Diese Arbeit konzentriert sich auf die in vivo subkutane Induktion von lumineszierenden kolorektalen Karzinomzellen in einem Mausmodell und die anschließende Lumineszenzmessung mit Hilfe eines bildgebenden Systems. Das Verfahren zielt darauf ab, ein reproduzierbares Tumorwachstumsmodell für das Echtzeit-Monitoring und die therapeutische Bewertung zu etablieren.
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Methodenartikel
Subkutane Injektion von humanen Darmkrebszellen in athyme Nacktmäuse zur Bewertung der Wirksamkeit von Antitumoren
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen weltweit, was den dringenden Bedarf an verbesserten präklinischen Modellen zur Bewertung potenzieller Therapien unterstreicht. Tiermodelle sind unerlässlich, um die Tumorbiologie aufzuklären und neue therapeutische Interventionen zu bewerten. Mausmodelle bieten entscheidende Vorteile gegenüber bestehenden Modellen, darunter genetische Manipulierbarkeit, schnelle Reproduktion, Kosteneffizienz und die Verfügbarkeit von immunkompetenten und immundefizienten Stämmen, die eine präzise Modellierung menschlicher Krebserkrankungen ermöglichen.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die subkutane Induktion der biolumineszierenden kolorektalen Karzinomzelllinie HCT-116 in einem immundefizienten Mausmodell, gefolgt von einer nicht-invasiven Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS-System und dem Messschieber zur Überwachung der Tumorprogression und des Tumorwachstums. Die Verwendung von lumineszierenden Zellen bietet einen quantifizierbaren Echtzeit-Ansatz zur Verfolgung der Tumorentwicklung und des Ansprechens auf therapeutische Eingriffe, wodurch der Bedarf an invasiven Verfahren reduziert wird. Für die Implantation von Tumorzellen wird eine Kohorte von Mäusen (n = 12) benötigt, und die Lumineszenzintensität wird gemessen, um ein standardisiertes Modell für therapeutische Tests zu etablieren. Das Tumorvolumen wird in der Regel nur anhand von Längen- und Breitenmessungen oder der Breite berechnet.
Die derzeitige Methodik gewährleistet eine konsistente Tumoretablierung bei gleichzeitiger Minimierung der Variabilität, was letztendlich die Zuverlässigkeit der präklinischen Beurteilung erhöht. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, Tumormodelle für die Wirkstofferprobung zu verfeinern und das translationale Potenzial der präklinischen Forschung in der klinischen Anwendung zu verbessern. Durch den Einsatz fortschrittlicher bildgebender Verfahren und eines reproduzierbaren Versuchsdesigns zielt diese Studie darauf ab, die Genauigkeit und Effizienz der In-vivo-Arzneimittelbewertung für die Behandlung von Darmkrebs zu verbessern.
Einleitung
Darmkrebs (CRC) ist eine große globale Gesundheitsbelastung und gehört zu den häufigsten und tödlichsten bösartigen Erkrankungen1. Die Entwicklung zuverlässiger präklinischer Modelle ist für die Evaluierung neuer Therapieansätze von entscheidender Bedeutung, da herkömmliche In-vitro-Assays die Komplexität des Tumorwachstums und des Ansprechens auf Medikamente in einem lebenden System nicht vollständig erfassen. In-vivo-Modelle , insbesondere Mausmodelle, wurden verwendet, um wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie zu liefern und es den Forschern zu ermöglichen, die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen in einer kontrollierten Umgebung zu bewerten.
Die Verwendung von lumineszierenden Darmkrebszellen in Mausmodellen stellt einen bedeutenden Fortschritt in der präklinischen Forschung dar und ermöglicht eine nicht-invasive Überwachung der Tumorprogressionin Echtzeit 2. Ziel dieser Studie ist es, ein standardisiertes Protokoll für die subkutane Tumorinduktion und IVIS-Bildgebung zu etablieren, um das Tumorwachstum dynamisch zu verfolgen. Ein subkutanes Injektionsmodell wurde aufgrund seiner technischen Einfachheit, Reproduzierbarkeit und einfachen longitudinalen Tumorüberwachung ausgewählt. Durch den Einsatz von Biolumineszenz-Bildgebung können Forscher präzise, quantifizierbare Daten über die Tumorentwicklung und das therapeutische Ansprechen erhalten, ohne dass Tiere zu mehreren Zeitpunkten eingeschläfert werden müssen3.
Das IVIS-Bildgebungssystem ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der Tumorlast mit hoher Sensitivität und Spezifität und verbessert die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von In-vivo-Studien . Diese Studie wird als Grundlage für zukünftige therapeutische Evaluierungen dienen und einen standardisierten und effizienten Ansatz für präklinische Arzneimitteltests zur Behandlung von Darmkrebs bieten. Durch die Verfeinerung von Tumorinduktionsmethoden und die Implementierung fortschrittlicher bildgebender Verfahren trägt diese Forschung dazu bei, die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Anwendungen in der Onkologie zu schließen4.
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Protokoll
Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der Ethikkommission des Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria (IMIB, Murcia) (Nr. A13240502) unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen gehalten. Die Inspektionen wurden wöchentlich von qualifiziertem Personal gemäß R. D. 1201/2005 durchgeführt.
1. Tiere
HINWEIS: Alle Tiere müssen vor der Injektion sicher und geschützt fixiert werden. Bei der Arbeit mit immundefizienten Mäusen (d. h. nackten athymen Mäusen wie Crl: NU(NCr)-Foxn1nu) ist es wichtig, die Sterilität aufrechtzuerhalten. In der aktuellen Studie wurden zu Beginn des Experiments 12 athyme Nacktmäuse verwendet, die 5 Wochen alt waren (20-22 g für Weibchen und 22-26 g für Männchen) (50% Männchen). Alle Anästhesien und experimentellen Verfahren wurden in der Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación des Zentrums durchgeführt, mit Genehmigung der institutionellen Ethikkommission (Protokoll Nr. A13240502) und in Übereinstimmung mit der spanischen Gesetzgebung (R.D. 1201/2005).
- Vor Beginn des Assays akklimatisieren Sie die Mäuse im Alter von 4 Wochen etwa 1 Woche lang an das Tierzentrum. Führen Sie anschließend die folgenden Verfahren aus.
2. Zubereitung der D-Luciferin-Stammung
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung von 15 mg/ml D-Luciferin-Kaliumsalz-Biolumineszenzsubstrat in vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem konischen Röhrchen in einer Biosicherheitswerkbank vor. Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um die Lösung gut zu homogenisieren.
- Die Lösung zur Sterilisation durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter leiten.
- Aliquotieren Sie die sterilisierte Lösung in 1 mL undurchsichtigen Mikroröhrchen und lagern Sie sie bei -20 °C.
HINWEIS: Luciferin ist lichtempfindlich.
3. Vorbereitung der extrazellulären Matrix
- Tauen Sie phenolrotfreies kommerzielles Hydrogel der extrazellulären Matrix (ECM) über Nacht auf Eis in einem Kühlschrank zwischen 2 °C und 8 °Cauf 5.
- Bewahren Sie die EZM am Tag der Injektion auf Eis auf und aliquotieren Sie mit einer vorgekühlten P1000-Mikropipette 200 μl EZM in sterile Röhrchen.
HINWEIS: Es wird empfohlen, Mikroröhrchen mit breiter Bohrung zu verwenden. Minimieren Sie Temperaturänderungen und vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. - Kühlen Sie die Spritzen und Nadeln vor der Vorbereitung der Injektionen auf Eis vor, um plötzliche Temperaturänderungen der ECM zu vermeiden.
4. Zellablösung und -zählung
- HCT-116-Biolumineszenzzellen (ATCC-Zelllinie CCL-247-LUC2) einige Tage vor der Tumorinduktion in T75-Kolben plattieren, um eine ausreichende Zellzahl sicherzustellen. Halten Sie die Zellkultur bei 37 °C, 5 % CO2 und ersetzen Sie bei Bedarf das Medium6.
- Am Tag des Experiments ist das Kulturmedium vorsichtig zu aspirieren, um adhärente Zellen nicht zu stören.
- Waschen Sie die Zellen mit 8 mL sterilem PBS (vorgewärmt auf 30 °C in einem Wasserbad), um Serumreste zu entfernen.
- 2 ml warmes Trypsin-EDTA (0,05%) pro Kolben zugeben und bei 37 °C 4-5 min inkubieren. Überwachen Sie die Zellablösung unter einem inversen Mikroskop. Wenn Zellen noch anhaften, klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um die Ablösung zu erleichtern.
- Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 10 ml vollständiges Wachstumsmedium hinzufügen, das fötales Rinderserum (FBS) enthält.
- Übertragen Sie die Zellen mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie die Kolben mit zusätzlichen 2 ml frischem Medium, um alle verbleibenden Zellen aufzufangen, und geben Sie die Waschungen in das 15-ml-Röhrchen.
- Die Zellsuspension wird bei 200 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 3 mL Saatmedium, um eine homogene Suspension zu erhalten.
- Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer oder einem automatischen Zellzähler. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen, indem Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau mischen und lebensfähige Zellen unter einem inversen Mikroskop zählen.
HINWEIS: Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Studie vor: mindestens 3 × 106 lebensfähige Zellen pro Maus. - Resuspendieren Sie die Zellen in sterilem PBS (vorgewärmt auf 30 °C im Wasserbad) und modifizieren Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen auf eine Endkonzentration von 2 × 107 Zellen/ml mit PBS. Bereiten Sie Aliquots von 200 μl vor.
5. Stellen Sie Ausrüstungsgegenstände auf und betäuben Sie die Tiere.
- Schalten Sie das Imaging-System mindestens 4 Stunden vor dem Imaging ein.
HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Systems, um den Initialisierungsschritt zu ermöglichen, einschließlich der Anpassung der Einstellungen für die Lichtintensität und die Belichtungszeit der Kamera in Abhängigkeit vom Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Einstellung muss basierend auf den Versuchsbedingungen manuell festgelegt werden. - Wiegen Sie die Tiere und berechnen Sie das Volumen an D-Luciferin, das verabreicht werden muss (200 μl einer 15 mg/ml-Lösung pro 20 g des Tieres).
- Reinigen und desinfizieren Sie die Bildgebungskammern und den Schrank.
- Identifizieren und fixieren Sie jede Maus sicher für die Anästhesie.
HINWEIS: Tragen Sie zwei Paar Handschuhe, um die Hände während der subkutanen Injektion vor versehentlichen Nadelstichen zu schützen. - Betäuben Sie Mäuse mit 2% Isofluran in Sauerstoff bei 1,8-2,0 l/min Durchfluss. Schalten Sie die Absaugpumpe gleichzeitig mit der Anästhesiepumpe ein.
6. Vorbereitung der Zellen für die Injektion
- Mischen Sie 200 μl 2 × 107 biolumineszierende Darmkrebszellen/ml mit 200 μl ECM in einem Kryofläschchen in einer Biosicherheitswerkbank. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer P1000-Pipette, um die Bildung von Luftblasen und Dissoziation zu vermeiden.
- Übertragen Sie das 400-μl-Gemisch in eine 1-ml-Spritze, entfernen Sie die Luftblasen und fahren Sie sofort mit der Injektion fort.
- Lösen Sie die Kappe sicher und behalten Sie dabei immer die Sterilität der Nadel bei.
HINWEIS: Es wird empfohlen, für jedes Tier individuelle Nadeln zu verwenden, um die Kontamination zu minimieren. Für jede Maus wird eine neue Nadel verwendet, um eine Infektion zwischen Mäusen zu verhindern. - Setzen Sie eine 25-G-Nadel auf und stellen Sie den Spritzeninhalt auf 200 μl ein, wobei Sie alle Luftblasen entfernen.
HINWEIS: Injektionen werden in der Regel mit 200 μl durchgeführt, was zu 2 × 106 Zellen pro Injektion führt. - Schieben Sie die Nadel locker zurück in die Kappe, ohne die Kappe oder die Nadel zu berühren, während das Tier festgehalten wird.
7. Subkutane Tumorinduktion
- Nehmen Sie die Maus aus der Kammer, sobald sie betäubt ist, und legen Sie die Schnauze des Tieres in eine Steckdose, die das gleiche Betäubungsmittel liefert.
HINWEIS: In unserem Fall wurde die Düse mit einem Handschuh hergestellt. - Legen Sie das Tier mit der rechten Seite auf eine ebene Fläche. Mit den Fingerspitzen der nicht dominanten Hand die Haut des Tieres im unteren linken Quadranten vorsichtig zusammendrücken und anheben.
- Vor der Injektion zuerst aspirieren, um die richtige Platzierung der Nadel sicherzustellen. Führen Sie die Nadel mit der dominanten Hand zu zwei Dritteln parallel zum Körper in die angehobene Haut ein und achten Sie dabei sehr darauf, dass Sie sich nicht in die Finger stechen oder die Doppelhandschuhe durchstechen.
HINWEIS: Bei richtiger Platzierung sollte ein Unterdruck und keine Aspiration in der Nabe der Nadel entstehen. - Injizieren Sie den Inhalt der Spritze (200 μl) direkt zwischen den beiden Fingern in die angehobene Haut. Halten Sie die Nadel kurz fest, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Entfernen Sie die Nadel nach der subkutanen Injektion und entsorgen Sie sie sicher in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
8. Intraperitoneale Injektion von D-Luciferin
- Bevor Sie das Tier in die Anästhesiekammer zurückbringen, verabreichen Sie D-Luciferin intraperitoneal (IP) in einer Konzentration von 150 mg/kg Körpergewicht mit der 15 mg/ml-Stammlösung in einer 30-g-Insulinspritze (200 μl pro 20 g des Tieres).
HINWEIS: Eine Injektion von bis zu 0,5 ml wird gut vertragen. - Manuelle Fixierung, Rückenlage (Bauchseite nach oben), mit dem Schädelende (Kopf) des Tieres nach unten. Lassen Sie den Darminhalt nach unten wandern.
- Halten Sie die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben und leicht abgewinkelt um 15-20° und schieben Sie die Nadel so in die Bauchhöhle, dass die Spitze der Nadel gerade die Bauchdecke des linken unteren Bauchquadranten des Tieres durchdringt.
- Injizieren Sie das D-Luciferin langsam in die intraperitoneale Höhle, entfernen Sie die Nadel und entsorgen Sie sie sicher.
- Legen Sie die Maus in die Anästhesiekammer und lassen Sie sie ca. 5 Minuten lang stabilisieren. Fahren Sie nach 15 Minuten mit der In-vivo-Bildgebung fort.
HINWEIS: Erstellen Sie für jedes neue Tiermodell eine kinetische D-Luciferin-Kurve, um die Spitzensignalzeit zu bestimmen. In unserem Fall erreichte die Lichtemission in der In-vivo-Bildgebung einen Spitzenwert von etwa 15 Minuten.
9. In-vivo-Bildgebungsanalyse
- Platzieren Sie das vollnarkotisierte Tier in der Kammer des bildgebenden Systems an der rechten Flanke. Stellen Sie sicher, dass das Tier richtig auf die Kamera und die Lichtquelle ausgerichtet ist, um den Tumorbereich zu erfassen.
- Öffnen Sie die verknüpfte Software. Wählen Sie den visuellen oder fotografischen Bildgebungsmodus , um die Position des Tieres zu bestätigen. Speichern Sie die Daten und ändern Sie den Namen des Ordners.
- Wählen Sie den Biolumineszenz-Bildgebungsmodus und stellen Sie ihn auf automatisch. Nehmen Sie Biolumineszenzbilder auf und überwachen Sie das Tumorlicht auf dem Computerbildschirm.
- Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und beobachten Sie etwaige Komplikationen.
- Führen Sie die Nachbearbeitung durch und skalieren Sie zuerst das Biolumineszenzlicht, so dass alle Mäusetumoren die gleiche Skala aufweisen, normalerweise zwischen 1e6 und 1e8.
- Richten Sie eine Region of Interest (ROI) um den Tumor für die Analyse ein und kopieren Sie diese für weitere Analysen. Messen Sie das Licht des ROI und exportieren Sie diese Ergebnisse zur weiteren Analyse. Fügen Sie zuvor erstellte und kopierte ROI in gleicher Größe für nachfolgende Tumoren ein.
- Fahren Sie das System gemäß den Anweisungen des Herstellers herunter und reinigen Sie die Bildgebungskammer. Schalten Sie die Extraktions- und Anästhesiepumpen zusammen mit dem Sauerstofffluss aus.
10. Messung des Tumorvolumens
- Betäuben Sie Tiere mit Isofluran zur Tumormessung. Bringen Sie das Tier in eine stabile Position und bedecken Sie den Kopf. Setzen Sie das Tier schnell ruhig.
- Messen Sie die Länge, Breite und Tiefe des Tumors mit einem kalibrierten digitalen Messschieber.
HINWEIS: Führen Sie die Messungen schnell durch, da das Tier etwa 1 Minute nach der Entnahme aus der Anästhesiekammer zu erwachen beginnt. - Wiederholen Sie die Messungen und berechnen Sie einen Mittelwert.
- Berechnen Sie das Volumen nach der Formel für sphärische oder elliptische Tumoren:
Bei sphärischen Tumoren 7
(1)
Bei Ellipsoidtumoren 8
(2)
HINWEIS: Um Messverzerrungen zu minimieren, sollten alle Tumormessungen innerhalb der Studie von demselben Bediener durchgeführt werden. Darüber hinaus ist zu beachten, dass am Tag der Tumorinduktion eine genaue Messung oft eine Herausforderung darstellt, da die Tumormasse noch nicht vollständig verfestigt ist.
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Ergebnisse
Dieses Protokoll ermöglicht die Einführung menschlicher Zellen in ein immundefizientes Mausmodell, was das Wachstum dieser Tumorzellen in vivo ermöglicht, was physiologisch immer relevanter ist als in vitro. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen so reproduzierbar wie möglich sind, dass Tumore eine ähnliche Anzahl lebensfähiger Zellen enthalten und dass sie an einer vergleichbaren und konsistent zugänglichen Stelle implantiert werden.<...
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Diskussion
Das Protokoll für die subkutane Induktion von lumineszierenden kolorektalen Karzinomzellen in einem athymischen Nacktmausmodell stellt einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz für die Tumorbildung und das Echtzeit-Monitoring dar. Zunächst ist es wichtig zu beachten, dass solche Studien in der Regel über 28 Tage durchgeführt werden, wobei Lumineszenzmessungen am Tag der Tumorinduktion und anschließend wöchentlich durchgeführt werden. Umgekehrt werden Messschiebermessungen des Tu...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in dieser Studie berichtete Arbeit beeinflussen könnten.
Danksagungen
ACS und CNN gehören dem "Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spain" an und halten PhD-Stipendien der UCAM. Die Autoren danken den Animal Facility Plattformen des IMIB (Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcia), wo der präklinische Assay durchgeführt wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-mL undurchsichtige Mikroröhrenröhren | Eppendorf | 30125215 | D-Luziferin-Speicherung |
| 15 mL konische Röhre | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | Zellkulturmaterial |
| Fortgeschrittenes Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | Zellkulturreagenz |
| Athymische Nackte Maus | Charles River | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | Immundefekte nackte Maus |
| Biolumineszente menschliche Darmkrebszellen HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 ist ideal für Biolumineszenz in vivo |
| D-luciferin Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | Zur Biolumineszenzmessung |
| Extrazelluläre Matrix (ECM) | Corning | 356231 | Matrigelmatrix für Zellinvasion |
| Fetales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Zellkulturreagenz |
| Filterpipettenspitzen | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden |
| Insulinspritze 25 G 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | Für die Implantation einer HCT-116-Zelllinie |
| Insulinspritze 30 G 0,5 mL | DH Material Medico | 9.41652E+15 | Für die Verabreichung von D-Luziferin |
| IVIS-Bildsystem mit Living Image-Software | PerkinElmer/Revvity | 128201 | Biolumineszenz- und Fluoreszenzbildscanner |
| Nadelsterikanisches Heparin | VWR | 612-0153 10 | Verabreichung von D-Luziferin und HCT-116-Implantation |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | VWR | 392-0042P | Zellsuspensionslösung für die Ablösung und Implantation von HCT-116 |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | Zellkulturreagenz |
| T-75 Kolben, TC-behandelt | STARLAB | CC7682-41 | Zellkulturmaterial |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
