Method Article

Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

DOI:

10.3791/68529

⸱

August 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Stem Cell and Regenerative Biology, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2Division of Pulmonary and Allergy Medicine, Department of Internal Medicine, Chungnam National University Hospital, 3Department of Physics, KAIST, 4KAIST Institute for Health Science and Technology, KAIST, 5Tomocube Inc., 6Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die hochauflösende, markierungsfreie und dreidimensionale Bildgebung von Organoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie vor. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Organoidkulturen, die Aufnahme von Bildern und die computergestützte Bildanalyse und ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der strukturellen Dynamik und des Wirkstoffansprechens in lebenden Organoiden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die genaue, markierungsfreie Bildgebung von Darmorganoiden ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Morphologie, Wachstumsdynamik und Reaktionen auf Umweltreize. Die Holotomographie (HT) ermöglicht eine hochauflösende, dreidimensionale (3D) Visualisierung lebender Organoide ohne Fluoreszenzmarker, wodurch die Phototoxizität minimiert und die Integrität der Probe erhalten bleibt. Die phasenbasierte Bildgebung in Echtzeit ermöglicht eine kontinuierliche, markierungsfreie Verfolgung von strukturellen und funktionellen Veränderungen. Durch die Verwendung des Brechungsindex als intrinsischer bildgebender Kontrast ermöglicht diese Methode die Quantifizierung biophysikalischer Eigenschaften wie Volumen, Proteindichte und Proteingehalt. Die Bildgebungsdaten werden durch auf maschinellem Lernen basierende Segmentierung und Merkmalsextraktion weiterverarbeitet, um eine konsistente Analyse mit hohem Durchsatz zu unterstützen. Dieses Protokoll beschreibt den vollständigen experimentellen Arbeitsablauf für den Einsatz von HT mit geringer Kohärenz in der Organoidforschung, einschließlich der Organoidpräparation, der Bildaufnahme und der auf maschinellem Lernen basierenden Datenanalyse. Durch die Integration von computergestützter Segmentierung und quantitativen Bewertungen ermöglicht dieser Ansatz eine unvoreingenommene Bewertung der wichtigsten Eigenschaften von Organoiden, einschließlich der Lebensfähigkeit, der strukturellen Organisation und des Ansprechens auf das Ansprechen auf das Medikament. Die Fähigkeit, morphologische Veränderungen in Echtzeit mit subzellulärer Auflösung zu erfassen, macht dieses Protokoll sehr gut anwendbar für organoidbasierte Studien in der regenerativen Medizin, der Krankheitsmodellierung und dem pharmazeutischen Screening. Die hier skizzierte Schritt-für-Schritt-Methodik erleichtert die Reproduzierbarkeit und breite Anpassung über verschiedene Organoidsysteme hinweg.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoide sind dreidimensionale (3D) miniaturisierte Versionen von Organen, die aus Stammzellen gezüchtet wurden und in der Lage sind, wichtige strukturelle und funktionelle Merkmale realer Organe in vitro zu rekapitulieren 1. Forscher haben Organoidsysteme für eine Vielzahl von Geweben entwickelt - darunter Darm, Gehirn, Lunge, Leber und Niere - und jedes zeigt die selbstorganisierende Architektur und die Zelltypvielfalt, die an sein In-vivo-Gegenstück erinnert. Durch die Spiegelung der nativen Organarchitektur und der multizellulären Komplexität dienen Organoide als leistungsfähige Modellsysteme für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung, der Geweberegeneration und der Krankheitsmechanismen1. Sie sind zu zentralen Werkzeugen für die Modellierung von Krankheiten und die Wirkstoffforschung geworden und ermöglichen es Forschern, Krankheitswege zu erforschen und neue Therapeutika an patientenspezifischen 3D-Geweben im Labor zu testen2. Bemerkenswert ist, dass Organoide auch in der regenerativen Medizin vielversprechend sind3: Aus Organoiden gewonnene Gewebe können in vivo transplantiert werden, um Schäden zu reparieren, wie bei Darm- und Leberorganoiden gezeigt wurde, was ihr Potenzial zur Wiederherstellung der Organfunktion unterstreicht4. Diese Vielseitigkeit macht Organoide in der modernen biomedizinischen Forschung und personalisierten Medizin unverzichtbar.

Angesichts ihrer mehrzelligen Zusammensetzung und 3D-strukturellen Komplexität ist die Erfassung und Analyse der Organoiddynamik von entscheidender Bedeutung. Herkömmliche bildgebende Verfahren stoßen jedoch bei der Auflösung von Organoidstrukturen und -dynamiken an erhebliche Grenzen und erzeugen oft 2D-Schnappschüsse, die ihren vollständigen physiologischen Zustand nicht darstellen5.

Die Hellfeldmikroskopie ist eine weit verbreitete, nicht-invasive Methode zur Erfassung von Organoiden. Es überwacht bequem das Wachstum und die Morphologie, bietet aber einen begrenzten Kontrast in ungefärbten 3D-Proben. Darüber hinaus fehlt es an optischen Schnitten, was zu einer schlechten Auflösung der internen Strukturen führt. Organoide erscheinen weitgehend transparent, was die Detektion feiner Strukturen unter der Oberfläche erschwert6. Der Phasenkontrast verbessert die Sichtbarkeit, indem er Phasenverschiebungen in Intensitätsunterschiede umwandelt und die allgemeine Architektur (z. B. ein zentrales Lumen) ohne Flecken sichtbar macht. Trotz seiner Nützlichkeit für die Echtzeitbeobachtung leidet der Phasenkontrast unter Halo-Artefakten, geringer Auflösung und begrenzter Eindringtiefe, was ihn für dickere Organoide weniger effektiv macht7.

Die serielle Schnittierung, gefolgt von Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und antikörperbasierter Immunfärbung, wird häufig zur Analyse der Mikrostruktur und der zellulären Zusammensetzung von Organoiden eingesetzt8. Verbesserte Gewebeverarbeitungstechniken, wie z. B. formalinfixierte Paraffineinbettung (FFPE) und Kryosektionen, verbessern die Erhaltung der Morphologie, wobei FFPE hervorragende Ergebnisse liefert9. Durch die Einbettung von Organoiden in Hydrogele wie Agarose und Zentrifugation werden mehrere Proben in einem einzigen Abschnitt ausgerichtet, wodurch die Analyseeffizienz verbessert wird. H&E-gefärbte Schnitte von patienteneigenen Tumororganoiden spiegeln die ursprüngliche Tumorhistologie wider, während die Immunfluoreszenzfärbung Marker wie CK8 für die Zellidentifizierung hervorhebt10. Diese Techniken können jedoch lebende Organoide nicht überwachen und können Artefakte wie Gewebefaltenbildung oder Verformungen während des Schnitts verursachen.

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wird häufig für die Organoid-Bildgebung verwendet und liefert hochauflösende optische Schnitte (im Submikrometerbereich), die eine detaillierte Visualisierung der Organoidarchitektur und der zellulären Zusammensetzung ermöglichen11,12. Die konfokale Bildgebung von 3D-Organoiden ist jedoch in der Regel auf oberflächliche Schichten (bis zu 100 μm Tiefe) beschränkt und kann aufgrund der Punktscanning-Laserbeleuchtung zeitaufwändig und phototoxisch sein13. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) überwindet einige dieser Einschränkungen, indem sie nur die Bildgebungsebene beleuchtet und so eine schnelle volumetrische Bildgebung ganzer Organoide mit minimalem Photobleaching und Phototoxizität ermöglicht14,15; Diese Technik erfordert jedoch häufig eine Gewebereinigung, um eine optimale Bildgebung dicker Proben zu ermöglichen. Darüber hinaus wird die LSFM-Abbildungstiefe durch Lichtstreuung und Fehlanpassungen des Brechungsindex (RI) eingeschränkt, die durch adaptive Optik, Multi-View-Bildgebung und optimierte Anregungswellenlängen gemildert werden können16. Die Probeneinbettung führt auch zu strukturellen Verformungen, während große 3D-Datensätze rechentechnische Herausforderungen bei der Speicherung und Analyse darstellen. Jüngste Fortschritte, darunter verbesserte genetische Markierungstechniken, neuartige Clearing-Reagenzien, adaptive Optik und KI-gesteuerte Bildanalyse, beheben diese Einschränkungen und machen LSFM zunehmend für die Organoidforschung machbar7.

Trotz dieser Fortschritte stellen 3D-Fluoreszenzbildgebungsverfahren mehrere Herausforderungen für die Langzeitüberwachung lebender Organoide dar. Erstens führt die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen zu phototoxischen Effekten und stört biologische Prozesse, was eine Herausforderung für längere Live-Bildgebungsstudien darstellt17. Zweitens leidet die antikörperbasierte Markierung aufgrund von Diffusionsbarrieren innerhalb dichter Organoidstrukturen unter einer begrenzten Penetration, was fortschrittliche Permeabilisierungs- und Gewebereinigungsmethoden erfordert, die für die Verwendung von Erst- und Sekundärantikörpern länger als 10 Tage Inkubation benötigen18. Drittens sind die Transfektion und die stabile Expression fluoreszierender Proteine in Organoiden nach wie vor ineffizient, da herkömmliche Gentransfer-Ansätze mit 3D-Umgebungen zu kämpfen haben19. Viertens führen optische Clearing-Techniken, die für die Tiefenbildgebung unerlässlich sind, häufig zu Fluoreszenzsignalverlusten und Gewebeverzerrungen, was optimierte Clearing-Protokolle erfordert, die Transparenz und Erhaltung der Fluoreszenz in Einklang bringen20.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde die Holotomographie (HT) als Technik zur Abbildung unmarkierter lebender Organoide mit hoher Auflösung über die Zeit eingeführt. HT, auch bekannt als quantitative 3D-Phasenbildgebung, ist eine markierungsfreie, hochauflösende Modalität, die eine quantitative Echtzeit-Visualisierung von Organoiden ermöglicht, während ihr nativer physiologischer Zustand erhalten bleibt. Das Prinzip der HT ist analog zur Röntgen-Computertomographie; Durch die Aufnahme mehrerer optischer 2D-Feldbilder unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen wird die 3D-RI-Verteilung einer unmarkierten Probe durch die Inverse-Wellen-Gleichung 21,22,23 rekonstruiert. HT wird in verschiedenen biologischen Bereichen eingesetzt, darunter in der Hämatologie24,25, der Phasenkondensation in der Zellbiologie26, der Mikrobiologie27 und der Histopathologie28. In jüngerer Zeit wurde die hochauflösende, markierungsfreie 3D-Bildgebung zunehmend für die Organoidforschung genutzt 21,22,23,29 und bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Untersuchung ihrer strukturellen und funktionellen Dynamik.

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für den Einsatz von Low-Coherence-HT im langfristigen, markierungsfreien Monitoring von Dünndarm-Organoiden (sIOs) der Maus vor. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des Organoidwachstums und des Wirkstoffansprechens über 24 Stunden und liefert gleichzeitig quantitative Messungen des Organoidvolumens, der Proteindichte und des Proteingehalts, was eine strenge, datengestützte Analyse des Verhaltens von Organoiden ermöglicht. Um morphologische Veränderungen in Organoiden zu untersuchen, behandelten wir die Proben mit Cisplatin, einem platinbasierten Chemotherapeutikum, von dem bekannt ist, dass es Apoptose induziert, indem es DNA-Vernetzungen bildet und die zelluläre Replikation hemmt30. Während die 3D-RI-Bildgebung strukturelle Details erfasst, ist eine systematische Analyse für die Quantifizierung der Organoiddynamik unerlässlich. Um dies zu erreichen, integrieren wir ilastik, ein auf maschinellem Lernen basierendes Segmentierungs-Toolkit31 , um Organoid-Regionen vom Hintergrund zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt den gesamten Arbeitsablauf, einschließlich der Vorbereitung von Organoidkulturen, der 3D-HT-Erfassung, der auf maschinellem Lernen basierenden Segmentierung und der quantitativen Analyse von RI-Tomogrammen. Durch das Angebot eines skalierbaren, reproduzierbaren und nicht-invasiven Bildgebungsrahmens etabliert dieser Ansatz einen neuen Standard für die Organoidforschung mit breiten Anwendungen in der Krankheitsmodellierung, der regenerativen Medizin und dem Wirkstoffscreening.

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Protocol

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HINWEIS: Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Als Alternative können gleichwertige Produkte verschiedener Hersteller verwendet werden. Ein schematischer Ablauf des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung der Probe

  1. Vorbereitung des sIO-Kulturmediums
    1. Bereiten Sie das handelsübliche Nährmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Sterilisieren Sie das Kulturmedium, indem Sie es durch eine 0,22-μm-Filtereinheit filtrieren.
      HINWEIS: Wenn das Medium vollständig unter sterilen Bedingungen in einer Zellkulturhaube hergestellt wird und alle Komponenten vorsterilisiert sind (z. B. in sterilen Flaschen und Fläschchen geliefert), ist eine Filtration durch einen 0,22-μm-Filter möglicherweise nicht unbedingt erforderlich.
    2. Aliquotieren Sie 15 mL des vorbereiteten Mediums in sterile Aufbewahrungsröhrchen. Das aliquotierte Medium wird vor der Verwendung in der Organoidkultur auf Raumtemperatur (15 - 25 °C) erwärmt.
  2. Auftauen der sIO-Aktie
    1. Tauen Sie die gefrorene Organoid-Brühe innerhalb von 2 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf. Übertragen Sie die aufgetaute Organoidsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 150 x g , um die Organoide zu pelletieren.
    2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um DMSO auszuwaschen und mögliche zytotoxische Wirkungen zu minimieren.
    3. Fügen Sie das Medium und die frische extrazelluläre Matrix (ECM) im Verhältnis 1:4 hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Resuspension des Pellets zu gewährleisten. Geben Sie 15 μl pro Dome in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte ab. Halten Sie ECM auf Eis, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
    4. Stellen Sie die Platte kopfüber für 1 h in einen 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um die ECM-Polymerisation zu ermöglichen. Geben Sie nach der Polymerisation vorsichtig 200 μl frisches Medium in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Dieses Protokoll ist mit verschiedenen kommerziellen Bildgebungsschüsseln und Well-Platten kompatibel. Passen Sie das Medienvolumen entsprechend dem Well-Typ an, um sicherzustellen, dass die ECM-Kuppel vollständig untergetaucht ist.
  3. Passage von sIOs
    HINWEIS: Organoide neigen dazu, an Pipettenspitzen zu haften. Um die Adhärenz zu minimieren, befeuchten Sie die Pipettenspitzen mit dem Medium.
    1. Aspirieren Sie verbrauchtes Medium. Geben Sie 200 μl Zellrückgewinnungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 4 °C, um den Abbau der EZM und die Entnahme von Organoiden zu erleichtern.
    2. Sammeln Sie die Organoid-Suspension durch vorsichtiges Pipettieren und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 150 x g 3 min zentrifugieren, dann den Überstand vorsichtig entfernen.
    3. (Fakultativ) Um den Durchgang als einzelne Zellen durchzuführen, führen Sie eine der folgenden Dissoziationsmethoden aus:
      1. Enzymatische Methode: 100 μl einzellige Dissoziationslösung zum Pellet geben und bei 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator für 1-2 min inkubieren. Fügen Sie 150 μl Medium zur Neutralisierung hinzu. Führen Sie Pipettieren oder sanftes Klopfen durch. Bei 150 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entfernen, so dass nur das Pellet übrig bleibt.
        HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Inkubation, da eine längere Exposition für die Zellen sehr schädlich sein kann.
      2. Mechanische Dissoziation: Das Pellet in 200 μl Nährmedium resuspendieren. Pipettieren Sie mit einer P200-Pipette 20x-30x auf und ab, um Organoide mechanisch in kleinere Fragmente oder einzelne Zellen zu dissoziieren. Bei 150 x g für 3 min zentrifugieren, dann den Überstand absaugen und das Pellet zurückhalten.
    4. Fügen Sie Medien und frisches ECM im Verhältnis 1:4 hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Resuspension des Pellets zu gewährleisten. Geben Sie 15 μl pro Dome in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte ab.
    5. Stellen Sie die Platte kopfüber für 1 h in einen 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, damit die ECM polymerisieren kann.
    6. Geben Sie nach der Polymerisation 200 μl frisches Kulturmedium in jede Vertiefung und füllen Sie die leeren äußeren Vertiefungen mit PBS, um eine Verdunstung zu verhindern. Tauschen Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage aus und passieren Sie die Organoide wöchentlich. Passen Sie das Passage-Intervall entsprechend der gewünschten Organoidgröße an.
  4. Medikamentöse Behandlung
    1. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Cisplatin vor, indem Sie 3,00 mg Cisplatinpulver (MW ≈ 300,05 g/mol) in 1 ml DMSO lösen. Kurz einreiben und die Lösung mit bernsteinfarbenen Tuben oder durch Umwickeln mit Alufolie vor Licht schützen.
    2. Zur Vorbereitung des Behandlungsmediums verdünnen Sie den 10 mM Cisplatin-Stamm 1:1.000 in vollständigem sIO-Kulturmedium, um eine Endkonzentration von 10 μM Cisplatin und 0,1 % DMSO zu erhalten.
    3. Für die Vehikelkontrolle 0,1 % DMSO in Kulturmedium so vorbereiten, dass es der endgültigen DMSO-Konzentration ohne Cisplatin entspricht.
    4. Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus sIO-Kulturen und ersetzen Sie es vorsichtig durch 10 μM cisplatinhaltiges Medium oder reines DMSO-Kontrollmedium.
    5. Nach der Behandlung werden die Proben in den Inkubator des bildgebenden Systems überführt.

2. Holotomographie-Bildgebung mit geringer Kohärenz mittels Bediensoftware

  1. Probenvorbereitung für die Bildgebung
    1. Geben Sie 15 μl Organoid-ECM-Kuppel auf die Deckglas-Boden-Bildgebungsschale #1.5, indem Sie das in den Schritten 1.3.1 bis 1.3.4 beschriebene Verfahren befolgen. Platzieren Sie jede Kuppel so nah wie möglich an der Mitte in der Schale, um eine optimale Bildgebung zu erzielen.
    2. Vor der Polymerisation 1 Minute bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Organoide am Boden absetzen können.
    3. Stellen Sie die Platte kopfüber für 1 h in einen 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator, um das ECM zu polymerisieren. Fügen Sie dann vorsichtig so viel Nährmedium hinzu, dass die Organoide vollständig untergetaucht sind.
      HINWEIS: Stellen Sie das mittlere Volumen ein, um sicherzustellen, dass die Organoide vollständig eingetaucht sind, entsprechend der Größe der Bildgebungsschale mit Deckglasboden.
    4. 5 Tage nach der Passage waschen Sie die Probe unmittelbar vor der Bildgebung 2x-3x mit PBS, um Ablagerungen zu entfernen und optische Artefakte zu reduzieren.
  2. Einrichtung der Bildgebung
    1. Schalten Sie den Umgebungsregler ein, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten. Die Kammersteuerung passt die Temperatur automatisch auf 37 °C und die CO2 -Konzentration auf 5 % an.
    2. Drücken Sie die Türtaste an der Vorderseite des Geräts, um die Tür zu öffnen. Fügen Sie Wasser hinzu, um eine dünne Schicht in der Vertiefung der Kammer zu bilden, um ein Austrocknen des Nährmediums zu verhindern.
    3. Stellen Sie die Bildgebungsschale in einen geeigneten Gefäßhalter, setzen Sie sie in die Bildgebungskammer ein und sichern Sie sie mit einem Stift, um ein Verrutschen zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Schüssel fest mit dem Gefäßhalter verbunden ist, ohne zu kippen.
    4. Schließen Sie die Tür des Geräts mit der Türtaste , um Störungen durch externes Licht zu blockieren.
    5. Starten Sie die TomoStudio X-Software und melden Sie sich an. Klicken Sie auf Start , um das Hauptfenster zu öffnen.
    6. Klicken Sie oben links auf Projekt hinzufügen und weisen Sie experimentelle Parameter zu (z. B. Projektname, Medientyp, Probentyp usw.). Die Probenplatte wird automatisch erstellt. Stellen Sie sicher, dass der richtige Medientyp für die Verwendung der entsprechenden RI im Experiment zugewiesen ist.
    7. Klicken Sie im Panel auf die gewünschte Vertiefung und klicken Sie oben auf Erstellen , um die Vertiefungen als Proben zu registrieren.
    8. Klicken Sie oben rechts auf ROI-Setup , um den Bereich of Interest (ROI) in der Schüssel zu definieren. Wenn alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie in der unteren rechten Ecke auf Experiment ausführen , um das Bildaufnahmefenster zu öffnen.
    9. Klicken Sie in der oberen rechten Ecke auf Behälter laden . Es erscheint ein Hellfeldbild. Passen Sie die Z-Position mit den Tasten +Z und -Z an, um zu fokussieren.
    10. Passen Sie auf der Registerkarte Single Imaging die ROI-Größe an. Erfassen Sie Organoide in einem Sichtfeld von 160 μm x 160 μm und erfassen Sie axiale Stapel mit einer Tiefe von bis zu 140 μm. Bei größeren Organoiden können Sie mehrere RI-Tomogramme erfassen und Bilder zusammenfügen, indem Sie unten das Kontrollkästchen "Tile Imaging " aktivieren.
    11. Navigieren Sie zur Registerkarte Zeitraffer-Bildgebung, um die Langzeit-Bildgebung zu konfigurieren. Stellen Sie die Dauer und die Intervallzeit nach Bedarf ein. In diesem Experiment wurde eine Zeitrafferbildgebung in 10-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt, und die Analyse wurde in 2-Stunden-Intervallen über die gleiche Dauer durchgeführt.
    12. Klicken Sie auf das Symbol Scannen , um den aktuellen ROI-Standort zu erfassen. Zentrieren Sie die ECM-Kuppel manuell mit Hellfeld-Bildgebung. Klicken Sie auf die Taste BF , um die Intensitäts- und Belichtungswerte für die Hellfeldaufnahme anzupassen.
    13. Wählen Sie ROI aus, indem Sie das ROI-Feld verschieben, das im Vorschaufenster angezeigt wird. Sobald der gewünschte ROI gefunden wurde, klicken Sie unten auf Punkt hinzufügen . Die Liste der Bildgebungspunkte wird angezeigt.
    14. Klicken Sie auf Erfassen , um das Imaging zu starten. Die Rohbilddaten werden erfasst.

3. Bildanalyse

  1. Auf maschinellem Lernen basierende Bildsegmentierung
    1. Exportieren Sie die TCF-Bilddatei in das HDF5-Format (Supplementary Coding File 1), um sicherzustellen, dass die Daten in einem mehrdimensionalen Format vorliegen, das mit ilastik kompatibel ist.
    2. Öffnen Sie ilastik und navigieren Sie zu Datei > Neues Projekt. Wählen Sie im Abschnitt Segmentierungs-Workflows die Option Pixel-Klassifizierung aus. Speichern Sie die Projektdatei in einem dafür vorgesehenen Verzeichnis.
    3. Laden Sie die HDF5-Datei, indem Sie zu 1 navigieren. Registerkarte Eingabedaten. Klicken Sie auf Neue Datei hinzufügen, wählen Sie das entsprechende H5-Dataset aus und stellen Sie sicher, dass die richtigen Bildkanäle zugewiesen sind.
    4. Navigieren Sie zu 2. Registerkarte Feature-Auswahl zur Auswahl relevanter Merkmale (Farbe/Intensität, Kante, Textur), um die Segmentierung zu optimieren.
      HINWEIS: Die Auswahl der Funktionen kann je nach Datensatz und Bildeigenschaften variieren. Für die aktuelle Analyse wurden folgende Features ausgewählt: Farbe/Intensität (σ = 1,60), Kante (σ = 3,50) und Textur (σ = 1,60). Je nach Komplexität des Bildes kann eine Optimierung auf der Grundlage eines heuristischen Ansatzes erforderlich sein. Alternativ kann die Funktion Features vorschlagen > Featureauswahl ausführen in ilastik verwendet werden, um einen optimalen Parametersatz zu identifizieren.
    5. In 3. Auf der Registerkarte "Training" können Sie organoide und nicht-organoide Regionen beschriften, indem Sie Pinselstriche in unterschiedlichen Farben anwenden. Um die Genauigkeit der Segmentierung zu verbessern, beschriften Sie Bereiche um Grenzen herum sorgfältig.
    6. Klicken Sie auf Live-Update , um eine Vorschau der Segmentierungsergebnisse anzuzeigen und bei Bedarf Verfeinerungen vorzunehmen.
    7. Navigieren Sie zu 4. Export von Vorhersagen. Wählen Sie in der Quellenauswahl die Option Einfache Segmentierung aus, um beschriftete Vorhersagen zu exportieren. Klicken Sie auf Alle exportieren, und stellen Sie sicher, dass das Ausgabeformat je nach den Anforderungen der nachgelagerten Analyse auf .h5 oder .tiff festgelegt ist.
  2. Quantitative Merkmalsanalyse
    HINWEIS: Dieser Protokollschritt wird in MATLAB ausgeführt, wobei jedes Verfahren in der ergänzenden Codierungsdatei 2 beschrieben ist.
    1. Durch Kombinieren des RI-Tomogramms mit dem Maskenbild erstellen Sie ein maskiertes RI-Bild, das nur die Organoidregion enthält.
    2. Berechnen Sie anhand des maskierten RI-Bildes quantitative Parameter wie Organoidvolumen, Proteindichte und Proteingehalt.
      1. Volumen: Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Organoids, indem Sie die Anzahl der Pixel in der segmentierten Maske mit der Pixelauflösung für X, Y und Z multiplizieren. Berechnen Sie die Anzahl der Pixel, indem Sie alle Voxelwerte im Organoid-beschrifteten Maskenarray mit der integrierten MATLAB-Funktion Summe zählen.
        HINWEIS: Die Pixelauflösung wird vom Bildgebungssystem bestimmt und befindet sich in der Gruppe Daten > 3D-Attribute innerhalb der HDF5-Struktur.
      2. Proteindichte: Berechnen Sie die Proteindichte, indem Sie den mittleren RI-Wert vom mittleren Organoid-RI subtrahieren und durch das Inkrement des Proteinbrechungsindex dividieren.
        1. Mittlerer RI: Messen Sie vor der Analyse den RI des umgebenden Mediums mit einem Refraktometer.
        2. Mittlerer RI-Wert: Bestimmen Sie den mittleren RI des Organoids, indem Sie die RI-Werte der Voxel in der Organoidmaske mitteln.
        3. Protein-Brechungsindex-Inkrement (α): Verwenden Sie eine zuvor berichtete empirische Konstante, die aus Studien zur Brechungsindex-Inkrementierung abgeleitet wurde.
      3. Proteingehalt: Der Gesamtproteingehalt wird berechnet, indem das in Schritt 3.2.2.1 ermittelte Volumen mit der in Schritt 3.2.2.2 ermittelten Proteindichte multipliziert wird.

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Results

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Abbildung 1 veranschaulicht den schematischen Arbeitsablauf für die 4D-Bildgebung und quantitative Analyse von sIOs. Dieses Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Live-Bildgebung und eine umfassende Bewertung von sIOs durch einen vierstufigen Prozess: Kultur, 4D-Bildgebung, Bildverarbeitung und quantitative Analyse (Abbildung 1D).

Nach einer 5-tägigen Inkubationszeit wurden reife sIOs zur Visualisierung mittels Low-Coherence-Holoto...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Holotomographie stellt einen leistungsstarken Ansatz für die markierungsfreie, hochauflösende Bildgebung lebender Organoide dar und überwindet viele Herausforderungen, die mit herkömmlichen Bildgebungsverfahren verbunden sind. In diesem Protokoll beschreiben wir eine umfassende Methodik für die Anwendung von HT mit geringer Kohärenz in der sIO-Forschung, die eine quantitative Echtzeit-Visualisierung der Organoid-Morphologie, der Wachstumsdynamik und des Ansprechens auf die medikament...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.L., J.H.L., S.M.L. und Y.K.P. haben finanzielle Beteiligungen an Tomocube Inc., einem Unternehmen, das Holotomographie und quantitative Phasenbildgebungsinstrumente vermarktet.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das von der koreanischen Regierung finanzierte Stipendium der National Research Foundation of Korea (MSIT) (RS-2024-00442348, RS-2024-00440577, 2022M3H4A1A02074314), das Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) im Rahmen des International Cooperative R&D Program (P0028463) und das von der koreanischen Regierung finanzierte Stipendium des Korean Fund for Regenerative Medicine (KFRM) (21A0101L1-12). Die Datenerfassung wurde von M.J.L. und J.H.L. durchgeführt, wobei J.H.L. für die Datenverarbeitung und J.M.C. für die Datenanalyse verantwortlich war. Alle Autoren haben zum Verfassen des Manuskripts beigetragen. Wir danken ChulMin Oh und Chungha Lee für wertvolle technische Gespräche und Unterstützung bei der Figurenvorbereitung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
48-Well-Platte Corning3548Kulturschale
Lösung zur Zellrückgewinnung Corning354253Abbau von Matrigel 
CisplatinSupelcoPHR1624N/A
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichNr. D2650Fahrzeug
Eppendorf TubeCorningMCT-175-C-SN/A
HTX-VerarbeitungsserverTomocube Inc., KoreaN/AServer zur Datenverarbeitung
HT-X1Tomocube Inc., KoreaN/ABetriebssoftware
IlastikN/AN/AAuf maschinellem Lernen basierendes Segmentierungs-Toolkit
Behälterhalter für bildgebende Schüsseln Tomocube Inc., KoreaN/AHalterung für Bildgebungsschüssel
IntestiCult Organoid Wachstumsmedium (Maus)STEMCELL-Technologien#06005Kommerziell erhältliches vorgefertigtes Nährmedium
Matlab (Englisch)MathWorks (Englisch)Matlab 2024aSoftware für die Bildverarbeitung
MatrigelCorning356231ECM für 3D-Organoide
Millipore  Steritop  Filter mit VakuumflaschenaufsatzMerckS2GPT05RE0,22 μm M Filtereinheit für die Mediumsterilisation
Darmorganoide der MausSTEMCELL-Technologien#70931N/A
RefraktometerATAGOR-5000Brechungsindex-Rechner
TomoSchaleTomocube Inc., Korea901002-02#1.5 Bildgebungsschale mit Deckglasboden
TomoStudio XTomocube Inc., KoreaN/ABildgebungssoftware
TrypLEGibco12604Dissoziation einzelner Zellen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  2. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  3. Arjmand, B., et al. Advancement of organoid technology in regenerative medicine. Regen Eng Transl Med. 9 (1), 83-96 (2023).
  4. Zhang, W., et al. Patch grafting of organoids of stem/progenitors into solid organs can correct genetic-based disease states. Biomaterials. 288, 121647(2022).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Park, J., et al. Artificial intelligence-enabled quantitative phase imaging methods for life sciences. Nat Meth. 20 (11), 1645-1660 (2023).
  7. Fei, K., Zhang, J., Yuan, J., Xiao, P. Present application and perspectives of organoid imaging technology. Bioengineering. 9 (3), 121(2022).
  8. Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. J Toxicol Pathol. 31 (1), 81-85 (2018).
  9. Yoshimoto, S., Taguchi, M., Sumi, S., Oka, K., Okamura, K. Establishment of a novel protocol for formalin-fixed paraffin-embedded organoids and spheroids. Biol Open. 12 (5), bio059882(2023).
  10. Badder, L. M., et al. 3D imaging of colorectal cancer organoids identifies responses to Tankyrase inhibitors. PLoS One. 15 (8), e0235319(2020).
  11. Lacin, M. E., Yildirim, M. Applications of multiphoton microscopy in imaging cerebral and retinal organoids. Front Neurosci. 18, 1360482(2024).
  12. Brémond Martin, C., Simon Chane, C., Clouchoux, C., Histace, A. Recent trends and perspectives in cerebral organoids imaging and analysis. Fronti Neurosci. 15, 629067(2021).
  13. Smits, L. M., Schwamborn, J. C. Midbrain organoids: a new tool to investigate Parkinson's disease. Front Cell Dev Biol. 8, 359(2020).
  14. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  15. Delgado-Rodriguez, P., Brooks, C. J., Vaquero, J. J., Munoz-Barrutia, A. Innovations in ex vivo light sheet fluorescence microscopy. Prog Biophys Mol Biol. 168, 37-51 (2022).
  16. Masson, A., et al. High-resolution in-depth imaging of optically cleared thick samples using an adaptive SPIM. Sci Rep. 5 (1), 16898(2015).
  17. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  18. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. elife. 9, e52904(2020).
  19. Laperrousaz, B., et al. Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens. Nucl Acids Res. 46 (12), e70-e70 (2018).
  20. Susaki, E., Takasato, M. Perspective: Extending the Utility of Three-Dimensional Organoids by Tissue Clearing Technologies. Front Cell Dev Biol. 9, 1-12 (2021).
  21. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nat Photon. 12 (10), 578-589 (2018).
  22. Kim, G., et al. Holotomography. Nat Rev Meth Primers. 4 (1), 51(2024).
  23. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Comm. 1 (4), 153-156 (1969).
  24. Kim, H., et al. Integrating holotomography and deep learning for rapid detection of NPM1 mutations in AML. Sci Rep. 14 (1), 23780(2024).
  25. Kim, S. Y., et al. Label-free imaging and evaluation of characteristic properties of asthma-derived eosinophils using optical diffraction tomography. Biochem BiophysRes Comm. 587, 42-48 (2022).
  26. Kim, T., et al. RNA-mediated demixing transition of low-density condensates. Nat Comm. 14 (1), 2425(2023).
  27. Kim, G., et al. Rapid species identification of pathogenic bacteria from a minute quantity exploiting three-dimensional quantitative phase imaging and artificial neural network. Light Sci Appl. 11 (1), 190(2022).
  28. Hugonnet, H., et al. Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution. Adv Photon. 3 (2), 026004-026004 (2021).
  29. Lee, M. J., et al. Long-term three-dimensional high-resolution imaging of live unlabeled small intestinal organoids via low-coherence holotomography. Exp Mol Med. 56 (10), 2162-2170 (2024).
  30. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nat Rev Drug Discov. 4 (4), 307-320 (2005).
  31. Berg, S., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  32. Sbrana, F., et al. Label-free three-dimensional imaging and quantitative analysis of living fibroblasts and myofibroblasts by holotomographic microscopy. Microscopy Res Tech. 87 (11), 2757-2773 (2024).
  33. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophys J. 100 (9), 2309-2317 (2011).
  34. Wallaeys, C., Garcia-Gonzalez, N., Libert, C. Paneth cells as the cornerstones of intestinal and organismal health: a primer. EMBO Mol Med. 15 (2), e16427(2023).
  35. Hooper, L. V. Epithelial cell contributions to intestinal immunity. Adv Immunol. 126, 129-172 (2015).
  36. Atanga, R., Singh, V., In, J. G. Intestinal enteroendocrine cells: present and future druggable targets. Int J Mol Sci. 24 (10), 8836(2023).
  37. Dicarlo, M., et al. Quercetin exposure suppresses the inflammatory pathway in intestinal organoids from winnie mice. Int J Mol Sci. 20 (22), 5771(2019).
  38. Miura, S., Suzuki, A. Generation of mouse and human organoid-forming intestinal progenitor cells by direct lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (4), 456-471.e5 (2017).
  39. Barer, R. Determination of dry mass, thickness, solid and water concentration in living cells. Nature. 172 (4389), 1097-1098 (1953).
  40. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).
  41. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. Sci Rep. 8 (1), 9183(2018).
  42. Kim, Y. S., et al. Combining three-dimensional quantitative phase imaging and fluorescence microscopy for the study of cell pathophysiology. Yale Biol Med. 91 (3), 267(2018).
  43. Liu, C., et al. Simultaneous dual-contrast three-dimensional imaging in live cells via optical diffraction tomography and fluorescence. Photonics Res. 7 (9), 1042-1050 (2019).
  44. Schlüßler, R., et al. Combined fluorescence, optical diffraction tomography and Brillouin microscopy. bioRvix. , (2020).
  45. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomed Optics Exp. 8 (5), 2496-2518 (2017).
  46. Jo, Y., et al. Label-free multiplexed microtomography of endogenous subcellular dynamics using generalizable deep learning. Nat Cell Biol. 23 (12), 1329-1337 (2021).
  47. Oh, C., Hugonnet, H., Lee, M., Park, Y. Digital aberration correction for enhanced thick tissue imaging exploiting aberration matrix and tilt-tilt correlation from the optical memory effect. Nat Comm. 16 (1), 1685(2025).
  48. Yasuhiko, O., Takeuchi, K. In-silico clearing approach for deep refractive index tomography by partial reconstruction and wave-backpropagation. Light Sci Appl. 12 (1), 101(2023).

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