Hochdurchsatzfähiges dreidimensionales Gewebemodell zur Quantifizierung von Elektroporationsschwellen

Summary

Dieses Protokoll verwendet computergestützte Modellierung, um reversible und irreversible Elektroporationsschwellen unter Verwendung der räumlichen Verteilung transfizierter Zellen innerhalb einer dreidimensionalen Gewebeimitation für die Hochdurchsatzanalyse von Elektroporationsprotokollen zu quantifizieren.

Abstract

Die Elektroporation ist eine vielversprechende Technologie, bei der elektrische Impulse für die Verabreichung von Makromolekülen und die Weichteilablation verwendet werden, mit Anwendungen, die die Prophylaxe der nächsten Generation und die Behandlung genetischer Krankheiten wie Krebs umfassen. Diese Studie demonstriert ein hochdurchsatzfähiges 3D-Gewebekulturmodell zur Quantifizierung der reversiblen und irreversiblen Elektroporationsschwellen für ein gegebenes Elektroporationsprotokoll. Durch die Verwendung eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes und die Analyse der räumlichen Verteilung transfizierter Zellen können sowohl reversible als auch irreversible Schwellenwerte innerhalb einer einzigen Probe identifiziert werden, was die Effizienz der Charakterisierung von Elektroporationsprotokollen erhöht, insbesondere für die in vivo-Translation . Um diese Fähigkeit zu demonstrieren, wurden 3D-Gewebe-Imitics, die HEK293-Zellen enthielten, mit einer Ring- und Pin-Elektrode transfiziert, um ein GFP-kodierendes Plasmid zu verabreichen. Die Elektroporationsschwellen wurden dann auf der Grundlage von Fluoreszenzmikroskopiebildern der transfizierten Proben abgeleitet. Dieses Modell zeigt das Potenzial für den Einsatz als Mittel zur Hochdurchsatz-Evaluierung von Elektroporationsprotokollen, ein wesentlicher Vorteil gegenüber aktuellen Methoden zur Bewertung dieser Schwellenwerte, die tendenziell zeitintensiv und weniger repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind.

Introduction

Die reversible Elektroporation (RE) ist eine etablierte Methode, um eine Vielzahl von normalerweise membranundurchlässigen Verbindungen und Molekülen in Zellen zu bringen ^1,2,3. Hier werden gepulste elektrische Felder (PEFs) verwendet, um eine kritische elektrische Feldstärke zu erreichen, die transiente, lokalisierte Nanoporen entlang von Teilen der Zellmembran induziert. RE wurde verwendet, um eine Vielzahl von Molekülen und Verbindungen zu verabreichen, die von Farbstoffen und Nukleinsäuren bis hin zu Chemotherapeutika und anderen Arzneimi....

Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen

1. In einer Biosicherheitswerkbank × Platte 1 10⁵ Zellen/ml der Zelllinie HEK293 in einem Volumen von 10 ml pro Gewebekultur-T75-Kolben in Eagle's Minimum Essential Medium, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Inkubieren Sie HEK293-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ -Umgebung.
3. Ernten Sie die Zellen für Experimente 2 Tage nach der Aussaat, i....

Results

Die Ring- und Pin-Elektrode lieferte erfolgreich ein DNA-Plasmid, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in 3D-Kollagengewebe-Imitatik, die in HEK293-Zellen eingebettet ist. Die erfolgreiche Quantifizierung der RE-Schwelle wurde erreicht, indem der äußere Radius der transfizierten Region gemessen und die entsprechende Feldintensität aus dem Computermodell des Versuchsaufbaus abgeleitet wurde, wie in Abbildung 2 zu sehen ist. Die IRE-Schwelle.......

Discussion

Mit dieser Methode können reversible und irreversible Elektroporationsschwellen identifiziert werden, ohne dass mehrere Proben bei diskreten Spannungen getestet werden müssen. Die Verwendung eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes ermöglicht eine Quantifizierung basierend auf der räumlichen Verteilung der transfizierten Zellen im Modell. Mit dieser ungleichmäßigen Verteilung sind jedoch Einschränkungen verbunden. In erster Linie sind die hierin beschriebenen RE- und IRE-Schwellenwerte .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1000 μl Pipettenspitzen	Fisher Scientific	13-811-164
Konisches 15-ml-Röhrchen	Fisher Scientific	14-959-70C
200 μl Pipettenspitzen	Fisher Scientific	13-811-139
304 Edelstahl Nadeln mit stumpfer Spitze	McMaster Carr	Artikel-Nr.: 75165A753
316 Edelstahlrohr	McMaster Carr	Artikel-Nr.: 89785K319
Acryl	McMaster Carr	Artikel-Nr.: 8505K754
Biosicherheitswerkbank	Fisher Scientific	13-261-312
CAD-Software	Dassault Systems	SolidWorks
Zentrifuge	Nuaire	NU-C200R
Elektroporator	Hbio	45-0662	In dieser Studie wurden ein speziell angefertigtes Gerät und ein BTX ECM 830 System verwendet
EMEM	Fisher Scientific	MT10009CV	Dies kann variieren bei Verwendung einer anderen Zelllinie als HEK293
Falcon 12-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem Flachboden, TC-behandelt, mit Deckel	Corning	353043	Jede 12-Well-Platte kann verwendet werden, stellen Sie einfach sicher, dass die Well-Abmessungen bei der Herstellung des Elektrodenhalters berücksichtigt werden.
FBS	Fisher Scientific	A5670701
LWL-Temperaturfühler	Micronor Inc.	Artikel-Nr.: TS5-20MM-02
GFP-Plasmid	Aldeveron	gWiz-GFP
HEK293 Zellen	ATCC	CRL-1573	Andere Zelllinien können verwendet werden, stellen Sie einfach sicher, dass das richtige Kulturmedium verwendet wird
Kochplatte	Thermoelectric Cooling America Corporation	AHP-301CPV
Eis- oder gekühltes Perlenbad	Fisher Scientific	10-876-001
Bildanalyse-Software	Leica	LAS X
Brutkasten	Fisher Scientific	15-015-2633
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Leica	DMi8
Laserschneider	McMaster Carr	7344N11
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pipetten-Kit	Fisher Scientific	14-388-100
Simulationssoftware	COMSOL	COMSOL Multiphysik 6.2
T75 Kolben	Fisher Scientific	156499
Typ I Rinderkollagenlösung	Fortschrittliche Biomatrix	5005	3 mg/ml