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Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

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DOI:

10.3791/68469

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17. Oktober 2025

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1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Zusammenfassung

Die FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3 (FLT3), eine Klasse-III-Rezeptor-Tyrosinkinase, weist bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) eine Mutationshäufigkeit von etwa 30% auf und stellt ein kritisches therapeutisches Ziel dar. Als repräsentative Typ I bzw. Typ II FLT3-Inhibitoren werden Gilteritinib und Quizartinib (AC220) klinisch bei der Behandlung von FLT3-mutierten AML eingesetzt.

Gilteritinib hemmt sowohl aktivierte als auch inaktivierte FLT3-Proteine, mit zusätzlicher Hemmung von AXL-Zielen, um die Überwindung von Resistenzen zu unterstützen. AC220 hemmt aktiviertes FLT3. Der Kometen-Assay wurde systematisch eingesetzt, um DNA-Schadensmuster, die durch Typ I FLT3-Inhibitoren induziert werden, mit Typ II FLT3-Inhibitoren in mutierten Zellen zu quantifizieren und zu vergleichen. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die durch AC220 verursachten DNA-Schäden signifikant höher waren als die durch Gilteritinib. Bei starken DNA-Schäden können FLT3-Inhibitoren mit DNA-Schadensreparatur-Inhibitoren kombiniert werden, um DNA-Reparaturdefekte zu bekämpfen. Die Ergebnisse liefern experimentelle Unterstützung für die rationale Kombinationsstrategie von Medikamenten, die auf DNA-Schäden abzielen.

Einleitung

Die akute myeloische Leukämie (AML) stellt eine klonale hämatopoetische Stammzellerkrankung dar, die durch eine pathologische Expansion undifferenzierter myeloischer Vorläuferzellen definiert ist, die zu einer hämatopoetischen Suppression und Knochenmarkversagen führt. Die inhärente molekulare Heterogenität der AML stellt erhebliche therapeutische Herausforderungendar 1. Von besonderer klinischer Bedeutung sind die FMS-ähnlichen Tyrosinkinase 3 (FLT3)-Mutationen, die in etwa 30 % der Fälle auftreten und eine starke Korrelation mit unerwünschten klinischen Ergebnissen aufweisen2. Die FLT3-Rezeptor-Tyrosinkinase wird an der Plasmamembran aktiviert, um PI3K/AKT- und RAS/MAPK-Signalkaskaden zu vermitteln, während die FLT3-ITD-Mutantenvariante im endoplasmatischen Retikulum verbleibt und eine persistente Phosphorylierung des Signaltransducers und Aktivators der Transkription 5 (STAT5) induziert. Diese genetischen Veränderungen treiben die Leukämogenese durch mehrere onkogene Mechanismen voran, hauptsächlich durch Signaltransduktionsdysregulation, unkontrollierte proliferative Signalübertragung und apoptotische Resistenz3.

AC220 und gilteritinib hemmen als typische FLT3-Inhibitoren die Zellproliferation und induzieren die Apoptose, indem sie die FLT3-Expression unterdrücken, jedoch mit unterschiedlichen Wirkmechanismen. Gilteritinib (ein Typ-I-Inhibitor) deckt nicht nur ein breiteres Spektrum von FLT3-aktivierenden Mutationen ab, sondern hemmt auch die AXL-Tyrosinkinase, die eng mit FLT3 verwandt ist. Durch die duale Hemmung kann Gilteritinib das Wachstum von Krebszellen umfassender blockieren4. AC220 (ein Typ-II-Inhibitor) übt seine inhibitorische Wirkung durch kompetitive Bindung an die aktivierte Kinase-Konformation aus und zielt spezifisch auf die ATP-Bindungstasche mit hoher Spezifitätab 5. Diese Hemmung kann zu einem Zellzyklusstillstand und erhöhtem DNA-Replikationsstress führen.

Gilteritinib ist mit einem geringen Resistenzrisiko verbunden und indiziert für die Monotherapie bei rezidivierter/refraktärer FLT3-mutierter AML. AC220 ist wirksam und selektiv für FLT3-ITD-Mutationen mit guten klinischen Ansprechraten, ist jedoch unwirksam für FLT3-TKD-Mutationen und kann gegen FLT3-TKD-Mutationen aufgrund sekundärer FLT3-TKD-Mutationen (z. B. D835 oder F691L) resistent sein und eine Resistenz entwickeln. Diese Inhibitoren haben aufgrund ihrer nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit und verbesserter therapeutischer Indizes bei AML-Therapeutika an Bedeutunggewonnen 6. Die klinische Anwendung dieser Medikamente wird jedoch durch erworbene Resistenzen und Off-Target-Effekte erschwert. Die langfristige Anwendung von AC220 in der Klinik führt zu einer Resistenz aufgrund von FLT3-TKD-Mutationen, während die langfristige Anwendung von Gilteritinib Einschränkungen für Wirkstoffmutationen (z. B. FLT3-ITD in Kombination mit TKD) aufweisen kann, auch wenn sie nicht zu einer Resistenz aufgrund von FLT3-TKD-Mutationen führt 7,8.

Diese beiden Klassen von FLT3-Inhibitoren üben eine doppelte therapeutische Wirkung aus, indem sie indirekt replikativen Stress durch Hemmung von FLT3 und Blockade des proliferativen Signalwegs - RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5-Signalweg - induzieren. Eine Blockade der Zellproliferation führt in der Regel zu einem Zellzyklusstillstand, Stoffwechselstörungen (Dysregulation der Redoxhomöostase) und schließlich zur Apoptose 9,10. Dieser Mechanismus erzeugt schließlich DNA-Läsionen, die kompensatorische DNA-Reparaturanpassungen in resistenten Zellpopulationen aktivieren. Der Comet-Assay ermöglicht den quantitativen Vergleich von inhibitorspezifischen DNA-Schadensprofilen in FLT3-mutierten Zellen. Dieser experimentelle Ansatz liefert wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung rationaler Kombinationstherapien, die die Schwachstellen von DNA-Schäden ausnutzen und so erworbene therapeutische Resistenzen überwinden.

Zu den modernen Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden gehören die immunhistochemische Analyse, die Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), die jeweils eine hohe analytische Sensitivität und Spezifität aufweisen11. Diese Ansätze sind jedoch durch erhebliche finanzielle Anforderungen, verlängerte Verarbeitungsdauern und strenge experimentelle Bedingungen eingeschränkt. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Einführung von Detektionsstrategien, die analytische Präzision mit einfacher Bedienung in Einklang bringen.

Der Kometen-Assay wurde aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit, technischen Zugänglichkeit, der visualisierten Quantifizierung von DNA-Schäden und seiner breiten Anwendbarkeit in biologischen Systemen in großem Umfang in der Umwelttoxikologie und Genotoxizitätsbewertung eingesetzt12,13. Es wurden drei prinzipielle methodische Varianten etabliert: der alkalische Kometen-Assay für die Einzel-/Doppelstrang-Bruchdetektion, der neutrale Komet-Assay für die Doppelstrang-Bruchanalyse und der enzymmodifizierte Komet-Assay für die Identifizierung spezifischer DNA-Läsionen. 14

Das methodische Prinzip beinhaltet: (1) Induktion von DNA-Strangbrüchen durch experimentelle Behandlung; (2) Lysepuffer-vermittelte Auflösung von zellulären und nukleären Membranen, die die Diffusion von zytoplasmatischen/nukleären Proteinen und RNA in den Elektrophoresepuffer ermöglicht, während hochmolekulare DNA in der Agarosematrix immobilisiert bleibt; (3) Alkalische Denaturierung (pH > 13), die die DNA-Entwindung und die Freisetzung beschädigter DNA-Fragmente induziert; (4) Elektrophoretische feldgetriebene anodische Migration fragmentierter DNA, die eine charakteristische Kometenmorphologie erzeugt, wobei die intakte DNA die sphärische Nukleoidstruktur beibehält15,16. Die Quantifizierung von DNA-Schäden wird durch eine computergestützte Analyse des Schwanz-DNA-Prozentsatzes (TDP) erreicht, die eine präzise Messung der genotoxischen Wirkung mit Einzelzellauflösung ermöglicht17.

Diese Untersuchung verwendete einen systematischen experimentellen Rahmen, um die unterschiedlichen genotoxischen Wirkungen von Gilteritinib und AC220 in validierten FLT3-mutierten 32D-Zellen zu vergleichen. Das Versuchsdesign umfasste zwei Hauptkomponenten: (i) die Etablierung eines FLT3-Mutations-spezifischen DNA-Schadensmodells und (ii) die quantitative Bewertung von medikamenteninduzierten DNA-Schäden durch die Methodik des alkalischen Kometenassays. Die FLT3-mutierte 32D-Zelllinie wurde unter Standard-In-vitro-Bedingungen vor der Exposition mit seriell verdünnten FLT3-Inhibitoren konserviert. Die zelluläre Lebensfähigkeit wurde mit CCK-8-Assays bewertet, mit anschließender Berechnung der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) durch nichtlineare Regressionsanalyse. Als Induktionsschwelle für DNA-Schäden wurde ein fünffacher IC50-Wert gewählt. Mit Medikamenten behandelte Zellen wurden geerntet und für die anschließende Analyse in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf Objektträgern eingebettet. Die elektrophoretische Trennung wurde bei 24 V (~0,74 V/cm) und 300 mA für 30 min in alkalischem Puffer durchgeführt, wobei die fragmentierte DNA anodisch wanderte und die charakteristische Kometenmorphologie bildete, während die intakte DNA die sphärische Nukleoidkonfiguration beibehielt. Die Quantifizierung der DNA-Schäden wurde durch das computergestützte Bildanalyse-Comet-Assay-Software-Projekt (CASP) erreicht, das den Schweifmoment misst, wobei die erhöhten Werte des Olive-Schweifmoments direkt mit dem Ausmaß der DNA-Fragmentierung korrelieren.

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Protokoll

1. Aufbau eines DNA-Schadensmodells in 32D-Zellen mit FLT3-ITD-Mutationen 18

  1. Rückgewinnung von Zellen
    1. Mit einer Pinzette werden kryokonservierte FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen (gelagert bei -80 °C) schnell übertragen. Entnehmen Sie Kryoröhrchen mit einer Pinzette und tauchen Sie sie sofort für genau 60 s in ein temperaturgeregeltes Wasserbad (37 °C ± 0,5 °C), um das kontrollierte Auftauen abzuschließen.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Kryoröhrchen während des Auftauens intermittierend, um eine gleichmäßige Erwärmung zu gewährleisten.
    2. Die kryokonservierten Proben werden bei 150 × g für 5 min bei 25 °C ± 1 °C zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig mit sterilen serologischen Pipetten abgesaugt, während das Zellpellet erhalten bleibt.
    3. Geben Sie 1 ml vollständiges Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10 % fötales Rinderserum + 1 % Penicillin/Streptomycin) in das Kryokonservierungsröhrchen. Führen Sie eine sanfte Verreibung durch 10 aufeinanderfolgende Pipettierzyklen (1 ml Volumen) durch, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 100-mm-Zellkulturschale und fügen Sie 7 ml vollständiges Medium hinzu, um ein Endvolumen von 8 mL zu erreichen.
    4. Bewegen Sie das Kulturgefäß vorsichtig mit fünf horizontalen und fünf rotierenden Bewegungen. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37,0 °C ± 0,2 °C mit 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Vor der experimentellen Verarbeitung 24 Stunden inkubieren.
  2. Bewertung der Zellviabilität
    1. Für das Experiment werden FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit gutem zellulären Status ausgewählt.
      HINWEIS: Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase haben in der Regel einen kurzen Teilungszyklus und eine hohe Häufigkeit der Zellteilung.
      1. Beobachten Sie die Morphologie und den Wachstumszustand von FLT3-ITD-mutierten 32D-Zellen mit einem Elektronenmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Kriterien für die Schwellenwerte für die Zellproliferation erfüllt sind: Suchen Sie nach Zellen in Form eines einzigen Kügelchens mit glatten Kanten, gleichmäßiger Dispersion, wenigen Aggregaten, einheitlicher Zellgröße, intakter Plasmamembranintegrität und Zelltrümmern < 5 %.
    2. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Konzentration der Zellsuspension zu bestimmen.
      HINWEIS: Mischen Sie die Zellsuspensionen (10 aufeinanderfolgende Pipettierzyklen mit 1 ml sterilen Spitzen bei 50 % maximaler Pipettengeschwindigkeit).
    3. Standardisieren Sie die Zellsuspension auf 2,0 × 105 Zellen/ml in vollständigem Wachstumsmedium durch iterative Verdünnung. Dispensieren Sie mit einer Pipette 50 μl Aliquots in die zentralen Vertiefungen (B2-G7) einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Füllen Sie die peripheren Vertiefungen (A1-H12) mit 100 μl sterilem PBS, um die Feuchtigkeit zu erhalten und Randverdunstungseffekte zu minimieren.
    4. Herstellung von FLT3-Inhibitor-haltigem Medium: Wählen Sie neun Wells in einer 12-Well-Zellkulturplatte aus und markieren Sie sie gemäß der FLT3-Inhibitor-Konzentrationsleiter (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 und 1000 nM). Geben Sie 400 μl vollständiges Medium in die mit 10,0 μM gekennzeichneten Vertiefungen und 200 μl vollständiges Medium in die verbleibenden Vertiefungen.
      1. Verdünnung von Gilteritinib: Geben Sie mit einer Pipettenpistole 4 μl 100 μM Gilteritinib-Reagenz (Gilteritinib in Dimethylsulfoxid) in jede der Vertiefungen, die mit 1000 nM markiert sind, und mischen Sie die Lösung gründlich. 200 μl 1000 nM Gilteritinib in die mit 500 nM gekennzeichneten Vertiefungen pipettieren und mischen; Pipettieren Sie dann 200 μl 500 nM Gilteritinib in die mit 250 nM gekennzeichneten Vertiefungen und mischen Sie. Nehmen Sie jedes Mal 200 μl der vorherigen Verdünnung in die nächste Vertiefung und mischen Sie, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
      2. AC220-Verdünnung: Geben Sie mit einer Pipettierpistole 4 μl 100 μM AC220-Reagenz (AC220 in Dimethylsulfoxid) in jede der Vertiefungen, die mit 1000 nM markiert sind. Führen Sie Schritt 1.2.4.1 für die anderen Vertiefungen aus.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die FLT3-Inhibitor-Stammlösung in der Pipette vollständig in die Vertiefungen überführt wird, um Lösungsreste zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gut gemischt ist, bevor Sie mit der Verdünnung fortfahren.
    5. Inkubation: Dispensieren Sie FLT3-Inhibitor-haltige Medien mit einer Pipette in dafür vorgesehene Vertiefungen (50 μl/Well). Bewahren Sie die 96-Well-Platte unter physiologischen Kulturbedingungen (37,0 °C ± 0,2 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) genau 72 Stunden ± 15 Minuten auf.
    6. Aliquotieren Sie 10 μl CCK-8-Reagenz mit einer Pipette in alle experimentellen und blinden Kontrollvertiefungen. Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie unter normoxischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) für 2,0 h ± 10 min.
      HINWEIS: Geben Sie das Reagenz bei niedriger Pipettengeschwindigkeit mit einer Eintauchtiefe von 2 mm an der Spitze ab, um die Blasenbildung zu minimieren. Vermeiden Sie Luftblasen während der Probenzugabe, um Interferenzen mit den Außendurchmessermesswerten zu vermeiden.
    7. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Notieren Sie die Ergebnisse.
    8. Berechnen Sie die prozentuale Hemmung gemäß der Berechnungsformel IC50 :
      Hemmung (%) = figure-protocol-1 × 100%
      Die experimentelle Vertiefung des Arzneimittels bezeichnet die mit dem Arzneimittel behandelten Zellvertiefungen. Zellkontrollvertiefung bezeichnet Zellvertiefungen, die nicht mit dem Medikament behandelt wurden. Blinde Kontrollvertiefungen zeigen nur Medium ohne Zellen an.
    9. Analysieren Sie die normierten Dosis-Wirkungs-Daten durch nichtlineare Regression unter Verwendung eines logistischen Modells mit vier Parametern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kurve anpassen, um die Kurvenanpassung durchzuführen. Leiten Sie die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) aus der Modellkonvergenz ab (R2 > 0,98, Restsumme der Quadrate < 0,15) und berechnen Sie die 95%-Konfidenzintervalle durch 1000-Iterations-Bootstrap-Resampling.
  3. DNA-Schädigungsexperiment von 32D-Zellen mit FLT3-ITD-Mutation, induziert durch FLT3-Inhibitor
    1. Wählen Sie FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen mit Wachstumsschub (Populationsverdopplungszeit < 24 Stunden) für die Beurteilung des DNA-Schadens aus.
    2. Zählen Sie die Zellen (siehe Schritt 1.2.2 für Details).
    3. Zellaussaat: Stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 1 × 106 Zellen pro Schale ein, indem Sie eine Schale mit einem Durchmesser von 6 cm und 4 ml Zellsuspension pro Schale verwenden.
    4. Bereiten Sie drei Replikate für jede Inhibitorkonzentration vor: 55 nM gilteritinib: 4 ml Medium + 2,2 μl 100 μM Stamm, 0,15 nM AC220: 4 ml Medium + 6 μl 100 nM Stamm. Die Lösungen werden im Vortex-Mix gemischt und 15 Minuten lang bei 37 °C äquilibriert. Schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten. Aspirieren Sie das ursprüngliche Medium und ersetzen Sie es durch 4 ml/Schale mit frisch zubereitetem inhibitorhaltigem Medium unter Verwendung steriler serologischer Pipetten.
    5. Inkubieren Sie die behandelten Zellen unter physiologischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) für definierte Intervalle (0, 2, 4, 6 H). Sofortige Prozesszeit-Null-Kontrollen für die Bewertung von DNA-Schäden zu Studienbeginn.
    6. Trypanblau-Ausschluss-Assay
      1. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 150 × g für 1 min. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden mit 1 ml Kulturmedium resuspendiert.
      2. Pipettieren Sie 100 μl resuspendierte Zellen in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff, fügen Sie 100 μl Trypanblau-Färbung (2x) hinzu, mischen Sie vorsichtig und färben Sie sie 3 Minuten lang.
      3. Zählen Sie die Zellen (siehe Schritt 1.2.2 für Details).
      4. Berechnen Sie die Zellviabilität wie folgt:
        %Zellüberleben = figure-protocol-2 × 100%
        HINWEIS: Für den Comet-Assay wurden nur Proben mit einer Lebensfähigkeit von ≥90 % verarbeitet.

2. Vorbereitung der Reagenzien und Vorbereitung der Zellprobe

  1. Die Lyselösung (enthält 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO) wird 30 Minuten lang im Kühlschrank bei 4 ΰC ± 0,5 °C äquilibriert.
  2. Schmelzende Agarose (LMA) bei 95 °C für 15 min schmelzen und dann in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahren, um eine Verfestigung zu verhindern.
  3. Bereiten Sie den alkalischen Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) vor, indem Sie 12 g NaOH mit einer elektronischen Waage wiegen, 2 mL 500 mM EDTA-Lösung pipettieren und dann ddH2O hinzufügen, um bis zu 1 l des Puffers herzustellen.
  4. Zellernte
    1. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang zentrifugiert. Die Überstände werden durch Vakuumfiltration abgesaugt.
      1. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml vollständigem Medium mit 1 ml-Pipettenspitzen mit breiter Bohrung, gefolgt von 10 vertikalen Inversionen.
      2. Zählen Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei 150 × g für 5 Minuten, um das gesamte Medium zu entfernen. Resuspendieren Sie die gewaschenen Zellen in kalziumfreiem PBS auf ~5,0 × 105 Zellen/ml.

3. Verfahren des Comet-Assays

  1. Bereiten Sie im Voraus Kometen-Assay-Objektträger und Zellproben vor. Bereiten Sie mit einer Pipette eine 10:1 (v/v) Mischung aus LMA, Agarose und Zellsuspension (5 × 105 Zellen/ml) in 1,5 ml-Röhrchen vor und mischen Sie vorsichtig. Dispensieren Sie 55 μl Aliquots des Agarose-Zell-Gemisches auf Kometenobjektträger mit einer Pipette, die in einem Winkel von 45° gehalten wird, wobei ein Abstand von 2 mm zur Objektträgeroberfläche eingehalten wird. Legen Sie die mit der Mischung beschichteten Objektträger 30 Minuten lang bei 4 °C auf, um Licht zu vermeiden.
    HINWEIS: Während der Zugabe des LMA und der Zellmischung zu den Komet-Assay-Objektträgern ist die Suspension langsam und gleichmäßig zu dosieren, um Blasenbildung zu verhindern und eine homogene Gelverteilung zu gewährleisten.
  2. Tauchen Sie die erstarrten Objektträger in eine vorgekühlte Lyselösung (enthält 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO) und führen Sie die Lyse für ≥1 h bei 4 °C unter lichtgeschützten Bedingungen durch.
  3. Entfernen Sie nach der Lyse den Objektträger aus dem Lysat und saugen Sie mit einer Pipettenpistole so viel Flüssigkeit wie möglich um das Paddel herum auf. Legen Sie dann den Objektträger in einen alkalischen Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH >13) und balkalibrieren Sie ihn 1 h lang bei 4 °C vor, wobei darauf zu achten ist, dass kein Licht vorhanden ist.
  4. Elektrophorese: Positionieren Sie die Objektträger in einer Elektrophoresekammer und fügen Sie ausreichend alkalische Elektrophoreselösung hinzu, um die Objektträger einzutauchen. Führen Sie die Elektrophorese bei 24 V (entspricht 0,74 V/cm) mit konstantem Strom (300 mA) für 30 Minuten unter Verwendung eines voräquilibrierten Puffers (4 °C) durch, um DNA-Schäden zu minimieren.
  5. Neutralisation: Nach der Elektrophorese die alkalische Elektrophoreselösung mit einer Pipettenpistole aus dem Objektträger absaugen, die Objektträger 2 x 5 min in dH2O tauchen und anschließend 5 min in 70%iges Ethanol tauchen. Trocknen Sie die Objektträger in einem Inkubator bei 37 °C für 15 min.
  6. Färbung: Ein 100 μL Aliquot von 1x YeaRed Nukleinsäure-Färbung pro Vertiefung auftragen und 30 min bei Raumtemperatur unter lichtgeschützten Bedingungen inkubieren. Entfernen Sie überschüssige Flecken durch sanftes wässriges Spülen und anschließendes thermisches Trocknen bei 37 °C.
  7. Bildgebung: Führen Sie die Fluoreszenzvisualisierung mit einem Fluoreszenzmikroskop durch, das mit einem 4-fach-Objektiv ausgestattet ist, wobei die digitale Bildaufnahme unter standardisierten Belichtungsbedingungen durchgeführt wird.

4. Datenverarbeitung

  1. Führen Sie eine quantitative Bildanalyse durch, um Standard-Kometenparameter zu bestimmen, einschließlich Schweif-DNA (%), Olivenschweifmoment und Schweiflänge (μm).
    1. Öffnen Sie die Schnittstelle der Software (Abbildung 5).
    2. Importieren Sie ein Bild in die Software, klicken Sie auf Datei und dann auf Datei auswählen , um das Bild, das Sie analysieren möchten, in die Software zu importieren. Halten Sie anschließend die Maustaste gedrückt und ziehen Sie, bis ein blaues Feld erscheint. Ziehen Sie das blaue Feld, um sicherzustellen, dass die Zelle, die Sie analysieren möchten, in dem Feld eingeschlossen ist. Mit der Option Anpassen in der Abbildung können Sie die Position des Rahmens so anpassen, dass die gesamte Zelle einbezogen wird (Abbildung 5).
    3. Bevor Sie die Analyse starten, klicken Sie auf Start und dann auf Analysieren. Die Ergebnisse der Einzelzellanalyse werden auf der rechten Seite unter "Profile" angezeigt. Nachdem Sie jede Zelle analysiert haben, klicken Sie auf Speichern. Die Parameter, die erkannt werden können, werden auf der rechten Seite von "Profile" angezeigt, und die numerischen Werte der verschiedenen Parameter werden unten angezeigt. Klicken Sie abschließend auf Datei | Exportieren von Ergebnissen. Zu den erhaltenen Ergebnissen gehören HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment und OliveTailMoment.

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Ergebnisse

Der Comet-Assay wurde systematisch eingesetzt, um differentielle DNA-Schadensprofile zu quantifizieren, die durch Gilteritinib und AC220 in FLT3-mutierten Zelllinien induziert wurden. Die Analysen zeigten, dass der Unterschied in der DNA-Schädigung zwischen Zellpopulationen, die nicht mit Gilteritinib und AC220 behandelt wurden, statistisch nicht signifikant war (P > 0,05). Dosisabhängige Erhöhungen der Schwanz-DNA (%) und der Olive Moment Tail (OMT)-Werte erreichten eine statistische Signifikanz (P < 0,05) nach ei...

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Diskussion

Der Comet-Assay stellt einen bedeutenden Fortschritt in den Methoden zur Bewertung der Genotoxizität dar. Diese Technik bietet deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen durch ihre technische Zugänglichkeit, die Einzelzellauflösung und die direkte Visualisierung von Schädigungsmustern über elektrophoretische Migrationsprofile. In der AML-Therapieentwicklung ermöglicht der Comet-Assay die systematische Bewertung der genotoxischen Profile von Wirkstoffkandidaten während der Zielva...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das innovative Forschungsteam für Wissenschaft und Technologie der Jiangsu Higher Education Institution (2021), das Programm des Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), das Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Program (2025KY1861), die Natural Science Key Foundation der Jiangsu Higher Education Institutions of China (Grant No. 24KJA310008), die Programme des Suzhou Vocational Health College (Grant No. SZWZYTD202201, szwzy202406) und Projekt des State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University (GZK12023013).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTABeyotimeST066
1x YeaRed Nukleinsäure-FärbungYeasen10202ES
32D-ZELLECobioerCBP60995
AC220TargetMolNr. T2066
Zellzähl-Kit-8DojindoCK04
Zell-ZählplatteQiuJingXB-K-25
CO2 InkubatorThermo51032872
Comet Assay Software-Projekt (CASP)
CometAssay Kit Trevigen4250-050-K
Zytation 5BioTek16280004
FBSPFANNEST30-3302
GilteritinibTargetMolNr. T4409
GraphPad Prism 9.0
Hochgeschwindigkeits-ZentrifugeThermo  Artikel-Nr.: 9AQ2861
L-1000XLS+ PipettenRainin17014382
L-20XLS+ PipettenRainin17014392
Behälter für flüssigen StickstoffMvecryogeYDS-175-216
Multiskan FC Mikroplatten-PhotometerThermo1410101
Na2OHDAMAO1588
PBSSolarbio GmbHNr. P1020
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100xBeyotimeNr. C0222
RPMI 1640 mittelGibcoC22400500BT
Trinokulares LebendzellmikroskopMotic1.1001E+12
UltratiefkühlschrankHaireV118574

Referenzen

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  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
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