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Methodenartikel

Skalierbarer Schritt-für-Schritt-Ansatz für eine nachhaltige Biokunststoffproduktion aus Lebensmittelabfällen

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DOI:

10.3791/68499

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18. Juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Quasar Energy Group, 3Department of Environmental Science and Technology, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine skalierbare Methode zur Umwandlung von Lebensmittelabfällen in biologisch abbaubare Polyhydroxyalkanoat (PHA)-Biokunststoffe dar. Es nutzt die gestoppte anaerobe Vergärung für die Vorbehandlung von Lebensmittelabfällen, die halophile mikrobielle Fermentation für die PHA-Biosynthese und ein chemikalienfreies Downstream-Verfahren für die PHA-Rückgewinnung.

Zusammenfassung

Die globale Mikroplastikkrise in Verbindung mit den wachsenden Herausforderungen bei der Entsorgung von Lebensmittelabfällen erfordert innovative Lösungen, um diese Umweltprobleme gemeinsam anzugehen. Polyhydroxyalkanoate (PHAs) sind einzigartige Biokunststoffe, die in allen Umgebungen, einschließlich mariner Ökosysteme, vollständig biologisch abbaubar sind und eine nachhaltige Alternative zu erdölbasierten Kunststoffen bieten. Gleichzeitig bietet die Verwendung von Lebensmittelabfällen als Rohstoff für die PHA-Produktion eine effektive Strategie, um die Herausforderungen der Entsorgung von Lebensmittelabfällen zu mildern und gleichzeitig hochwertige biologisch abbaubare Kunststoffe herzustellen. Diese Studie bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Herstellung von PHA aus Lebensmittelabfällen, wobei der Schwerpunkt auf der Intensivpflege liegt, die erforderlich ist, um einen hohen zellulären PHA-Gehalt und eine hohe Qualität zu gewährleisten. Der Prozess beginnt mit der anaeroben Vergärung, bei der Lebensmittelabfälle in mikrobiell assimilierbare flüchtige Fettsäuren (VFA) umgewandelt werden, indem eine anaerobe Umgebung aufrechterhalten und Parameter wie die feste Retentionszeit optimiert werden, um die VFA-Produktion, einen wichtigen Vorläufer für die PHA-Synthese, zu maximieren. Der VFA-reiche Gärrest wird dann zur Kultivierung von Haloflex mediterranei verwendet, einem halophilen Mikroorganismus, der in der Lage ist, PHA bis zu 66 % ± 5 % seines Trockenzellgewichts anzureichern. Die Anbauumgebung mit hohem Salzgehalt von H. mediterranei verhinderte eine Kontamination der Kultur und gewährleistete eine optimale PHA-Produktion. Das Zellwachstum wird durch Messung der optischen Dichte überwacht, um den idealen Zeitpunkt für die PHA-Ernte zu bestimmen. Die Zellen werden mit einer chemikalienfreien, wasserbasierten Methode lysiert, die einen osmotischen Druckgradienten nutzt und eine PHA-Rückgewinnung von 93 % ± 3 % erreicht, gefolgt von einer lösungsmittelbasierten PHA-Reinigung, um eine PHA-Reinheit von 96 % ± 2 % zu erreichen. Jeder Schritt ist entscheidend, um die Produktion von hochwertigen, biologisch abbaubaren Kunststoffen zu gewährleisten. Dieses Papier bietet detaillierte Methoden für die angehaltene anaerobe Vergärung, die Reinkulturfermentation, die chemikalienfreie Zelllyse und die lösungsmittelbasierte PHA-Reinigung und bietet einen skalierbaren und nachhaltigen Ansatz für die Umwandlung von Lebensmittelabfällen in biologisch abbaubare Biokunststoffe, die für Pilot- und Großanwendungen geeignet sind.

Einleitung

Die Verschmutzung durch Kunststoffe und die Entsorgung von Lebensmittelabfällen sind ein wachsendes Umweltproblem, was den Bedarf an innovativen Ansätzen unterstreicht, die beide Herausforderungen durch nachhaltige Abfallwirtschaft und Materialentwicklung angehen1. Konventionelle erdölbasierte Kunststoffe tragen wesentlich zur Umweltverschmutzung und Mikroplastikkontamination bei und verbleiben seit Jahrhunderten auf Mülldeponien und in aquatischen Ökosystemen2. Polyhydroxyalkanoate (PHAs), eine Klasse von mikrobiellen Biokunststoffen, bieten eine vollständig biologisch abbaubare Alternative mit mechanischen Eigenschaften, die mit herkömmlichen Kunststoffen vergleichbar sind, und gewährleisten gleichzeitig einen vollständigen Abbau in natürlichen Umgebungen3. Die hohen Produktionskosten von PHAs stellen jedoch nach wie vor ein erhebliches Hindernis für eine breite kommerzielle Einführungdar 4. Ein vielversprechender Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung ist die Nutzung organischer Abfälle als kostengünstige Kohlenstoffquelle für die mikrobielle PHA-Biosynthese, da Rohstoffe etwa 50 % der gesamten Produktionskosten in aktuellen industriellen Prozessen ausmachen, die auf reinen Kohlenstoffquellen wie Maisstärke oder Glukoseberuhen 5. Durch die Verwertung von Abfällen wird auf dieser Weise nicht nur organisches Material von Mülldeponien abgeführt, sondern es auch in eine nachhaltige Alternative zu erdölbasierten Kunststoffen umgewandelt, wobei gleichzeitig die Abfallansammlung und die Probleme der Plastikverschmutzung angegangen werden.

H. mediterranei, ein halophiler Mikroorganismus, weist ein großes Potenzial für die Verwendung von aus Abfällen gewonnenen Rohstoffen für die PHA-Produktion auf, da er unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt (2-5 M NaCl) gedeihen kann, was eine Kontamination auf natürliche Weise verhindert, indem es das Wachstum nicht-halophiler Mikroben hemmt6. Diese Umgebung mit hohem Salzgehalt macht eine strenge Sterilisation in der industriellen Fermentation überflüssig und senkt die Betriebskosten. Im Gegensatz zu herkömmlichen bakteriellen PHA-Produzenten verstoffwechselt H. mediterranei effizient eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen aus Abfällen und es wurde berichtet, dass es PHA bis zu 70 % seines Trockenzellgewichts (DCW) als Stressreaktionsmechanismus akkumuliert 7,8. Darüber hinaus ermöglicht die Umgebung mit hohem Salzgehalt eine einfache nachgelagerte Verarbeitung, da der durch das Eintauchen in Wasser induzierte osmotische Schock die Zellen effektiv zerstört und eine PHA-Freisetzung ohne enzymatische oder chemische Behandlungen ermöglicht9. Diese Vorteile positionieren H. mediterranei als idealen Kandidaten für eine skalierbare, abfallbasierte Biokunststoffproduktion.

Bestehende Studien haben verschiedene Abfallstoffe, darunter Käsemolke, Abwässer aus Olivenmühlen und agroindustrielle Rückstände, für die PHA-Fermentation von H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 untersucht . Die hohe Variabilität der Abfallzusammensetzung stellt eine große Herausforderung dar, die vor der mikrobiellen Assimilation unterschiedliche Vorbehandlungsstrategien wie enzymatische Hydrolyse, saure Hydrolyse oder thermische Verarbeitung erfordert 11,17,19,20. Hier bietet die gestoppte anaerobe Vergärung (aAD) eine skalierbare Lösung, indem sie verschiedene Lebensmittelabfälle in einen homogenen Gärrest mit hohem Anteil an flüchtigen Fettsäuren (VFA) umwandelt, der als direkter Vorläufer für die PHA-Synthese von H. mediterranei dient 21,22. Dieser Prozess verbessert die Konsistenz des Ausgangsmaterials und verringert die Variabilität des Substrats, während er gleichzeitig die Effizienz der mikrobiellen Fermentation verbessert.

Trotz seines Potenzials haben nur wenige Studien diesen zweistufigen Prozess, der die aAD- und mikrobielle PHA-Fermentation für die allgemeine Umwandlung von Lebensmittelabfällen in Biokunststoff durch H. mediterranei integriert, erfolgreich nachgewiesen 23,24,25. Diese Studie enthält ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das die Vorbehandlung von Lebensmittelabfällen, die VFA-Produktion durch semi-kontinuierliche aAD und die Reinkulturfermentation von H. mediterranei für die PHA-Produktion abdeckt. Darüber hinaus haben frühere Studien zwar die wasserbasierte PHA-Extraktion aus H. mediterranei validiert, aber keine hat die Effizienz und Reinheit der PHA-Rückgewinnung mit dieser Methode quantifiziert11,18. Diese Studie schließt diese Lücke, indem sie die chemikalienfreie PHA-Rückgewinnungsmethode unter Verwendung einer osmotischen Lyse mit Wasser demonstriert und ihre Rückgewinnungseffizienz im Vergleich zu herkömmlichen Natriumhypochlorit (NaClO)-basierten PHA-Rückgewinnungsmethoden quantifiziert26. Darüber hinaus bewertet diese Studie die Reinheit von wasserzurückgewonnenen PHA und bietet eine umfassende Bewertung ihrer Wirksamkeit für eine skalierbare Biokunststoffproduktion.

Um die Lücke zwischen der Machbarkeit im Labormaßstab und der industriellen Umsetzung zu schließen, ist dieses Protokoll auf Skalierbarkeit in industriellen Anwendungen ausgelegt und umfasst die aAD- und PHA-Fermentation im Pilotmaßstab sowie die Scheibenzentrifugation für die Zelltrennung, eine weit verbreitete Technik in der Bioprozesstechnik und der mikrobiellen Fermentation im großen Maßstab27. Durch die Optimierung der Umwandlung von Lebensmittelabfällen in Biokunststoffe unterstützt diese Methode die Industrialisierung der großflächigen Verwertung von Abfällen und fördert Initiativen zur zirkulären Bioökonomie. Die Integration von aus Abfällen gewonnenen Rohstoffen, halophiler Fermentation und einer umweltfreundlichen PHA-Rückgewinnungsstrategie ermöglicht eine effiziente Umwandlung von Abfällen in Biopolymere, wodurch die Abhängigkeit von Kunststoffen auf Basis fossiler Brennstoffe verringert und gleichzeitig eine nachhaltige Biokunststoffproduktion gefördert wird.

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Protokoll

1. Sammlung und Aufbereitung von Lebensmittelabfällen

  1. Sammeln Sie Lebensmittelabfälle aus lokalen Restaurants, wie in Abbildung 1A dargestellt. Bewerten Sie den anfallenden Abfall visuell. Beobachtungen zeigten, dass es sich bei den Abfällen hauptsächlich um Gemüseschalen, weggeworfenes rohes Fleisch und kohlenhydratreiche Bestandteile wie Reis und Nudeln handelte. Das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C:N) muss möglicherweise wie in den Schritten 5.1 und 5.2 beschrieben gemessen und angepasst werden, wenn die Lebensmittelabfälle überwiegend kohlenstoffreich sind, mit einem optimalen C:N-Verhältnis von 20:128.
  2. Geben Sie 10 kg Lebensmittelabfälle in einen 5-Gallonen-Eimer und fügen Sie 2,5 l Wasser hinzu. Schließen Sie den Mixer an eine Stromquelle an. Tauchen Sie die Klinge in die Mischung aus Lebensmittelabfällen und Wasser und drücken Sie dann die Start-Taste , um mit dem Mixen zu beginnen. Mindestens 30 Minuten mixen, bis es vollständig homogenisiert ist (Abbildung 1B). Bewegen Sie die Klinge auf und ab, um eine gründliche Durchmischung der Lebensmittelabfälle zu gewährleisten.
    ACHTUNG: Um eine Überhitzung zu vermeiden, muss die Starttaste des Mixers möglicherweise alle 2 Minuten für 1 Minute losgelassen werden.
  3. Nach dem Pürieren den Mixer herausnehmen und mit heißem Wasser und Spülmittel reinigen. Decken Sie den Eimer mit einem Deckel ab, beschriften Sie den Eimer mit dem Namen der Probe und dem Herstellungsdatum und lagern Sie ihn bei 4 °C, wenn er nicht sofort verwendet wird.
    HINWEIS: Aufgrund unterschiedlicher Eigenschaften von Lebensmittelabfällen, die aus verschiedenen Quellen und zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt wurden, sollten die grundlegenden Parameter der vorbereiteten Gülle, wie z. B. Gesamtfeststoffe (TS) und flüchtige Feststoffe (VS), nach jeder Zubereitung auf der Grundlage von Schritt 5.1 gemessen werden, um genaue TS- und VS-Eingaben für die spätere Verwendung zu gewährleisten. In diesem Protokoll gelten 4 °C für die kurzfristige Lagerung (weniger als 7 Tage) und -20 °C für die langfristige Lagerung.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Visueller Vergleich von Lebensmittelabfällen in Restaurants vor und nach der Homogenisierung. Die Fotos zeigen (A) rohe Lebensmittelabfälle und (B) homogenisierte Gülle aus Lebensmittelabfällen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. VFA-Produktion durch aAD

  1. Betrieb eines aAD-Fermenters im Pilotmaßstab (100 l) (Abbildung 2A) für die Umwandlung von Lebensmittelabfällen in VFA.
    1. Überprüfen Sie den Stromanschluss und die Luftdichtheit des Pilot-aAD-Fermenters. Stellen Sie die Fermentertemperatur auf 35 °C und die Rührgeschwindigkeit auf 150 U/min ein.
    2. Drücken Sie die Hebe-Taste , um den Fermenterdeckel anzuheben. Stoppen Sie, sobald sich der Deckel ca. 40 cm hebt, indem Sie die Stopp-Taste drücken.
    3. Die aus einem Saatgut-aAD-Fermenter gesammelte Kultur wird in den Pilot-aAD-Fermenter gegeben, bis sie ein Arbeitsvolumen von 80 l erreicht. Detaillierte Informationen über den Saatgutfermenter finden Sie in einer früheren Studie25.
    4. Drücken Sie die untere Taste, bis der Deckel vollständig geschlossen ist, und sichern Sie ihn dann mit den Klammern. Dadurch wird sichergestellt, dass der Fermenter anaerobe Bedingungen beibehält.
    5. In dieser Studie wurde eine feste Retentionszeit (SRT) von 9 Tagen im aAD-Fermenter aufrechterhalten. Be- und Entleeren Sie alle 3 Tage 1/3 des Arbeitsvolumens des Fermenters (ca. 26,7 l) wie unten beschrieben.
      HINWEIS: Die traditionelle anaerobe Vergärung wird mit einer SRT von 14-30 Tagen für die Methanproduktionvon 29,30 durchgeführt. Eine kurze 9-Tage-SRT wird hier eingesetzt, um die Methanogenese zu hemmen und die VFA-Akkumulation für eine erfolgreiche aAD zu fördern.
    6. Ausscheiden eines Teils des aAD-Inhalts vor der Fütterung. Um eine einfache Entleerung zu erleichtern und Verstopfungen zu vermeiden, erhöhen Sie vorübergehend die Rührgeschwindigkeit des Fermenters von 150 U/min auf 200 U/min und halten Sie diese Drehzahl vor dem Entleeren 20 Minuten lang aufrecht.
      HINWEIS: Die Erhöhung der Rührgeschwindigkeit sorgt für eine gleichmäßige Verteilung der Feststoffpartikel im Gärrest, was einen leichteren Austrag und eine homogene Probenahme ermöglicht.
    7. Öffnen Sie das Auslassventil am Boden des aAD-Fermenters und entleeren Sie 1/3 des Arbeitsvolumens des Gärrests. Sammeln Sie die ausgetragenen Gärreste in Eimern und lagern Sie diese bei 4 °C für die VFA-Analyse und die anschließende Fest-Flüssig-Trennung in Schritt 2.2.
    8. Verwenden Sie eine organische Beladungsrate (OLR) von 2,5 g VS/L-Tag, und die VS der Lebensmittelabfallgülle beträgt durchschnittlich ~14,5 % (Tabelle 1). Hierfür werden 4,1 kg Nassgewicht der Speiseresteülle auf Basis von Gleichung 1 benötigt, um die ausgelegte OLR zu erreichen. Nehmen Sie eine Probe von dieser 4,1 kg schweren Gülle und geben Sie sie für die spätere Fütterung in einen separaten Eimer.
      Nassgewicht der zu verfütternden Speiserestgülle = figure-protocol-2 (1)
      in dem die OLR 2,5 g VS/L-Tag beträgt, das Fütterungsintervall 3 Tage beträgt, das Arbeitsvolumen 80 l und der VS 14,5 % beträgt.
    9. Geben Sie Wasser in einen separaten Eimer mit dem bereits erwähnten 4,1 kg Nassgewicht der Speisereste, bis das aus Gleichung 2 berechnete Volumen erreicht ist, das in diesem Beispiel 26,7 l beträgt.
      figure-protocol-3(2)
      Bei einem Fütterungsintervall von 3 Tagen beträgt das Arbeitsvolumen 80 l und die SRT 9 Tage.
    10. Verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um diese 26,7-l-Aufschlämmung für Lebensmittelabfälle in den aAD-Fermenter in Abbildung 2A zu leiten. Stellen Sie sicher, dass der Einlassschlauch der Schlauchpumpe in der Flüssigkeit des Zulaufeimers eingetaucht bleibt, bis die gesamte Flüssigkeit übertragen ist.
      HINWEIS: Während des Ansaugvorgangs kann der Schlauch leicht vibrieren, was normal ist.
    11. Schalten Sie die Pumpe aus und ziehen Sie den Netzstecker. Die Rührgeschwindigkeit des Pilotfermenters für 30 min auf 150 U/min zurücksetzen, um das neue Futter mit dem vorhandenen Gärrest zu homogenisieren.
    12. 3 L homogenisierte Gärreste in einen Eimer ableiten, um den pH-Wert einzustellen. 100 mL des Gärrests aus dem 3 L homogenisierten Gärrest in ein Becherglas geben und den pH-Wert messen.
    13. Geben Sie nach und nach NaOH-Pellets in den 100-ml-Gärrest, bis der pH-Wert 5,5 erreicht. Um das Gewicht der zugesetzten NaOH-Pellets zu berechnen, berechnen Sie den Gewichtsverlust des NaOH-Pelletbehälters vor und nach der pH-Einstellung.
    14. Geben Sie NaOH-Pellets proportional zum Gärrestvolumen in den Pilotfermenter in Abbildung 2A , um den pH-Wert auf 5,5 einzustellen. Wenn beispielsweise 0,09 g NaOH-Pellets benötigt werden, um 100 mL homogenisierte Gärreste auf pH 5,5 einzustellen, müssen 72 g NaOH-Pellets in den aAD-Pilotfermenter geladen werden, da sein Arbeitsvolumen 80 l beträgt, d. h. 80 l / 0,1 l × 0,09 g = 72 g.
      HINWEIS: Da der ideale pH-Bereich für aAD bei 5-5,531 liegt, muss der pH-Wert nach jeder Fütterung auf 5,5 eingestellt werden. Während der aAD sinkt der pH-Wert aufgrund der Ansäuerungsreaktion immer ab. Daher wird dringend empfohlen, die Schritte 2.1.13 bis 2.1.16 zu befolgen, um den pH-Wert täglich zu überprüfen und gegebenenfalls anzupassen.
    15. Überprüfen Sie den Pilotfermenter, um sicherzustellen, dass alle Ventile geschlossen sind, und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 150 U/min ein, um eine intermittierende Durchmischung für den nächsten Zyklus des aAD-Betriebs zu gewährleisten.
      ANMERKUNG: Der aAD-Pilotfermenter in dieser Studie wird in einem halbkontinuierlichen Modus betrieben, um industrielle Prozessenachzuahmen 32.
  2. Überstandsabscheidung zur Rückgewinnung von VFA für die PHA-Fermentation
    1. Schalten Sie den Hauptschalter der Scheibenzentrifuge ein.
    2. Warten Sie, bis der Text STANDSTILL auf dem Bildschirm des Mensch-Maschine-Schnittstelle (HMI)-Systems angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass der Schmierölstand über dem Mindestschwellenwert liegt.
    3. Öffnen Sie das Ventil der Wasserversorgungsleitung und stellen Sie den Druck auf 45 psi ein. Öffnen Sie das Ventil der Luftleitung und stellen Sie den Druck auf 90 psi ein.
    4. Drücken Sie die grüne Taste auf dem Bildschirm des HMI-Systems, um den Produktionsprozess der Scheibenzentrifuge zu starten. Warten Sie, bis das System seine Prüfungen abgeschlossen hat.
    5. Überwachen Sie, bis das System die volle eingestellte Geschwindigkeit erreicht hat, die durch STANDBY auf dem Bildschirm des HMI-Systems angezeigt wird.
      HINWEIS: Die Drehzahl der Scheibenzentrifuge ist auf die maximale Kapazität eingestellt, um eine hocheffiziente Trennung zu ermöglichen.
    6. Stellen Sie sicher, dass der Zulaufschlauch in den entleerten Gärrestbehälter eingetaucht ist. Verbinden Sie das Überstandsauslassrohr der Scheibenzentrifuge mit einem leeren 5-Gallonen-Eimer zum Auffangen des Überstands, der für die anschließende PHA-Fermentation verwendet wird. Verbinden Sie den Feststoffauslass mit einem separaten leeren Eimer, um die Restfeststoffe aus dem Gärrest aufzufangen (Abbildung 2B).
    7. Verwenden Sie die Schlauchpumpe, um die Gärreste dem Einlass der Scheibenzentrifuge zuzuführen. Klicken Sie in der Zwischenzeit auf die Schaltfläche PROD auf dem Bildschirm des HMI-Systems. PROD steht für Production.
    8. Stellen Sie das Einlassventil so ein, dass eine Durchflussmenge zwischen 0,2 und 0,5 m3/h und ein Gegendruck zwischen 0,5 und 1 bar aufrechterhalten wird.
      HINWEIS: Der Überstand wird zirkuliert, um während des Produktionsprozesses ein höheres Trennverhältnis zu erzielen, was sich auf die Fest-Flüssig-Trennstufe der Scheibenzentrifuge bezieht, während sich Feststoffe in der Scheibenzentrifuge ansammeln.
    9. Drücken Sie nach 30 Minuten des Produktionsprozesses die Entleerungstaste auf dem Bildschirm des HMI-Systems, um die Feststoffe und den Überstand in den jeweiligen Eimer zu entleeren (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Dieser Schritt basiert auf einer visuellen Kontrolle, da der Abscheidegrad in Bezug auf TS nicht sofort gemessen werden kann. In der Regel reichen 30 Minuten Betrieb aus, um die gewünschte Trennung von Überstand und festen Rückständen zu erreichen.
    10. Lagern Sie den gesammelten Überstand bei 4 °C für die anschließende PHA-Gärung. Entsorgen Sie die Restfeststoffe gemäß der Bioabfallentsorgungsverordnung oder führen Sie sie zur weiteren Vergärung in den aAD-Fermenter zurück.
    11. Starten Sie den CIP-Zyklus (Clean-in-Place), indem Sie die CIP-Taste auf dem HMI-Bildschirm auswählen. Waschen Sie die Scheibenzentrifuge gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Schritten.
      HINWEIS: Eine Schlauchpumpe wird zum Zu- und Abführen von Waschmedien verwendet. Dieser Waschschritt ist wichtig für die Wartung der Ausrüstung.
    12. Schalten Sie nach Abschluss des Waschvorgangs die Schlauchpumpe aus und trennen Sie sie ab und drücken Sie dann die PROD-Taste , um sicherzustellen, dass die Scheibenzentrifuge alles aus dem Trennbehälter entleert. Reduzieren Sie die Drehzahl schrittweise.
    13. Drücken Sie die rote Taste auf dem Bildschirm des HMI-Systems, um den Betrieb anzuhalten. Drehen Sie die Ventile der Wasser- und Luftleitung in die Position OFF . Schalten Sie die Stromversorgung aus.

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Abbildung 2: Anlagen für die VFA-Herstellung und die Fest-Flüssig-Trennung. (A) 100 l aAD-Fermenter im Pilotmaßstab. (B) Austrag des Überstands und der Feststoffe in die entsprechenden Becher aus dem Trennbehälter der Scheibenzentrifuge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ParameterSpeiseabfall
TS (%)~16.5
VS (%)~14.5
C:N~17:1 Uhr

Tabelle 1: Merkmale von Beispielen für Lebensmittelabfälle.

SchrittMedienTemperaturZweckZeitraum (min)Austragsvolumen (L)Notizen
1WasserKaltFür die Primärspülung51Benutztes Wasser gelangt in der Regel in den Abfluss.
2WasserHeiß (70 °C)Für die Thermolyse von Hefe, falls zutreffend51Verbrauchtes Wasser gelangt in der Regel entweder in den Abfluss oder wird zirkuliert.
32%ige NaOH-LösungHeiß (70 °C)Zum Auflösen von Proteinablagerungen, falls zutreffend201Die Lösung wird normalerweise zirkuliert.
4WasserHeiß (70 °C)Zum Spülen51Verbrauchtes Wasser gelangt in der Regel entweder in den Abfluss oder wird zirkuliert.
51%ige Salpetersäure-LösungHeiß (70 °C)Zum Auflösen anorganischer Ablagerungen101Wenn weiches Wasser verwendet wird, ist eine Säurewäsche nur wenige Male im Jahr erforderlich. In diesem Fall kann der Rücklauf in den Abfluss gelangen. Wenn hartes Wasser verwendet wird, kann bei jedem CIP eine Säurewäsche erforderlich sein. In diesem Fall sollte ein Umlaufsystem verwendet werden.
6WasserHeiß (80–95 °C)Zum Spülen und Sterilisieren51Wenn die Trübung des Ausflusses aus diesem Schritt hoch ist, wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.

Tabelle 2: Waschanleitung für die Scheibenzentrifuge.

3. PHA-Fermentation mit VFA-reichem Gärrestüberstand

  1. PHA-Fermentation im Labormaßstab zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für das Scale-up.
    1. Der in Schritt 2.2.9 gesammelte Gärrestüberstand wird mit Wasser auf einen Konzentrationsgradienten verdünnt, um die optimale Verdünnungszeit zu ermitteln, die die hemmenden Wirkungen potenzieller toxischer Verbindungen, die im Gärrestüberstand von Lebensmittelabfällen vorhanden sind, minimiert und gleichzeitig eine minimale Beeinträchtigung des Zellwachstums gewährleistet23.
      HINWEIS: In der Regel ist eine mindestens 2-fache Verdünnung erforderlich, um diese hemmenden Wirkungen zu mildern25.
    2. Ergänzen Sie den verdünnten Gärrestüberstand mit Salz und Nährstoffen, insbesondere 156 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt, 13 g/l MgCl26H2O, 20 g/l MgSO47H2O, 1 g/l CaCl22H2O, 4 g/l KCl, 0,2 g/l NaHCO3 und 0,5 g/l NaBr, und NH4Cl nach Bedarf33.
    3. Messen Sie den Salzgehalt des Gärrestüberstands mit einer Leitfähigkeitssonde, bevor Sie NaCl hinzufügen. Gärreste von Lebensmittelabfällen haben in der Regel einen vernachlässigbaren Salzgehalt; Wenn jedoch ein hoher Salzgehalt vorhanden ist, passen Sie die NaCl-Dosierung basierend auf Gleichung 3 an.
      NaCl-Zugabe (g) = 156 g/L NaCl × Gesamtvolumen des aufbereiteten Mediums - figure-protocol-5 × zugesetztes Volumen des Gärrestüberstands (3)
    4. Das C:N-Verhältnis des Mediums aus Gärrestüberstand wird bei 15 gehalten. Die Zugabe von NH4Cl wird auf der Grundlage des einheimischen C:N-Verhältnisses des Gärrestüberstands bestimmt, gemessen als gesamter organischer Kohlenstoff (TOC) und Gesamtstickstoff (TN), wie in den Schritten 5.2 und 5.3 angegeben.
    5. Rühren Sie das Medium mit einer magnetischen Rührplatte bei 200 U/min, bis sich alle Zusätze vollständig aufgelöst haben. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit 1 N NaOH oder 1 N H2SO4 auf 7,0 ± 0,05 ein.
    6. Verteilen Sie das vorbereitete Medium in sterile Erlenmeyerkolben und füllen Sie nur 1/5 des Volumens, um einen großen Kopfraum für einen ausreichenden Lufttransfer während der Kultivierung zu erhalten (Abbildung 3A). Decken Sie den Kolben mit Baumwolle oder einem anderen atmungsaktiven Material ab, das ausreichend porös ist, um den Gasaustausch während der Kultivierung zu ermöglichen.
    7. Tauen Sie die H. mediterranei-Samenkultur (aktiviert aus der kommerziellen American Type Culture Collection (ATCC) 33500, die bei -80 °C gelagert wird) durch leichtes Rühren in einem Wasserbad auf, das auf eine normale Wachstumstemperatur des H. mediterranei-Stammes (z. B. 37 °C) eingestellt ist. Das Auftauen sollte schnell erfolgen, d. h. etwa 2 Minuten oder bis alle Eiskristalle geschmolzen sind.
    8. Impfen Sie 0,2 % (v/v) H. mediterranei-Samenkultur mit OD600 nm von ~0,5 in das vorbereitete Medium. Es wird ein Positiv-Kontrollkolben mit Inokulation und ein Negativ-Kontrollkolben ohne Inokulation mit ATCC-Medium 117633 hergestellt.
      HINWEIS: Das ATCC-Medium hat die gleiche Nährstoffzusammensetzung wie in Schritt 3.1.2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Gärrestüberstand durch 1 g/l Glukose ersetzt wird und keine zusätzliche Stickstoffquelle hinzugefügt wird.
    9. Alle Kolben werden bei 37 °C und Schütteln bei 150 U/min in einem Orbitalschüttler inkubiert. Messen Sie täglich die optische Dichte (OD600 nm), bis sie sich in der stationären Phase stabilisiert hat, und stoppen Sie dann die Kultivierung. Sammeln Sie die rosafarbene Brühe (Abbildung 3B) für die nachgelagerte PHA-Rückgewinnung.
  2. PHA-Fermentation im Pilotmaßstab in einem 50-Liter-Glasfermenter.
    1. Schließen Sie den PHA-Pilotfermenter (Abbildung 4) und die Wasserzirkulationsheizung an die Stromversorgung an.
    2. Schalten Sie den Schalter für die Heizung im Wasserbad ein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Schalten Sie den Rührer ein und stellen Sie ihn auf 150 U/min ein.
    3. Der unter Verwendung des optimalen Verdünnungsfaktors hergestellte Gärrestüberstand für Lebensmittelabfälle wird zusammen mit dem in Schritt 3.1.2 ermittelten Salz und den Nährstoffzusätzen zugegeben, um ein Arbeitsvolumen von 40 l zu erreichen.
    4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein. 10% (v/v) H. mediterranei Samenkultur mit OD600nm von ~0,5 in das vorbereitete Medium impfen.
    5. Schalten Sie die Luftpumpe des Pilotfermenters ein und stellen Sie die Belüftungsleistung auf 110 m3/h ein. Sammeln Sie die Probe und messen Sie täglich einen Außendurchmesservon 600 nm . Wenn OD600 nm die stationäre Phase erreicht, stoppen Sie die Fermentation und lagern Sie die Fermentationsbrühe bei 4 °C für die nachgeschaltete PHA-Rückgewinnung.
    6. Waschen Sie den Gärbehälter mit Leitungswasser und 70% Ethanol.

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Abbildung 3: Vor- und Nachfermentationskolben der PHA-Produktion von H. mediterranei. (A) Medium in Kolben, die vor der Inkubation/Fermentation aus Überständen von Gärresten aus Lebensmittelabfällen hergestellt werden. (B) Rosafarbene PHA-reiche H . mediterranei-Kultur nach der Fermentation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: 50-Liter-PHA-Fermenter im Pilotmaßstab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. PHA-Downstream-Rückgewinnung

  1. Die Scheibenzentrifuge mit H. mediterranei Fermentationsbrühe füttern, um den salzigen Überstand und die H . mediterranei-Zellen zu trennen. Sammeln Sie die geerntete Zelle (Solid Out-Teil in Abbildung 5) für die anschließende Zelllyse. Entsorgen Sie die Fraktion Liquid Out gemäß der Bioabfallentsorgungsverordnung.
    HINWEIS: Die Bedienung der Scheibenzentrifuge ist hier die gleiche wie in den Schritten in 2.2.
  2. Die geernteten Zellen, die in Wasser bei 100 mL/g Feuchtzellen gesammelt wurden, resuspendieren und bei 150 U/min für 2 Stunden bei Raumtemperatur mischen, um eine Zelllyse durch osmotischen Druckschock zu ermöglichen.
  3. Eine kleine Portion (50 ml) der in Schritt 4.1 entnommenen geernteten Zellen in 4%iger NaClO-Lösung (2 ml 4%ige NaClO-Lösung pro g Feuchtzellen) resuspendieren und 5 Minuten lang mischen.
    HINWEIS: Die NaClO-Behandlung wird verwendet, um eine Ausgangsbasis zu schaffen, die vermutlich 100% PHA aus H. mediterranei-Zellen zurückgewinnen kann. Diese Annahme beruht auf der Tatsache, dass diese NaClO-Behandlung die am weitesten verbreitete Methode zur PHA-Wiederherstellung ist34. Diese NaClO-Behandlung wird in der Regel als aggressiv genug für eine vollständige Zelllyse und PHA-Wiederherstellung angesehen, unabhängig von der Zellspezies.
    ACHTUNG: NaClO ist ein starkes Oxidationsmittel. Es kann schwere Hautverbrennungen, Augenschäden und Atemwegsreizungen verursachen. Behandeln Sie NaClO immer in einem gut belüfteten Bereich oder unter einem Abzug, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und Laborkittel. Bei Hautkontakt spülen Sie die betroffene Stelle sofort mit reichlich Wasser ab und suchen Sie einen Arzt auf, wenn die Reizung anhält. Entsorgen Sie NaClO-haltige Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften für gefährliche Abfälle, um eine Kontamination der Umwelt zu vermeiden.
  4. Zentrifugieren Sie die lysierte Suspension bei 10.000 x g für 30 Minuten, um PHA-Granulat zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand gemäß der Bioabfallentsorgungsverordnung im Labor.
  5. Das PHA-Granulat wird ~48 h lang bei -50 °C gefriergetrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist, um rohes PHA-Pulver zu erhalten (Abbildung 6A).
  6. Fügen Sie Ethanol zu rohem PHA-Pulver in einer Menge von 10 mL/g hinzu, um verbleibende Verunreinigungen zu entfernen. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 10.000 x g , um gereinigtes PHA-Granulat zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand gemäß der Entsorgungsverordnung für chemische Abfälle.
  7. Gefriertrocknen Sie das PHA-Pellet bei -50 °C für ~48 Stunden, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist, um gereinigtes PHA-Pulver zu erhalten (Abbildung 6B).

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Abbildung 5: Getrennter salziger Überstand (links) und Zellen (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 6: PHA-Pulver. (A) Rohes PHA-Pulver und (B) gereinigtes PHA-Pulver. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Analytische Methoden

  1. TS und VS werden nach Standardmethodengemessen 35. Die TN wird mit den Hach-Prüfkits nach der Standardmethode mit einem Spektralphotometer35 bestimmt.
  2. Messen Sie den TOC mit einem TOC-Analysator nach den in einer früheren Studiebeschriebenen Methoden 25. Messen Sie den pH-Wert mit einem Tisch-pH-Messgerät.
  3. Bestimmen Sie die VFA-Quantifizierung mit einem Kit36. Überwachen Sie den OD600 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
  4. Die DCW wird aus den flüchtigen Schwebstoffen (VSS) der Zellbouillon, gemessen nach der Standard-VSS-Messmethode25,35, geschätzt. Kurz gesagt, zentrifugieren Sie 50 mL Zellbrühe bei 8.000 x g für 15 min und geben Sie das Pellet in einen Tiegel für die VSS-Analyse.
    HINWEIS: Verwenden Sie VSS zur Schätzung der DCW, da sie die organische Biomasse widerspiegelt und eine Überschätzung aufgrund des Salzgehalts in H. mediterranei23 vermeidet.
  5. Durchführung der PHA-Quantifizierung durch eine Gaschromatographie (GC) nach Methoden in einer früheren Studie25, bei der gefriergetrocknete Biomasse in Chloroform methanolysiert und Methanol bei 105 °C für 2 h angesäuert wird und die resultierenden Monomere unter Verwendung von GC mit Methylbenzoat als internem Standard quantifiziert werden. Berechnen Sie die PHA-Rückgewinnung mit Gleichung 4 und die PHA-Reinheit mit Gleichung 5. Bestimmen Sie die gesamte Masse von PHA aus der GC.
    PHA-Wiederfindung (%) = figure-protocol-10 (4)
    PHA-Reinheit (%) = figure-protocol-11 (5)
    ACHTUNG: Chloroform und Schwefelsäure, die bei der PHA-Quantifizierung verwendet werden, sind gefährlich und müssen mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Chloroform ist ein flüchtiges organisches Lösungsmittel, das ein Toxizitätsrisiko für die Inhalation birgt und bei längerer Exposition Leber- und Nierenschäden verursachen kann. Schwefelsäure ist eine stark ätzende Chemikalie, die schwere Verbrennungen bei Haut- oder Augenkontakt verursachen kann. Behandeln Sie diese Chemikalien immer in einem Abzug, um eine Inhalation zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass Sie geeignete PSA verwenden, einschließlich chemikalienbeständiger Handschuhe, Schutzbrille und eines Laborkittels. Entsorgen Sie alle Chloroform- und Schwefelsäureabfälle ordnungsgemäß gemäß den örtlichen Vorschriften für gefährliche Abfälle, um sichere Laborpraktiken zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Eigenschaften von Lebensmittelabfällen und VFA-Produktion aus aAD
Ein Beispiel für das Verhältnis von TS, VS und C:N in zubereiteten Lebensmittelabfällen ist in Tabelle 1 dargestellt. Aufgrund der inhärenten Variabilität der Zusammensetzung von Lebensmittelabfällen über verschiedene Probenahmequellen und -zeiten hinweg sind Schwankungen der TS-, VS- und C:N-Verhältniswerte zu erwarten. Obwohl die Variabilität akzeptabel ist, sind regelmäßige Messungen des TS-, VS- und C:N-Verhältnisse...

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Diskussion

VFA-Produktion von aAD
VFA spielt eine entscheidende Rolle als wichtiger Vorläufer für H. mediterranei bei der Umwandlung von Lebensmittelabfällen in PHA. Daher ist es wichtig, eine hohe VFA-Konzentration während der aAD aufrechtzuerhalten. Es können mehrere Strategien eingesetzt werden, um die VFA-Produktion in aAD25 zu verbessern. Ein wirksamer Ansatz ist die SRT-Optimierung mit einer idealen Dauer von 8 Tagen oder weniger, die das A...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt vom Department of Energy-Office of Energy Efficiency and Renewable Energy (Prime Award No. DEEE0009268) und des National Institute of Food and Agriculture des US-Landwirtschaftsministeriums (Preisträger Nr. 2023-79000-38973).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LuftAirgasKI UZ300Wird für den GC-Betrieb verwendet
LuftpumpeWolkenrochenHailea ACO-009D
AmmoniumchloridAcros OrganicsA0396560
AutoklavSTERISAMSCO Labor 250Wird in der ATCC-Medienaufbereitung verwendet
GleichgewichtMETTLER TOLEDOME204TE/00
MixerVENVORIB750LV+BLD300+WB-1
EimerLowe'sModell 506405-Gallonen BPA-freier Kunststoffeimer
Calciumchlorid-DihydratAcros OrganicsA0362932
ChloroformMillipore SigmaNr. C2432
ExsikkatorJeder Typ, der in der TS-, VS-, VSS-Messung verwendet werden kann
Aufschlussröhrchen, Schraubverschluss mit PTFE-AuskleidungMillipore SigmaCLS982613
Digitaler ReaktorblockHach UnternehmenDRB200Wird in Hach VFA-Quantifizierungsmethoden verwendet
Digitaler RührerSCILOGEXSCI550-Pro
Scheiben-ZentrifugeAlfa Laval Inc.Clara 20
ErlenmeyerkolbenAmazonasB07V3JPQMM
EthanolAmazonasB09DGVL4ML
GefriertrocknerLabconco10030133, 1027319 und 0109621FreeZone 2,5 Liter Gefriertrocknungssysteme
AbzugKewaunee Scientific CorporationSupreme Air LV
OfenThermo ScientificModell F30428C
Gaschromatographie (GC)AgilentModell 8890 
Haloferax mediterraneiATCC33500
WasserstoffAirgasHY UHP300Wird für den GC-Betrieb verwendet
MesserJede Art, die zum Schneiden von Lebensmittelabfällen verwendet wird
SchmierölFisher Scientific UnternehmenNC9844626
Magnesiumchlorid-HexahydratFisher Scientific UnternehmenNr. BP214-500
Magnesiumsulfat-HeptahydratMillipore SigmaM1880
MethonalMillipore Sigma34860
MethylbenzoatMillipore Sigma93583Wird als interner Standard bei der PHA-Quantifizierung verwendet
Mikroplatten-Reader BioTek SynergieSynergie H1
StickstoffAirgasNI UHP300Wird für den GC-Betrieb verwendet
OfenThermo ScientificOMH750
Peristaltische PumpeSimply Pumps Inc.PM6000 WechselstromSelbstansaugende Pumpe mit hohem Durchfluss und hervorragender Trockenlauffähigkeit, die für die Verarbeitung von Schlämmen mit hohem Partikelgehalt geeignet ist und für 1/8-Zoll-Wandschläuche ausgelegt ist.
pH-MessgerätFisher Scientific UnternehmenAE150
PHA-NormMillipore Sigma403105
Pilot-aAD-FermenterQuasar energy group, Independence, Ohio, USAFermenter aus Edelstahl mit einem Gesamtvolumen von 100 l und einem Arbeitsvolumen von 80 l 
Pilot-PHA-FermenterManukabaumSF-50l ISO 9001 CEDoppelschicht-ummantelter Glasreaktor
KaliumchloridG-BIOWISSENSCHAFTEN162006
Schläuche für PumpenJede Marke von Silikonschläuchen mit einem Innendurchmesser von 1/8 Zoll und einem Außendurchmesser von 3/8 Zoll
NatriumbicarbonatFisher Chemical241787
NatriumbromidCarolina21139-45
NatriumchloridAmazon B0787CFHF3
Natriumhydroxid, PelletsFisher Bioreagenzien236088
NatriumhypochloritMillipore Sigma425044
Sorvall LYNX 4000 Superspeed ZentrifugeThermo Scientific75006580Wird für die Sammlung von PHA-Granulaten bei der nachgelagerten PHA-Rückgewinnung verwendet 
Spektralphotometer Hach UnternehmenDR3900Wird in Hach VFA-Quantifizierungsmethoden verwendet
SchwefelsäureMillipore Sigma258105
Spritzenvorsatz-FilterAmazonasB06X6GTKVY
TOC-AnalysatorShimadzuModell TOC-LCSN
Flüchtige Säuren TNTplus FläschchentestHach UnternehmenTNT 872Kann VFA im Bereich von 50 - 2.500 mg/l Essigsäure messen.
WarmwasserbereiterBosch Inc.Tronic 3000 T 7 Gallonen (ES8)
HefeextraktFisher Scientific UnternehmenAAJ6028736

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