BRET-basierte G-Protein-Biosensoren zur Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivität in lebenden Zellen

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Superfamilie von Transmembranrezeptoren dar, die für die Übertragung extrazellulärer Reize in intrazelluläre Signalkaskaden verantwortlich sind, die zu spezifischen biologischen Reaktionen führen. Sie sind zentrale pharmakologische Ziele, wobei etwa 30 % der vermarkteten Arzneimittel auf GPCRs wirken¹. Die GPCR-Ligandenbindung induziert Konformationsänderungen im Rezeptor, was die Interaktion mit heterotrimeren G-Proteinen und/oder GPCR-Kinasen (GRKs) und β-Arrestinen erleichtert und dadurch die nachgeschaltete Signalübertragung oder Rezeptorinternalisierung initiiert².

Heterotrimere G-Proteine dienen als primäre intrazelluläre Wandler des GPCR-Signalwegs und bestehen aus drei Untereinheiten: G_α, G_β und G_γ. Diese Heterotrimere werden in vier Familien eingeteilt -_{- G i/o}, G_s, G_q und G_12/13 -- basierend auf dem G_α-Subtyp , die jeweils unterschiedliche Signalwege aktivieren: Der G_i/o-Subtyp hemmt die Adenylatcyclase, während G_s sie stimuliert, G_q aktiviert die Phospholipase C-β und G_12/13 reguliert die GTPasen der Rho-Familie.

Die GPCR-Aktivierung führt zu ihren Konformationsumlagerungen, die eine schnelle G-Protein-Aktivierung innerhalb der Subsekunden-Kinetik ermöglichen. Dieser Prozess induziert Konformationsänderungen des G-Proteins, die den GDP-GTP-Austausch in der G-α-Untereinheit fördern. Die GTP-Bindung verändert die Konformation der G_α Untereinheit weiter, was zu einer Dissoziation vom G_βγ-Dimer führt, was eine Signalausbreitung ermöglicht. G-Proteine sind daher entscheidend für die Modulation der Spezifität und zeitlichen Dynamik zellulärer Reaktionen, indem sie verschiedene Effektorproteine wie Adenylatcyclase oder Ionenkanäle regulieren ^3,4,5.

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Aktivierung oder Inaktivierung von G-Proteinen mit Hilfe von Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)-basierten Biosensoren nach GPCR-Ligandenstimulation in lebenden Zellen. Inspiriert von Pionierarbeiten an den G-Protein-Biosensoren 6,7,8,9 basiert das von Schihada et ^al.10 eingeführte G-CASE-System (G protein tri-cistronic activity sensors) auf BRET zwischen markierten_G-α- und_{G-βγ-Untereinheiten} und bietet einen optimierten Ansatz, der nur eine einzige Plasmidtransfektion erfordert. Diese Funktion erhöht die Sensitivität und mildert die Herausforderungen im Zusammenhang mit der Co-Transfektion mehrerer Plasmide, die für die drei Untereinheiten (G_α, G_β und G_γ) des heterotrimeren G-Proteins kodieren. Diese Sensoren wurden akademischen Forschungsgruppen kommerziell zur Verfügung gestellt (siehe Materialtabelle).

BRET bietet deutliche Vorteile gegenüber dem Förster Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Bei BRET findet der Energietransfer zwischen einem biolumineszierenden Donor und einem fluoreszierenden Akzeptor statt, ohne dass externe Lichtquellen erforderlich sind. Diese intrinsische Biolumineszenz reduziert mit FRET verbundene Probleme wie Autofluoreszenz und Lichtstreuung, was zu einem geringeren Hintergrundsignal und einer verbesserten Assay-Empfindlichkeit führt ^6,7,11.

Dieses Fehlen einer externen Anregung in BRET minimiert Photobleiche und phototoxische Effekte, was zu geringeren Hintergrundsignalen im Vergleich zu FRET führt. Folglich weisen BRET-Assays meist eine erhöhte Sensitivität auf, die die Messung der G-Protein-Aktivierung von konstitutiv aktiven GPCRs ermöglicht. Die erhöhte Empfindlichkeit von BRET-Assays erleichtert den Nachweis subtiler biologischer Wechselwirkungen, was besonders in pharmakologischen Studien wertvoll ist, bei denen eine präzise Messung der Rezeptoraktivität entscheidend ist.

Diese Biosensoren können in ein Hochdurchsatz-Screening in 96-Well- oder 384-Well-Platten übersetzt werden, wie kürzlich von Scott-Dennis et al. gezeigt wurde, wo eine Methode unter Verwendung dieser Biosensoren in einem membranbasierten 384-Well-Assay entwickelt wurde, um die Aktivität der Cannabinoidrezeptoren CB1R und CB2R¹² zu analysieren. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung dieser Biosensoren in 96-Well-Platten in lebenden Zellen, indem er die Aktivität des β2-AR als prototypisches GPCR der Klasse A misst, das das Protein G_s bindet, und das CB1R, das zu den GPCRs der Klasse A gehört und das Protein der G_i/o-Familie aktiviert. Die Verwendung von zwei G-CASE-Biosensoren ist validiert: G_s und G_i3 in HEK 293T-Zellen mit dem GPCR entweder transient (mit dem β2-AR) oder stabil exprimiert (mit dem CB1R).

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Experiment in verschiedenen Zelllinien durchgeführt werden kann, was die Vielseitigkeit und Robustheit dieser Technik in verschiedenen zellulären Kontexten demonstriert. Dies stellt sicher, dass die Methode auf verschiedene experimentelle Modelle angewendet werden kann, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung des GPCR-Signalwegs in verschiedenen physiologischen und pharmakologischen Umgebungen macht. Abbildung 1 veranschaulicht das Prinzip von BRET-basierten G-Protein-Aktivitätssensoren.

Abbildung 1: Prinzip von BRET-basierten G-Protein-Aktivitätssensoren. G-Protein-Sensoren bestehen aus drei Untereinheiten:_G-α, natives_G-β und_G-γ. Die Untereinheit_{G α} ist mit der kleinen und hellen NanoLuciferase (Nluc) fusioniert, während die Untereinheit_{G γ} N-terminally mit der zirkular permutierten Venus (cpVenus¹⁷³) markiert ist. Die Gene, die für diese manipulierten G-Protein-Untereinheiten kodieren, werden zu einem einzigen Plasmid kombiniert. Die Bindung von Liganden an GPCRs induziert GPCR-Konformationsänderungen, die die Rekrutierung von G-Proteinen und die anschließende Dissoziation mit anschließender GTP-Hydrolyse fördern. Diese Dissoziation unterbricht den Energietransfer zwischen den Partnern, was zu einer Abnahme des BRET-Signals führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aussaat der Well-Platte (Tag 1)

HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen Laminar-Flow-Haube, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. White-Well-Platten mit transparenten, flachen Böden werden verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu verfolgen. Verwenden Sie die vollständige White-Well-Platte, um die Verwendung eines Aufklebers in Schritt 3.2.1 zu vermeiden.

1. Well-Platten-Beschichtung
   HINWEIS: Vorbeschichtete Platten können verwendet werden, um diesen Schritt zu umgehen.
   1. Gießen Sie etwa 6 ml steril filtrierte Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung (0,01%) in ein Mehrkanal-Reservoir. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung einer 96-Weißwell-Mikroplatte mit 60 μl PLL.
   2. Stellen Sie die Mikroplatte an einen dunklen Ort und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang.
   3. Fahren Sie während der Inkubation mit der Vorbereitung der Zellen fort, wie in den Schritten 1.2.1-1.2.3 beschrieben.
   4. Aspirieren Sie die PLL-Lösung mit der Mehrkanalpipette und lagern Sie sie bei 4 °C in einem 15-ml-Röhrchen.
   5. Waschen Sie die Platte dreimal mit DPBS, um freie PLL zu entfernen, die eine Zelldegradation verursachen könnten.
2. Zellvorbereitung und Plattierung
   1. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 37 °C in 5 % CO₂.
      HINWEIS: FBS wird dem Kulturmedium zugesetzt, um die notwendigen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren bereitzustellen, die für eine ordnungsgemäße Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich sind.
   2. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 2 mL DPBS.
   3. 0,5 ml Trypsin zugeben und 3-5 min bei 37 °C inkubieren, um die Zellen abzulösen.
   4. Geben Sie 4,5 ml DMEM in den Kolben, um Trypsin zu neutralisieren, und pipettieren Sie dann wiederholt auf und ab, um die Zellen abzulösen und wieder zu suspendieren.
   5. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 1000 x g (bei Raumtemperatur, RT).
   6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL DMEM.
   7. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer und bereiten Sie 9 ml mit 300.000 Zellen/ml vor. Geben Sie sie in ein Mehrkanal-Reservoir und säen Sie die 96-Well-Mikroplatte aus, indem Sie 100 μl pro Well mit der Mehrkanalpipette gießen (endgültige Dichte von 30.000 Zellen/Well).
   8. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 37 °C, 5 % CO₂ für ca. 24 h.
      HINWEIS: Die Zellen sollten für eine effiziente Transfektion eine Konfluenz von etwa 70 % bis 80 % erreichen.

2. Plasmid-Transfektion (Tag 2)

HINWEIS: Die Zelltransfektion kann am ersten Tag an suspendierten Zellen vor der Beschichtung während Schritt 1.2.7 und die Datenerfassung an Tag 3 durchgeführt werden.

1. Verdünnen Sie 10 μg der gewünschten Plasmid-DNA (z. B. 5 μg β2-adrenerger Rezeptor und 5 μg G_s(short)-CASE in HEK-wt-Zellen oder nur 10 μg G_i3-CASE in HEK CB1-Zellen) und 20 μl Lipofectamin in den Röhrchen mit 500 μl Opti-MEM-Medium. 5 Minuten bei RT inkubieren.
   1. Für eine Negativkontrolle ersetzen Sie den β2-adrenergen Rezeptor durch leeres Plasmid pcDNA 3.1 in der gleichen Konzentration. Kombinieren Sie die Lösungen in einem Röhrchen und mischen Sie, um eine Transfektionsmischung (1 ml) zu erhalten.
2. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 20 Minuten lang bei RT.
3. Geben Sie 10 μl der Transfektionsmischung aus Schritt 2.2 tropfenweise in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Es wird eine Endkonzentration von 100 ng DNA pro Vertiefung erreicht.
4. Inkubieren Sie die Mikroplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h.

3. Datenerfassung (Tag 3)

1. Vorbereitung des Liganden
   HINWEIS: Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Puffer: NaCl 140 mM, Kaliumchlorid 5 mM, Calciumchlorid 1 mM, Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,4 mM, Magnesiumchlorid-Hexahydrat 0,5 mM, Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat 0,3 mM, Kaliumphosphat monobasisch 0,4 mM, D-Glukose (Dextrose) 6 mM, Natriumbicarbonat 4 mM, pH 7,4, gefiltert 0,22 μm.
   1. Bereiten Sie eine Stammlösung in der höchstmöglichen Konzentration in dem geeigneten Lösungsmittel für die verschiedenen Liganden vor (in diesem Protokoll wird Isoproterenol in H₂0 mQ und WIN-55.212-2 in DMSO hergestellt).
      HINWEIS: Die Konzentration der Ligandenstammlösung muss in Abhängigkeit von der Löslichkeit und der bekannten Dissoziationskonstante (K_d) des Liganden angepasst werden.
   2. Aus diesem Stamm wird eine Liganden-Reihenverdünnung von 10 μl um das K_d des Liganden in dem geeigneten Lösungsmittel hergestellt. Lagern Sie diese serielle Verdünnung bei -20 °C.
      HINWEIS: Je nach Liganden kann der serielle Verdünnungsbereich bis zu zehnmal eingefroren und aufgetaut werden, bevor es zu einer Degradation kommt. Bereiten Sie eine Lösung vor, die nur das für die Ligandenauflösung verwendete Lösungsmittel enthält, um eine Vehikelbedingung (in diesem Protokoll H₂0 oder DMSO) einzubeziehen.
   3. Für jede Ligandenkonzentration und jedes Vehikel wird eine Verdünnung von 1/100 in HBSS durchgeführt, indem 1,3 μl jeder Konzentration zu einem Gesamtvolumen von 130 μl hinzugefügt werden. Daraus ergibt sich eine Endkonzentration von 1 % Vehikel in HBSS.
      HINWEIS: Dieser endgültige Verdünnungsbereich wird für Experimente verwendet, indem 10 μl hinzugefügt werden, um ein Gesamtvolumen von 100 μl pro Vertiefung zu erhalten. Daraus ergibt sich eine Endkonzentration von 0,1 % Vehikel in allen Bohrlöchern. Das Volumen von 130 μl entspricht der Menge, die zum Befüllen einer Reihe einer 96-Well-Platte erforderlich ist: (10 x 12) ± 10 %. Jede Reihe entspricht einer anderen Ligandenkonzentration, wobei die letzte Zeile als Vehikelkontrolle dient.
   4. Bereiten Sie 980 μl Furimazin 1/100 Verdünnung aus Stammlösung vor (9,8 μl in 970,2 μl HBSS, um ein Gesamtvolumen von 980 μl zu erhalten).
      HINWEIS: Bereiten Sie eine frische Lösung von Furimazin vor und lassen Sie sie mindestens 3 Minuten inkubieren. Fügen Sie es dann unmittelbar vor der Akquisition hinzu. Es sollte nicht zu früh vorbereitet werden, da das Signal bei Raumtemperatur eine Halbwertszeit von ca. 120 min hat. Um diese Einschränkung zu überwinden, können langwirksame Fruimazin-Derivate wie Vivazin und Endurazin verwendet werden. Diese Substrate halten ein stabiles BRET-Signal für bis zu 48 h aufrecht.
2. Ablesungen von Platten
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Multimode-Plattenleser. Passen Sie die Messung an die untersuchten Bedingungen und die Anzahl der Wiederholungen an. Hierbei wird die Datenerfassung in drei Messwerte à 4 Spalten aufgeteilt, was 32 Wells entspricht. Alle Messungen erfolgen mit einer Top-Optik mit einem transparenten Deckel, um eine Verdunstung des Puffers zu verhindern. Stellen Sie vor allen Messwerten die Messverstärkung ein. In dieser Studie wurde der Gewinn auf 3600 festgelegt. Es ist möglich, die manuelle Ligandenzugabe durch die Verwendung eines automatisierten Injektor- oder Spritzensystems zu vermeiden, das in vielen Plattenlesegeräten verfügbar ist.
   1. Entfernen Sie das Medium aus den ersten 4 Säulen der 96-Well-Platte. Spülen Sie jede Füllung gut mit 100 μl HBSS aus und fügen Sie 80 μl HBSS hinzu. Kleben Sie einen weißen Aufkleber auf die Unterseite des Tellers. Dies verbessert Fluoreszenz- und/oder Biolumineszenzmessungen.
   2. Aufzeichnung von G-Protein-Lumineszenzspektren: Setzen Sie die 96-Well-Platte in den Plattenreader ein. Zeichnen Sie die cpVenus^173-Emission mit einem 535/30-nm-Monochromator auf und messen Sie die Lumineszenzemission zwischen 500 und 600 nm mit einer Auflösung von 2 nm.
      HINWEIS: Bei dieser Aufzeichnung handelt es sich um eine Kontrolle, um sicherzustellen, dass bei Anregung von cpVenus¹⁷³ Fluoreszenz emittiert wird.
   3. Aufzeichnung von G-Protein-Lumineszenzspektren: Erfassen Sie die Nluc-Emissionsintensität mit einem 450/40-nm-Monochromator und messen Sie die Lumineszenzemission zwischen 400 nm und 600 nm mit einer Auflösung von 5 nm.
      HINWEIS: Bei dieser Aufzeichnung handelt es sich um eine Kontrolle, um sicherzustellen, dass vor der Zugabe des Nluc-Substrats Furimazin keine Biolumineszenz emittiert wird.
   4. Nehmen Sie die Platte aus dem Plattenleser und geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette 10 μl der zuvor hergestellten Furiazinlösung (Schritt 3.1.4.) in jede Vertiefung.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.3.
      HINWEIS: Diese Aufzeichnung ist eine Kontrolle, um sicherzustellen, dass Biolumineszenz bei Zugabe von Furimazin emittiert wird. Fahren Sie nach dieser Messung direkt mit Schritt 3.2.6 fort, um Signalschwankungen aufgrund des Verbrauchs und/oder der Degradation von Furimazin zu verhindern. Die Variation des BRET-Signals kann aufgrund des Verbrauchs und/oder des Abbaus von Fruimazin und regulatorischer Prozesse auftreten, die die durch agonistische Stimulation induzierte Reaktion beenden. Um diese Einschränkung zu überwinden, könnten GRK-Inhibitoren (CMPD101) und Internalisierungsinhibitoren (Dynasore) oder geneditierte Zellen ohne GRKs oder Arrestine verwendet werden.
   6. Aufzeichnung des basalen BRET des G-Proteins: Vor der Zugabe des GPCRs-Liganden ist die Emissionsintensität von Nluc und cpVenus¹⁷³ mit einem 450/40-nm- bzw. einem 535/30-nm-Monochromator aufzuzeichnen. Messen Sie 3 Zyklen von 60 s mit einer Messintervallzeit von 0,30 s (Gesamtlesezeit von 3 min).
      HINWEIS: Eine Erhöhung des Messintervalls auf 0,90 s verbessert in der Regel das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich, führt jedoch zu einer viel längeren Lesezeit. Der Experimentator sollte entscheiden, ob die höhere zeitliche Auflösung oder das verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis für ihre Anwendung wichtiger ist.
   7. Nehmen Sie die Platte aus dem Plattenleser und geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette jeweils 10 μL des zuvor vorbereiteten Verdünnungsbereichs des GPCR-Liganden (Schritt 3.1) in jede Vertiefung einer Säule. Gehen Sie für die 3 anderen Spalten genauso vor.
   8. Aufzeichnung von G-Protein-Liganden-induziertem BRET: Aufzeichnung der Emissionsintensität von Nluc und cpVenus¹⁷³ mit einem 450/40-nm- bzw. einem 535/30-nm-Monochromator. Messen Sie 16 Zyklen à 60 s mit einer Messintervallzeit von 0,30 s (Gesamtlesezeit von 16 min).
      HINWEIS: Richten Sie die Messparameter so ein, dass die Vertiefungen in Spalten gemessen werden. Duplikate werden mit einer Zeitdifferenz von 2,4 s gelesen.
   9. Wiederholen Sie Schritt 3.2. für die nächsten vier Spalten 2 mal.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Erfassen Sie die Daten jedes Messwerts in separaten Datentabellendateien.

1. Kontrollieren Sie die Messwerte
   1. Plotten Sie die Emissionsintensität gegen die Wellenlänge.
2. Basale BRET-Messwerte
   1. Berechnen Sie für jede Vertiefung das BRET-Verhältnis der drei Messungen. Das BRET-Verhältnis ist definiert als Akzeptoremission/Donoremission.
      
   2. Berechnen Sie für jede Vertiefung den Durchschnitt der drei BRET-Verhältnisse vor der Ligandenzugabe. Dieser Wert wird als basales BRET-Verhältnis vor der Ligandenstimulation bezeichnet: Verhältnis_basal.
   3. Um die vorherigen BRET-Verhältnisse aller Wells zu normalisieren, subtrahieren Sie für jede der drei Messungen den BRET-Verhältniswert, der aus den Vehikel-Kontrollwells berechnet wurde, vom BRET-Verhältnis zum entsprechenden Messzeitpunkt.
      HINWEIS: Die analysierten Daten entsprechen den Zeitpunkten vor der Ligandenzugabe. Da die Wells, in die der Ligand gegeben wird, bekannt sind, können die Vehikel-Steuerwellen entsprechend identifiziert werden.
3. G-Protein-Liganden-induzierte BRET-Messwerte
   1. Berechnen Sie für jede Vertiefung das BRET-Verhältnis jeder Messung, wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben. Diese Werte werden als_{Verhältnisstim} bezeichnet.
   2. Um ligandeninduzierte Änderungen zu quantifizieren, berechnen Sie den ΔBRET für jeden_{Verhältnis-Stim} jeder Vertiefung als einen Prozentsatz über dem Basalwert. Verwenden Sie dazu das_{entsprechende Basalverhältnis} , das zuvor in Abschnitt 4.2.2 berechnet wurde.
      
   3. Berechnen Sie den ΔBRET(%), um die ΔBRET-Werte der einzelnen Vertiefungen zu normalisieren. Subtrahieren Sie dazu die jeweiligen ΔBRET-Werte des Fahrzeugs.
   4. Um die ΔBRET-Kinetik in einer Datentabelle zu visualisieren, addieren Sie die drei in Schritt 4.2.3 normierten basalen BRET-Messwerte. vor den entsprechenden ΔBRET(%)-Werten, die für jede Vertiefung in Abschnitt 4.3.3 berechnet wurden.
   5. Plotten Sie die vorherigen Daten gegen den Zeitpunkt des Lesevorgangs, um ein kinetisches Diagramm zu erhalten.
   6. Wenn ein Plateau erreicht ist, nehmen Sie die ΔBRET(%) Werte zu einem ausgewählten Zeitpunkt und stellen Sie sie gegen die Konzentration des verwendeten Liganden dar, da jede Vertiefung einer anderen Ligandenkonzentration entspricht. Es wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve erhalten.
      HINWEIS: Das Plateau wird in der Regel etwa 5 Minuten nach der Ligandenstimulation erreicht. In diesem Protokoll werden die Werte nach 15-minütiger Ligandenstimulation aufgetragen. Um Daten aus verschiedenen Experimenten zu vergleichen, passen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der kinetischen Aktivierung an.
   7. Plotten Sie die vorherigen Daten in der Analysesoftware und passen Sie sie mit einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Anpassung mit drei Parametern an, die auf der folgenden Gleichung basiert:
      
      Dabei ist X die Konzentration des verwendeten Liganden, Y die ΔBRET(%)-Werte, Top und Bottom stellen die Plateaus dar und EC₅₀ ist die Ligandenkonzentration, die erforderlich ist, um 50 % des maximalen Effekts zu erreichen. Dies ermöglicht es, den E_max und EC₅₀ zu erhalten.
   8. Vergleichen Sie die Daten aus der Kontrollbedingung mit einem nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test. Die Ergebnisse werden mit p < 0,05 als signifikant angesehen.

Abbildung 2: Wichtige Schritte zur Durchführung des BRET-Assays. Überblick über die drei wichtigsten experimentellen Schritte, die in diesem Protokoll beschrieben sind (Zellaussaat, Zelltransfektion und BRET-Signalerfassung) und eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Datenerfassung. Versuchsaufbau: An Tag 1 werden die Zellen in eine PLL-vorbeschichtete weiße 96-Well-Platte mit flachem, klarem Boden bei einer Dichte von 30.000 Zellen/Well ausgesät. An Tag 2 werden die Zellen mit dem ausgewählten G-Protein-Sensor zusammen mit den untersuchten GPCR- oder pcDNA3.1-Plasmiden transfiziert. Nach 24 Stunden Inkubation wird die Aktivität des G-Protein-Sensors durch Biolumineszenz- und Fluoreszenzmessungen bei Ligandenzugabe gemessen. Datenerfassung: Nach dem HBSS-Waschen der Zellen werden 80 μl HBSS in die Vertiefungen gegeben, und die cpVenus^{173-Fluoreszenzemission} wird zwischen 500 nm und 600 nm mit einem 535/30-nm-Monochromator gemessen (1). Als nächstes wird die Nluc-Biolumineszenz zwischen 400 nm und 600 nm mit einem 450/40-nm-Monochromator gemessen, sowohl vor (2) als auch nach (3) der Zugabe von Furimazin. Schließlich wird das BRET-Signal für die basale und ligandeninduzierte G-Proteinaktivität mit 450/40-nm- bzw. 535/30-nm-Monochromatoren über 3 min (3 Zyklen à 60 s mit einem Messintervall von 0,30 s) (4) und 16 min (16 Zyklen à 60 s mit einem Messintervall von 0,30 s) (5) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ein verallgemeinertes Schema des Versuchsaufbaus und der Durchführung ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Aktivierung vonProteinen der G-s- oderG-i/o-Familie nach Ligandenaktivierung von zwei GPCRs wurde mit Hilfe der G-CASE-Biosensoren untersucht. Zunächst wurde eine prototypische Familie A GPCR untersucht, die β2-AR, die transient in HEK 293T-Zellen transfiziert wurde. Wenn ein Agonist (d. h. Isoproterenol) zusammen mit dem Gs(short)-CASE-Proteinsensor auf HEK wt-Zellen aufgetragen wurde, die das β2-AR exprimieren, wurde eine konzentrationsabhängige Abnahme des BRET-Signals beobachtet, was auf eine Aktivierung des Gs-Proteins hinweist (Abbildung 3B). Die ΔBRET-Werte nahmen mit der Ligandenkonzentration ab, bis die Sättigung erreicht war, wobei ein Plateau etwa 5 Minuten nach der Ligandenstimulation beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu zeigten HEK-wt-Zellen, die mit dem leeren pcDNA3.1-Plasmid transfiziert wurden, und dem Gs(short)-CASE-Proteinsensor eine inverse, aber geringe und nicht signifikante Reaktion auf die Isoproterenol-Stimulation (Abbildung 3B). In diesem Protokoll werden Werte, die nach 15 Minuten Ligandenstimulation erhalten wurden, aufgetragen. Um die Konsistenz der Ergebnisse und die Unabhängigkeit von der Zeitauswahl zu gewährleisten, sollten andere Zeitpunkte getestet werden, um sicherzustellen, dass ein Gleichgewicht erreicht wurde. Um die Ergebnisse verschiedener Experimente vergleichen zu können, sollte die Zeitauswahl außerdem basierend auf der Aktivierungskinetik jedes Experiments angepasst werden.

Um die in Abbildung 3C gezeigten sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurven zu erstellen, wurden die ΔBRET-Werte, die 15 Minuten nach der Stimulation (wenn das Plateau stabilisiert ist) gemessen wurden, gegen die verschiedenen Ligandenkonzentrationen aufgetragen. Der beobachtete EC50 (9,4 nM ± 2,1 nM) liegt im Bereich des bekannten Kd des Rezeptors für Isoproterenol (13 nM ± 6 nM)13,14 (Abbildung 3C,D). Diese Ergebnisse zeigen die Effizienz der G-CASE-Sensoren bei der Bewertung der G-Protein-Aktivierung mit einer beobachteten Reaktion, die spezifisch mit dem Vorhandensein des β2-AR verbunden ist.

Abbildung 3: Bewertung desG-Protein-Sensors in HEK-wt-Zellen. Kinetische ΔBRET-Messwerte nach Zugabe des Agonisten Isoproterenol zu HEK wt-Zellen, transfiziert mit demG-s-Proteinsensor und β2-AR (A) oder pcDNA3.1 (B). (C) Dosis-Wirkungs-Kurven, die durch Anpassung der ΔBRET-Werte (%) nach 15-minütiger Ligandenstimulation bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen erhalten wurden. (D) Vergleich der δbret Maximalwerte zwischen den Kontrollzellen pcDNA3.1 und β2-AR, die mit Isoproterenol stimuliert wurden. Die statistische Differenz zur pcDNA3.1-Bedingung wurde mit einem nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test getestet (**p < 0,01). Die Daten zeigen die mittlere ± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zweitens wurden die Biosensoren in HEK CB1-Zellen getestet, einer HEK 293T-Zelllinie, die das CB1R stabil exprimiert. Diese Zellen wurden transient mit dem Gi3-CASE Proteinsensor transfiziert. Die Stimulation mit dem CB1R-Agonisten WIN-55,212-2 induzierte ein konzentrationsabhängiges ΔBRET-Signal, was auf eine Aktivierung des Gi3-Signalwegs hinweist (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu zeigten HEK-wt-Zellen, die mit dem G i3-CASE-Proteinsensor transfiziert und unter den gleichen Bedingungen stimuliert wurden, keine Reaktion, was die Spezifität der CB1R-Aktivierung bestätigt (Abbildung 4B). Ein Plateau wurde etwa 5 Minuten nach der Ligandenaktivierung erreicht. Die entsprechende Dosis-Wirkungs-Kurve verdeutlichte die konzentrationsabhängige ΔBRET-Reaktion, die durch die Stimulation von WIN-55,212-2 in HEK-CB1-Zellen induziert wurde, während eine solche Reaktion in HEK-wt-Zellen nicht beobachtet wurde (Abbildung 4C). Die beobachtete EC50 (112 nM ± 25 nM) liegt im Bereich der bekannten EC50 des Rezeptors für WIN-55,212-2 (354 nM ± 62 nM)15 (Abbildung 4C, D). Schließlich veranschaulicht ein Vergleich der ΔBRET-Werte, die 15 Minuten nach Agonistenstimulation erhalten wurden, mit 10 μM WIN-55,212-2 in HEK CB1 und HEK wt-Zellen die CB1R-abhängige Aktivierung des G i3-Signalwegs (Abbildung 4D).

Abbildung 4: Bewertung des Gi3-Proteinsensors in HEK CB1-Zellen. Kinetische ΔBRET-Messwerte nach Zugabe des Agonisten WIN-55,212-2 zu HEK CB1 (A) oder HEK wt-Zellen (B). Dosis-Wirkungs-Kurven, die durch Anpassung der ΔBRET-Werte (%) nach 15-minütiger Ligandenstimulation an die Ligandenkonzentration (C) erhalten wurden. ΔBRET Maximalwertevergleich zwischen den Kontrollzellen HEK wt und HEK CB1, die mit WIN-55.212-2 (D) stimuliert wurden. Die statistische Differenz zur HEK-wt-Bedingung wurde mit einem nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test getestet (****p < 0,0001). Die Daten zeigen den Mittelwert ± SEM von fünf unabhängigen Experimenten, die doppelt durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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