Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Zusammenfassung

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine Methode vor, um ein selbst gebautes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter 13-C-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zu integrieren, um den Pyruvatstoffwechsel in lebenden Zellen in Echtzeit zu messen. Das Protokoll beschreibt den Aufbau eines Bioreaktorsystems, das ein präzises Timing der hyperpolarisierten Substratinjektion und der NMR-Signalerfassung ermöglicht und gleichzeitig eine stabile Zellkulturumgebung aufrechterhält. Die Methode detektiert zuverlässig die metabolische Umwandlung von Pyruvat in Laktat innerhalb eines Messfensters von 60 s bei gleichzeitiger Beibehaltung eines ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnisses während des gesamten Prozesses. Die In-situ-Mischfähigkeit des Systems beschleunigt die Erkennung von NMR-Signalen und reduziert die T 1-Relaxationsverluste. Das Protokoll enthält auch detaillierte Anweisungen für die Herstellung von Alginatgelen, um Zellen zu verkapseln und sie in den Bioreaktor zu bringen. Die vorgeschlagene Methode weist im Vergleich zu herkömmlichen Methoden eine verbesserte Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit auf, was auf mögliche Anwendungen in Studien zum Krebsstoffwechsel und zum Wirkstoffscreening hinweist. Weitere Verfeinerungen des Systems, wie z. B. die Verwendung alternativer Gelmatrizen, können seine Vielseitigkeit in verschiedenen biologischen Studien verbessern.

Einleitung

Die hyperpolarisierte NMR, insbesondere durch dynamische Kernpolarisation (DNP), erhöht die NMR-Signalintensität^{signifikant 1} und ermöglicht die Echtzeit-Verfolgung von metabolischen Veränderungen mit stark verbesserter Empfindlichkeit ^2,3. Diese Technik wurde erfolgreich in verschiedenen biologischen Systemen angewendet, darunter Hefe ^4,5, Krebszellmodelle ^6,7,8 und Mikroorganismen ^9,10. Es wurde auch verwendet, um wichtige Stoffwechselwege wie die Glykolyse^11,12, die Redoxhomöostase^13,14 und die pH-Regulierung^15,16 zu überwachen. Über die Grundlagenforschung hinaus wird die hyperpolarisierte NMR heute in der klinischen Bildgebung durch MRT eingesetzt und ermöglicht eine metabolische Beurteilung von der zellulären bis zur Ganzkörperskala¹⁷. Diese Entwicklungen unterstreichen die wachsende Nachfrage nach zugänglichen Protokollen, die den breiteren Einsatz hyperpolarisierter NMR in verschiedenen biologischen Kontexten ermöglichen.

Trotz ihrer Vielseitigkeit bleibt die Implementierung von Echtzeit-Stoffwechselmessungen in lebenden Zellen mit hyperpolarisierter NMR eine technische Herausforderung. Herkömmliche Systeme beruhen oft auf komplexen, laborspezifischen Aufbauten, denen es an Reproduzierbarkeit mangelt und die ohne umfangreiches Know-how nur schwer zu bedienen sind 8,18,19,20. Dies stellt ein großes Hindernis für Forscher dar, die diese Technologie für die biologische oder translationale Forschung einsetzen wollen. Im Vergleich zu alternativen Methoden wie der optischen Bildgebung oder der Massenspektrometrie ermöglicht die hyperpolarisierte 13-C-NMR ein nicht-invasives, zeitaufgelöstes Monitoring spezifischer Stoffwechselreaktionen ohne destruktive Probenahme. Es liefert direkte biochemische Informationen mit zeitlicher Präzision und eignet sich daher gut für dynamische Studien des Zellstoffwechsels.

Um diese Einschränkungen zu beheben, stellt diese Studie ein praktisches und reproduzierbares Protokoll vor, das speziell entwickelt wurde, um Forschern die Durchführung hyperpolarisierter NMR-Messungen des Metabolismus lebender Zellen mit minimalen technischen Hürden zu ermöglichen. Es wird eine umfassende Methode zur grundlegenden Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen beschrieben. Während dieses Protokoll auf andere ¹³C-markierte Sonden angewendet werden kann, ist Pyruvat aufgrund seiner schnellen zellulären Aufnahme, gut charakterisierten Stoffwechselwege und seiner zentralen Rolle im Zellstoffwechsel besonders geeignet. Das Verfahren besteht aus: (i) der Vorbereitung von Zellproben, (ii) der Verkapselung in Alginatgelen, (iii) der Hyperpolarisation mit einem DNP-Polarisator und (iv) der Echtzeit-13-C-NMR-Messung in einem 400-MHz-Spektrometer (Abbildung 1). Darüber hinaus werden Schlüsselparameter für den Aufbau des Bioreaktorsystems bereitgestellt, um die Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit Standard-NMR-Hardware zu gewährleisten. Das Protokoll ist für eine einfache Implementierung mit kommerziell erhältlichen Komponenten optimiert und soll Forschern, insbesondere solchen, die mit der Technik noch nicht vertraut sind, helfen, ihre Eignung für ihre experimentellen Anforderungen zu bestimmen.

Protokoll

1. Aufbau des Bioreaktors (Abbildung 2A-B)

1. Zusammenbau der NMR-Röhre
   1. Verwenden Sie für das Einführen des Schlauchs einen NMR-Schlauch mit Schraubverschluss (10 mm Durchmesser, Länge 178 mm) mit einer oben offenen Kappe.
   2. Bereiten Sie ein Silikon/PTFE-Fläschchenseptum (9 mm Durchmesser) vor und führen Sie einen PEEK-Schlauch hindurch, um es dicht abzudichten (Ergänzende Abbildung 1).
   3. Führen Sie das Septum mit chemisch beständigem PEEK-Schlauch (Innendurchmesser 1,0 mm, Außendurchmesser 1,6 mm, Wandstärke 0,3 mm, Länge 1 m) in die Öffnung der modifizierten Kappe ein.
   4. Platzieren Sie das Septum zwischen dem NMR-Schlauch und seiner oben offenen Kappe und sichern Sie es, indem Sie die Kappe fest schließen. Dieser Aufbau hält das Septum an Ort und Stelle und bietet eine ausreichende Abdichtung, um ein Auslaufen während der Perfusion oder Injektion zu verhindern.
2. Einrichten eines Schlauchs für die mittlere Förderung (Abbildung 2C)
   1. Verbinden Sie den PEEK-Schlauch mit den Einlass- und Auslassanschlüssen des NMR-Schlauchs, um eine kontinuierliche Perfusion zu ermöglichen. Sichern Sie die Verbindungen mit einem flanschlosen Verschraubungssatz, um Leckagen zu vermeiden.
3. Einbau der Komponenten für die Erwärmung des Mediums
   1. Schließen Sie den PEEK-Schlauch an eine Schlauchpumpe an, die auf eine stabile Durchflussrate von ca. 0,2 mL/min einstellbar ist, um eine kontinuierliche Zirkulation des Mediums über ein externes Zirkulationskit zu gewährleisten. Stellen Sie den Mediumbehälter in ein Wasserbad, das auf 37 °C eingestellt ist, um die Temperatur zu halten.
4. Hinzufügen einer Komponente zur Verhinderung von Gelleckagen
   1. Schneiden Sie einen dichten Schwamm so zu, dass er zum Durchmesser der NMR-Röhre passt. Führen Sie den Schwamm in den Boden des Rohrs ein, um ein Auslaufen des Alginatgels zu verhindern und gleichzeitig einen Mediumfluss zu ermöglichen.
5. Herstellung und Einsetzen der 3D-gedruckten Schwammfixierkomponente (Abbildung 2D-F)
   1. 3D-Druck eines zylindrischen Halters (Außendurchmesser 9,1 mm, Länge 20 mm, mit einem zentralen Loch von 1,5 mm Durchmesser) aus einem Photopolymerharz, das mit dem stereolithographischen 3D-Druck kompatibel ist. Die Konstruktionsspezifikationen sind in der beigefügten Zusatzdatei 1 enthalten.
   2. Führen Sie eine Kapillare aus Borosilikatglas (Außendurchmesser 1,5 mm, Innendurchmesser ca. 0,9 mm, Länge 90 mm) durch das vorgeformte Loch des 3D-gedruckten Halters.
   3. Befestigen Sie den Schwamm mit UV-härtendem Harz mit Wasserbeständigkeit an der Plattform auf dem Halter. 30 s unter UV-Licht aushärten, um eine Verfestigung zu gewährleisten.
   4. Setzen Sie den zusammengebauten Halter mit Schwamm in den NMR-Schlauch ein.

2. Zellvorbereitung (Beginn 2 Wochen vor der Messung)

1. Tauen Sie gefrorene Zellbestände (SCCVII oder HeLa) schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Übertragen Sie etwa 1 × 10⁶ Zellen in 10 ml RPMI-1640-Medium, das mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
2. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und passieren Sie sie alle 2-3 Tage, sobald eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht ist. Setzen Sie die Kultivierung für ca. 2 Wochen fort, um ~4 x 10⁷ Zellen zu erhalten, geschätzt aus fünf 10-cm-Schalen, die auf etwa 90% Konfluenz gezüchtet wurden (jede ergibt ~8 x 10⁶ Zellen).

3. Alginat-Gel-Vorbereitung

1. Herstellung der Alginatlösung
   1. Biologisches Natriumalginatpulver in Forschungsqualität in entionisiertem Wasser auflösen, um eine 2%ige (w/v) Lösung herzustellen. Die Lösung über Nacht bei 25 °C oder höher unter sanftem Rühren von Anfang bis Ende inkubieren. Verwenden Sie einen Röhrenrotator, der auf ca. 10-20 U/min eingestellt ist, um Blasenbildung zu vermeiden und eine gleichmäßige Auflösung zu gewährleisten.
2. Verkapselung von Zellen in Alginatgel
   1. Geben Sie 2 ml 0,25 % (v/v) Trypsin-EDTA in die 10-cm-Schale. Kippen Sie die Schale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken, und saugen Sie das überschüssige Trypsin-EDTA ab.
   2. Das Gericht bei 37 °C 2 Minuten inkubieren.
   3. Geben Sie 10 ml Nährmedium in die Schale. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu lösen. Sammeln Sie die gesamte Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
   4. Nehmen Sie etwa 10 μl der Suspension und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler. In der Regel werden für die nachfolgenden Eingriffe etwa 1 × 10⁷ Zellen benötigt, aber die tatsächliche Anzahl sollte durch Messung bestätigt werden.
   5. Die restliche Zellsuspension wird bei 120 × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml 2%iger (w/v) Alginatlösung. Pipettieren Sie langsam, um die Bildung von Blasen zu minimieren.
3. Gelbildung durch Calciumvernetzung (Abbildung 3)
   1. Geben Sie 10 mL 50 mM CaCl_2-Lösung in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen (Abbildung 3A).
   2. Nehmen Sie 300 μl des Zell-Alginat-Gemischs in eine 0,5-ml-Spritze, die mit einer 30G-10-mm-Nadel ausgestattet ist, und befestigen Sie sie an der Kappe des Zentrifugenröhrchens (Abbildung 3B).
   3. Verschließen Sie die Kappe des Zentrifugenröhrchens fest mit der Spritze und zentrifugieren Sie die gesamte Baugruppe vorsichtig bei 200 × g für 5 min. Entfernen Sie die überstehende Lösung nach der Zentrifugation und resuspendieren Sie das zellbeladene Gel im Medium (Abbildung 3C-D).
4. Laden des Gels in das NMR-Röhrchen
   1. Übertragen Sie das zellverkapselte Gel mit einer Pasteurpipette in das NMR-Röhrchen. Setzen Sie die Schwammhalterung ein und sorgen Sie für einen dichten Verschluss.
   2. Der in Schritt 1.3.2 hergestellte Mediumbehälter (mit 5 % (v/v) D₂O) wird in einem Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt und mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 μl/h zirkuliert, um die Bedingungen zu stabilisieren.
   3. Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind, bevor Sie den NMR-Schlauch in den Magneten einführen. Halten Sie den PEEK-Schlauch gerade und führen Sie den NMR-Schlauch in den Magneten ein. Passen Sie die Gelgröße, die Anzahl der Beads und die Pipettiergeschwindigkeit je nach Zelltyp und experimentellen Anforderungen an.

4. Vorbereitung der hyperpolarisierten Sonde mit einem DNP-Polarisator (Abbildung 4)

1. Vorbereitung des Probengefäßes
   1. 18 μl [^1-13C]-Brenztraubensäure (14,2 M), dotiert mit 25 mM OX063, in ein Probengefäß geben. Verbinden Sie das Fläschchen mit dem Flüssigkeitsweg des DNP-Polarisationssystems.
2. Polarisation der Probe
   1. Setzen Sie das Fläschchen in die Bohrungseinheit des DNP-Polarisators (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar) ein. Wenden Sie Mikrowellenbestrahlung bei ca. 188 GHz (22 mW) für 60-80 Minuten an.
3. Überwachungssignal während der Polarisation
   1. Verwenden Sie das in das DNP-System integrierte Festkörper-NMR-Spektrometer, um die Signalintensität von ^{13 °}C zu überwachen. Zeichnen Sie alle 5 Minuten Signaldaten mit der NMR-Software (SPINit) auf.
4. Auflösen und Vorbereiten der hyperpolarisierten Lösung
   1. Lösen Sie die polarisierte Probe schnell in 3,2 mL vorgewärmtem Auflösungspuffer (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg/L EDTA) auf. Stellen Sie sicher, dass die Lösung eine biologische Temperatur (308-313 K, pH ~7) erreicht, bevor Sie sie zur NMR-Messung überführen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Hochdruckkomponenten. Heizen Sie den Auflösungspuffer auf ~461 K vor, um einen effizienten Transfer und die Integrität der Probe zu gewährleisten.

5. NMR-Einrichtung

1. Vorbereitung des NMR-Spektrometers
   1. Laden Sie die Probe in das NMR-Röhrchen und führen Sie es in das Spektrometer ein.
   2. Sperren, Tuning, Anpassen und Shimming auf der NMR-Konsole mit dem automatisierten Verfahren mit eingelegter Probe durchführen, um die spektrale Auflösung und Signalstabilität zu optimieren.
2. Einrichten der Erfassungsparameter
   1. Laden Sie eine 13-C-Pulserfassungssequenz (z. B. zg2d) mit aktivierter Protonenentkopplung (z. B. 13-CPD).
   2. Stellen Sie den Flip-Winkel mit einem Impuls von 1 μs (P1) auf 90° ein. Stellen Sie die Erfassungszeit auf 1.376 s, die spektrale Breite auf 23.663 Hz und die Anzahl der Erfassungspunkte (TD) auf 65.536 ein. Stellen Sie die Relaxationsverzögerung (D1) auf 0 s ein.
   3. Stellen Sie die Anzahl der Zeitschritte (TD1) auf 150 ein, um 150 sequenzielle Spektren im Pseudo-2D-Modus zu erfassen. Stellen Sie die Empfängerverstärkung auf einen niedrigen Wert ein (z. B. ~1), um eine Signalsättigung durch hyperpolarisierte Abtastungen zu vermeiden.
      HINWEIS: Aufgrund der hohen Signalintensität der hyperpolarisierten NMR stellen Sie die Empfängerverstärkung auf einen niedrigen Wert (z. B. ~1) ein, der in der Regel weniger als 1 % der maximal verfügbaren Verstärkung entspricht. Die Empfängerverstärkung ist ein interner, einheitenloser Parameter, der die Signalverstärkung steuert. Zu hohe Werte können zu einer Signalsättigung führen.

6. NMR-Messung

1. Vorbereitung für die Messung
   1. Füllen Sie den gesamten Weg des Einlassschlauchs vom Einlassschlauch zum NMR-Schlauch mit Auflösungspuffer, um Lufteinschlüsse zu vermeiden (Abbildung 2B). Der Einlassschlauch wird sowohl für die Mediumperfusion als auch für die hyperpolarisierte Sondeninjektion verwendet.
   2. Vergewissern Sie sich sorgfältig, dass sich keine Luftblasen im Einlassschlauch oder im Inneren des NMR-Schlauchs befinden, da Blasen in diesem Bereich die Signalerfassung während der NMR-Messungen beeinträchtigen können.
2. Vorbereitung für die Injektion von hyperpolarisierter Lösung
   1. Stoppen Sie die Peristaltikpumpe, um die Zirkulation des Mediums vorübergehend zu stoppen, bevor Sie die hyperpolarisierte Lösung durch den Einlassschlauch injizieren.
   2. Beginnen Sie die spektrale Erfassung etwa 10 s vor dem Auflösen des hyperpolarisierten Substrats, um sicherzustellen, dass das Signal sofort nach der Injektion an der NMR-Nachweisstelle erfasst wird.
   3. Ziehen Sie 1 ml der Lösung mit einer Spritze, wenn sie aus dem DNP-Polarisator austritt.
3. Injektion der hyperpolarisierten Lösung und Bestätigung des Signals
   1. Schalten Sie das Dreiwegeventil am Einlass des Bioreaktors auf Position B, um die hyperpolarisierte Lösung in das NMR-Röhrchen zu injizieren.
   2. Schalten Sie das Ventil nach der Injektion wieder in Position A, um die Zirkulation des Mediums wieder aufzunehmen und einen Rückfluss zu verhindern.
   3. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion und Ankunft des Substrats, indem Sie einen Anstieg des FID-Signals (Free Induction Decay) in der Erfassungssoftware beobachten.

7. Datenverarbeitung und -analyse

1. Verarbeitung von Spektraldaten
   1. Laden Sie das zeitaufgelöste NMR-Spektrum in die Datenverarbeitungssoftware. Wenn die Daten im ser-Dateiformat gespeichert sind, suchen und laden Sie die entsprechende Datei.
2. Analyse der Spektren
   1. Führen Sie die Fourier-Transformation (FT) durch, um die Roh-FID in den Frequenzbereich umzuwandeln. Wenden Sie die Phasenkorrektur entweder manuell oder automatisch an. Führen Sie eine Basislinienkorrektur durch, um Verzerrungen zu entfernen.
3. Visualisierung der Metabolitenumwandlung
   1. Plotten Sie die Zeitverlaufssignale für Pyruvat C1 (~171 ppm) und Laktat C1 (~183 ppm).
4. Quantifizierung der metabolischen Umsetzung
   1. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC) für die Pyruvat- und Laktatpeaks.
   2. Bestimmen Sie das Verhältnis von [Laktat]/[Pyruvat], indem Sie die AUC von Laktat durch die von Pyruvat dividieren.
      HINWEIS: AUC wird anstelle der Peakhöhe verwendet, um den Einfluss von Ringing-Artefakten zu minimieren, die durch das große hyperpolarisierte [1-¹³C] Pyruvatsignal verursacht werden. Die AUC-Werte ergeben sich aus der einfachen Summierung der Signalintensitäten innerhalb des definierten Integrationsbereichs für jeden Peak.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde ein fabriziertes System an die hyperpolarisierte 13-C-NMR-Spektroskopie gekoppelt, um den Pyruvatstoffwechsel in lebenden Zellen in Echtzeit zu messen. Die Hauptsignale, die im 1D ¹³C NMR-Spektrum detektiert wurden, entsprachen Pyruvat (ca. 171 ppm) und Laktat (ca. 183 ppm)²¹, was es uns ermöglichte, die metabolische Umwandlung von Pyruvat in Laktat unter physiologischen Bedingungen zu bewerten (Abbildung 4).

Spektrale Qualität und Signaldynamik
In Abbildung 5 sind repräsentative Ergebnisse von wiederholten Messungen an derselben Probe mit SCCVII-Zellen – einer Plattenepithelkarzinomlinie der Maus, die häufig in hyperpolarisierten MRT-Studien verwendet wird – dargestellt. Die erste Messung zeigte einen deutlichen Anstieg des Laktatsignals, was auf eine aktive metabolische Umsetzung hinweist. Nachfolgende Messungen im Abstand von 1,5 h zeigten jedoch einen fortschreitenden Rückgang der Stoffwechselaktivität. Diese zeitabhängige Reduktion spiegelt wahrscheinlich biologischen Stress oder Anpassung wider, die durch die anfängliche Pyruvatinjektion induziert wurde. Bemerkenswert ist, dass eine ähnliche vorübergehende metabolische Modulation in vivo mit hyperpolarisierter MRT und EPRI berichtet wurde, bei denen die Sauerstoffversorgung des Tumors nach Pyruvatverabreichung vorübergehend abnahm²². Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wiederholbarkeit dieser Messungen eine zerstörungsfreie Verfolgung dynamischer metabolischer Veränderungen ermöglicht – ein Vorteil, der mit destruktiven Methoden nur schwer zu erreichen ist²³.

Um die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf andere Zelltypen zu bewerten, wurden zusätzliche Messungen mit HeLa-Zellen durchgeführt, einer weit verbreiteten menschlichen Krebszelllinie. Wie in Abbildung 6 gezeigt, zeigten HeLa-Zellen auch eine deutliche Umwandlung von Pyruvat in Laktat. Obwohl die Signalintensität aufgrund der_{T1-Relaxation} allmählich abnahm, blieb das Signal-Rausch-Verhältnis während der gesamten Erfassungsperiode von 60 s ausreichend. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das derzeitige Protokoll breit anwendbar ist und als vielseitiges Werkzeug für die Echtzeit-Erstellung von Stoffwechselprofilen in verschiedenen Zelltypen dienen kann.

Während der schnelle Signalabfall eine inhärente Einschränkung der DNP-basierten NMR ist, minimiert unser In-situ-Mischsystem die Verzögerung zwischen Auflösung und Messung und erhöht dadurch die Nachweisempfindlichkeit. Weitere Verfeinerungen, wie z. B. die Optimierung der Gelmatrixzusammensetzung, können die Anwendbarkeit dieser Methode auf ein breiteres Spektrum biologischer Systeme erweitern.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des gesamten Arbeitsablaufs von der Zellkultur bis zur hyperpolarisierten NMR-Messung. Der Prozess beginnt mit der Zellkultur (~2 Wochen), gefolgt von der Alginat-Gel-Vorbereitung (~60 min), um die Zellen für eine stabile Messung zu verkapseln. Als nächstes wird die Hyperpolarisation mit einem DNP-Polarisationssystem (~60 min) durchgeführt, und die NMR-Messung wird mit einem 400 MHz NMR-Spektrometer (~5 min) durchgeführt. Die Fotos auf der rechten Seite zeigen die entsprechenden Instrumente, die in diesem Workflow verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aufbau eines Bioreaktors für die hyperpolarisierte NMR-Messung. (A) Schematische Darstellung des Bioreaktoraufbaus. Das Kulturmedium wird durch Einlass A in das NMR-Röhrchen eingeführt und anschließend in den Abfall geleitet. Alginatkügelchen, die lebende Zellen enthalten, werden in das NMR-Röhrchen gegeben. Bei hyperpolarisierten NMR-Messungen wird die hyperpolarisierte Sonde durch den Einlass B injiziert, der als hyperpolarisierter Sondeneinlass bezeichnet wird. (B) Foto des gesamten Bioreaktoraufbaus, wobei die Einlass- und Auslassschläuche deutlich beschriftet sind. (C) Nahaufnahme des Schalters für den Einlassschlauch mit Einlass A (mittlere Perfusion) und Einlass B (hyperpolarisierte Sondeninjektion). (D) CAD-Design und (E) repräsentatives Foto der 3D-gedruckten Schwammfixierungskomponente, die in der NMR-Röhre platziert ist. Das Bauteil umfasst ein Loch zur Führung einer Glaskapillare, die die hyperpolarisierte Substratlösung abgibt, und eine Plattform zum Halten eines Schwamms. Das Bauteil selbst liegt nicht dicht an der Innenwand des NMR-Schlauchs an; (F) Stattdessen wird ein Schwamm um ihn herum eingeführt, um die Lücke zu füllen. Diese Struktur stabilisiert das Bauteil und lässt das Abfallmedium durch den Schwamm nach oben fließen, wodurch ein zusätzliches Auslassloch überflüssig wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zubereitung des Alginat-Gels. (A) Schematische Darstellung und (B) Foto der Alginat-Gel-Kugelbildungsvorrichtung. Das linke Bild zeigt den gesamten Aufbau, einschließlich des Zentrifugenröhrchens mit einer Spritze, die an seinem modifizierten Deckel befestigt ist. Das Bild oben rechts zeigt einen Deckel mit einem kleinen Loch für die Spritzenspitze, während das Bild unten rechts einen Deckel mit einer quadratischen Öffnung für eine stabile Positionierung der Spritze zeigt. Das Zentrifugenröhrchen ist mit 10 mL Calciumchloridlösung vorgefüllt, so dass die Alginatlösung, die aus der Spritzenspitze austritt, geliert werden kann, wodurch Alginat-Gelkugeln gebildet werden. (C) Repräsentatives mikroskopisches Bild, das die Morphologie von Alginat-Gelkugeln zeigt. (D) Repräsentatives mikroskopisches Bild, das die Morphologie von Alginat-Gelkugeln zeigt, die HeLa-Zellen enthalten. Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Vorbereitungsschritte für die NMR-Messung und Hyperpolarisation. Während des ~60-minütigen DNP-Aufbauprozesses wird die NMR-Einrichtung parallel durchgeführt, um Verzögerungen zu minimieren. Die Vorbereitung umfasst das Laden von Alginatperlen in das NMR-Röhrchen, gefolgt von ^einer1-Stunden-Lock-Einstellung, Shimming und Sondenabstimmung, um sicherzustellen, dass das System für die sofortige Messung bereit ist. Nach Auflösung und in situ Mischen zeigt die zeitaufgelöste 13-C-NMR-Spektroskopie klare Pyruvat- und Laktatpeaks. Die bei etwa 171 ppm, 179 ppm und 183 ppm beobachteten Spitzenwerte entsprechen Pyruvat, Pyruvathydrat bzw. Laktat. Für die NMR-Messung wurden ca. 4 × 10⁷ HeLa-Zellen verwendet, die in Alginat-Gel verkapselt waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zeitaufgelöster Nachweis von Pyruvat- und Laktatsignalen in wiederholten Messungen. Hyperpolarisierte ¹³C NMR-Spektren derselben SCCVII-Zellverkapselung Probe wurden in Abständen von 1,5 Stunden aufgenommen, um die Durchführbarkeit wiederholter zerstörungsfreier Messungen zu bewerten. Die Spitzenintensitäten von Pyruvat (offene Kreise) und Laktat (gefüllte Kreise, skaliert um 1000×) werden für jede Aufnahme im Zeitverlauf aufgetragen. (A) Erste Messung. (B) Die zweite Messung nach 1,5 h zeigt eine deutliche Verringerung der Laktatproduktion. (C) Die dritte Messung, nach weiteren 1,5 Stunden, bestätigte eine anhaltend niedrige Stoffwechselaktivität. Die quantitative Analyse auf der Grundlage der Fläche unter der Kurve (AUC) zeigte, dass das Verhältnis von [Laktat]/[Pyruvat] von 0,00134 (erste Messung) auf 0,00019 (zweite) und 0,00027 (dritte) abnahm. Die endgültige Zellkonzentration im Alginatgel betrug etwa 1,0 × 10⁷ Zellen/ml (4 × 10⁷ Zellen in 4 ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Umwandlung von Pyruvat in Laktat in HeLa-Zellen. Zeitaufgelöste hyperpolarisierte ¹³C NMR-Signale von Pyruvat und Laktat wurden in lebenden HeLa-Zellen gemessen. Die Intensität des Pyruvatsignals wird auf ihren Maximalwert zum Zeitpunkt Null normiert. Die Intensität des Laktatsignals wird zur besseren Sichtbarkeit um den Faktor 10:³ skaliert. Die quantitative Analyse auf der Grundlage der Fläche unter der Kurve (AUC) ergab ein [Laktat]/[Pyruvat]-Verhältnis von 0,00121. Die endgültige Zellkonzentration im Alginat-Gel betrug ungefähr 7,5 × 10⁶ Zellen/ml (3 × 10⁷ Zellen in 4 ml). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Ergänzende Abbildung 1. Repräsentative Bilder des Fläschchenseptums, das im Bioreaktorsystem verwendet wird. (A) Silikon/PTFE-Septum (9 mm Durchmesser) vor Gebrauch. (B) Das gleiche Septum in der Praxis, mit PEEK-Schlauch, der durch durchstochene Löcher eingeführt wird. Die Elastizität des Septummaterials ermöglicht es, dass es um den Schlauch herum wieder abdichtet und während der hyperpolarisierten Substratinjektion luftdichte Bedingungen aufrechterhält. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen

Ergänzende Abbildung 2: Zeitaufgelöstes ^{hyperpolarisiertes 13}C NMR-Spektrum, aufgenommen nach externem Mischen. Repräsentatives zeitaufgelöstes Spektrum des [^1-13C]-Pyruvatstoffwechsels, gemessen mit einem Tisch-NMR-System nach externem Mischen von hyperpolarisiertem Pyruvat und Zellen außerhalb des NMR-Röhrchens. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen

Ergänzende Datei 1: CAD-Konstruktion des zylindrischen Halters. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Diskussion

Kritische Schritte des Protokolls
Der Erfolg dieses Protokolls hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Zunächst ist es wichtig, die ordnungsgemäße Auflösung und Übertragung von hyperpolarisiertem 13-C-Pyruvat sicherzustellen, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Um die frühe metabolische Umwandlung von Pyruvat in Laktat zu erfassen, müssen der Zeitpunkt der Injektion der hyperpolarisierten Sonde und die NMR-Erfassung synchronisiert werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen während des gesamten Experiments zu erhalten. Abweichungen von diesen Parametern können zu einer verminderten Stoffwechselaktivität und einem Signalverlust führen.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode
Während dieses Protokoll einen robusten Ansatz für die Echtzeit-Stoffwechselüberwachung bietet, können bestimmte Modifikationen seine Anwendbarkeit verbessern. Durch Anpassen des Flip-Winkels der NMR-Aufnahme können beispielsweise die Signalintensität und der Polarisationsabfall ausgeglichen werden, um die Datenerfassung zu optimieren. Darüber hinaus wurde zwar ein Verfahren zur stabilen Herstellung von Alginat-Gelen einer bestimmten Größe eingeführt, die Größe der herzustellenden Gele kann jedoch leicht durch Auswahl einer Spritze oder Nadel eingestellt werden. Dies kann dazu beitragen, eine hypoxische Umgebung²⁴ zu reproduzieren und zu verhindern, dass Zellen aus der NMR-Sonde entweichen. Darüber hinaus wird das Alginat-Gel im Inneren des NMR-Röhrchens dicht und viskos, insbesondere im NMR-Messbereich. Wenn bei der Injektion des Nährmediums oder der hyperpolarisierten Sonde aus dem PEEK-Röhrchen Luft eindringt, verbleibt sie wahrscheinlich an der NMR-Messstelle, was zu einer Verschlechterung der Qualität des Spektrums führt.

Einschränkungen der Methode
Obwohl hyperpolarisierte Messungen den Vorteil einer hohen Empfindlichkeit der NMR-Signale haben, haben sie inhärente Einschränkungen. Aufgrund der_{T1-Relaxation} von hyperpolarisiertem ¹³C-Pyruvat ist die Dauer der Stoffwechselmessungen auf etwa 1 min begrenzt, was die Beobachtung langfristiger metabolischer Verschiebungen einschränkt. Darüber hinaus ist es schwierig, eine Zellprobe mehrere Stunden nach einer Messung zu messen, was mit dem Abtropfen einer großen Menge Pyruvat bei einer Messung zusammenhängen kann. Dies ist dasselbe wie die Tatsache, dass verwandte Gruppen Spektren einen Tag später gemessen haben¹⁸, und das Messintervall muss so lang sein.

Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden Techniken
Im Vergleich zu herkömmlichen metabolischen Assays hat unsere Methode gegenüber Endpunktmessungen wie Massenspektrometrie und biochemischen Assays den Vorteil, dass sie einen Echtzeit-Einblick in den zellulären Stoffwechsel bietet. Obwohl ähnliche hyperpolarisierte NMR-Spektren ohne Verwendung eines Bioreaktors erhalten werden können, ist die Möglichkeit, Messungen sofort mit In-situ-Mischen zu starten, angesichts der Schnelligkeit der Relaxation von Vorteil. Darüber hinaus können die Zellen vor der Injektion in einer stabilen Umgebung voreingestellt werden, was die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit der Stoffwechselanalyse verbessert. Dieser Vorteil wird durch ein ergänzendes Experiment (Ergänzende Abbildung 2) unterstützt, bei dem zeitaufgelöste Spektren mit einem Tisch-NMR-System nach externem Mischen aufgenommen wurden. In diesem Aufbau führte eine Verzögerung von ca. 30 s zwischen Mischen und Signalerfassung zu einem signifikanten Polarisationsverlust, der sich insbesondere auf die Detektion von Laktat auswirkte. Dies bestätigt, dass das in situ Mischen die Genauigkeit kinetischer Messungen unter Bedingungen mit schnellem T_1-Zerfall verbessert. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die Signalintensität in diesem In-situ-Aufbau geringer war, wahrscheinlich aufgrund der Verdünnung durch die mittlere Perfusion – ein Problem, das noch optimiert werden muss.

Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten
Diese Methode kann den Weg für Anwendungen zum Verständnis der metabolischen Eigenschaften verschiedener Lebensformen ebnen. Die Echtzeitmessung von Stoffwechselflüssen ermöglicht es Forschern, die Wirkung von Stoffwechselhemmern dynamisch zu bewerten. Die Integration dieses Ansatzes mit anderen Messtechniken kann die Genauigkeit der intrazellulären Stoffwechselanalyse weiter verbessern.

Wir stellen uns einen praktischen experimentellen Arbeitsablauf vor, in dem destruktive Hochdurchsatz-Metabolomik verwendet wird, um Kandidatenwege zu identifizieren, gefolgt von einer Echtzeitvalidierung mit hyperpolarisierter 13-C-NMR, um die Enzymfunktion und die Flussdynamik in lebenden Zellen zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht den direkten Nachweis transienter Stoffwechselreaktionen unter physiologischen Bedingungen - etwas, das mit Immunoassays oder Fluoreszenzsensoren, die in der Regel statische Metabolitenspiegel messen oder exogene Sonden erfordern, nur schwer zu erreichen ist. Während Fluoreszenzbildgebung und Immunoassays für die räumliche Lokalisierung bzw. das Hochdurchsatz-Screening unverzichtbar sind, bietet die hyperpolarisierte NMR eine komplementäre funktionelle Auslesung, die die Reaktionskinetik auf zerstörungsfreie Weise erfasst. Diese Strategie ermöglicht nicht nur mechanistische Erkenntnisse auf zellulärer Ebene, sondern dient auch als Brücke zu diagnostischen Anwendungen auf Gewebe- oder Organismusebene. Insbesondere die Fähigkeit, funktionelle metabolische Verschiebungen in Echtzeit zu erfassen, kann die Früherkennung von Stoffwechselstörungen und therapeutischen Reaktionen in komplexen biologischen Systemen unterstützen.

Fortschritte wurden auch bei der Entwicklung von Stoffwechselsonden erzielt, die auf verschiedene Stoffwechselwege abzielen, und synthetischen Substraten, die für bestimmte Enzyme entwickelt wurden, wodurch die Möglichkeiten der Stoffwechselforschung erweitert^{werden 25,26}. Darüber hinaus können Fortschritte in Hyperpolarisationstechniken, wie z. B. das direkte Fördern hyperpolarisierter Substrate vom Polarisator zur NMR durch einen magnetischen Tunnel²⁷- die Signalerhaltung verbessern und die potenziellen Anwendungen dieses Verfahrens in der biomedizinischen Forschung erweitern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
[1-13C] Brenztraubensäure	Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.	CLM-8077
3D-Drucker	Elegoo	Saturn 2
Calciumchlorid	Nacalai Tesque, Inc.	06729-55
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Externes Zirkulationskit für Pumpe	ALS EINHEIT	1-4141-02
Fötales Rinderserum	Gibco	10270106
Flanschloser Verschraubungssatz	GL Sciences Inc.	6010-46390
Glaskapillare mit Kern	Narishige	GDC-1.5	Innendurchmesser ~0,9 mm, Länge 90 mm
Magnetische Umwälzpumpe	ALS EINHEIT	1-4141-01
MestReNova	Mestrelab-Forschung		Software zur Verarbeitung und Analyse von NMR-Spektraldaten
Meine Spritze	Nipro Corporation	8277	0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 Stück
OX063	Oxford Instruments Co. Ltd.  und Polarize IVS Co. Ltd.	-
PEEK-Rohr	ALS EINHEIT	3-780-05
Penicillin-Streptomycin	Nacalai Tesque, Inc.	26252-94
Peristaltische Bio Mini-Pumpe	ATTO	1221200	Hochpräziser, breiter Durchflusstyp für stabilen Medienfluss
Harz	Siraya Tech	Rauchiges Schwarz
RPMI-1640 Mittel	Nacalai Tesque, Inc.	30264-85
Silikon/PTFE-Fläschchen-Septum	GL Sciences Inc.	1030-50009
Natriumalginat 80-120	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	194-13321
SPINit-Software	RS2D		NMR-Software im DNP-Polarisator
Schwamm	-	-	Handelsüblicher Schwamm im Zuschnitt zur Gelstabilisierung
Dreiwege-Absperrhahn	ALS EINHEIT	3-6247-04
Topspin	Bruker		Software zur Erfassung und Verarbeitung von NMR-Daten
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Thermo Fisher Scientific	07086-74
UV-härtendes Harz	BONDIC	BD-SKCJ
Wasserbad	ALS EINHEIT	1-5832-41	Thermischer Roboter TR Serie TR-1α für die Aufrechterhaltung von 37°; C-Temperatur
Wilmad NMR-Röhre mit Schraubverschluss	Sigma	Z271977	Frequenz 400 MHz, Durchmesser 10 mm, L 178 mm.