Method Article

CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen: Eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode

DOI:

10.3791/68503

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June 13th, 2025

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1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

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Wir beschreiben ein Protokoll für eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode, die CRISPR-basierte Shuttle-Klonierung (CRISPRshuttle-Klonierung), die den Transfer von DNA-Fragmenten von Interesse zwischen Vektoren ermöglicht, ohne dass eine PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente erforderlich ist.

Abstract

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Die Entwicklung genomweiter Plasmidbibliotheken unter Verwendung bestehender genomischer Repositorien dient als zentrale Voraussetzung für die systematische funktionelle Charakterisierung von Genen über verschiedene biologische Prozesse hinweg. Aktuelle Hochdurchsatzmethoden für den Transfer von DNA-Fragmenten zwischen Vektoren erfordern jedoch eine PCR-Amplifikation der Zielsequenzen vor der Klonierung, was die Generierung von Plasmidsammlungen im Genommaßstab technisch anspruchsvoll und zeitintensiv macht. Durch die Nutzung einer CRISPRshuttle-Kassette haben wir eine neue Hochdurchsatz-Klonierungsmethode entwickelt, die CRISPR-basierte Shuttle-Klonierung (CRISPRshuttle-Klonierung), die den Transfer vieler DNA-Fragmente von Donatorplasmiden, die identische Rückgratsequenzen aufweisen, auf einen CRISPRshuttle-kompatiblen Vektor ohne PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRshuttle vor. Dieses Protokoll umfasst zwei aufeinanderfolgende Reagenzglasreaktionen vor der bakteriellen Transformation. Zunächst werden Ziel-DNA-Fragmente durch Cas9-vermittelte Spaltung ihrer gemeinsamen Vektor-Rückgratsequenz aus Spenderplasmiden herausgeschnitten. Zweitens werden die herausgeschnittenen DNA-Fragmente durch Gibson-Assemblierung in linearisierte CRISPRshuttle-kompatible Vektoren eingefügt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Wirkungsgrad von CRISPRshuttle über 94% liegt und dass zwei Forscher mit CRISPRshuttle in 7 Tagen etwa 300 Plasmide erzeugen können. CRISPRshuttle ermöglicht den effizienten, anpassungsfähigen und kostengünstigen Transfer von DNA-Fragmenten zwischen Vektoren und vereinfacht die Erstellung genomweiter Plasmidbibliotheken erheblich.

Introduction

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Der Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken aus verfügbaren Ressourcen ist die Grundlage und Voraussetzung für den Einsatz der funktionellen Genomik zur Aufklärung biologischer Prozesse. Aktuelle Hochdurchsatz-Klonierungsmethoden, einschließlich Gateway-, In-Fusion-, Creator- und Univector-Klonierungssysteme, erfordern eine PCR-Amplifikation der Ziel-DNA-Fragmente 1,2,3,4,5. Diese Voraussetzung beinhaltet fragmentspezifische Verarbeitungsabläufe, die mehrere standardisierte ....

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Protocol

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1. Bestimmung der optimalen Cas9/sgRNA-Spaltstellen, die cDNA/ORF flankieren

  1. Präparation von cDNA/ORF-Plasmiden
    1. Beziehen Sie cDNA/ORF-Klone aus öffentlichen Repositories.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die vektorbasierten ORF-Klone von pLX304 aus der humanen CCSB-breiten lentiviralen Expressionsbibliothek8.
    2. Isolieren Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Miniprep-Kit und messen Sie seine Konzentration mit einem Spektralphotometer.
  2. sgRNA-Design
    1. Rufen Sie die CHOPCHOP-Website auf (https://chopchop.cbu.uib.no/). Fügen Sie die 2....

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Results

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Wir haben CRISPRshuttle verwendet, um eine UAS-cDNA/ORF-Plasmidsammlung zu erstellen, die 1.397 menschliche Gene abdeckt, die in Drosophila7 konserviert sind. Die Restriktionsanalyse zeigte, dass CRISPRshuttle einen Wirkungsgrad von 94,5 % für die Verwendung von CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektoren mit zwei sich wiederholenden Sequenzen und von 96,1 % für die Verwendung von Zielvektoren ohne sich wiederholende Sequenzen erreicht7. Unsere Daten zeigten, dass im Al.......

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Discussion

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Ein kritischer Schritt im CRISPRshuttle-Protokoll ist die Vorbereitung linearisierter CRISPRshuttle-kompatibler Zielvektoren. Um eine vollständige Verdauung zu gewährleisten, verwenden Sie einen Überschuss an Restriktionsenzymen, um die Vektoren zu verdauen, und eine Gelreinigung der verdauten Vektoren wird dringend empfohlen. Ein weiterer entscheidender Schritt ist der Verdau von cDNA/ORF-Plasmiden mit Cas9. Wenn die Plasmidkonstruktion fehlschlägt, überprüfen Sie mit Hilfe der Agaroseg.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde durch einen Zuschuss der National Natural Science Foundation of China (32071135) und einen Startup-Fonds des Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, unterstützt. Wir danken Prof. Feng Zhang für die freundliche Bereitstellung des pX330-Plasmids und Dr. Xiaohui Cai für die technische Unterstützung.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar PulverChembaseKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Automatisiertes digitales Gel-BildanalysesystemTanonTanon-2500B
ChloramphenicolSangonA100230-0010
E.Z.N.A. Gel-Extraktions-KitOmegaNr. D2500-02
E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit IOmegaNr. D6942-02
EcoRI-HFSCHNABELR3101S
Gibson Assembly Master MixSCHNABELE2611S
HiScribe T7 Quick RNA-Synthesekit mit hoher AusbeuteSCHNABELNr. E2050
NEBuilder HiFi-DNA-Montage-MastermixSCHNABELE2621X
PCR-ThermocyclerLongGenT20 (Englisch)
Platin-SuperFi-II-DNA-PolymeraseThermo Scientific12361010
PvuII-HFSCHNABELNr. R3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x MastermixSCHNABELNr. M0494
S. pyogenes Cas9GenScriptNr. Z03386
Schüttel-InkubatorZhichuZQLY-180V
SpektralphotometerShimadzuBioSpec-nano
T4-DNA-LigasePromegaM1801
Trans 10 chemisch kompetente ZelleTransGenNr. CD101-02
TryptonOxoidNr. LP0042
XbaISCHNABELR0145S
HefeextraktOxoidNr. LP0021

References

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  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from th....

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CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

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