Method Article

CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen: Eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben ein Protokoll für eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode, die CRISPR-basierte Shuttle-Klonierung (CRISPRshuttle-Klonierung), die den Transfer von DNA-Fragmenten von Interesse zwischen Vektoren ermöglicht, ohne dass eine PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente erforderlich ist.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung genomweiter Plasmidbibliotheken unter Verwendung bestehender genomischer Repositorien dient als zentrale Voraussetzung für die systematische funktionelle Charakterisierung von Genen über verschiedene biologische Prozesse hinweg. Aktuelle Hochdurchsatzmethoden für den Transfer von DNA-Fragmenten zwischen Vektoren erfordern jedoch eine PCR-Amplifikation der Zielsequenzen vor der Klonierung, was die Generierung von Plasmidsammlungen im Genommaßstab technisch anspruchsvoll und zeitintensiv macht. Durch die Nutzung einer CRISPRshuttle-Kassette haben wir eine neue Hochdurchsatz-Klonierungsmethode entwickelt, die CRISPR-basierte Shuttle-Klonierung (CRISPRshuttle-Klonierung), die den Transfer vieler DNA-Fragmente von Donatorplasmiden, die identische Rückgratsequenzen aufweisen, auf einen CRISPRshuttle-kompatiblen Vektor ohne PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRshuttle vor. Dieses Protokoll umfasst zwei aufeinanderfolgende Reagenzglasreaktionen vor der bakteriellen Transformation. Zunächst werden Ziel-DNA-Fragmente durch Cas9-vermittelte Spaltung ihrer gemeinsamen Vektor-Rückgratsequenz aus Spenderplasmiden herausgeschnitten. Zweitens werden die herausgeschnittenen DNA-Fragmente durch Gibson-Assemblierung in linearisierte CRISPRshuttle-kompatible Vektoren eingefügt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Wirkungsgrad von CRISPRshuttle über 94% liegt und dass zwei Forscher mit CRISPRshuttle in 7 Tagen etwa 300 Plasmide erzeugen können. CRISPRshuttle ermöglicht den effizienten, anpassungsfähigen und kostengünstigen Transfer von DNA-Fragmenten zwischen Vektoren und vereinfacht die Erstellung genomweiter Plasmidbibliotheken erheblich.

Introduction

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Der Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken aus verfügbaren Ressourcen ist die Grundlage und Voraussetzung für den Einsatz der funktionellen Genomik zur Aufklärung biologischer Prozesse. Aktuelle Hochdurchsatz-Klonierungsmethoden, einschließlich Gateway-, In-Fusion-, Creator- und Univector-Klonierungssysteme, erfordern eine PCR-Amplifikation der Ziel-DNA-Fragmente 1,2,3,4,5. Diese Voraussetzung beinhaltet fragmentspezifische Verarbeitungsabläufe, die mehrere standardisierte Vorgänge umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Design von Oligonukleotid-Primern, die Gelaufreinigung und die Sequenzvalidierung durch Sequenzierung. Infolgedessen ist die Erstellung genomweiter Plasmidbibliotheken (z. B. cDNA/ORF-Überexpressionsbibliotheken) arbeits- und zeitaufwändig geworden, was die Weiterentwicklung der funktionellen Genomik behindert.

Zuvor haben wir CRISPRmass entwickelt, eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode, die entwickelt wurde, um spezifische DNA-Fragmente (z. B. das UAS-Modul) in mehrere Plasmide zu integrieren, die identische Vektorrückgrate haben6. Mit Hilfe von CRISPRmass haben wir mehr als 5.500 GAL4/UAS-basierte UAS-cDNA/ORF-Plasmide aus einer Drosophila cDNA/ORF-Bibliothek, dem Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection6, konstruiert. CRISPRmass ist jedoch nicht in der Lage, DNA-Fragmente zwischen Vektoren zu übertragen, was seine Anwendung bei der Klonierung mit hohem Durchsatz einschränkt.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir die CRISPR-basierte Shuttle-Klonierung (CRISPRshuttle) entwickelt, eine neuartige Hochdurchsatzmethode, die den Transfer mehrerer Ziel-DNA-Fragmente auf Zielvektoren aus Donorplasmiden ermöglicht7. Dieser Prozess erfordert nur zwei aufeinanderfolgende Reagenzglasreaktionen, wodurch die Anforderung einer fragmentspezifischen Handhabung diskreter DNA-Ziele umgangenwird 7.

Das CRISPRshuttle-Protokoll umfasst zwei aufeinanderfolgende Reagenzglasreaktionen (Abbildung 1). Zunächst werden gemeinsam genutzte Vektor-Rückgratsequenzen von Spenderplasmiden durch Cas9/sgRNA gespalten, um Ziel-DNA-Fragmente freizusetzen. Diese Fragmente werden dann über die Gibson-Assemblierung auf die CRISPRshuttle-Kassette eines CRISPRshuttle-kompatiblen Vektors übertragen, um die endgültigen Plasmide zu erzeugen. Eine CRISPRshuttle-Kassette besteht aus einer ~20-40 bp Vektor-Rückgratsequenz, die die 5'- und 3'-Enden der DNA-Fragmente flankiert, die von Donorplasmiden stammen, und einer oder zwei einzigartigen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, die sich zwischen diesen flankierenden Sequenzen befinden. Ein CRISPRshuttle-kompatibler Vektor wird konstruiert, indem eine CRISPRshuttle-Kassette in einen Zielvektor eingefügt wird, der anschließend durch Verdauen der Restriktionsstellen innerhalb der Kassette linearisiert wird. Der Zielvektor muss ein Antibiotikaresistenzgen tragen, das sich von denen in Spenderplasmiden unterscheidet. Wenn es identisch ist, muss das Resistenzgen vor der Verwendung durch ein anderes ersetzt werden.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das CRISPRshuttle zum Aufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek verwendet. Dieser Prozess beinhaltet die Übertragung humaner ORFs aus der CCSB-Broad Lentiviral Expression Library in den Drosophila-Transgenese-Vektor pBID-UASC 8,9. CRISPRshuttle vereinfacht den Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken und erleichtert so funktionelle Genomikstudien.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bestimmung der optimalen Cas9/sgRNA-Spaltstellen, die cDNA/ORF flankieren

  1. Präparation von cDNA/ORF-Plasmiden
    1. Beziehen Sie cDNA/ORF-Klone aus öffentlichen Repositories.
      HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die vektorbasierten ORF-Klone von pLX304 aus der humanen CCSB-breiten lentiviralen Expressionsbibliothek8.
    2. Isolieren Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Miniprep-Kit und messen Sie seine Konzentration mit einem Spektralphotometer.
  2. sgRNA-Design
    1. Rufen Sie die CHOPCHOP-Website auf (https://chopchop.cbu.uib.no/). Fügen Sie die 20-100 bp-Region des pLX304-Vektor-Backbones, die das ORF 3'-Ende flankiert, in das Zielfeld ein.
    2. Wählen Sie Drosophila melanogaster als Art aus und klicken Sie auf Zielstandorte suchen. Wählen Sie sgRNA-Kandidaten aus, für die eine Effizienz von über 80 % prognostiziert wird.
  3. sgRNA-Vorbereitung
    1. Synthetisieren Sie einen Vorwärtsprimer (5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′), wobei (N)20 die sgRNA-Zielsequenz darstellt, und einen reversen Primer sgRNA-REV (5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′).
      HINWEIS: Es werden PAGE-gereinigte Grundierungen empfohlen.
    2. Generierung eines DNA-Templates für sgRNA in vitro Transkription (IVT) mittels PCR. Bereiten Sie eine 100-μl-Reaktion vor, die jeweils 5 μl Template pX330 (Addgene-Plasmid 42230; 0,1 ng/μl), Forward-Primer (10 μM) und sgRNA-REV-Primer (10 μM) enthält; 50 μl 2x High-Fidelity-PCR-Mastermix; und 35 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Reinstwasser.
    3. Amplifizieren Sie in einem PCR-Thermocycler mit dem folgenden Programm: 98 °C für 30 s; 5 Zyklen von 98 °C für 8 s, 52 °C für 15 s, 72 °C für 5 s; 30 Zyklen von 98 °C für 8 s, 72 °C für 20 s; 72 °C für 2 min.
    4. Lösen Sie PCR-Produkte auf einem 0,8%igen Agarose-Gel auf. Schneiden Sie die ~120-bp-Bande heraus und reinigen Sie sie mit einem Gel-Extraktionskit.
    5. Bereiten Sie eine 10-μl-IVT-Reaktion vor, die 300 ng gereinigtes DNA-Fragment, 3,33 μl NTP-Puffermischung, 0,67 μl T7-RNA-Polymerase-Mischung und DEPC-behandeltes Reinstwasser enthält. Inkubieren Sie bei 37 °C für 4 h.
    6. Quantifizieren Sie ungereinigte sgRNA durch Spektrophotometrie, verdünnen Sie sie auf 20 ng/μl mit DEPC-behandeltem Reinstwasser und frieren Sie sie bei -80 °C in kleinen Aliquoten ein.
      HINWEIS: Eine DNase-Behandlung ist nicht erforderlich, da verbleibende DNA die nachgelagerten Reaktionen nicht beeinträchtigt.
  4. sgRNA-Evaluierung
    1. Verdau eines cDNA/ORF-Plasmids, das das Rückgrat des pLX304-Vektors enthält, unter Verwendung eines Restriktionsenzyms. Lösen Sie die resultierenden DNA-Fragmente mit 0,8 % Agarosegel auf. Reinigen Sie das DNA-Substrat mit einem Gel-Extraktionskit.
    2. Bereiten Sie ein 5 μl Cas9-Spaltreaktionsgemisch vor, das 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,015 pmol DNA-Substrat, 0,5 μl 10x Cas9-Puffer und DEPC-behandeltes Reinstwasser enthält. Die Reaktion wird 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
    3. Die Spaltprodukte mit 0,8 % Agarosegel auflösen. Nehmen Sie das ungespaltene DNA-Substrat als Negativkontrolle auf.
    4. Visualisieren Sie die Spaltungsmuster mit einem digitalen Bildgebungssystem und wählen Sie die sgRNA mit minimalem Restsubstrat für nachfolgende Experimente aus (Abbildung 2).

2. Austausch des Antibiotikaresistenzgens des Zielvektors

HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden wir das Beispiel des Austauschs des Ampicillin-Resistenzgens des Zielvektors pBID-UASC mit dem Chloramphenicol-Resistenzgen, wodurch der Chloramphenicol-tragende Zielvektor pBIDC-UASC erzeugt wird.

  1. Entfernen Sie das Ampicillin-Resistenz-Gen aus pBID-UASC.
    HINWEIS: Das Ampicillin-Resistenzgen von pBID-UASC wurde durch Cas9-Verdau in Verbindung mit zwei sgRNAs, f1Ori5-G4 (Zielsequenz: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') und Amp3-G2 (Zielsequenz: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3') entfernt, was zu einem linearen pBID-UASC-Vektorrückgrat von 7.687 bp führte. Diese beiden sgRNAs zielen auf die 5' stromaufwärts bzw. 3' stromabwärts des Ampicillin-Resistenzgens ab.
    1. Bereiten Sie eine 10-μl-Spaltreaktion vor, die 0,03 pmol pBID-UASC, 0,25 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 20 ng f1Ori5-G4, 20 ng Amp3-G2, 1 μl 10x Cas9-Puffer und DEPC-behandeltes Reinstwasser enthält. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
      HINWEIS: Das Cas9-gespaltene Plasmid wird ohne Reinigung direkt der Gibson-Assemblierung unterzogen.
  2. PCR-Amplifikation des Chloramphenicol-Resistenzgens.
    HINWEIS: Ein 840 bp Chloramphenicol-Resistenzgen wurde aus dem Plasmid pMartini-Cam6 mittels PCR unter Verwendung des f1Ori5-Cam-F (5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATTGTGTATGATACATAAGGTT-3') und Amp3-Cam-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') Primer.
    1. Bereiten Sie das Chloramphenicol-Resistenzgen durch PCR vor, indem Sie das 840 bp Chloramphenicol-Resistenzgen amplifizieren. Richten Sie eine 20-μl-PCR-Reaktion ein, die 2 μl pMartini-Cam (0,1 ng/μl), 1 μl f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μl Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μl 5x Puffer, 0,4 μl dNTPs (10 mM), 0,4 μl High-Fidelity-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten/μl) und 11,2 μl Reinstwasser enthält.
    2. Führen Sie die PCR unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen durch: 1 Zyklus mit 95 °C für 1 min; 5 Zyklen von 95 °C für 15 s, 46 °C für 15 s, 72 °C für 20 s; 30 Zyklen von 95 °C für 15 s, 61 °C für 15 s, 72 °C für 20 s; 1 Zyklus von 72 °C für 2 min. Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler durch.
    3. Lösen Sie die Spaltprodukte mit 0,8 % Agarosegel auf und reinigen Sie ein 840 bp DNA-Fragment mit einem Gelextraktionskit.
  3. Fügen Sie das Chloramphenicol-Resistenzgen in das linearisierte pBID-UASC-Vektorrückgrat ein, was zu pBIDC-UASC führt.
    1. Führen Sie eine 2-μl-Gibson-Assemblierungsreaktion durch: 0,008 pmol des 840 bp Chloramphenicol-Resistenzgens, 0,002 pmol des linearisierten pBID-UASC (Schritt 2.1.1), 1,0 μl 2x Gibson-Assemblierungs-Mastermix. Die Reaktion wird 1 h lang bei 50 °C durchgeführt.
    2. 10 μl kompetente E . coli-Zellen mit 1 μl Ligationsreaktionsprodukt transformieren. Ausgewählte Transformanten auf einer LB-Platte, ergänzt mit 15 μg/ml Chloramphenicol.
    3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und unterziehen Sie sie einer nachfolgenden Bakterienkultur und Plasmid-Miniprep. Verifizierung des chloramphenicol-haltigen Zielvektors pBIDC-UASC durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung.

3. Aufbau eines CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektors

HINWEIS: Eine CRISPRshuttle-Kassette besteht aus etwa 20-40 bp großen Vektor-Rückgratsequenzen, die sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende der Ziel-DNA-Fragmente flankieren, wobei sich zwischen ihnen eine oder zwei einzigartige Restriktionsstellen befinden.

  1. Anneal-Oligonukleotide mit einem Thermocycler mit folgendem Programm: 94 °C für 2 min; 70 Zyklen à 52 s bei (95-N) °C, wobei N die Zykluszahl darstellt.
    HINWEIS: Die geglühte CRISPRshuttle-Kassette enthält 5'-Überhänge komplementär zu EcoRI und XbaI.
  2. Lilizieren Sie die geglühte CRISPRshuttle-Kassette in den EcoRI/XbaI-verdauten Zielvektor pBIDC-UASC, um den CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektor pBIDC-UASC-pLXvect zu erzeugen.
    HINWEIS: Diese Ligation eliminiert die ursprünglichen EcoRI- und XbaI-Stellen innerhalb der mehreren Klonierungsstellen, wodurch die EcoRI- und XhoI-Stellen in der Mitte der CRISPRshuttle-Kassette im endgültigen Vektor einzigartig werden. Die einzigartigen Restriktionsstellen in der CRISPRshuttle-Kassette ermöglichen die Linearisierung des CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektors.
    1. Bereiten Sie eine 5-μl-Ligationsreaktion vor, die 14 ng 8.451 bp EcoRI/XbaI-verdautes pBIDC-UASC, 0,02 pmol der geglühten CRISPRshuttle-Kassette, 0,5 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer und 0,3 μl T4-DNA-Ligase enthält. Die Reaktion wird über Nacht bei 16 °C inkubiert.
    2. 10 μl kompetente E . coli-Zellen werden mit 1 μl des Ligationsreaktionsprodukts transformiert. Wählen Sie Transformanten auf einer LB-Platte, die mit 15 μg/ml Chloramphenicol ergänzt wird, und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
    3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und unterziehen Sie sie einer nachfolgenden Bakterienkultur und Plasmid-Miniprep. Verifizieren Sie den CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektor pBIDC-UASC-pLXvect durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung.

4. Erzeugung von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden mittels CRISPRshuttle

HINWEIS: Das CRISPRshuttle-Protokoll umfasst zweistufige Reagenzglasreaktionen, die parallel vor der bakteriellen Umwandlung durchgeführt werden (Abbildung 1).

  1. Reagenzglasreaktion Schritt 1
    1. Extrahieren Sie ORFs aus pLX304-ORF-Plasmiden, indem Sie das Vektorrückgrat mit Cas9 in Verbindung mit zwei sgRNAs, pLX304-CMV-G16 (Zielsequenz: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', lokalisiert im pLX304-Vektorrückgrat, das ORF 5'-Ende flankiert) und pLX304-3'-G1 (Zielsequenz: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', lokalisiert im pLX304-Vektorrückgrat, das ORF 3'-Ende flankiert), lokalisiert ist.
      1. Bereiten Sie einen Mastermix für eine gegebene Anzahl (N) von Aufschlussreaktionen wie folgt vor: (N+1) x 0,4 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,5 μl 80 ng/μl pLX304-CMV-G1, (N+1) x 0,5 μl 80 ng/μl pLX304-3'-G1, (N+1) x 0,4 μl 10x Cas9-Puffer und (N+1) x 1,45 μl DEPC-behandeltes Reinstwasser.
      2. Mischen Sie gründlich und drehen Sie den Mastermix herunter. Aliquotieren Sie 3,75 μl des Mastermixes auf jedes Röhrchen. Geben Sie 0,75 μl 0,03 μM pLX304-ORF-Plasmid in jedes Röhrchen. Gründlich mischen und die Reaktionen 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
        HINWEIS: Jedes pLX304-ORF-Plasmid auf eine Konzentration von 0,03 μM mit DEPC-behandeltem Reinstwasser verdünnen. Wenn die Konzentration weniger als 0,03 μM beträgt, fügen Sie der Reaktion direkt Plasmid-DNA hinzu. Die Cas9-gespaltenen Plasmide müssen nach Spaltreaktionen nicht aufgereinigt werden und können direkt für die nachfolgende Gibson-Assemblierung verwendet werden.
  2. Reagenzglasreaktion Schritt 2
    1. Fügen Sie die exzidierten ORFs über die Gibson-Assemblierung in den CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektor pBIDC-UASC-pLXvect ein, was zu UAS-cDNA/ORF-Plasmiden führt.
      1. Verdau von pBIDC-UASC-pLXvect mit EcoRI und XbaI. Trennen Sie das linearisierte pBIDC-UASC-pLXvect durch Agarose-Gelelektrophorese und reinigen Sie es mit einem Gelextraktionskit.
      2. Bereiten Sie einen Master-Mix für eine gegebene Anzahl (N) von Gibson-Assemblierungsreaktionen wie folgt vor: (N+1) x 0,14 μl 3,36 μM linearisierter pBIDC-UASC-pLXvekt und (N+1) x 1,8 μl Gibson-Assemblierungs-Mastermix.
      3. Mischen Sie gründlich und drehen Sie den Mastermix herunter. Aliquotieren Sie 1,94 μl des Mastermixes in jedes Röhrchen. Geben Sie 1,66 μl Cas9-gespaltenes Plasmid in jedes Röhrchen. Gründlich mischen und die Reaktionen 1 h lang bei 50 °C inkubieren.
        HINWEIS: Halten Sie den Mastermix und die Tuben vor der Inkubation bei 50 °C eis.
  3. Transformieren Sie E. coli mit Gibson Montageprodukten.
    HINWEIS: Die Produkte der Gibson-Montage müssen vor der Umwandlung in E. coli nicht gereinigt werden.
    1. Tauen Sie bakterielle kompetente Zellen auf Eis auf. Aliquotieren Sie 10 μl Zellen in jedes vorgekühlte 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Kompetente Bakterienzellen mit einer Transformationseffizienz von mindestens 1 × 108 KBE/μg pUC19-DNA werden empfohlen.
    2. Mischen Sie vorsichtig 10 μl kompetente Zellen mit 1 μl Gibson Assemblierungsprodukten. 30 Min. auf Eis legen.
    3. 1 Min. bei 42 °C einen Hitzeschock erleiden und anschließend 2 Min. auf Eis kalt stellen.
    4. Geben Sie 100 μl vorgewärmtes SOC-Medium (37 °C) in jedes Röhrchen. Bei 250 U/min 1 h bei 37 °C schütteln.
    5. Die Zellen werden auf LB-Platten gelegt, die 15 μg/ml Chloramphenicol enthalten. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Durchführung dieser Verfahren in großem Maßstab dauert in der Regel mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie sowohl die Reagenzien als auch die Reaktionsanordnungen auf Eis auf.
  4. Nachweis von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden.
    1. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 4,5 ml LB-Medium mit 15 μg/ml Chloramphenicol. Über Nacht bei 37 °C bei 250 U/min schütteln.
    2. Isolieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Mini-Prep-Kit.
    3. Bereiten Sie eine 20-μl-Restriktionsaufschlussreaktion für jedes Plasmid vor, das 300-500 ng Plasmid-DNA, 0,3 μl PvuII, 2 μl 10x Puffer und Reinstwasser enthält. Die Reaktionen werden 1 h lang bei 37 °C durchgeführt.
    4. Lösen Sie DNA-Fragmente mit 0,8 % Agarosegel auf. Bild unter UV-Licht (Abbildung 3).

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Results

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Wir haben CRISPRshuttle verwendet, um eine UAS-cDNA/ORF-Plasmidsammlung zu erstellen, die 1.397 menschliche Gene abdeckt, die in Drosophila7 konserviert sind. Die Restriktionsanalyse zeigte, dass CRISPRshuttle einen Wirkungsgrad von 94,5 % für die Verwendung von CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektoren mit zwei sich wiederholenden Sequenzen und von 96,1 % für die Verwendung von Zielvektoren ohne sich wiederholende Sequenzen erreicht7. Unsere Daten zeigten, dass im Al...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein kritischer Schritt im CRISPRshuttle-Protokoll ist die Vorbereitung linearisierter CRISPRshuttle-kompatibler Zielvektoren. Um eine vollständige Verdauung zu gewährleisten, verwenden Sie einen Überschuss an Restriktionsenzymen, um die Vektoren zu verdauen, und eine Gelreinigung der verdauten Vektoren wird dringend empfohlen. Ein weiterer entscheidender Schritt ist der Verdau von cDNA/ORF-Plasmiden mit Cas9. Wenn die Plasmidkonstruktion fehlschlägt, überprüfen Sie mit Hilfe der Agaroseg...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde durch einen Zuschuss der National Natural Science Foundation of China (32071135) und einen Startup-Fonds des Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, unterstützt. Wir danken Prof. Feng Zhang für die freundliche Bereitstellung des pX330-Plasmids und Dr. Xiaohui Cai für die technische Unterstützung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar PulverChembaseKBS-001H
AgaroseSangonA600014-0100
Automatisiertes digitales Gel-BildanalysesystemTanonTanon-2500B
ChloramphenicolSangonA100230-0010
E.Z.N.A. Gel-Extraktions-KitOmegaNr. D2500-02
E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit IOmegaNr. D6942-02
EcoRI-HFSCHNABELR3101S
Gibson Assembly Master MixSCHNABELE2611S
HiScribe T7 Quick RNA-Synthesekit mit hoher AusbeuteSCHNABELNr. E2050
NEBuilder HiFi-DNA-Montage-MastermixSCHNABELE2621X
PCR-ThermocyclerLongGenT20 (Englisch)
Platin-SuperFi-II-DNA-PolymeraseThermo Scientific12361010
PvuII-HFSCHNABELNr. R3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x MastermixSCHNABELNr. M0494
S. pyogenes Cas9GenScriptNr. Z03386
Schüttel-InkubatorZhichuZQLY-180V
SpektralphotometerShimadzuBioSpec-nano
T4-DNA-LigasePromegaM1801
Trans 10 chemisch kompetente ZelleTransGenNr. CD101-02
TryptonOxoidNr. LP0042
XbaISCHNABELR0145S
HefeextraktOxoidNr. LP0021

References

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