eines hochmodernen robotergestützten Injektionssystems vor. Darüber hinaus präsentieren wir Injektionsvideos und Validierungsdaten, die die erfolgreiche Leistung des Systems belegen.

Zusammenfassung

Zebrafischlarveninjektionen, einschließlich der subkutanen und hirnorthotopen Tumor-Xenotransplantation sowie der intravenösen Verabreichung von Medikamenten, sind zu zentralen Techniken in der Zebrafisch-basierten Forschung geworden. Diese Verfahren sind jedoch nach wie vor langwierig, technisch anspruchsvoll und hängen stark von den Fähigkeiten des Bedieners ab, was den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit einschränkt. Um diese Einschränkungen zu beheben, führen wir ein fortschrittliches Robotersystem ein, das Mikroinjektionen in Zebrafischlarven automatisiert und so die Effizienz, Präzision und Reproduzierbarkeit gegenüber manuellen Injektionen erheblich verbessert. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für den Betrieb des automatisierten Injektors zur Verfügung, einem Hochdurchsatzsystem, das in der Lage ist, Flüssigkeiten, Partikel oder Krebszellen an drei verschiedenen anatomischen Stellen mit überlegener Genauigkeit und Geschwindigkeit im Vergleich zu geschulten Zebrafischforschern zu fördern. Wir skizzieren die wesentlichen Schritte, einschließlich Einrichtung, Kalibrierungen, Injektionsverfahren und Fehlerbehebung, um eine optimale Leistung zu gewährleisten. Darüber hinaus stellen wir repräsentative Beispiele für Ergebnisse aus dem Einsatz des Roboters vor und diskutieren sein Potenzial, großflächige Larveninjektionen zu ermöglichen, auch für Wirkstoffscreenings und die Präzisionsmedizin. Durch die Integration eines automatisierten Injektors in die Arbeitsabläufe können Forscher die Einschränkungen manueller Injektionen überwinden und die präklinische Wirkstoffforschung und die personalisierte Behandlungsauswahl beschleunigen.

Einleitung

Mit zunehmendem Verständnis des Krebsverhaltens und der Arzneimittelresistenz wird immer deutlicher, dass eine bessere Diagnose, Charakterisierung und therapeutische Ausrichtung von Krebssubtypen erforderlich ist. In den letzten zwanzig Jahren sind die Veröffentlichungen auf dem Gebiet der personalisierten Medizin (auch als Präzisionsmedizin bekannt) gestiegen 1,2. In der Tat wird Präzisionsmedizin definiert als die Praxis, die medizinische Behandlung auf der Grundlage der Krankheitsmerkmale des einzelnen Patienten anzupassen3. Dies folgt unserem derzeitigen Verständnis, dass es keinen One-Drug-fits-all-Ansatz gibt, der in der Krebstherapie besonders deutlich und relevant geworden ist. Derzeit bedeutet der Mangel an klinisch relevanten präzisionsmedizinischen Ansätzen für die meisten Krebspatienten jedoch, dass der Prozess der Auswahl der am besten geeigneten Behandlungsstrategie durch Versuch und Irrtum erfolgt. Dies führt zu erheblichen Verzögerungen und unnötigen Beschwerden mit verminderter Lebensqualität und verkürztem Überleben. Wichtig ist, dass sich ein Patient mit verminderter Lebensqualität nach mehreren unwirksamen Chemotherapien für eine palliative Behandlung entscheiden kann4. Mit einer geeigneten, personalisierten Screening-Methode kann die Wirkstoffauswahl mit höherer Präzision und ohne Verzögerung durchgeführt werden. Es ist zwar möglich, genetische und proteomische Sequenzierungen an Krebszellen durchzuführen5, aber solche molekularen Daten sind insgesamt schlecht prädiktiv für das Patientenergebnis und haben oft einen geringen klinischen Wert6. In der Arzneimittelentwicklung verbessert ein möglichst früher Ansatz der Präzisionsmedizin die Erfolgsquoten bei den verschiedenen Meilensteinen der Arzneimittelentwicklungspipeline erheblich. In der Tat verringert das frühzeitige Verständnis, welche Wirkstoffkandidaten das breiteste interindividuelle Wirksamkeitsprofil aufweisen oder welche Krebssubtypen besonders empfindlich auf jeden Arzneimittelkandidaten reagieren, das Risiko und verbessert die Effizienz später präklinischer Tests und klinischer Studien7. Angesichts steigender pharmazeutischer F&E-Kosten8, des wachsenden politischen Drucks, die Arzneimittelpreise zu senken 9,10 und der Fortschritte bei der KI-gesteuerten Zielvalidierung11 war der Bedarf an einer groß angelegten, effizienten und präzisionsmedizinisch ausgerichteten Screening-Methode in der Arzneimittelentwicklung noch nie so groß wie heute.

Hier kommen Zebrafische ins Spiel, insbesondere Zebrafischlarven 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Tumor-Xenotransplantatmodelle, die auf Zebrafischlarven als Wirte basieren, stellen eine schnelle in vivo-Screening-Plattform dar, um das klinische Ansprechen auf eine Chemotherapie vorherzusagen 6,12,13,14. Zebrafisch-Tumor-Xenotransplantat-Modelle haben sich als leistungsstarke Alternative sowohl zur molekularen Präzisionsmedizin (d. h. genomische oder molekularpathologische Ansätze zur Unterstützung der Behandlungswahl für Krebspatienten) als auch zu Organoid- und Maus-Xenotransplantat-Studien für die präklinische Arzneimittelentwicklung herausgestellt15,16. Mit Zebrafisch-Tumor-Xenotransplantaten werden fluoreszierende Tumorzellen (genetisch oder chemisch markiert) mit hoher Effizienz in Zebrafischlarven transplantiert13. Medikamente oder Wirkstoffkandidaten mit einem relativ schnellen Wirkmechanismus (z. B. solche, die direkt oder indirekt über z. B. die Aktivierung der T-Zell-Zytotoxizität auf die Lebensfähigkeit von Tumorzellen abzielen) können dann in nur drei Tagen gescreent werden, was zu schnellen, funktionellen Messwerten der Wirksamkeit von Krebs- und Antimetastasierungsmedikamenten führt. Im Anschluss daran kann eine fundierte Auswahl der Therapie getroffen werden, die eine gute Wirksamkeit zeigt, wobei Studien zeigen, dass dies zu einem starken Behandlungsergebnis für den Patienten bzw. zu einer Erfolgschance in einem Arzneimittelentwicklungsprojekt führen sollte 12,17,18,19. Darüber hinaus ist dieser Screening-Prozess von großer Bedeutung für die Auswahl von Wirkstoffen, die in der Wirkstoffentwicklungspipeline vorangetrieben werden sollen.

Um jedoch ein brauchbares diagnostisches Instrument im klinischen Umfeld zu werden und groß angelegte Wirkstoffscreenings in der Krebsforschung und -entwicklung zu ermöglichen, muss das Zebrafisch-Tumor-Xenotransplantat-Modell (ZTX) schnell, zuverlässig, reproduzierbar und kostengünstig sein. Um diese Ziele zu erreichen, ist die Automatisierung unerlässlich, da sie die Variabilität des Bedieners minimiert und gleichzeitig den Durchsatz erhöht und die Präzision bei der Injektion und Analyse von Tumorzellen erhöht. Durch die Standardisierung dieser Verfahren können wir die Reproduzierbarkeit der Daten verbessern und menschliche Fehler eliminieren, während die automatisierten Arbeitsabläufe Möglichkeiten für ein Hochdurchsatz-Screening bieten und groß angelegte Studien möglich machen20,21. Vor kurzem haben wir einen automatisierten Injektor entwickelt, der Flüssigkeiten, Partikel oder Zellen unterschiedlicher Herkunft an drei verschiedenen anatomischen Stellen mit gleicher oder höherer Geschwindigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit injiziert als ausgebildete Zebrafischforscher22. Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem Tumorzellen präzise und kontrolliert automatisiert in Zebrafischlarven injiziert werden können. Mit Hilfe einer fortschrittlichen Bilderkennung werden Zebrafischlarven auf der Injektionsplatte lokalisiert, die Ausrichtung bestimmt und der Zielort für die Injektion identifiziert. Die Nadel wird dann automatisch geführt und eine erfolgreiche Punktion wird von der Software ermittelt. Mit minimalem Schulungsaufwand können die Bediener dieses System verwenden, um komplexe Injektionen durchzuführen, z. B. Mikrotumore in lebenden Zebrafischlarven zu erzeugen und so ein effizientes Screening von Behandlungsstrategien zu ermöglichen.

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Protokoll

Die Zebrafischlinien wurden nach Standardprotokollen (https://zfin.org) gepflegt und in Übereinstimmung mit den lokalen Tierschutzbestimmungen behandelt. Mit diesen Verordnungen werden die Leitlinien des Europarats zum Schutz von Versuchstieren (Richtlinie 86/609/EWG) umgesetzt, die die Verwendung von Zebrafischlarven bis zum Beginn der freien Fütterung (5 Tage nach der Befruchtung) erlauben. Da alle in dieser Studie verwendeten Larven nicht älter als 5 Tage waren, war gemäß der Richtlinie 86/609/EWG keine ethische Zulassung erforderlich.

HINWEIS: Dechorionierte 48 hpf Zebrafischlarven und das Material, das in diese Larven injiziert werden soll, sollten vor Beginn des Verfahrens mit dem automatischen Injektor vorbereitet werden. Protokolle hierfür finden Sie in den ergänzenden Methoden (Ergänzende Datei 1), die diesem Artikel beigefügt sind. Eine schematische Darstellung des Protokoll-Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Ergänzende Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Entwicklungsstadien von Zebrafischembryonen.

1. Vorbereitung der Mikronadel

HINWEIS: Für die Injektionen werden Mikronadeln benötigt, die ein wesentliches Element des Injektionsprozesses sind, um Fehler zu beheben und für diesen Zweck abzustimmen. Im automatisierten Injektor können sowohl handelsübliche als auch manuell hergestellte Nadeln verwendet werden. Im Folgenden finden Sie das Verfahren zum manuellen Ziehen von Mikronadeln mit dem Sutter Instrument P-1000 oder PC-10, obwohl die meisten Mikronadelabzieher in ihrer Funktionsweise ähnlich sind. Die bevorzugte Nadelmorphologie ist eine allmähliche 6-8 mm Verjüngung mit einer Spitzengröße von 0,3-0,7 μm, die vor der Injektion mit einer scharfen Pinzette manuell aufgebrochen wird.

  1. Bereiten Sie geeignete Kapillaren aus Borosilikatglas vor: 1,0 mm AD, 0,78 mm Innendurchmesser (ID). Stellen Sie sicher, dass sie sauber und frei von Staub und Schmutz sind.
  2. Prüfen Sie, ob die Heizspirale intakt und in gutem Zustand ist.
  3. Setzen Sie die Glaskapillare in die Klemmen ein und befestigen Sie sie mit den Klemmschrauben fest, jedoch nicht so fest, dass das Rohr reißt.
  4. Passen Sie die Einstellungen an: Heizstufe, Zugkraft und Rampenzeit. Bei Verwendung eines Nadelabziehers PC-10 wird die korrekte Nadelmorphologie durch einen einstufigen Zug mit der Heizstufe 68 und vollen Gewichten erreicht.
    HINWEIS: Diese Einstellungen beeinflussen die Länge und Breite der Spitzenverjüngung und können je nach Wandstärke der Kapillare variieren. Hier ist Versuch und Irrtum gefragt, um das beste Ergebnis zu erzielen.
  5. Entfernen Sie die Nadeln vorsichtig von den Klemmen, um die Spitze nicht zu beschädigen. Überprüfen Sie die Spitze, um eine gleichmäßige Verjüngung sicherzustellen.
  6. Bewahren Sie die Mikronadeln sorgfältig auf Klebeband auf und achten Sie darauf, dass die empfindliche Spitze keine Oberfläche berührt.

2. Vorbereitung der Agarose-Gelplatte für die Roboterinjektion

  1. Wiegen Sie 0,6 g Agarose und füllen Sie sie in eine 100-ml-Glasflasche um.
  2. Mit einem Messzylinder 40 mL E3-Lösung abmessen. Geben Sie es in die Glasflasche mit der Agarose, um eine 1,5%ige Agaroselösung herzustellen.
  3. Stellen Sie die Glasflasche in die Mikrowelle und erhitzen Sie sie 30 s lang bei 900 W. Erhitzen Sie dann weiter in 30-s-Schritten und schwenken Sie den Inhalt zwischen jedem Intervall (mit Handschuhen), bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, da das Kochen auch durch Verwirbeln beginnen kann.
  4. Nach dem Schmelzen die Agarose abkühlen lassen, indem Sie die Außenseite der Glasflasche unter fließendem Wasser spülen, bis sie sich warm, aber nicht heiß anfühlt (ca. 60 °C).
  5. Reinigen und trocknen Sie den wiederverwendbaren Tellerhalter und die Glasschiene gründlich. Montieren Sie es, indem Sie den Glasschieber in den Schlitz an der Seite des Plattenhalters schieben (Ergänzende Abbildung 2A) und platzieren Sie ihn auf einer ebenen Fläche.
    HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Glasplatte nicht aus der Seite des Halters herausragt.
  6. Gießen Sie etwa 40 ml der Agarosemischung auf die Glasplatte und stellen Sie sicher, dass sie sich über die gesamte Oberfläche verteilt. Kippen Sie ggf. so, dass alle Kanten erreicht sind.
  7. Die Agarose ca. 5 min fest werden lassen. Die Platte ist dann gebrauchsfertig.
    HINWEIS: Die Zugabe von E3-Lösung auf der Oberfläche der festen Agaroseplatte kann ein Austrocknen verhindern. Es sollte jedoch vor seiner Verwendung für Injektionszwecke entfernt werden.

3. Platzieren der Zebrafischlarven auf der Agarose-Gelplatte

  1. Befeuchten Sie die Agarose-Gelplatte mit E3-Lösung.
  2. Halten Sie die Platte schräg, damit die überschüssige E3-Lösung aufgefangen werden kann.
  3. Eine E3-Lösung mit 40 μg/ml Tricain in einer Petrischale zubereiten. Legen Sie ca. 20 Larven in die Lösung und lassen Sie sie 2 Minuten lang betäuben.
  4. Legen Sie vorsichtig 10-20 betäubte Larven auf die Platte (Ergänzende Abbildung 2B) und stellen Sie sicher, dass überschüssiges Wasser auf natürliche Weise abfließt.
  5. Achten Sie darauf, dass die Larven ausgebreitet sind, sich nicht berühren, und vermeiden Sie es, sie zu nahe (5-10 mm) am Rand der Platte zu positionieren (Ergänzende Abbildung 2B).
  6. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Platte und achten Sie darauf, dass die Larven feucht bleiben.
    HINWEIS: Übermäßige Flüssigkeit kann während der Injektion zu unbeabsichtigten Larvenbewegungen führen, während ein unzureichender Feuchtigkeitsgehalt die Sterblichkeitsrate erhöhen kann.

4. Laden der Mikronadel

HINWEIS: Beladen Sie die Mikronadel mit fluoreszierenden Zellen hoher Dichte, kurz bevor Sie eine Injektion durchführen. Zellen können genetisch einen fluoreszierenden Marker exprimieren, oder es kann eine chemische Markierung verwendet werden23. Obwohl die Anzahl der Zellen, die in jede Larve injiziert werden, vergleichsweise gering ist, typischerweise 700 bis 900 Zellen, muss die Zelldichte in der Injektionsphase hoch sein. etwa 300.000 bis 500.000 Zellen pro μl, was hauptsächlich auf das winzige Volumen (ca. 2 nL) zurückzuführen ist, das injiziert wird.

  1. Die Zellsuspension bei 200 × g 5 min zentrifugieren und das Zellmedium entfernen.
  2. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und resuspendieren Sie das Pellet dann in sterilem PBS bei Raumtemperatur (RT), um eine endgültige Dichte von 300.000 Zellen/μl zu erreichen.
  3. Nehmen Sie eine vorbereitete Mikronadel und halten Sie sie vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger. Laden Sie dann die Mikronadel mit einer Microloader-Pipettenspitze mit 1-10 μl der Zellsuspension, abhängig von der Anzahl der Zellen.
    HINWEIS: Führen Sie die Spitze bis zum Ende der Mikronadel ein und ziehen Sie sie langsam heraus, während sie gefüllt wird.
  4. Brechen Sie mit einem Stereomikroskop mit 4-facher Vergrößerung und einer feinen Pinzette vorsichtig die versiegelte Spitze der Mikronadel ab, um eine Öffnung zu erzeugen. Dieser Schritt kann auch vor dem Laden einer Injektionssuspension durchgeführt werden.
    HINWEIS: Eine abgeschrägte Nadelspitze erleichtert die Punktion und kann mit einem Nadelschleifer hergestellt werden. Wenn Sie einen Nadelschleifer verwenden, schrägen Sie die Nadelspitze ab, bevor Sie die Injektionssuspensionen laden. In diesem Fall ist die Nadel bereits geöffnet, bevor die Zellen geladen werden.

5. Bedienung des Roboters für die Mikroinjektion

  1. Führen Sie den Bootvorgang aus.
    1. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Gasversorgung angeschlossen und eingeschaltet ist.
      HINWEIS: Der empfohlene Eingangsdruck von einem Luftkompressor oder einem Luftventil in einer Laborumgebung mit zentralisierter Druckluft beträgt 0,6 MPa (6 bar). Der Luftkompressor oder das Ventil kann kontinuierlich eingeschaltet und offen bleiben, ohne dass ein häufiges Abschalten erforderlich ist. Für den Eingangsdruck kann Druckluft, Stickstoff oder CO2 verwendet werden.
    2. Stecken Sie ein USB-Laufwerk in einen der Anschlüsse an der Rückseite des Roboters (optional).
      HINWEIS: Vor dem Einschalten des Roboters sollte ein USB-Laufwerk in das Gerät eingesteckt werden, das erst nach dem Ausschalten des Roboters entfernt wird.
    3. Drücken Sie die grüne Ein-/Aus-Taste neben dem Bildschirm, um den Roboter einzuschalten (Ergänzende Abbildung 2C). Warten Sie, bis das Bedienfeld angezeigt wird (ca. 1 Minute).
    4. Prüfen Sie, ob links und rechts des Roboters 15 cm freier Platz vorhanden sind, und drücken Sie im Popup-Fenster auf OK (Ergänzende Abbildung 2D).
    5. Drücken Sie im nächsten Popup-Fenster (Ergänzende Abbildung 2E) über das USB-Laufwerk auf OK.
      HINWEIS: Dieses Popup-Fenster wird nicht angezeigt, wenn kein USB-Laufwerk angeschlossen ist.
  2. Stellen Sie den Anschluss für die Fernbedienung ein (optional).
    HINWEIS: Eine Fernbedienung wird verwendet, um die Maschine aus der Ferne zu betrachten und zu bedienen. Diese Funktion ist nützlich für Demonstrationen, Schulungen, Software-Updates und Fehlerbehebung.
    1. Stecken Sie ein Ethernet-Kabel in den Anschluss an der Rückseite des Geräts. Wenden Sie sich für die Ersteinrichtung an die IT-Abteilung, um Unterstützung zu erhalten.
    2. Tippen Sie auf das Menüsymbol in der oberen linken Ecke des Bildschirms (Ergänzende Abbildung 2F).
    3. Tippen Sie auf das Einstellungssymbol unten in der Mitte des Menüs (Ergänzende Abbildung 2F).
    4. Wählen Sie im Einstellungsmenü den Wartungsmodus aus (Ergänzende Abbildung 2G).
    5. Tippen Sie auf Mit LSM verbinden, um eine Remote-Verbindung herzustellen (Ergänzende Abbildung 2H).
  3. Nehmen Sie die Injektionseinstellungen vor.
    1. Tippen Sie im Menü auf Injektionseinstellungen (Ergänzende Abbildung 2F).
    2. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium der Zebrafischlarven für die Injektion (Ergänzende Abbildung 3A).
      HINWEIS: Für Injektionen in den Cuvier-Gang, den perivitellinen Raum und den Hinterhirnventrikel werden 48 hpf-Larven empfohlen, die bei 28,5 °C gehalten werden.
    3. Wählen Sie die bevorzugte Injektionsstelle aus den Optionen für die Durchführung von Injektionen aus (Ergänzende Abbildung 3B).
    4. Wählen Sie die Injektionsstelle im schematischen Diagramm einer Zebrafischlarve aus. Passen Sie die Position des Larvendiagramms, die Nadelspitze und die Nadelausrichtung so an, dass sie mit der ausgewählten Injektionsstelle übereinstimmt (Ergänzende Abbildung 3C).
      HINWEIS: Vorgeschlagene Nadelplatzierungen für verschiedene Injektionsstellen finden Sie in einer zuvor veröffentlichten Arbeit22. Bei der Injektion des Cuvier-Gangs (DoC) wird die Nadel aufgrund des höheren Blutflusses in diesem Bereich in der Regel in der Mitte des DoC platziert. Die Nadelausrichtung kann entweder dorsal oder ventral sein. Für die Injektion des Perivitellinraums (PVS) wird empfohlen, mit dem Einstechen der Nadel am Rand des Raumes zu beginnen und sie in einem Winkel von etwa 30-45° zur Chorda zu positionieren. Bei der Injektion von Hinterhirnventrikeln wird empfohlen, mit dem Einstechen der Nadel außerhalb des Hinterhirns zu beginnen, um ein Verrutschen zu verhindern. Der Nadelwinkel sollte zwischen den Augen und dem Vesikel oticus ausgerichtet sein.
    5. Wählen Sie das Einspritzmakro aus, das Optionen für den automatischen und den manuellen Modus bietet (Ergänzende Abbildung 3D).
      HINWEIS: Im automatischen Modus gibt der Name der Injektionsstelle an, dass der Injektionsprozess vom System autonom durchgeführt wird. Bei der manuellen Auswahl lokalisiert der Roboter die Larven selbstständig und nähert sich ihnen. Sobald die Larven identifiziert sind, erscheint eine Steuerschnittstelle, über die der Benutzer den Injektionsprozess bedienen kann.
    6. Sobald die Injektionseinstellungen abgeschlossen sind, tippen Sie auf Weiter zur Nadelkalibrierung , um mit der Kalibrierung der Nadel fortzufahren.
  4. Führen Sie die Nadelkalibrierung durch.
    HINWEIS: Da jede Nadel anders ist, muss die Position der Nadelspitze kalibriert werden. Die anfängliche Schnittstelle der Nadelkalibrierung ist in der ergänzenden Abbildung 3E dargestellt.
    1. Fassen Sie den Nadelhalter fest an und drehen Sie das Metallteil gegen den Uhrzeigersinn, um den Nadelhalter vom Roboter zu lösen.
    2. Führen Sie die stumpfe Seite einer gefüllten Nadel in die furokonische Seite des Nadelhalters ein.
    3. Tippen Sie auf Bühne verschieben, um das auf dem Bildschirm angezeigte Needl e zu montieren(Ergänzende Abbildung 3E). Der Tisch wird in eine sichere Position für die Montage der Nadel gebracht, und ein Lineal wird angezeigt (Ergänzende Abbildung 3F). Messen Sie die Länge der Nadel außerhalb des Nadelhalters mit dem Lineal. Er sollte etwa 22 mm betragen.
    4. Fassen Sie den Nadelhalter mit der gefüllten Nadel und drehen Sie das Metallteil im Uhrzeigersinn, um die Verbindung fest zu ziehen (Ergänzende Abbildung 3G). Drücken Sie OK , um fortzufahren.
    5. Positionieren Sie die Nadel im Popup-Bildschirm in der Mitte des Kreises (Ergänzende Abbildung 3H), indem Sie die beiden Schrauben an der Maschine verstellen (Ergänzende Abbildung 3I). Wenn Sie zentriert sind, tippen Sie auf das grüne Häkchen.
    6. Stellen Sie im nächsten Popup-Bildschirm (Ergänzende Abbildung 3J) den Fokus auf der Nadelspitze ein, indem Sie die Schraube an der Rückseite des Roboterkopfes drehen (Ergänzende Abbildung 3K). Wenn Sie fokussiert sind, tippen Sie auf das grüne Häkchen. Der Roboter kalibriert dann automatisch die Nadelhöhe. Anschließend dreht der Roboter die Nadel und zeigt bei jeder Umdrehung die Injektionspositionen als rote Punkte an (Ergänzende Abbildung 3L).
    7. Wenn Sie fertig sind, tippen Sie unten rechts auf dem Bildschirm auf Verstanden und Weiter zur Tröpfchenkalibrierung .
  5. Führen Sie eine Tröpfchenkalibrierung durch.
    HINWEIS: Die Tröpfchengröße wird durch eine Injektion in Mineralöl kalibriert.
    1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, wobei eine Well mit 10 mL Mineralöl und eine weitere Well mit 10 mL Reinigungspuffer (z. B. PBS oder Wasser) gefüllt ist. Platzieren Sie die 6-Well-Platte in der linken Position des Plattenhalters.
      HINWEIS: Bitte entfernen Sie während des (ganzen) Experiments den Deckel der 6-Well-Platte, damit sie wieder verwendet werden kann, wenn eine Nadel verstopft ist oder eine neue Nadel eingesetzt wird.
    2. Tippen Sie auf das Symbol neben Mit einer Well-Platte kalibrieren (Ergänzende Abbildung 4A).
    3. Wählen Sie die Positionen der Ölquelle und der Reinigungsbohrung aus (Ergänzende Abbildung 4B).
    4. Tippen Sie auf Tröpfchen erstellen , um ein Tröpfchen mit den Einstellungen zu erzeugen, die auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt werden (Ergänzende Abbildung 4C). Passen Sie den Einspritzdruck, den Gegendruck und die Dauer des Luftimpulses nach Bedarf an, um das Zielvolumen zu erreichen. Alternativ können Sie auf die Schaltfläche "Automatisch verbessern " tippen, um die Einstellungen automatisch zu optimieren und die gewünschte Lautstärke zu erreichen.
    5. Wenn die Nadel verstopft ist, drücken Sie die blaue Taste zum Reinigen der Nadel (Ergänzende Abbildung 4C), um einen Hochdruckreinigungsimpuls in der Vertiefung mit Wasser oder Medium zu aktivieren.
    6. Wenn Nadel und Tröpfchen verschwommen erscheinen, stellen Sie den Fokus der Nadel und des Tröpfchens mit der oberen dritten Taste auf der rechten Seite des Bildschirms ein (Ergänzende Abbildung 4C).
    7. Tippen Sie auf das grüne Häkchen , um den Bildschirm zu schließen.
  6. Plattenauswahl durchführen.
    1. Klicken Sie auf Tisch verschieben, um die Platte zu platzieren, und der Roboter bewegt den Tisch automatisch in eine geeignete Position zum Platzieren der Platte.
    2. Prüfen Sie, ob die Agarose-Gelplatte darunter trocken ist und platzieren Sie die Platte mit den betäubten Larven in der richtigen Position des Plattenhalters.
    3. Klicken Sie dann auf OK und tippen Sie auf Weiter zur Injektion , um mit dem Injektionsprozess fortzufahren (Ergänzende Abbildung 4D).
  7. Führen Sie die Injektion durch.
    1. Klicken Sie in der Injektionsschnittstelle auf die Schaltfläche Start , um den Injektionsvorgang zu starten (Ergänzende Abbildung 4E). Der Prozess beginnt damit, dass sich der Robotertisch bewegt, während das System die Agaroseplatte abtastet und nach einem Fisch sucht (Ergänzende Abbildung 4F). Bei der Identifizierung einer Larve navigiert die Nadel automatisch zur vorgesehenen Injektionsstelle und passt ihre Richtung automatisch an den vorgegebenen Winkel an.
    2. Wenn der automatische Modus gewählt ist, verabreicht der Roboter die Injektionen nahtlos an der ausgewählten Stelle (Ergänzende Abbildung 4G). Nach Abschluss der aktuellen Injektion fährt der Roboter mit der Suche nach der nächsten Larve auf der Platte fort, um die Injektionen durchzuführen.
    3. Wenn der manuelle Modus gewählt ist, erscheint eine manuelle Steuerschnittstelle, wenn sich die Nadel der Larve nähert (Ergänzende Abbildung 4H). Verwenden Sie die blauen und gelben Pfeile, um die Nadel zu bewegen, und drehen Sie die Nadel mit der kreisförmigen Drehtaste auf der linken Seite des Bildschirms. Sobald sich die Nadel in der Larve befindet, tippen Sie auf den roten Tröpfchenknopf, um die Injektion durchzuführen. Tippen Sie alternativ auf die Taste m, um die Makrosequenz zu starten, mit der die Injektion automatisch durchgeführt wird.
    4. Wenn alle Larven injiziert wurden, schließen Sie die Injektionsschnittstelle, indem Sie auf die Stopp-Taste klicken. Die Nadel wird automatisch in die Ölquelle eingesetzt.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die Platte mit den injizierten Larven.
  8. Übertragen Sie die injizierten Zebrafischlarven.
    1. Um die injizierten Larven zu übertragen, kippen Sie die Platte über eine Petrischale und spülen Sie die Larven mit einer Pipette oder einer Quetschflasche vorsichtig mit einem kontrollierten Wasserfluss aus.
    2. Beginnen Sie von oben und bewegen Sie sich nach unten, um eine effektive Spülung zu erzielen.
    3. Entfernen Sie alle abgestorbenen Larven, ersetzen Sie das Wasser durch frische E3-Lösung und stellen Sie die Petrischale in den Inkubator.
      HINWEIS: Wenn menschliche Krebszellen oder klinische Proben injiziert werden, inkubieren Sie die Petrischale bei 33-36 °C; Andernfalls bei 28,5 °C inkubieren.

6. Ausschalten des Roboters

  1. Wenn die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Nadel, indem Sie das Nadelkalibrierungsmenü aufrufen und auf Stufe verschieben drücken, um die Nadel zu entfernen (Ergänzende Abbildung 3E). Wenn Sie beabsichtigen, die Nadel für den späteren Gebrauch in der Maschine zu behalten, überspringen Sie diesen Schritt.
  2. Gehen Sie zum Menü und tippen Sie auf die Ein -/Aus-Taste , die sich unten links befindet (Ergänzende Abbildung 2D).
  3. Drücken Sie die Park-Nadeltaste , um die Nadel zu erhalten (Ergänzende Abbildung 4I).
  4. Andernfalls klicken Sie auf OK. Das Gerät wird heruntergefahren und die grüne Ein -/Aus-Taste erlischt, sobald das Herunterfahren abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Wenn sich der Roboter im Leerlauf befindet, legen Sie leere Multi-Well-Platten in beide Multi-Well-Plattenhalter, um das Eindringen von Staub in die Maschine zu verhindern.

7. Agarose-Gel entfernen und aufräumen

  1. Nehmen Sie das Agarose-Gel von der Platte und nehmen Sie vorsichtig (Schutzbrille und Handschuhe tragen) die Glasplatte aus der Halterung.
  2. Reinigen Sie die Glasplatte und den Halter gründlich mit warmem Wasser und Ethanol und stellen Sie sicher, dass sie vor der Wiederverwendung getrocknet sind.
    HINWEIS: Reinigen Sie alle Gelplatten sofort nach Gebrauch, da sich das Agarosegel im nassen Zustand leichter entfernen lässt.

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Ergebnisse

Hier stellen wir den automatisierten Injektionsprozess für die drei am häufigsten verwendeten Injektionsstellen für Krebszell-Xenotransplantate vor.

Video 1 zeigt die automatische Injektion des Cuvier-Kanals (DoC) mit Hilfe des Robotersystems. Der Roboter tastet die Platte zunächst systematisch ab, bewegt sich von oben nach unten und von links nach rechts, um eine Zebrafischlarve zu lokalisieren. Sobald eine Larve identifiziert ist, nähert sic...

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Diskussion

Die Entwicklung und Implementierung des automatisierten Injektors stellen einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Zebrafisch-Tumor-Xenotransplantation für das Screening von Krebsmedikamenten und die Präzisionsmedizin dar. Nach unserem besten Wissen handelt es sich um den ersten kommerziell erhältlichen Roboter zur automatisierten Injektion von Zellsuspensionen in Zebrafischlarven, und dieses Protokoll ist daher für alle Forschungen relevant, die solche Injektionen mit hohem Durc...

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Offenlegungen

Y.D., K.J.v.d.K. und J.d.S. arbeiten für Life Science Methods, das das in dieser Publikation verwendete Robotersystem kommerziell nutzt. Die übrigen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken dem Eurostars-Programm herzlich für die Unterstützung unserer Forschung durch das ROBO-FISH-Stipendium (Fördernummer: E! 114899) und das EIC-PATHFINDER-Programm durch das ALADDIN-Stipendium (Fördernummer: 101130574).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-Well-Platten Greiner bio-one cellstar Ref 657160
AgaroseVWR#N605-100G
Automatisiertes Einspritzsystem + VerbrauchsmaterialienLebenswissenschaftliche Methodenhttps://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774
Kapillaren aus Borosilikatglas,WeltpräzisionsinstrumenteN/A1,0 mm Außendurchmesser, 0,78 mm Einbaugrad
Zellzähler ThermoFisherGräfin 3
Kommerzielle Nadeln Clunbury Scientific LLC #B100-58-20
DNase-Typ I Roche#11284932001
Filter für KrebszellenSysmex CellTricsTM04-0042-231630 & Mikro; m
Mineralöl  Diapharma #330779-1L
Nadelschleifer ()Narishige   EG-401
Polyvinylpyrrolidon 40Sigma#102420477
GentleMACS Octo DissoziatorMiltenyi Biotechttps://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine
Posted by JoVE Editors on 11/03/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68441

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