Methodenartikel

Im lebenden Organismus Proximity-Biotinylierung für Proteininteraktionsstudien in Paramecium tetraurelia

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DOI:

10.3791/68504

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12. September 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode für die kovalente In-vivo-Bindung von Biotin an Proteine vor, die auf ihrer Nähe zu einer Biotin-Ligase basiert, die mit einem Protein von Interesse fusioniert ist. Diese Modifikation ermöglicht eine selektive Anreicherung der Proteine mit Streptavidin-Kügelchen, wie sie in Proteininteraktionsstudien benötigt wird.

Zusammenfassung

Paramecium ist ein wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung molekularer Mechanismen, die an programmierten genomischen Umlagerungen und der Eliminierung von Transposons während der meiotischen Fortpflanzung beteiligt sind. Viele Details dieses Prozesses bleiben aufgrund der Komplexität der beteiligten molekularen Maschinerie und der vorübergehenden Protein-Protein-Wechselwirkungen rätselhaft. Hier stellen wir eine Methode zur zeitaufgelösten Markierung von Proteinen vor, wobei sich Biotin in der Nähe eines Zielproteins von Interesse befindet. Die Methode kann leicht an verschiedene Ziele angepasst werden, da die Biotinylierung durch Injektion einer DNA erreicht wird, die für ein Zielprotein kodiert, das mit einer gentechnisch hergestellten Biotin-Ligase fusioniert ist. Das Fusionskonstrukt wird vom Promotor des endogenen Gens exprimiert, was ein stadienspezifisches Expressionsprofil ähnlich dem des nativen Proteins ermöglicht. Insbesondere ermöglicht die kovalent gebundene Biotin-Einheit die selektive Anreicherung der markierten Proteine unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kügelchen. Darüber hinaus zeigen wir mit der Immunfluoreszenzfärbung, dass eine effiziente Markierung eine Supplementierung der Kultur mit Biotin erfordert. Der Plug-and-Play-Expressionsvektor in Kombination mit dem hier gezeigten effizienten Injektionsverfahren ermöglicht die schnelle Erzeugung von Pantoffeltierchenlinien , die ein modifiziertes Protein exprimieren. Das hier demonstrierte Biotinylierungsverfahren kann mit der Massenspektrometrie zur Identifizierung der angereicherten Proteine nachverfolgt werden, die die Interaktionspartner des Zielproteins enthalten. Die Proximity-Biotinylierung hat das Potenzial, die Entdeckung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Paramecium zu vereinfachen und zu beschleunigen und die Bemühungen um das Verständnis der Genom-Editing-Maschinerie zu verstärken.

Einleitung

Der Flimmereinzeller Paramecium tetraurelia beherbergt zwei unterschiedliche Arten von Zellkernen: einen Keimbahnkern für die langfristige Speicherung genetischer Informationen und einen somatischen Kern für die physiologischen Funktionen der Zelle1. Die sexuelle Fortpflanzung in diesem Organismus erfordert die Bildung eines neuen somatischen Genoms. Dieser Prozess umfasst die irreversible Exzision von mehr als 45.000 DNA-Fragmenten aus dem somatischen Genom2, zu denen auch die transponierbaren Elemente3 und andere Wiederholungen gehören. Besonders auffällig ist, dass die Exzisionsereignisse mit einer Genauigkeit bis auf das einzelne Basenpaar1 ausgeführt werden. Diese Genauigkeit ist biologisch notwendig, da die exzidierten DNA-Fragmente proteinkodierende Regionen4 stören und jede fehlerhafte Exzision Frameshift-Mutationen, vorzeitige Stopp-Codons oder Veränderungen der proteinkodierenden Sequenz hervorrufen könnte. Ein ausgeklügelter RNA-Vergleichsmechanismus ermöglicht es der Zelle, die Sequenzen zu differenzieren, die im neuen somatischen Genom benötigt werden. Es wird mit der Transkription des gesamten Keimbahngenoms5 eingeleitet, gefolgt von einem Trimmen auf eine Größe von 25 bp6 und dem Transport zum alten somatischen Genom7, wo alle komplementären RNAs verworfen werden8. Die verbleibenden sRNAs, denen komplementäre Sequenzen im alten somatischen Genom fehlen, werden weiter in das sich neu entwickelnde somatische Genom transportiert, wo sie sich an allen keimbahnbegrenzten Sequenzen ausrichten und deren Exzision leiten9. Dieser komplexe mehrstufige Prozess erfordert ein präzises und zeitliches Zusammenspiel vieler zellulärer Komponenten und insbesondere vorübergehende schwache Wechselwirkungen beim Transit der kleinen RNAs zwischen den verschiedenen Zellkernen10,11. Zuvor wurden Versuche unternommen, die molekulare Mechanik des Prozesses mit Hilfe von Knockdown-Experimenten zu verstehen, um festzustellen, ob mutmaßliche Komponenten für den Prozess essentiell sind, gefolgt von Immunpräzipitationsansätzen, um die Wechselwirkungen der essentiellen Proteine aufzudecken 12,13,14. Während diese Methode für den Nachweis einer starken und kontinuierlichen Bindung nützlich ist, die auch die nicht-physiologischen Bedingungen während des Pulldowns überdauert, kann der Nachweis von schwachen und vorübergehenden Wechselwirkungen eine langwierige Optimierung erfordern. Aufgrund der potenziell vorübergehenden Natur vieler Interaktionen, die an der Genom-Editierung beteiligt sind, könnten In-vivo-Methoden den Nachweis solcher Wechselwirkungen verbessern. Darüber hinaus können einige Proteine unter extrazellulären Bedingungen nicht effizient solubilisiert werden15, was ein Problem darstellt, das durch in vivo interaktionsbasierte Proteinmodifikationen, wie z. B. Proximity-Markierung mit Biotin, gelöst werden kann.

Hier beschreiben wir eine neue Methode, die eine spezifische in vivo Biotinylierung von Proteinen ermöglicht, die in der Nähe des gewünschten Zielproteins lokalisiert sind. Die kovalente Biotinmodifikation kann für eine effiziente Anreicherung mit Streptavidin-basierten Pulldown-Ansätzen genutzt werden. Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Verwendung der Biotin-Ligase TurboID16 zur Durchführung der Proteininteraktionsstudien bei Paramecium tetraurelia erreicht. Unser Ansatz kann leicht auf jedes Zielprotein angewendet werden, indem die im Protokoll beschriebenen Schritte befolgt werden. Daher stellt dieser Artikel eine effiziente und skalierbare Strategie für die Proximity-Biotinylierung vor, die für Hochdurchsatz-Proteomstudien in einem prominenten Protozoen-Modellorganismus verwendet werden kann.

Protokoll

1. Allgemeine Methoden

  1. Besorgen Sie sich Puffer, Reagenzien und andere Materialien, die in Tabelle 1 aufgeführt sind.
  2. Kultivieren Sie monoklonale Paramecium-Linien , wie zuvor beschrieben17. Kurz gesagt, übertragen Sie eine Zelle in eine neue Vertiefungsgefäße, die bakteriisiertes Leichtmedium (0,8 μg/ml β-Sitosterol) enthält, so dass die Zelldichte unter 500 Zellen/ml bleibt, um einen vorzeitigen Beginn des meiotischen Zyklus zu verhindern. Nach 50 Zellteilungen werden die Zellen in eine bakteriisierte Rich-Media-Kultur (mit 0,8 μg/ml β-Sitosterol) überführt und so lange belassen, bis alle Bakterien verbraucht sind, wodurch die sexuelle Fortpflanzung (Autogamie) induziert wird18.
    HINWEIS: Nach Abschluss des sexuellen Fortpflanzungszyklus verbleiben die Zellen in einem sich nicht teilenden postautogamen Zustand, bis eine neue Nährstoffquelle bereitgestellt wird.
  3. Konstruktion von Fusionsproteinen der Zielgene unter Verwendung eines Vektors, der eine Codon-optimierte 3x HA-TurboID-Sequenz mit vorgeschalteten Restriktionsenzym-Schnittstellen enthält.
    1. Führen Sie eine PCR-Amplifikation des Zielgens und seiner Promotorregion aus genomischer DNA durch, wobei Primer verwendet werden, die mit Überhängen versehen sind, die geeignete Restriktionsstellen kodieren.
    2. Das Produkt wird unter Verwendung des Standard-Restriktionsaufschlusses in die im Rahmen kompatiblen Schnittstellen19 stromaufwärts der turboID-Codierungsbereiche eingeführt.
  4. Sequenzierung, Verifizierung und Amplifikation der konstruierten Plasmid-DNA in E.coli DH5α. Isolieren Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Midiprep-Kit und linearisieren Sie 100 μg Plasmid-DNA durch Restriktionsverdau.
  5. Reinigen Sie durch Phenol-Chloroform-Extraktion und filtrieren Sie dann durch einen Zentrifugalfilter12. Führen Sie eine Ethanolfällung durch und lösen Sie das DNA-Pellet in Wasser auf, um eine Konzentration von 5 mg/ml zu erhalten.
    HINWEIS: Die DNA kann mit dem folgenden Mikroinjektionsverfahren in die somatischen Kerne von Pantoffeltierzellen eingebracht werden.

2. Mikroinjektion in den somatischen Kern (MAC)

  1. Eine Zelle aus der in Schritt 1.2 gewonnenen postautogamen Kultur wird auf einen frischen Depressionsträger mit bakteriisiertem Leichtmedium mit 0,8 μg/ml β-Sitosterol übertragen. Vor der Injektion zwei Tage lang bei 27 °C inkubieren, um die Zellen zu gewinnen.
  2. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Zellen aus der gewonnenen Kultur auf einen frisch vorbereiteten Depressionsobjektträger zu übertragen, der mit dem Waschmedium gefüllt ist.
  3. Während sich die Zellen im Waschmedium befinden, geben Sie 20 μL ddH2O auf einen Objektträger und legen Sie es mit einem Deckglas auf.
  4. Geben Sie 200 μl Mineralöl auf das Deckglas.
  5. Übertragen Sie anschließend einzelne gewaschene Zellen als Tröpfchen unter das Mineralöl mit möglichst wenig Flüssigkeitsvolumen. Platzieren Sie bis zu 20 Blasen mit einer einzigen Zelle pro Objektträger und positionieren Sie dann den vorbereiteten Objektträger auf dem Sockel des Injektionsmikroskops.
  6. Bringen Sie die Aspirationsnadel an und bringen Sie sie in Position, dann starten Sie den Roboterarm und die Injektionsmaschine.
  7. Geben Sie mit einer Microloader-Pipettenspitze 2-3 μl der in Schritt 1.5 hergestellten DNA-Lösung in die Injektionsnadel. Befestigen Sie die Nadel am Roboterarm, bringen Sie sie in Position und verbinden Sie sie dann mit dem Druckventil der Spritzgießmaschine.
  8. Positionieren Sie die Injektionsnadel mit dem Roboterarm in einem leeren Wassertropfen auf dem Objektträger. Drücken Sie dann auf Reinigen , um die verbleibende Luft in der Injektionsnadel zu entfernen, bis der DNA-Fluss beobachtet wird.
  9. Gehen Sie zu einem Tröpfchen über, das eine Zelle enthält, und senken Sie dann die Aspirationsnadel. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit (Wasser) aus diesem Tröpfchen, bis die Zelle immobilisiert ist.
  10. Heben Sie die Aspirationsnadel an, senken Sie die Injektionsnadel ab und wechseln Sie dann zu einer höheren Vergrößerung.
  11. Stellen Sie sicher, dass der somatische Kern (MAC) nun als dunklerer Bereich ohne Nahrungsvakuolen sichtbar ist (siehe Abbildung 1c), in den die Injektionsnadel eingeführt werden muss.
  12. Versuchen Sie, den MAC mit der Injektionsnadel vollständig zu durchdringen und ziehen Sie die Nadel über mehrere Sekunden langsam zurück.
    HINWEIS: Wenn sich die Nadel im MAC befindet, fließt die DNA aufgrund des konstanten Luftdrucks, der von der Spritzgießmaschine ausgeübt wird, in den MAC. Eine diffuse Vakuole, bestehend aus der injizierten DNA, könnte innerhalb der Grenzen der MAC sichtbar werden.
    HINWEIS: Es ist möglich, dieselbe Zelle mehrmals zu injizieren, um eine erfolgreiche Injektion zu gewährleisten.
  13. Nach Abschluss der Zellinjektion wird die Aspirationsnadel mit dem in Schritt 2.9 abgesaugten Wasser abgesenkt. Kehren Sie den Durchfluss um, um genügend Wasser in das Tröpfchen zurückzuführen, bis sich die Zelle wieder zu bewegen beginnt.
  14. Fahren Sie fort, bis alle Tröpfchen, die eine Zelle enthalten, verarbeitet wurden.
  15. Gewinnen Sie jede injizierte Zelle, indem Sie die Tröpfchen vom Objektträger sammeln und jede von ihnen in eine separate Vertiefung übertragen, die mit bakteriisiertem Leichtmedium mit 0,8 μg/ml β-Sitosterol gefüllt ist.
  16. Inkubieren Sie über Nacht bei 27 °C, übertragen Sie eine einzelne Zelle aus jeder Vertiefung in eine neue Vertiefung und bewahren Sie die ursprüngliche Vertiefung bei 18 °C als Backup auf.
  17. Kultivieren Sie die übertragenen Zellen über Nacht bei 27 °C für 1 Tag und übertragen Sie dann 5 Zellen aus jeder monoklonalen Vertiefung in ein PCR-Röhrchen. Verwenden Sie für die Amplifikation konstruktspezifische Primer, um das Vorhandensein der injizierten DNA in den Zellen zu überprüfen.

3. Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung der korrekten Proteinlokalisierung und der Funktion der Biotin-Ligase

  1. Die ausgewählten PCR-positiven Klone werden in 20 mL bakteriisiertem Medium mit 0,8 μg/mL β-Sitosterol kultiviert.
  2. Nachdem das Medium weniger trüb geworden ist, entnehmen Sie eine 50-μl-Probe aus der Kultur. Fügen Sie 1 μl DAPI-Lösung (0,1 mg/ml) und 1 μl EDTA (0,5 mM) für die DNA-Färbung hinzu, um zu überprüfen, ob die Autogamie eingeleitet wird.
    HINWEIS: Die Autogamie beginnt in der Regel bei einer Zelldichte von 2.000 Zellen/ml.
  3. Wenn eine Biotinylierung gewünscht ist, ergänzen Sie das Kulturmedium mindestens 1 h lang mit Biotin auf eine Endkonzentration von 500 μM, bevor Sie die Zellen ernten.
  4. Die Zellen werden im entsprechenden Entwicklungsstadium mit einer Ölmesszentrifuge mit birnenförmigen Röhrchen bei 280 x g für 2 min geerntet. Entsorgen Sie das Nährmedium und geben Sie PBS in die Röhrchen, zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie das PBS.
  5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS und geben Sie es in ein durchsichtiges 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Bereiten Sie eine 3,7%ige PFA-Verdünnung in PBS aus der 37%igen Stammlösung vor.
  7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml 3,7 % PFA und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Röhrchenrotator.
  8. Bei 600 x g 1 min zentrifugieren, bis sich ein sichtbares Kügelchen bildet. Entsorgen Sie die PFA-Lösung in den dafür vorgesehenen Sonderabfallbehälter.
  9. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 50 mM Glycin in PBS. 5-10 min auf einem Röhrenrotator inkubieren.
  10. Bei 600 x g 1 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 0,8 mL 1x PBS hinzu. Optional noch einmal mit PBS waschen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen bei Bedarf bei 4 °C gelagert werden.
  11. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 600 x g , entfernen Sie das PBS und fügen Sie 500 μl 0,5 % Triton X-100 in PBS hinzu. 20 min auf einem Röhrenrotator inkubieren.
  12. Zentrifugieren Sie, bis das Pellet sichtbar wird (1.000 x g für 2 Minuten), entfernen Sie die Triton X-100-Lösung und resuspendieren Sie die Zellen in PBS.
  13. Bereiten Sie eine 5%ige BSA-Lösung in PBS entsprechend dem erforderlichen Antikörpervolumen vor.
  14. Entfernen Sie die PBS-Waschung aus den Zellen und geben Sie 100 μl des primären Antikörpers, verdünnt in 5 % BSA in PBS, in die Zellen. Passen Sie die Inkubationszeit entsprechend dem verwendeten Antikörper an.
    HINWEIS: Eine Inkubation von 2 Stunden bei Raumtemperatur ist für die meisten Antikörper ausreichend.
  15. Zentrifugieren Sie bei 600 x g, entfernen Sie die primäre Antikörperverdünnung und waschen Sie die Zellen mit 500 μl PBS.
  16. 100 μl des in 5 % BSA verdünnten Sekundärantikörpers in PBS zugeben. Passen Sie die Inkubationszeit an; In der Regel ist 1 h bei Raumtemperatur ausreichend. Decken Sie das Röhrchen mit Alufolie ab, um das Fluorophor vor Licht zu schützen.
  17. Fügen Sie während der letzten 10 Minuten der Inkubation mit dem Sekundärantikörper 1 μl DAPI-Lösung (0,1 mg/ml) hinzu.
  18. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 600 x g , entfernen Sie die Fleckenlösung und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Lassen Sie 20 μl der zweiten Wäsche in der Tube und resuspendieren Sie die Zellen.
  19. Montieren Sie 10 μl auf einen Objektträger für die Inspektion unter einem Mikroskop.

4. Selektive Anreicherung von biotinylierten Proteinen

  1. Es werden 1 x 106 Zellen im korrekten Entwicklungsstadium geerntet, wie unter 3.4 beschrieben.
  2. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Lysepuffer.
  3. In einen Dounce-Homogenisator umfüllen und die Zellen mit 100 Stößelhüben lysieren.
  4. Das Lysat in zwei Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 21.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
  5. Äquilibrieren Sie Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen, indem Sie 20 μl (pro Probe) Pulswirbel-resuspendierte Bead-Aufschlämmung mit 1 mL des Lysepuffers in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen und 2 Minuten lang inkubieren.
  6. Entfernen Sie den Lysepuffer mit einem Magnetständer von den Kügelchen und suspendieren Sie ihn wieder in Lysepuffer.
  7. Wiederholen Sie Schritt 4.6.
  8. Den Lysepuffer entfernen und die äquilibrierten Kügelchen mit dem Überstand (geklärtes Lysat) aus Schritt 4.4 mischen.
    HINWEIS: Die optimalen Salzkonzentrationen und der prozentuale Anteil der Reinigungsmittel für die Bindung an die Kügelchen können unterschiedlich sein und müssen experimentell validiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, das Pellet aus 4,4 in 50 μl 2 % SDS für 10 min bei 60 °C zu inkubieren, um Proteine aus der unlöslichen Fraktion zu extrahieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 21.000 x g für 10 min. Fügen Sie diesen Extrakt zum geklärten Lysat und den Kügelchen hinzu.
  9. 1-2 h bei Raumtemperatur auf einem Röhrenrotator inkubieren.
  10. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz (<1s), um die gesamte Flüssigkeit auf den Boden des Röhrchens zurückzugewinnen, sammeln Sie die Kügelchen auf einem Magnetständer und ersetzen Sie dann den Überstand (Durchfluss) durch Waschpuffer 1.
  11. 5 Minuten auf einem Röhrenrotator inkubieren und dann wie in Schritt 4.10 für eine zweite Wäsche wiederholen.
  12. Tauschen Sie den Waschpuffer 1 gegen den Waschpuffer 2 gegen zwei weitere Waschgänge (Waschgang 3 und 4) aus.
  13. Tauschen Sie den Waschpuffer 2 gegen den Waschpuffer 3 für zwei Endwäschen (Waschgang 5 und 6) aus.
  14. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche die Kügelchen vor der Weiterverarbeitung bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Die Kügelchen können mit Laemmli-Puffer für die Western-Blot-Analyse eluiert und der Massenspektrometrie für eine On-Bead-Peptidpräparation zur Proteinidentifizierung unterzogen werden.

Ergebnisse

Unser Protokoll beschreibt ein vereinfachtes Verfahren zur Einführung einer kovalenten Biotinmodifikation in die Proteine in der Nähe eines Zielproteins in Paramecium (Abbildung 1A). Diese biotinylierten Proteine können dann mit Hilfe eines Streptavidin-Pulldowns weiter angereichert und mittels Massenspektrometrie identifiziert werden20. Um einen praktischen Anwendungsfall der Methode zu demonstrieren, haben wir das Protokoll auf das Nowa1-Protein angewendet. Dieses Protein ist essentiell für den genomischen Umlagerungsprozess und weist dynamische Veränderungen in seiner Lokalisation auf12. In den frühen Stadien verbleibt es im alten somatischen Kern und in den Fragmenten, aber später befindet es sich im neuen sich entwickelnden Kern. Bemerkenswert ist, dass unsere bisherigen Versuche einer Tag-vermittelten Anreicherung der Nowa1-interagierenden Proteine erfolglos waren (unveröffentlichte Ergebnisse). Dies war wahrscheinlich auf die komplexen Wiederholungen zurückzuführen, die Ähnlichkeit mit dem Prionprotein PrP27 aufweisen und unter nicht optimalen Bedingungen während des Pulldown-Verfahrens eine Selbstaggregation verursachen können21. Wir haben die Nowa1-kodierende Region zusammen mit ihrer stromaufwärts gelegenen nicht-kodierenden Region, die den Promotor enthält, PCR-amplifiziert. Das Produkt wurde dann in einen Frame mit einer Codon-optimierten turboID-Codierungssequenz (Abbildung 1B). Um transgeninduziertes Silencing zu vermeiden, das durch die Injektion von zirkulärer DNA in Paramecium, wurde der Vektor vor der Injektion linearisiert. Die linearisierte und gereinigte DNA wurde dann in den somatischen Kern (MAC) mikroinjiziert, wie in diesem Protokoll beschrieben. Ein dispergiertes Tröpfchen, das in der dunkleren Region des somatischen Kerns eingeschlossen war, wurde bei einigen der erfolgreichen Injektionen sichtbar (Abbildung 1C). Die erfolgreiche Injektion und die Amplifikation der DNA durch die Zellen während der Zellteilung wurden anschließend mittels PCR verifiziert. Erwartungsgemäß waren 40-50% der Zellen positiv für die injizierte DNA des Nowa1-Konstrukts (erwartete Produktgröße 685 bp) (Abbildung 2). Der nächste Schritt bestand darin, das Vorhandensein des Proteins zu überprüfen, das von der injizierten DNA kodiert wird. Da der Empfängervektor die turboID-Sequenz enthält, die von einem dreifachen HA-Tag flankiert wird, verwendeten wir Immunfluoreszenzfärbung, um den Tag nachzuweisen. Auf diese Weise konnten wir überprüfen, ob die injizierten Zellen das Fusionsprotein exprimieren und ob es richtig lokalisiert war. Wir verwendeten Zellen im späten Stadium, die eine Lokalisierung des Fusionsproteins in den beiden sich neu entwickelnden Zellkernen zeigten, wie sie zuvor für das Wildtyp-Protein Nowa1 beobachtet wurde12. Die einzelnen injizierten Zelllinien wiesen unterschiedliche Konzentrationen des Fusionsproteins (Abbildung 3). Ein niedrigeres Expressionsniveau kann für Anwendungen von Vorteil sein, bei denen ein reduzierter Hintergrund wünschenswert ist, aber in diesem Fall haben wir uns für das maximale Signal entschieden und mit Klon 2 fortgefahren, der die höchste Expression zeigte. Anschließend sammelten wir Proben aus verschiedenen Entwicklungsstadien, um die Lokalisation des Fusionsproteins zu verfolgen. Das Protein war in den frühen Stadien der Autogamie zunächst in den aus dem alten Körperkern gebildeten Strängen und in den abgetrennten Kernfragmenten lokalisiert. Nach dem Erscheinen der Kernanlagen ging das Fusionsprotein in Richtung dieser sich neu entwickelnden Kerne über (Abbildung 4). Um die Biotinylierung des proximalen Proteoms in den verschiedenen Stadien zu fördern, ergänzten wir die Kultur 2 h lang mit 500 μM Biotin, bevor wir die Zellen für IF ernteten. Wir haben die Biotin-markierten Proteine über eine IF-Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten Streptavidin visualisiert. Das beobachtete Signal entsprach der Lokalisation des HA-markierten Fusionsproteins. Wichtig ist, dass es möglich war, eine Biotinylierungslokalisation zu erhalten, die spezifisch für die verschiedenen Kernentwicklungsstadien ist, da bereits eine kurze Inkubation mit Biotin ausreicht, um eine signifikante Biotinylierung zu erreichen (Abbildung 4). Darüber hinaus war ohne die Zugabe von zusätzlichem Biotin nur eine vernachlässigbare Biotinylierung in den injizierten Zellen nachweisbar. In Wildtyp-Zellen führte die Zugabe von zusätzlichem Biotin zu keiner nachweisbaren Biotinylierung (Abbildung 5A). Bemerkenswert ist, dass sich das Biotin nicht nur im sich entwickelnden Zellkern ansammelte, da es auch unter denaturierenden Bedingungen an die Proteine gebunden bleibt. (Abbildung 5B). Mit Hilfe von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen war es möglich, die biotinylierten Proteine (Abbildung 6). Die angereicherten Proteine können mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. In diesen nachfolgenden Proteinidentifizierungsexperimenten können sowohl die nicht supplementierte Kultur als auch Zellen, die ein nicht fusioniertes turboID-Protein exprimieren, als Hintergrundkontrollgruppen verwendet werden.

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Abbildung 1: Überblick über das Verfahren zur Proximity-Biotinylierung bei P. tetraurelia. (A) Allgemeine Gliederung des Protokolls. (B) Klonierungsprinzip für den Plug-and-Play-turboID-Empfängervektor und das resultierende Konstrukt für das Nowa1-Fusionsprotein. Die in diesem Plasmid verwendete 3'UTR-Region leitet sich von CenH3a ab. (C) Sichtbares diffuses Tröpfchen, das nach erfolgreicher DNA-Injektion in dem dunkleren Bereich des somatischen Kerns (MAC) enthalten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: PCR-Test für erfolgreiche Injektion. Agarose-Gel-Analyse der PCR-Reaktion für ein Produkt mit einem Forward-Primer, der spezifisch für den Upstream-Bereich ist, der für die Ampicillin-Resistenz kodiert (AMP-Start), und einem Reverse-Primer, der zu Nowa1 komplementär ist. Die Pfeilspitze zeigt die erwartete Produktgröße an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunfluoreszenzfärbung zur Validierung der korrekten Lokalisierung des turboID-Fusionsproteins. Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-HA-Primärantikörpers (1:100) und eines Kaninchen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 568-Konjugositors (1:1000) von monoklonalen Paramecium-Linien mit einem positiven PCR-Signal für die DNA, die für ein Nowa1-HA-turboID-Fusionsprotein kodiert. Skala 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Nowa1-spezifische Biotinylierung in verschiedenen Entwicklungsstadien. Immunfluoreszenzfärbung der monoklonalen Linie 2 in fortschreitenden Stadien während der Bildung des neuen somatischen Kerns. Das Kulturmedium wurde mit 500 μM Biotin ergänzt, um eine optimale TurboID-Aktivität zu gewährleisten. Der HA-Tag wurde wie in Abbildung 3 nachgewiesen, und Biotin wurde mit Streptavidin-FITC (1:200) nachgewiesen. Skala 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Für eine effiziente Proximity-Markierung mittels turboID ist zusätzliches Biotin in der Kultur erforderlich. (A) Immunfluoreszenzfärbung von wt- und injizierten Zellen im späten Entwicklungsstadium mit der Expression von Nowa1-HA-turboID und der beobachteten Biotinylierung mit 500 μM zusätzlichem Biotin. HA-Tag und Biotin wurden wie in Abbildung 4 nachgewiesen. Skala 20 μm. (B) Western-Blot-Analyse auf Biotin unter Verwendung von HRP-Streptavidin von wt-Zellen, die mit 500 μM Biotin kultiviert wurden, und turboID-injizierten Zellen mit und ohne Biotin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Anreicherung von biotinylierten Proteinen mit Streptavidin-Magnetkügelchen. Western-Blot-Analyse auf Biotin von Proben aus einem Pulldown-Experiment mit Streptavidin-beschichteten Magnetbeads. Bei den Proben handelt es sich um: Nowa1-HA-turboID-Zelllysat (Input), die ungebundene Fraktion (Flowthrough), die Waschschritte (Wash 1-6) und die an die Kügelchen gebundenen Proteine (Output). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Anhängen einer Biotin-Einheit an die Proteine in der Nähe des interessierenden Proteins. Aufgrund der starken Affinität von Streptavidin zu Biotin ermöglicht dies eine schnelle und effiziente Anreicherung der modifizierten Proteine. In Kombination mit der schnellen Anpassungsfähigkeit für verschiedene Proteine von Interesse kann die vorgestellte Methode die Untersuchung von Multiprotein-Wechselwirkungen in Paramecium erleichtern. Dieser Modellorganismus ist gut etabliert für die Erforschung der Transposon-Wirt-Wechselwirkungen während der meiotischen Fortpflanzung3. Darüber hinaus könnte es neuartige molekulare Werkzeuge für die präzise Genom-Editierung bieten, da es während seiner programmierten genomischen Umlagerungen mehr als 45.000 Sequenzen herausschneidet. Der Prozess wird von einer komplexen Mehrkomponenten-Maschinerie orchestriert, die eine präzise RNA-gesteuerte Exzision dieser DNA-Fragmente mit einer reproduzierbaren Spaltstelle über jede Generation ermöglicht. Die hier vorgestellte Methode bietet zwei große Vorteile, um diesen Prozess zu untersuchen. Es vereinfacht die Entdeckung transienter Protein-Protein-Wechselwirkungen. Darüber hinaus ermöglicht der Plug-and-Play-Empfängervektor die schnelle Herstellung vieler funktioneller Fusionsproteine. Da wahrscheinlich mehrere Faktoren in verschiedenen Stadien an dem Prozess beteiligt sind, ermöglicht die Anpassungsfähigkeit die Aufdeckung der Interaktome vieler Proteine, die Teil der Exzisionsmaschinerie sein könnten. Wichtig ist, dass die Fusionskonstrukte vom Promotor des endogenen Gens exprimiert werden und daher eng mit dem nativen Expressionszeitverlauf übereinstimmen. Darüber hinaus ermöglicht die nachgewiesene Verwendung von Mikroinjektion zur Abgabe von exogenem genetischem Material an diesen Modellorganismus die Erzeugung homogener monoklonaler Populationen. Solche Populationen ermöglichen eine synchronere Initiierung des Autogamie-Prozesses, bei dem die Entwicklung eines neuen somatischen Kerns stattfindet.

Während das demonstrierte Verfahren zur Einführung der turboID-Fusionskonstrukte robust ist, könnte in den nachgeschalteten Proteinanreicherungsprotokollen aufgrund des Mechanismus der Biotinylierung eine spezifische Optimierung erforderlich sein. Da das fusionierte turboID-Enzym reaktive Biotin-AMP-Einheiten erzeugt, die vom Enzym weg diffundieren, können diese möglicherweise mit jeder nukleophilen Einheit in der Umgebung reagieren. Ein wesentlicher Schritt in dieser Methodik ist daher die Identifizierung der wahren Interaktionspartner aus den Hintergrundtreffern und aus den Proteinen, die in der allgemeinen Umgebung des turboID-Fusionsproteins lokalisiert sind und nicht die eigentlichen Interaktionspartner sind. Um dies zu erreichen, kann eine Variation von Parametern angepasst werden, wie z.B. die Dauer der Inkubation mit Biotin16. Darüber hinaus könnte ein Versuchsaufbau, der eine Kontrollgruppe ohne zusätzliches Biotin im Medium umfasst, auf die Hintergrundbindung hinweisen. Wie gezeigt, ist eine solche Kontrollgruppe genetisch identisch mit dem eigentlichen Experiment, aber die Biotinylierung durch turboID ist aufgrund der geringen Abundanz von Biotin stark reduziert. Weitere wichtige Kontrollgruppen könnten ein nicht fusioniertes turboID-Protein sowie eine Wildtyp-Gruppe umfassen, die beide in dem mit Biotin supplementierten Medium kultiviert werden. Auch wenn die starke Affinität von Streptavidin zu Biotin ein signifikanter Vorteil gegenüber antikörperbasierten Pulldowns ist, dürften unterschiedliche Salz- und Detergenzkonzentrationen einen Einfluss auf die Reinheit und Effizienz der Anreicherung haben.

Überlegene proteomische Ansätze könnten unser Verständnis der einzigartigen molekularen Maschinerie von Paramecium und möglicherweise auch von anderen Ciliaten verbessern. Molekulare Komponenten mit neuartigen Funktionen versprechen, als Werkzeuge in der synthetischen Biologie umfunktioniert zu werden und könnten so biotechnologische Entwicklungen fördern22,23. Gentechnisch hergestellte synthetische Proteine bestehen oft aus Kombinationen von funktionellen Domänen mit neuartigen Eigenschaften, die bisher unpraktikable therapeutische Anwendungen ermöglichen. Gentechnisch hergestellte Proteine können auch in pharmazeutischen Produktionsprozessen Anwendung finden24. Das RNA-gerichtete Genom-Exzisionssystem aus Paramecium ist für solche Entwicklungen von besonderem Interesse. Dieses System erreicht die RNA-abhängige Exzision von Tausenden von DNA-Fragmenten mit einer Genauigkeit bis zum Einzelnukleotid25. Solche Parameter machen es interessant, die Genauigkeit der Genom-Editierung in menschlichen Zellen zu verbessern. Die vorgestellte Proximity-Biotinylierungsmethode kann verwendet werden, um die Entdeckung neuartiger Proteinkomponenten und ihrer Wechselwirkungen innerhalb molekularer Multiproteinmaschinen zu beschleunigen und zu fördern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein DigiK-Stipendium der Universität Bern und ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds finanziert 229074 an B.-A.S. und das Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds 214853 an M.N. vergeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mikroskop Axiovert 40 CFL (10x, 40x Objektive)ZeissNa
B-SitosterolSigma Aldrich567152
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma AldrichNr. A9647
CellTram ÖlEpendorfNa
Codon-optimierte 3xHA-turboID DNA-SequenzTwist BiowissenschaftenNaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
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DAPISigma AldrichNr. D9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
epT.I.P.S. Microloader-TippsEpendorf5242956003
EthanolGrogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfNa
Femtotip IIKaliber Wissenschaftlich5242957000
Formaldehyd-LösungSigma AldrichNr. F8775
GlycinAppliChem10021259
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificNr. A-11011
HA-Tag (C29F4) Kaninchen mABZell-Systeme3724
InjectMan NI 2EpendorfNa
leicht mittelNaNa0,2x Weizengraspulverlösung in 2,5 mM Na2HPO4
MineralölSigma AldrichM8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
Phenol-Chloroform-IsoamylalkoholSigma Aldrich77617
phosphorgepufferte Kochsalzlösung Fischer Scientific10722497
Plasmid plus Midiprep-KitQiagene12945
Reichhaltiges MediumNaNa1x Weizengraspulverlösung in 2,5 mM Na2HPO4
Streptavidin-FITCThermo Fisher Scientific11-4317-87
Ultrafree-MC GV Zentrifugalfilter EMD MiliporeUFC30GV00
WaschlösungNaNa0,1 % BSA in Volvic Wasser 
Weizengras-PulverlösungKiefern internationalNaAls 20x Brühe aus dem Pulver wie zuvor beschrieben zubereiten (0,5g/10mL)
Streptavidin-HRPABCAMAB7403
Streptavidin-beschichtete Magnatics-KügelchenSigma AldrichLSKMAGT02
Lysepuffer für den PulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Natriumdesoxycholat; 1 % Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete Proteasehemmer (Roche);  
Waschpuffer 1 für PulldownNaNa50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Natriumdesoxycholat; 1 % Triton X-100; 5 mM MgCl2;
Waschpuffer 2 für PulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2
Waschpuffer 3 für PulldownNaNa10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl;

Referenzen

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