Ein fluoreszenzbasiertes Protokoll zur vorläufigen Screening von Proteinsyntheseinhibitoren aus natürlichen Quellen

Summary

Dieses Protokoll führt eine fluorometrische Screening-Methodik ein, die zur Identifizierung von Inhibitoren der Proteinsynthese von Naturprodukten oder kleinen Molekülen optimiert ist. Seine Praktikabilität eignet es sowohl für die Grundausbildung in Arzneimittelforschungstechniken als auch für die Anwendung in Kampagnen der Arzneimittelchemie.

Abstract

Naturprodukte stellen eine reiche Quelle therapeutischer Verbindungen dar, die bei mehreren Krankheiten, insbesondere bei Krebs, eingesetzt werden. Durch die Nutzung dieser Biomoleküle als strukturelle Vorlagen in der Arzneimittelforschung haben Forscher sowohl schnellere Entwicklungszeiten als auch eine verbesserte biologische Wirksamkeit im Vergleich zu vollständig synthetischen Verbindungen erreicht. Der Proteinsynthese-Weg hat sich als überzeugendes Ziel für Naturprodukte etabliert, insbesondere angesichts seiner Beteiligung an schwer behandelbaren Krebserkrankungen. Der potente Proteinsynthesehemmer Cycloheximid, abgeleitet von Streptomyces griseus, veranschaulicht das Potenzial natürlicher Verbindungen in diesem Bereich. Da diese natürlichen Produktderivate zu arzneimittelähnlichen Molekülen entwickelt werden, bleibt die Bestätigung ihrer inhibitorischen Aktivität der Proteinsynthese ein entscheidender Validierungsschritt. Das Hauptziel ist es, ein bachelorfreundliches Protokoll zur schnellen Bewertung der Hemmungsaktivität von Verbindungen bereitzustellen. Das Protokoll verwendet ein fluoreszierendes Substrat und fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopietechniken, um systematisch die inhibitorischen Fähigkeiten dieser natürlichen Produkte zu erkennen und zu messen. Die Studie untersuchte Verbindungen, die aus zwei Pflanzenarten stammen: Pinus sylvestris und Psoralea corylifolia. Mit Cycloheximid als Referenzinhibitor zeigten beide Naturprodukte unterschiedliche Hemmungen der Proteinsynthese.

Introduction

Die Proteinsynthese beinhaltet stark regulierte Prozesse: Transkription und Translation. Während der Transkription werden DNA-Sequenzen von Genen kopiert, wodurch Boten-RNA (mRNA) entsteht. Das Enzym RNA-Polymerase arbeitet daran, die DNA-Doppelhelix zu trennen und verwendet einen Strang als Leitfaden, um ein passendes mRNA-Molekül zu bilden. Sobald die mRNA vollständig gebildet ist, wandert sie vom Zellkern zum Zytoplasma zur Translation. Die Translation erfolgt im Ribosom, wobei mRNA als Vorlage verwendet wird, um Aminosäuren zu einer Polypeptidkette zusammenzusetzen. Diese Polypeptidkette wird beim Verlassen des Austrittstunnels des Ribosoms zu einem funktionellen Protein gefaltet. Die Transkription wird hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren, Chromatinmodifikationen und regulatorische RNAs reguliert, während die Translation durch Initiationsfaktoren, Signalwege und RNA-Stabilitätsmechanismen geregelt wird. Diese regulatorischen Systeme ermöglichen es den Zellen, zelluläre Funktionen aufrechtzuerhalten und effektiv auf Stress oder Schäden zu reagieren¹.

Die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krebsarten – etwa 85 % – äußert sich als solide Tumoren². Obwohl diese Tumore sich in ihren spezifischen Merkmalen und Verhaltensweisen stark unterscheiden können, teilen sie meist bestimmte gemeinsame physiologische Merkmale und Muster, wie etwa eine hochregulierte Proteinsynthese unabhängig von ihrer Ätiologie oder anatomischen Position³. Krebszellen stören die Proteinsynthese, indem sie translationale Mechanismen kapern, um ihren hohen Energiebedarf und ihr unkontrolliertes Wachstum zu unterstützen. Diese Umprogrammierung ist das Ergebnis einer Dysregulation nahezu aller wichtigen onkogenen Signalwege, die das Überleben, die Proliferation und Metastasen der Zellen fördert und gleichzeitig die Zelltodeswege unterdrückt⁴. In Tumorzellen schaltet die Maschinerie zur Herstellung von Ribosomen auf Hochtouren, was eine erhöhte Proteinproduktion und eine schnelle Zellteilung ermöglicht. Da diese verbesserte Proteinsynthese entscheidend für das Überleben von Krebs ist, zeigen Behandlungen, die diesen Prozess ansprechen und blockieren, vielversprechende Möglichkeiten⁵. Daher könnte Forschung mit Schwerpunkt auf krebsspezifischen Translationsfaktoren, einzigartigen ribosomalen Zusammensetzungen oder veränderten Signalwege, die die Proteinsynthese regulieren, gezieltere Inhibitoren mit verbesserten therapeutischen Fenstern liefern.

Da Naturprodukte (NPs) für ihr breites Spektrum biologischer Aktivitäten bekannt sind, ist die Entwicklung selektiver Proteinsynthesehemmer für die Krebsbehandlung mit ihren Gerüsten ein vielversprechender Ansatz ^6,7. NPs können verschiedene Komponenten der Proteinsynthese-Maschinerie anvisieren, von der Ribosomenbindung bis hin zur Interferenz mit Initiationsfaktoren oder Elongationsprozessen, was sie zu unschätzbaren Ausgangspunkten in der Arzneimittelentwicklung für Proteinsyntheseinhibitoren in festen^Tumoren macht. Die Fähigkeit, Verbindungen schnell auf gewünschte Aktivitäten zu testen, dient als entscheidender Einstiegspunkt für Wirkstoffforschungsplattformen, die NP-Treffer effizient identifizieren wollen. Typischerweise verwendet das Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen Fluoreszenz-Assays, um die führenden Kandidatenmoleküle⁸ schnell einzugrenzen.

Wissenschaftler weltweit verlassen sich auf fluoreszenzbasierte Techniken als wesentliche Werkzeuge zur Analyse biologischer Systeme. Diese Ansätze werden weit verbreitet zur Untersuchung zellulärer Prozesse eingesetzt, sodass Forscher biomolekulare Interaktionen in Echtzeit verfolgen^können. In Kombination mit bioorthogonalen Klickchemie-Reaktionen ermöglichen diese Methoden eine präzise Visualisierung der Proteinsynthese¹⁰. Der vorgestellte fluoreszierende Proteinsynthese-Test ist eine nicht-radioaktive Methode zur Beurteilung der Proteinsynthese, die O-Propargly-Puromycin (OPP), ein zelldurchlässiges, alkynhaltiges, puromycinhaltiges Analog verwendet. Nach der zellulären Behandlung wird OPP am C-Terminus von verlängerten Polypeptidketten eingebaut, was zu einer Translationstermination führt. Diese alkyn-markierten abgeschnittenen Proteine werden anschließend mittels kupferkatalysierter Klickchemie in Kombination mit 5-FAM-azid nachgewiesen.

Dieser fluorometrische Test ist ein wertvolles Forschungsinstrument und eine zugängliche chemische biologische Methode zur Ausbildung von Bachelor-Studierenden. Durch die Bereitstellung eines zugänglichen, effizienten Protokolls mit minimaler Datenverarbeitung erhalten die Studierenden praktische Erfahrungen in modernen Techniken der Arzneimittelforschung und beschleunigen den Prozess der Arzneimittelentwicklung. Da die Nachfrage nach neuen Proteinsyntheseinhibitoren wächst, stattet dieser Ansatz Studierende mit sinnvollen Forschungsmöglichkeiten aus und trägt gleichzeitig zu Fortschritten in der Krebstherapie bei.

Protocol

1. Reagenzvorbereitung aus dem Kit

HINWEIS: Ausreichend mischen, abdrehen und alle Reagenzien bis zur Anwendung auf Eis lassen.

1. Organisieren und erhalten Sie das Proteinsynthese-Hemmungskit, den PBS-Puffer, das Zellkulturmedium, die mit Zellkulturen behandelten Platten, 15-mL konische, sterile Polypropylen-Zentrifugenröhren, 2-mL-Zentrifugenröhren, p10-, p20-, p200- und p1000-Pipetten sowie geeignete Spitzen.
2. Waschpuffer vorbereiten.
   1. Taue den 10-fachen Waschpuffer bei 37 °C auf, indem du das Fläschchen in der Hand umwickelst. Nutzen Sie die Körperwärme in den Händen zum Auftauen und prüfen Sie häufig, ob das Auftauen abgeschlossen ist.
   2. Verdünne den 10-fachen Waschpuffer mit 1:10 in deionisiertem Wasser in einem Zentrifugenrohr. Mischen Sie durch Inversion oder Wiederaufhängung durch Pipetten auf und ab. Lagern Sie auf Eis, bis Sie es verwenden.
3. Fixierende Lösung bei Raumtemperatur auftauen. Lagern Sie auf Eis, bis Sie es verwenden.
4. Bereiten Sie den Permeabilisierungspuffer vor.
   1. Tauen Sie den 10-fachen Permeabilisierungspuffer bei 37 °C auf, indem Sie das Fläschchen in der Hand umschließen. Nutzen Sie die Körperwärme in den Händen zum Auftauen und prüfen Sie häufig, ob das Auftauen abgeschlossen ist.
   2. Verdünne den 10-fachen Vorrat 1:10 in deionisiertem Wasser in einem Zentrifugenrohr. Mischen Sie die Komponenten durch Inversion oder Re-Suspension durch Hoch- und Ab-Pipetten. Lagern Sie auf Eis, bis Sie es verwenden.
5. Auftauen von 400x Proteinetiketten, 100x fluoreszierendes Azid, 100x Cycloheximid, DNA-Färbung und das 20-fache Reduktionsmittel bei Raumtemperatur. Während der Nutzung auf Eis in einer dunklen Umgebung aufbewahren. Decken Sie die Farbstoffe mit Alufolie ab oder bewahren Sie sie in einem 2 °C Kühlschrank auf, wenn sie nicht verwendet werden.

2. Markierung von Kontroll- und experimentellen Zellen

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit stabilen, epithelialen Brustkrebszellen MDA-MB-231 entwickelt. Alle adhärenten Zelllinien können verwendet werden. Alle unten aufgeführten Schritte verwenden eine 96-Well-Platte, und alle Volumina und Konzentrationen werden für zwei Testverbindungen und zwei Kontrollen mit einem Arbeitsvolumen von 100 μL berechnet.

1. Kultivierung anhängender Säugetierzellen
   HINWEIS: Zellen sollten vor einer 80-90%igen Konfluenz ausgeschieden werden, um ein gesundes, exponentielles Wachstum zu erhalten und Kontakthemmung oder -differenzierung zu verhindern.
2. Taue ein Fläschchen mit kryokonservierten Zellen auf Zimmertemperatur auf und verdünne es dann mit geeignetem Medium.
3. Zentrifugiere die Suspension, um die Zellen zu pelletieren und das Supernatant zu aspirieren. Das Pellet in einem frischen Medium wieder aufhängen und bei entsprechender Zelldichte in eine neue Flasche übertragen.
4. Sobald die Zellen zu 80 % zusammengewachsen sind, entferne das Medium und sauge Altwuchsmedium aus dem Kolben an. Anschließend werden die Zellen mit sterilem PBS ausgespült, um das Restserum zu entfernen, das das Trypsin hemmt. Gib eine Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellschicht zu bedecken, und inkubiere 3–5 Minuten oder bis die Zellen bei 37 °C abgelöst sind.
5. Fügen Sie ein vollständiges Medium mit Serum hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, übertragen Sie die Zellsuspension in ein Rohr, mischen Sie vorsichtig und zählen Sie die Zellen.
6. Samenzellen in Sichtplatten verdünnen Zellen im geeigneten Aufteilungsverhältnis (z. B. 1:3 oder 1:5) in frische Kolben mit neuem Medium und inkubieren (typischerweise 37 °C, 5 % CO₂), um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten.
   HINWEIS: Für das hier beschriebene Experiment wurde die Zelllinie mit 2 × 10⁴ pro Bohrloch (96-Bohrloch-Platte) plattiert und bei 37 °C für 12 Stunden inkubiert.

3. Addition von Verbindungen

1. Bereite Mastermix A vor.
   1. Beschriften Sie ein Zentrifugenrohr mit "A". Pipette 598,5 μL Kulturmedium und 1,5 μL Protein in "A". Die Mischung wird durch Pipettieren nach oben und unten wieder suspendiert, um die Homogenität zu gewährleisten.
2. Bereite Mastermix B vor.
   1. Beschriften Sie ein Zentrifugenrohr mit "B". Pipette 1,5 μL Proteinetikett, 6,6 μL Cycloheximid und 591,9 μL Kulturmedium in "B". Die Mischung wird durch Pipettieren nach oben und unten wieder suspendiert, um die Homogenität zu gewährleisten.
3. Behandeln Sie die Zellen mit gewünschten Verbindungen (Abbildung 1), positiven und negativen Kontrollen.
   1. Entferne die Zellen aus dem Inkubator und entferne das Wachstumsmedium durch Aspiration. Neigen Sie die Platte und aspirieren Sie an der Seite des Bohrlochs statt in der Mitte, um eine Störung der Zellen zu verhindern.
   2. Pipette 1 μL Testmasse in einen Brunnen und 1 μL Prüfstoff-Vehikel (0,1 % v/v DMSO) in einen Brunnen. Für doppelte Studien fügen Sie jede Probe einem zweiten Brunnen hinzu und wiederholen Sie diesen Vorgang. Fügen Sie 99 μL Mastermix A in diese Bohrungen hinzu. Pipettieren Sie vorsichtig schräg an die Seite des Brunnens, um kinetische Störungen der Zellen zu verhindern.
      HINWEIS: Die maximale DMSO-Konzentration für das Compound-Screening hängt vom Zelltyp und -test ab, aber die allgemeinen Richtlinien lauten: 0,1–0,5 % DMSO – im Allgemeinen sicher für die meisten zellbasierten Assays mit minimaler Toxizität, und 1 % DMSO – häufig verwendetes Maximum und akzeptabel für viele Zelltypen in kurzfristigen Assays.
   3. Pipette 100 μL Mastermischung B in zwei Bohrungen. Pipettieren Sie schräg in die Seite des Brunnens, um eine Zellstörung zu verhindern.
   4. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die gewünschten Komponenten in die Zellen einzubinden. Inkubiere Zellen bei 37 °C für 0,5–2 Stunden.

4. Beendigung des Experiments und Waschen der Zellen

1. Entferne das Kulturmedium durch Aspiration. Neigen Sie die Platte und aspirieren Sie an der Seite des Bohrlochs statt in der Mitte, um eine Störung der Zellen zu verhindern.
2. Gib 100 μL PBS-Puffer in jede Bohrung und zentrifugiere die Platte bei 900 × g für 5 Minuten.
3. Entferne den PBS-Puffer durch Aspiration.

5. Fixierung und Permeabilisierung

1. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL Fixationslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur 15 Minuten in einer dunklen Umgebung.
2. Entfernen Sie die fixierende Lösung durch Aspiration. Neigen Sie die Platte und saugen Sie an der Seite des Brunnens statt in der Mitte.
3. Waschen Sie die Zellen mit 100 μL Waschpuffer und entfernen Sie den Puffer durch Aspiration. Wiederhole diesen Schritt zweimal.
4. Fügen Sie jedem Brunnen 100 μL Permeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer durch Aspiration. Neigen Sie die Platte und saugen Sie an der Seite des Brunnens statt in der Mitte.

6. Proteinreaktion und Färbung

1. Bereite die Reaktionscocktail-Mastermischung vor.
   1. Fügen Sie 651 μL PBS-Puffer, 7,0 μL 100-fache Kupferreagenz, 7 μL fluoreszierend Azid und schließlich 35 μL Reduktionsmittel in eine Zentrifugenröhre ein. Suspendiere diese Mischung erneut, um die Homogenität zu gewährleisten.
      HINWEIS: Folgen Sie genau dieser Reihenfolge beim Zufügen der Reagenzien. Verwenden Sie es innerhalb von 15 Minuten nach der Zubereitung.
2. Gib jedem Bohrloch 100 μL des Reaktionscocktails hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer dunklen Umgebung, um Photobleaching zu verhindern.
3. Zentrifugiere Zellen bei 900 × g für 5 Minuten. Gleiche die Zentrifuge aus, indem du leere Platten hinzufügst, um das Gewicht gleichmäßig zu verteilen. Entferne die Mischung durch Aspiration.
4. Waschen Sie die Zellen mit 100 μL Waschpuffer und entfernen Sie den Puffer durch Aspiration. Wiederhole diesen Schritt zweimal.

7. DNA-Färbung

1. Bereiten Sie eine 1-fache Verdünnung der Gesamt-DNA-Färbung vor und fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL hinzu. Inkubiere Zellen bei Raumtemperatur für 20 Minuten in einer dunklen Umgebung, um Photobleaching zu verhindern.
2. Zentrifugiere die Platte bei 900 × g für 5 Minuten. Gleiche die Zentrifuge aus, indem du leere Platten hinzufügst, um das Gewicht gleichmäßig zu verteilen. Entferne die Mischung durch Aspiration.
3. Waschen Sie die Zellen mit 100 μL Waschpuffer und entfernen Sie den Puffer durch Aspiration. Wiederhole diesen Schritt zweimal.
4. Stellen Sie die Zellen mit 100 μL gekühltem PBS-Puffer wieder auf, um sie auf die Bildgebung vorzubereiten.

8. Bildgebung

1. Stecken Sie die Platte in den Kennzeichenleser.
2. Stell die Vergrößerung auf 20x ein.
3. Analysieren Sie die Kernfärbung mit dem GFP 469/525 nm-Kanal. Verwenden Sie Autobinning und Autofokus, um die Bildergebnisse zu verbessern.
4. Analyse der aktiven Proteinsynthese mit dem Texas Red 586/647nm-Kanal. Verwenden Sie Autobinning und Autofokus, um die Bildergebnisse zu verbessern.

Results

Dieser Test nutzte Fluoreszenz, um die Fähigkeit verschiedener Naturprodukte zur Hemmung der Proteinsynthese zu visualisieren und zu quantifizieren. Cycloheximid (CHX) ist ein bekannter Proteinsyntheseinhibitor, dessen Wirkungsweise darin besteht, den Translokationsprozess während der Verlängerung^zu stören. Für diese Studie wurden lebende Zellen mit einem grünen, fluoreszierenden Kernfarbstoff nachgewiesen. OPP ist ein Derivat von Puromycin, das kovalent an entste...

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine fluorometrische Screening-Methodik zur Untersuchung natürlicher Produkte und kleiner Moleküle, um deren Fähigkeit zur Hemmung der Proteinsynthese zu bewerten. Die Einfachheit dieses Protokolls ermöglicht es Bachelor-Forschern, es korrekt umzusetzen, sodass sie substanzielle Beiträge zum wissenschaftlichen Wissen leisten können. Das Protokoll verlangt ein grundlegendes Verständnis biologischer Methoden und Techniken, wobei Schritte sorgfältige Ausführung erfor...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Biotek Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Agilent	BTCYT1V
Verbindung 1 (Dehydroabietylamin, CAS 1446-61-3)	Enamine	EN300-7409771
Compound 2 (Bakuchiol, CAS 10309-37-2)	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R	Thermowissenschaftlich	75004271
Ibidi GmbH-Schlittplatte 96-Bohrloch	Ibidi	80826
MDA-MB-231-Zelllinien	ATCC	ATCC HTB-26
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	ATCC	ATCC 30-2200
Proteinsynthese-Assay-Kit (Grün)	Abcam	Ab239725