Split-Hybridisierungssonde unter Verwendung eines DNA-Fluoreszenz-Leuchtaptamers als Signalreporter für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse

Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Design von Split-Hybridisierungssonden, die das fluoreszierend leuchtende Aptamer DAP-10-42 als Signalreporter verwenden, und ihre Anwendung für den Nukleinsäurenachweis und die Differenzierung zwischen Zielen mit Einzelnukleotidsubstitutionen.

Abstract

DNA-basierte fluoreszierende Leuchtaptamere (FLAPs) sind vielversprechend für bioanalytische Assays, da sie eine kostengünstige Fluoreszenzsignalauslesung ermöglichen, ohne dass Nukleinsäuresignalreporter mit Fluorophoren und/oder Quenchern markiert werden müssen, im Gegensatz zu herkömmlichen Hybridisierungssonden, die für die sofortige Nukleinsäuredetektion verwendet werden. Stattdessen binden FLAPs nicht-kovalent Farbstoffliganden, die in wässrigen Lösungen eine intrinsisch geringe Fluoreszenz aufweisen, aber bei der FLAP-Bindung stark emittieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Algorithmus zum Design von Split-Light-Up-Aptamer-Sensoren (SLASs) unter Verwendung von DAP-10-42, dem effizientesten DNA-FLAP, über den bisher berichtet wurde. Wenn SLAS mit Nukleinsäuresequenzen ausgestattet ist, die zu einem interessierenden Nukleinsäureziel komplementär sind, ist es ein vielversprechendes Werkzeug für die Nukleinsäureanalyse, das die sequenzspezifische Detektion von Nukleinsäurezielen mit einer Selektivität bis zu einem Nukleotid ermöglicht, um die Analyse von Einzelnukleotidsubstitutionen (SNSs) zu ermöglichen. SLASs bieten den Vorteil einer markierungsfreien fluoreszenzbasierten Signalauslesung, die mit einem herkömmlichen küvettenbasierten Fluoreszenzspektrophotometer, einem tragbaren Fluorometer oder visuell bei Anregung mit einer tragbaren Lichtquelle gemessen werden kann. Der SLAS-Ansatz ist vorteilhaft für Biosensoranwendungen in der Krankheitsdiagnostik, der Umweltüberwachung und der biomolekularen Forschung.

Introduction

Die Nukleinsäureanalyse mit Hybridisierungssonden wird routinemäßig durchgeführt, um spezifische DNA/RNA-Sequenzen nachzuweisen und zu quantifizieren¹. Eine der erfolgreichsten Hybridisierungssonden ist die Molecular Beacon (MB)-Sonde, bei der es sich um eine haarnadelförmige DNA handelt
Oligonukleotid, markiert mit einem Fluorophor und einem Quencher an den entgegengesetzten Termini ^2,3. Es weist sofort (ohne dass der Sonden-Ziel-Komplex aus dem Überschuss der Sonde gewaschen werden muss) das Vorhandensein einer Nukleinsäuresequenz nach, die zum Schleifenfragment der Sonde komplementär ist, und wird häufig in der quantitativen PCR (qPCR) verwendet. Die Notwendigkeit, zwei Farbstoffe - den Fluorophor und den Quencher - kovalent an die Oligonukleotidsequenz der Sonde zu binden, erhöht die Kosten, insbesondere wenn eine neue MB-Sonde benötigt wird, die auf eine neue Nukleinsäuresequenz abzielt. Alternativ kann die MB-Sonde als Signalreporter in einem Mehrkomponenten-Hybridisierungssondenformat (Split) verwendet werden, bei dem zwei unmarkierte Oligonukleotide sowohl mit dem Ziel- als auch mit dem MB-Sondenreporter⁴ interagieren. Der Mehrkomponenten-Sondenansatz erhöht die Selektivität für die Nukleinsäureerkennung und verbessert die Bindung der Sonde an strukturierte Ziele ^5,6,7. Dieser Ansatz beseitigt jedoch nicht die Notwendigkeit einer kovalenten Markierung des Reporters mit einem Fluorophor⁸.

Fluoreszierende Light-up-Aptamere (FLAPs⁾⁹ sind Aptamere, die eine Affinität zu niedrig fluoreszierenden umweltempfindlichen Farbstoffen (Fluorogenen) aufweisen, bei denen die Bindung durch FLAP die Fluoreszenz des Fluorogen-Mannigfaltigkeitsschemas erhöht. Im Gegensatz zu fluoreszenzmarkierten Sonden und Signalreportern benötigen FLAPs keine kovalente Markierung von Sensorelementen mit einem oder mehreren Farbstoffen und bieten somit den Vorteil der markierungsfreien Fluoreszenzdetektion¹⁰. Dies ist besonders wichtig während des Optimierungsschritts, wenn Dutzende von Nukleinsäurekonstrukten getestet werden müssen, um eine zufriedenstellende Assay-Leistung zu erzielen. Darüber hinaus können FLAP-Assays optimiert werden, indem die Konzentration eines Fluorogen- und/oder FLAP-Sensors angepasst wird, anstatt das Design des Sensors zu ändern. Diese Vorteile können für Low-Budget-Forschungs- und Lehrlabore von Bedeutung sein. DNA-FLAPs sind besonders vielversprechend als Signalreporter von Mehrkomponenten-Hybridisierungssonden, die als Split Light-up Aptamer Sensors (SLASs) bezeichnet ^werden11. Der effizienteste DNA-FLAP, über den bisher berichtet wurde, ist DAP-10-42, das ursprünglich ausgewählt wurde, um die Fluoreszenz von Dapoxylsulfonylfarbstoffen¹² zu verbessern, mit einer promiskuitiven Fähigkeit, die Fluoreszenz einer Vielzahl von Arylmethanfarbstoffen (z. B. Auramin O, AO; Kristallviolett, CV)¹³ zu binden und zu verbessern. DAP-10-42 wurde in SLAS umgewandelt und kann für die Nukleinsäureanalyse 13,14,15 verwendet werden.

Das Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, eine sequenzspezifische Analyse von Nukleinsäurezielen von Interesse unter Verwendung von markierungsfreien SLAS-Strängen und einem fluorogenen Farbstoff als Pufferkomponente zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt einen Algorithmus zum Entwerfen von SLAS auf Basis von DAP-10-42 und unterstreicht die SLAS-Leistung für die hochselektive Detektion von Nukleinsäuresequenzen, die sich in nur einem einzigen Nukleotid unterscheiden.

Der SLAS-Nukleinsäure-Detektionsassay erfordert zwei speziell synthetisierte unmodifizierte DNA-Oligonukleotide, die in einer Endkonzentration von 0,5-1 μM verwendet werden, um eine maximale Leistung zu erzielen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet einen kommerziell erhältlichen Auramin O (AO)-Farbstoff als Fluorogen. Die endgültige AO-Konzentration im Assay reicht von 1 bis 10 μM, um eine hohe Fluoreszenzverstärkung in Gegenwart eines spezifischen Nukleinsäureziels über dem Blindwert zu gewährleisten (Abwesenheit des Ziels; Ergänzende Abbildung 1). Die notwendigen Bestandteile des Assay-Puffers sind Kalium- und Magnesiumionen (Ergänzende Abbildung 2). Kaliumionen (1,25-40 mM) stabilisieren die vorgeschlagene G-Quadruplex-Domäne des FLAP, der als Signalreporter verwendet wird. Magnesiumionen (2,5-50 mM) reduzieren die Abstoßung negativ geladener Phosphatgruppen bei SLAS-Ziel-Wechselwirkungen. Die Temperatur des SLAS-Assays unter Verwendung der gemeldeten Sequenzen für den Signalberichterstattungsbereich sollte 28 °C nicht überschreiten, um Leistungsverluste zu vermeiden¹⁶.

SLAS ist kompatibel mit einzelsträngigen Nukleinsäurezielen, wie z. B. DNA-Amplikons der asymmetrischen PCR oder einer isothermen DNA-Amplifikationsreaktion (z. B. Rekombinase-Polymerase-Amplifikation, RPA¹⁷), RNA-Produkten aus der transkriptionsvermittelten Amplifikation (TMA) oder der Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikation (NASBA)¹⁸ und nativen RNA-Molekülen wie miRNA, rRNA oder ncRNA). Variationen in der Nukleotidsequenz des Ziels bis hinunter zu einem einzelnen Nukleotid können mit dem SLAS-Ansatz ^13,14 nachgewiesen werden.

Protocol

1. Aufbau des Split Light-up Aptamer Sensors (SLAS) mit DAP-10-42 als Signalmelder

1. Entwerfen Sie die Sequenzen von zwei unmodifizierten DNA-Oligonukleotidsträngen, die SLAS bilden. Verwenden Sie ein Fragment, das die Nukleotide (nts) 4,6-39 von DAP-10-42 enthält (Tabelle 1, Abbildung 1A).
2. Die Sequenz von Stamm 1 (NTS 1-8 und 36-42) wird in Stamm 1' umgewandelt, indem ein prall gefüllter Thyminrückstand an Position nt 5 entfernt, der Stamm auf 4 bp (NTS 4,6-8 und 36-39) gekürzt und ein terminaler C-G bp hinzugefügt wird (Abbildung 1A, Schritt 1). Zusätzlich enthält einer der SLAS-Stränge die nts 9-29 der DAP-10-42-Kernsequenz, während ein anderer SLAS-Strang die nts 30-35 der Sequenz enthält.
3. Die 3'-terminale Sequenz des Fragments, das nts 9-29 enthält, mit d(GGTCAT) und die 5'-terminale Sequenz des nts 30-35 Fragments mit d(ATGACC) wird zu einem 6-bp-Stamm 2 erweitert (Abbildung 1A, Schritt 2).
   HINWEIS: Die Basenpaare T4-A39, A6-T38, C7-G37 und G8-C36 des Schaftes 1 in DAP-10-42 werden für die Leuchtfunktion des Aptamers benötigt. Die Sequenz des Stammes 1' kann nur an der Klemme bp modifiziert werden und kann je nach Bedarf ein G-C-, A-T-, T-A-Basenpaar sein oder um 1-2 Basenpaare erweitert werden. Die Reihenfolge von Stamm 2 ist beliebig und kann geändert werden. Es wird jedoch empfohlen, die thermodynamische Stabilität von Stamm 2 beizubehalten, es sei denn, die Prüftemperatur wird auf über 28 °C angehoben. Das Kürzen oder anderweitige Destabilisieren von Stamm 2 verhindert eine vorzeitige Farbstoffbindung ohne Ziel, wenn ein hoher Hintergrund des SLAS-basierten Fluoreszenzassays beobachtet wird. Eine Aufspaltung der Nukleotidsequenz DAP-10-42 zwischen nts 28-29, 27-28 oder 26-27 anstelle von nts 29-30 ist ebenfalls zulässig (Abbildung 1B).
4. Um das entworfene SLAS auf ein Nukleinsäureziel oder -interesse zuzuschneiden, verlängern Sie Stamm 1' mit DNA-Sequenzen, die zu den Ziel-Ziel-bindenden Fragmenten (Armen) durch d(TT)-Linker komplementär sind (Abbildung 1A, Schritt 3). Daraus ergeben sich die Sequenzen der Stränge SLAS-U und SLAS-S, aus denen die Sonde besteht.
5. Machen Sie den Zielbindungsarm von SLAS-S komplementär zu einem 7-10-nt-Fragment des Ziels, das die SNS-Stelle enthält, und den Zielbindungsarm von SLAS-U komplementär zu einem 15-25 nt-Fragment des Ziels, das an den Zielbindungsarm von SLAS-S angrenzt (Tabelle 1).
   HINWEIS: Es ist optional, ob der Zielbindungsarm von SLAS-S mit nt 4 oder nt 39 der DAP-10-42-Sequenz verbunden wird (Abbildung 1, Arm 1 bzw. Arm 2).
6. Bewerten Sie die Schmelztemperatur (T_m) der Duplexe zwischen dem Zielmolekül und den Zielbindungsarmen von SLAS-S und SLAS-U mit dem UNAFold Webserver (unafold.org)¹⁹.
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte DINAMelt oben auf der Webseite; Gehen Sie zu Anwendungen und wählen Sie Zwei-Zustands-Schmelzhybridisierung (Ergänzende Abbildung 3A). Geben Sie auf der Seite Two-State Melting Hybridization eine der interagierenden Sequenzen in das linke Feld und eine weitere in das rechte Feld ein (Ergänzende Abbildung 3B). Stellen Sie sicher, dass beide Sequenzen in einer Reihenfolge von 5' bis 3' sind. Sie können mehr als ein Paar interagierender Sequenzen eingeben, indem Sie sie durch Semikolons trennen.
   2. Geben Sie unten auf der Seite die Assay-Temperatur (22 °C), die monovalenten und zweiwertigen Kationenkonzentrationen (20 mM bzw. 25 mM) an, um sie an die Assay-Bedingungen anzupassen. Geben Sie die Konzentration der interagierenden Sequenzen an.
   3. Drücken Sie auf Senden (ergänzende Abbildung 3B). Beobachten Sie die Ergebnisse, die die Gibbs-Energieänderung, die Enthalpieänderung und die Entropieänderung der Bindung sowie die_T-m-Werte für die entsprechenden Duplexe enthalten (Ergänzende Abbildung 3B).
   4. Stellen Sie sicher, dass die_T-m-Werte für die Duplexe zwischen dem vollständig abgestimmten Ziel (M) und den Zielbindungsarmen von SLAS-S und SLAS-U über der Assay-Temperatur liegen, die im aktuellen Protokoll 22 °C beträgt. Hier lagen die_T-m-Werte bei 32,2 °C bzw. 74,4 °C (Ergänzende Abbildung 3C).
   5. Stellen Sie sicher, dass der Duplex zwischen SLAS-S und einem nicht übereinstimmenden Ziel (MM), das ein SNS enthält, einen T_m unter der Assay-Temperatur aufweist. Dies gewährleistet eine hohe Selektivität der Sonden-Ziel-Erkennung und verhindert, dass das AO-Fluorogen das Vorhandensein des Zielnukleinsäure-Analyten signalisiert, wenn es ein SNS im SLAS-bindenden Fragment enthält (Abbildung 2). Hier betrug die T_m 21,3 °C (Ergänzende Abbildung 3C), was ausreichte, um die Diskrepanz vom angepassten Komplex zu unterscheiden.
   6. Passen Sie die Sequenzen der Zielbindungsarme an, indem Sie die zielkomplementären Fragmente bei Bedarf kürzen oder verlängern, um die angegebenen Stabilitätsanforderungen zu erfüllen.
7. Beziehen Sie die entworfenen Stränge SLAS-S und SLAS-U von jedem kommerziellen Anbieter, der maßgeschneiderte DNA-Oligonukleotide liefert, oder synthetisieren Sie die DNA-Stränge intern mit einem automatisierten Oligonukleotid-Synthesizer.

Abbildung 1: Umbau eines fluoreszierenden Leucht-Aptamers (FLAP) DAP-10-42 in einen Split-Light-Up Aptamer Sensor (SLAS). (ein)Die Sekundärstruktur von DAP-10-42¹² wird durch eine DNA-Faltungsanwendung des UNAFold Web Servers¹⁹ bei 22 °C, 20 mM Na⁺, 25 mM Mg²⁺ vorhergesagt. Das Aptamer weist eine Haarnadel-Sekundärstruktur mit einem Kern auf, der sich vermutlich zu einem G-Quadruplex-Motiv faltet, das durch Stiel 1 stabilisiert wird. Damit DAP-10-42 in ein SLAS umgewandelt werden kann, (1) wird der Stamm 1 des Aptamers auf 4 bp gekürzt und von einem zusätzlichen G-C bp flankiert, um den Stamm 1' zu erhalten; (2) Die Kernsequenz wird zwischen NTS 29 und 30 aufgeteilt, wobei die 3'- und 5'-Seiten der Teilungsstelle mit komplementären Sequenzen d(GGTCAT) bzw. d(ATGACC) erweitert werden, um Stamm 2 zu bilden; (3) Stamm 1' ist mit den Sequenzen komplementär zu den angrenzenden Fragmenten eines Ziels von Interesse - Zielbindungsarmen - verlängert, mit einem d(TT)-Linker zwischen den Zielbindungsarmen und dem Signalmeldebereich der Sonde. (B) Der Kern kann auch zwischen den Knoten 28-29, 27-28 oder 26-27 aufgeteilt werden, ohne dass das Signal signifikant verloren geht und/oder die Fluoreszenzfaltung zunimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Mechanismus zur Generierung von SLAS-Signalen. SLAS besteht aus zwei Strängen - SLAS-U und SLAS-S - und einem fluorogenen Farbstoff (z. B. Auramin O; AO). In Ermangelung eines interessierenden Nukleinsäureziels befinden sich beide Stränge im dissoziierten Zustand und sind nicht in der Lage, den Farbstoff zu binden; Es wird kein Signal beobachtet (Mitte). In Gegenwart eines vollständig übereinstimmenden Ziels M hybridisieren sowohl SLAS-U als auch SLAS-S mit dem angrenzenden Fragment von M , um die Kernfragmente in die Nähe zu bringen. Dies ermöglicht die Bildung der Farbstoffbindungsstelle. Die Bindung von AO erhöht seine Fluoreszenz, die als Fluoreszenzsignalauslesung gemessen wird (links). In Gegenwart eines nicht übereinstimmenden Ziel-MM , das eine Einzelnukleotidsubstitution (SNS) in einem Fragment enthält, das mit SLAS-S interagiert, kann nur SLAS-U mit dem MM-Ziel hybridisieren, während sich SLAS-S im dissoziierten Zustand befindet. Dadurch wird die Bildung der Farbstoffbindungsstelle verhindert und es wird kein Signal beobachtet (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Amplifikation der Zielsequenz

1. Amplifizieren Sie ein Fragment des Gens, das mit dem SLAS-Assay analysiert werden soll. Verwenden Sie für die PCR- oder RPA-Amplifikation asymmetrische Bedingungen (z. B. mit dem Forward Primer, der mit einem 10-fachen Überschuss über dem Reverse Primer hinzugefügt wird), um ein einzelsträngiges Amplikon zu erzeugen. Um ein 126-nt-Fragment aus dem NANOGP8-Gen mit der Linear After The Exponential (LATE) PCR²⁰ zu amplifizieren, verwenden Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Primersequenzen. Hierbei wurde ein einzelsträngiges DNA-Template (Template NANOGP8 oder Template G1423C, Tabelle 2) verwendet, das dem 126-nt-Fragment des Gens entspricht. Das Template wurde von Integrated DNA Technologies, Inc. individuell synthetisiert.
   1. Bereiten Sie eine 100-μl-PCR-Reaktion vor, indem Sie 10 μl 10x Standard-Taq-Reaktionspuffer, 2 μl 10 mM dNTP-Mischung (für die Endkonzentration von 0,2 mM), 10 μl 10 μM Forward-Primer und 10 μl 1 μM Reverse-Primer (für die Endkonzentration von 1 μM und 0,1 μM, 0,5 μl 5U/μl Taq-DNA-Polymerase, DNA-Template und nukleasefreies Wasser. Fügen Sie für ein Steuerelement ohne Vorlage Wasser anstelle der Vorlage hinzu.
   2. Es sind folgende Thermocycling-Bedingungen zu verwenden: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 1 min; 45 Zyklen (1) Denaturierung bei 95 °C für 15 s, (2) Primerglühen bei 60 °C für 30 s, (3) Primerverlängerung bei 68 °C für 30 s; und abschließende Verlängerung bei 68 °C für 5 min.
      HINWEIS: Transkriptionsbasierte Amplifikationstechniken wie NASBA¹⁸ können anstelle von PCR oder RPA verwendet werden, insbesondere wenn ein RNA-Template für die Amplifikation verfügbar ist. NASBA erzeugt ein einzelsträngiges RNA-Amplikon mit einer Endproduktkonzentration im mikromolaren Bereich, die hoch genug ist, um im nachgeschalteten SLAS-Assay ohne Produktkonzentration verwendet zu werden.
2. Die amplifizierten Proben werden mit Ethanol ausgefällt, indem Sie das 0,1-fache Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und das 3-fache Volumen von Ethanol hinzufügen. 1 h bei -20 °C inkubieren, 5 min lang bei 12.000-18.000 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
3. Waschen Sie das Pellet mit 70 % Ethanol, zentrifugieren Sie es erneut und entsorgen Sie den Überstand wieder. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und lösen Sie es in 10 μl nukleasefreiem Wasser auf, um es im SLAS-Assay zu verwenden.

3. Fluoreszenz-Assay mit SLAS

1. Bereiten Sie Stammlösungen von AO (0,1 mM in DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM in nukleasefreiem Wasser, 10x), SLAS-U (10 μM in nukleasefreiem Wasser, 10x) und 4x Assay-Puffer (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl₂, 80 mM KCl) vor.
   HINWEIS: Kaliumionen sind notwendig, um das vermutete G-Quadruplex-Motiv des Aptamers zu stabilisieren, das Teil der Farbstoffbindungsstelle ist. Bereits 1 mM KCl (bei 25 mM MgCl₂) in 1x Assay-Puffer ist ausreichend, um eine ~14-fache Fluoreszenzverstärkung in Gegenwart des spezifischen Ziel-M über dem Blindwert (keine Zielprobe; Ergänzende Abbildung 2B). Magnesiumionen stabilisieren die Wechselwirkungen der Nukleinsäurestränge (zwischen SLAS-S, SLAS-U und dem Ziel). Die Konzentration von Mg²⁺ im 1x Assay-Puffer sollte mindestens 5 mM betragen (bei 20 mM KCl; Ergänzende Abbildung 2C,D). Die Stammlösung von AO (~1 mM) wird in DMSO aufbereitet. Die Stammkonzentrationen von SLAS-S und SLAS-U sind willkürlich und können bei Bedarf angepasst werden, solange die Endkonzentrationen der Stränge beibehalten werden (siehe die Begründung für die Auswahl der endgültigen SLAS-Konzentration in der Diskussion).
   ACHTUNG: AO ist schädlich, wenn es verschluckt wird, giftig bei Hautkontakt und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Tragen Sie bei der Arbeit mit AO-Lösungen immer Handschuhe. Das Wiegen von AO und die Herstellung seiner Stammlösungen sollte unter der chemischen Haube erfolgen.
2. Bereiten Sie den Mastermix vor, der alle Assay-Komponenten außer dem Ziel enthält. Berechnen Sie das Master-Mix-Volumen (_V-Mix), indem Sie das Probenvolumen (60 μL) mit der Anzahl der Proben plus eins (n+1) multiplizieren:
   
   Die Anzahl der Proben n sollte die erforderlichen Negativ- und Positivkontrollen umfassen.
3. Kombinieren Sie 0,25x V_Mix μL von 4x Assay Puffer, 0,1x_{V Mix} μL von 0,1 mM AO, 0,1x_{V Mix} μL von 10 μM SLAS-S und 0,1x V_Mix μL von 10 μM SLAS-S. Dem Endvolumen von wird nukleasefreies Wasser so zugegeben, dass es das in Schritt 3.4 hinzugefügte Zielvolumen aufnimmt. Den Mastermix vortexen und kurz zentrifugieren. Aliquotieren Sie 50 μl des Mastermixes in n Probenröhrchen.
   HINWEIS: Das Probenvolumen kann je nach den Eigenschaften des Instruments, das zur Detektion des Fluoreszenzsignals verwendet wird, angepasst werden. Das Volumen des Mastermixes, das in Probenröhrchen aliquotiert wird, kann auf der Grundlage des in Schritt 3.4 hinzugefügten Zielvolumens angepasst werden. Das Volumen des nukleasefreien Wassers, das zur Herstellung des Mastermixes hinzugefügt wird, sollte entsprechend angepasst werden. Wenn die zielhaltige Probe beispielsweise mit 10 % (V/V) des endgültigen Probenvolumens zugegeben wird, sollte dem Mastermix Wasser bis zu einem 0,9-fachen_V-Mix zugesetzt werden.
4. Verwenden Sie eine Stichprobe als No-Target-Kontrolle (leer) und eine Probe als Positivkontrolle. Geben Sie 10 μl der zielhaltigen Probe in den Mastermix (50 μl), um das endgültige Probenvolumen von 60 μl mit 10-1000 nM Ziel zu erhalten. Verwenden Sie für den Rohling anstelle des Ziels nukleasefreies Wasser (10 μL). Zur Positivkontrolle wird ein synthetisches DNA-Oligonukleotid verwendet, das die Zielsequenz enthält (z. B. Ziel M, Tabelle 1). Fügen Sie 10 μl 0,6-3 μM Kontrolle hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1-0,5 μM zu erreichen.
   HINWEIS: Eine hohe Fluoreszenz in dieser Positivkontrolle stellt sicher, dass der Assay wie erwartet funktioniert, auch wenn bei den getesteten unbekannten Proben ein negatives Signal beobachtet wird.
5. Mischen Sie die Proben und schleudern Sie sie mit einer Mikrozentrifuge herunter. Inkubieren Sie die Proben bei 22 °C für 10-60 Minuten. Das Signal steigt zwischen 40 min und 60 min nur um <15% an (Abbildung 3).
6. Messen Sie die Fluoreszenz der Proben bei 540 nm nach Anregung bei 475 nm mit einem Fluoreszenzspektrophotometer.
   HINWEIS: Es ist möglich, ein tragbares Fluorometer zu verwenden, das die Fluoreszenz in dünnwandigen PCR-Röhrchen misst. Das Fluorometer muss über Anregungs- und Emissionsfilter verfügen, die für die Detektion von AO-Fluoreszenz geeignet sind. Ein Beispiel für einen geeigneten Anregungsfilter ist ein 495 nm Kurzpass. Ein Beispiel für einen geeigneten Emissionsfilter ist 510-580 nm. Alternativ kann das Signal bei Anregung der AO-Fluoreszenz in der Probe mit einer UV- oder Blaulichtquelle visuell beobachtet werden.
   ACHTUNG: Wenn eine UV-Lampe verwendet wird, tragen Sie eine UV-Schutzbrille.

Abbildung 3: Zeitabhängigkeit der Signalerzeugung für SLAS-29U/30S. Eine Probe, die AO, SLAS-29U und SLAS-30S enthielt, wurde unter Verwendung des Kinetikmodus eines Fluoreszenzspektrophotometers (Anregung bei 475 nm, Emission bei 540 nm, 5-nm-Anregungs-/Emissionsschlitze) über 60 min analysiert. Nach einer Zeit von 5 Minuten (gekennzeichnet durch einen Pfeil) wurde das Ziel M zur Probe hinzugefügt. Die Daten wurden aus zwei unabhängigen Studien gemittelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Results

Die Leistungsfähigkeit von SLAS, bei dem der DAP-10-42-Kern als Signalreporter verwendet wird, wurde anhand einer Sonde demonstriert, die entwickelt wurde, um ein Fragment des NANOGP8-Gens abzufragen, das für die Progression des Glioblastoma multiforme (GBM), einer aggressiven Form von Hirntumor, wichtig ist²¹. Es wurde berichtet, dass dieses Fragment SNS in der DNA-Fracht von Exosomen enthält, die aus Krebszellen stammen²². Daher wurde das SLAS auf die SNS-Stelle ...

Discussion

Zu den kritischen Schritten des berichteten Protokolls gehören (i) das SLAS-Design; ii) Temperatur des Assays; iii) Vorhandensein von mono- und zweiwertigen Metallkationen (K⁺ und Mg²⁺); iv) Konzentrationen von SLAS-Strängen.

SLAS-Ausführung
Bei der Entwicklung von SLAS-Strängen ist es wichtig, die thermodynamische Stabilität der Komplexe, die von SLAS-S- und SLAS-U-Strängen gebildet werden, in Abwesenheit von Zielen u...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auramine O	MP Biomedizin	195064	ein fluorogener Farbstoff, der für die Signalberichterstattung verwendet wird
Cary Eclipse Fluorometer	Agilent Technologien	G9800A	zur Messung des Fluoreszenzsignals der Proben
Dimethy-Sulfoxid	MP Biomedizin	196055	Lösungsmittel zur Herstellung von Stammlösungen von Auramine O
DNA-Oligonukleotide (Primer, SLAS-Stränge, synthetisches Template für die PCR)	IDT	N/A	Sonderanfertigung und Entsalzung durch den Verkäufer, Verwendung ohne weitere Reinigung
dNTP-Mix, 10 mM	ThermoFisher Scientific	Nr. R0191	für LATE PCR Reaktion
Magnesiumchlorid	Invitrogen	AM9530G	Puffer-Komponente; erforderlich für die korrekte Assoziation der Sondenstränge mit dem analysierten Ziel
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)	Fisherbrand	02-681-320	Kunststoff für die Probenvorbereitung
Mikropipette (0,1-2,5 &Mikro; L)	Eppendorph	K56877G	wird für die Probenvorbereitung verwendet
Mikropipette (100-1000 & Mikropipette; L)	Eppendorph	K13160F	wird für die Probenvorbereitung verwendet
Mikropipette (20-200 & Mikro; L)	Eppendorph	J05253M	wird für die Probenvorbereitung verwendet
Mikropipette (2-20 &Mikro; L)	Eppendorph	G24675G	wird für die Probenvorbereitung verwendet
Mini-Zentrifuge	Corning	6770	Wird zum Herunterdrehen der Proben verwendet
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)	ThermoFisher Scientific	AM9932	Verwendung für Proben in PCR- und SLAS-Assays
PCR-Röhrchen (0,5 ml)	Invitrogen	AM9932	zur Messung der Fluoreszenz mit dem Quantus-Fluorometer
Pipettenspitzen (20-200 &Mikro; L)	VWR	76322-150	Kunststoff für die Probenvorbereitung
Pipettenspitzen (1-10 μl)	VWR	76322-528	Kunststoff für die Probenvorbereitung
Kaliumchlorid	Invitrogen	AM9640G	Puffer-Komponente; Erforderlich für die korrekte Faltung der fluoreszierend leuchtenden Aptamerdomäne der Sonde
Quantus Fluorometer	Promega	Nr. E6150	Tragbares, kostengünstiges Fluorometer, das für Fluoreszenzmessungen verwendet werden kann
Quarz-Küvette	Starna	16.50F-Q-10/Z15	zur Verwendung für die Fluoreszenzmessung mit dem Cary Eclipse Fluorometer
Taq-DNA-Polymerase mit Standard-Taq-Puffer	New England BioLabs	M0273S	zur Amplifikation eines Genfragments, das mit dem SLAS-Assay analysiert werden soll
Tris-HCl-Puffer (pH 7,4)	Boston Bioproducts	R-314	Puffer-Komponente
UV-Lampe	UVP	95-0016-14	AO für die visuelle Signalbeobachtung anzuregen
Vortex-Mischer	VWR	10153-838	Wird zum Mischen der Proben verwendet