Methodenartikel

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

DOI:

10.3791/68568

⸱

6. August 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Elektronenmikroskopie (EM) und insbesondere die dreidimensionalen (3D) EM-Techniken haben sich in der strukturellen Virologie etabliert. Die Untersuchung von virusinduzierten Veränderungen der zellulären Ultrastruktur, wie z. B. Zika-Virus (ZIKV)-induzierte Replikationsfabriken oder Coronavirus-Replikationsorganellen, erfordert 3D-Bildgebung. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Tomographie ist eine weit verbreitete Methode, obwohl sie auf Proben mit einer Dicke von bis zu 200 nm beschränkt ist. Mit der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Tomographie können 3D-Daten größerer Volumina mit isotroper, wenn auch typischerweise geringerer Auflösung erzeugt werden. Für die Abbildung größerer Volumina werden alternative Techniken wie die Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (BF-SEM), die SEM-Array-Tomographie oder die TEM-Bildgebung von Serienschnitten eingesetzt. Im Vergleich zu den zuvor genannten Techniken gehen diese Techniken jedoch auf Kosten einer viel geringeren Auflösung entlang der Z-Achse der Probe. Eine Technik, die 3D-Informationen von Proben mit einer Dicke von bis zu 1 μm mit einer isotropen Auflösung von wenigen Nanometern liefert, ist die Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM)-Tomographie.

Im Folgenden stellen wir ein Protokoll für die Präparation von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten und in Harz eingebetteten virologischen Proben und deren Analyse mittels STEM-Tomographie vor. Dieses Protokoll profitiert von den Vorteilen der Bildgebung bei Raumtemperatur, während die biologische Ultrastruktur in einem nahezu nativen Zustand erhalten bleibt. Wir zeigen zwei repräsentative Beispiele für Fragestellungen, die mittels MINT-Tomographie beantwortet werden können. Zunächst wenden wir das Protokoll zur Untersuchung der Virionmorphogenese eines rekombinanten vesikulären Stomatitisvirus (VSV) an. Die STEM-Tomogramme bieten Informationen über rekombinante VSV-Knospung, die sonst durch 2D-Bildgebung nicht zugänglich sind. Zweitens zeigen wir korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) mit Hilfe der Foerster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) und der STEM-Tomographie (FRET-3D-CLEM) von EF-C-Peptid-Nanofibrillen. Diese kürzlich veröffentlichte Kombination gibt neue Einblicke in die Aufnahme und den Abbau von infektionsfördernden Peptid-Nanofibrillen und profitiert insbesondere von dem großen Volumen, das durch STEM-Tomographie zugänglich ist.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-introduction-1
Abbildung 1: Vergleich verschiedener 3D-Mikroskopietechniken unter Berücksichtigung von Auflösung, Instrumentierung, Erfassungszeit und Aufwand. Das maximal realisierbare Volumen der Techniken liegt zwischen der technisch anspruchsvollen Kryo-TEM-Tomographie, die eine molekulare Auflösung bietet, und der Lichtmikroskopie, bei der die Auflösung durch die Beugungsgrenze des Lichts begrenzt ist. Abkürzungen: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; STEM = scannendes TEM; REM = Rasterelektronenmikroskopie; FIB = fokussierter Ionenstrahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Virusbezogene Strukturen und Systeme erstrecken sich über eine Skala vom Sub-Angström-Bereich (z. B. kleine Moleküle für die Virotherapie, isolierte virale Proteine) bis zu mehreren Metern (z. B. ganze infizierte Organismen). Virale Partikel liegen im Bereich von 20-1.000 nm und werden hauptsächlich in ihrem biologischen Kontext untersucht, wie z.B. Wirtszellen und virale Produzentenzelllinien, die im μm-Bereich liegen. Die Visualisierung spezifischer virusbezogener Strukturen hängt daher von der Wahl einer Technik ab, die ein ausreichendes Sichtfeld und eine geeignete Auflösung bietet. Die Untersuchung von virusinfizierten Zellen und Gewebestücken beruht auf Mikroskopietechniken (Abbildung 1). Während mit der klassischen Lichtmikroskopie Übersichtsbilder von Zellen und Geweben aufgenommen werden können, werden intrazelluläre Strukturen, die an der Virusvermehrung beteiligt sind, häufig mit der Elektronenmikroskopie (EM) untersucht. Obwohl EM heute vor allem in der virologischen Grundlagenforschung eingesetzt wird, wird sie auch in der Diagnostik eingesetzt 1,2 und hat auch Eingang in biopharmazeutische Anwendungen gefunden3.

Oft können 2D-EM-Ansätze wie die klassische Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) eine gegebene biologische Fragestellung nicht ausreichend beantworten. In der Virologie ist dies insbesondere der Fall, wenn Virus-Wirt-Zell-Interaktionen wie die Bindung und der Eintritt in Virionen, die Bildung von Virusfabriken oder die Virionenmorphogenese untersucht werden 4,5,6,7,8,9. Daher wird die EM-Tomographie verwendet, um die 3D-Ultrastruktur biologischer Proben zu analysieren. Prinzipiell gibt es zwei Möglichkeiten, ein Tomogramm einer bestimmten Probe zu erfassen: 1) die schrittweise Abbildung von seriellen Schichten, die später zu einem 3D-Bildstapel kombiniert werden, oder 2) die Aufnahme von Projektionen aus verschiedenen Betrachtungswinkeln der Probe, gefolgt von der computergestützten Rekonstruktion der Informationen in einen virtuellen Bildstapel.

Zu den Techniken des ersten Typs gehören die Bildgebung von Serienschnitten mittels TEM oder REM (REM-Array-Tomographie), das serielle Blockflächen-REM und die fokussierte Ionenstrahl-(FIB)-REM-Tomographie. Bei der REM- und TEM-Bildgebung von seriellen Schnitten fehlt die Auflösung in z, die durch die Schnittdicke begrenzt ist, aber ein großes Sichtfeld bietet und auf Geräten basiert, die in den meisten EM-Laboren leicht verfügbar sind4. Die FIB-REM-Tomographie kann eine isotrope Auflösung liefern, aber die Geräte- und Wartungskosten können eine Herausforderung darstellen, und die Bildgebung ganzer Zellen mit isotroper Auflösung ist zeitaufwändig 9,10.

Die zweite Art der Tomographie beruht ausschließlich auf der Übertragung des Elektronenstrahls durch eine Probe. Dies kann mit zwei verschiedenen Bildgebungsmodalitäten erfolgen: TEM oder Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM). Während die TEM-Tomographie weiter verbreitet und einfacher zu implementieren ist, ist die Schnittdicke auf ~200 nm begrenzt. Daher können Strukturen, die größer als die Schnittdicke sind, wie Mitochondrien, Vesikel oder Virionen, nicht in einem einzigen Tomogramm abgebildet werden. Die STEM-Tomographie bietet die Möglichkeit, Proben bis zu einer Dicke von 1 μm 11,12 abzubilden. Es erfordert jedoch einen STEM mit hoher Beschleunigungsspannung (≥200 kV) und einem Aufbau, der sowohl hohe Neigungswinkel als auch einen kleinen Semikonvergenzwinkel13 unterstützt. Obwohl die MINT-Bildgebung eine gängige Technik in den Materialwissenschaften ist, bleibt sie in biologischen EM-Labors eine seltene Technik.

Hier stellen wir einen anwendungsorientierten Ansatz für den Einsatz der STEM-Tomographie für virologische Proben vor. Aufgrund der hohen Komplexität und des arbeitsintensiven Charakters der EM-Tomographie ist eine qualitativ hochwertige Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung. Während die kryogene TEM (Tomographie) zweifellos der Goldstandard für Untersuchungen auf molekularer Ebene ist, bietet die Bildgebung bei Raumtemperatur von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Zellen eine solide Konservierung und Klarheit der zellulären Ultrastruktur 7,14. Kurz gesagt, adhärente Zellen werden auf einer Saphirscheibe gezüchtet und nach Belieben infiziert oder anderweitig behandelt. Die Zellen werden dann immobilisiert, indem sie unter hohem Druck bei sehr hohen Abkühlraten eingefroren werden, was zu einer Verglasung des darin enthaltenen Wassers führt. Anschließend wird das Wasser durch ein Lösungsmittel ersetzt, während die Proben kontrastiert und langsam wieder auf Raumtemperatur gebracht werden. Anschließend werden die Proben nach und nach in Harz eingebettet.

Es gibt viele Protokolle für das Einfrieren und die Gefriersubstitution, die sich in der Maschinerie, dem Trägersystem und der Zusammensetzung der Probe unterscheiden. Detaillierte Protokolle für das Hochdruckgefrieren wurden veröffentlicht, darunter eines von Walther et al.15 und ein Videoprotokoll von Steyer et al.16, das sich auf die Gewebevorbereitung für FIB-REM mittels mikrowellengestützter Kontrastmittelverstärkung konzentriert. Für die virologische Forschung veröffentlichten Read et al.17 und Romero-Brey18 detaillierte Protokolle für die Präparation virusinfizierter Zellen durch Hochdruckeinfrieren mit Saphirscheiben und anschließende Analyse mittels Elektronentomographie. Ultradünne Schnitte wurden bereits zuvor beschrieben 15,17. Weitere Informationen zu diesen Ansätzen finden Sie in der zitierten Literatur.

Hier stellen wir einen Workflow vor, der eine angepasste und aktualisierte Version der zuvor veröffentlichten Protokolle15,17 ist, die zum ersten Mal mit einer detaillierten Videoanleitung gekoppelt ist. Das Protokoll bietet einen Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung unter Verwendung von Hochdruckgefrieren, Gefriersubstitution und Einbettung in Epoxidharz. Abschnitte mit einer Dicke von 800 nm bis 1.000 nm werden mit einem Ultramikrotom geschnitten. Eine Kippreihe wird mit einem 200 kV STEM unter Verwendung der Software EM Tools erfasst. Dieses Protokoll ist für adhärente Zellen optimiert und bietet einen umfassenden Arbeitsablauf, während es gleichzeitig Modifikationen für andere Probentypen wie Gewebe- oder Suspensionszellen ermöglicht. Für die STEM-Tomographie unter kryogenen Bedingungen verweisen wir auf die Arbeit der Arbeitsgruppe19,20 von Michael Elbaum.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellkultur

  1. Vorbereitung von Saphirscheiben
    1. Reinigen Sie die Saphirscheiben, indem Sie 3x in 100% Ethanol für 20 min waschen. Entfernen Sie das restliche Ethanol, indem Sie die Scheiben über ein trockenes Filterpapier ziehen. Lassen Sie die Scheiben mindestens 30 Minuten lang in einer 37 °C warmen Trockenkammer oder bis sie vollständig trocken sind.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden Saphirscheiben mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Dicke von 0,16 mm verwendet. Für andere Systeme, einen für Gewebe- oder Suspensionszellen optimierten Arbeitsablauf, siehe Walther et al.15. Einige "Tipps und Tricks" für kultivierte Zellen und andere Systeme werden von McDonald et al.21 zur Verfügung gestellt.
    2. Beschichten Sie die Saphirscheiben mit Kohlenstoff, indem Sie ca. 50 Saphirscheiben flach auf ein sauberes Uhrglas legen und mit einer Kohlenstoffbeschichtungsvorrichtung mit einer 10-15 nm dicken Kohlenstoffschicht beschichten. Die Scheiben über Nacht bei 120 °C backen, um die Carbonschicht zu stabilisieren.
      ANMERKUNG: Für korrelative EM-Ansätze ist ein Koordinatensystem einzuführen: Platzieren Sie vor der Kohlenstoffbeschichtung ein Suchergitter auf den Saphirscheiben, so dass das Gitter als Negativ auf der Scheibe21 sichtbar ist.
    3. Um später die kohlenstoffbeschichtete Seite der Saphirscheibe identifizieren zu können, ritzen Sie mit einem scharfen Werkzeug (z.B. der Spitze einer Pinzette) eine Markierung in den Kohlenstoff, die nur von einer Seite korrekt gelesen werden kann.
      HINWEIS: Wir empfehlen die Zahl "2" oder ähnlich (Abbildung 2A,B). Überspringen Sie diesen Schritt für Saphirscheiben mit einem beschichteten Koordinatensystem.
    4. Lagern Sie die Saphirscheiben bis zur weiteren Verwendung in einer 37 °C warmen Trockenkammer.
      HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, Saphirscheiben wiederzuverwenden, da dies die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie beim Einfrieren unter hohem Druck brechen.
  2. Zellkultur
    1. Kurz vor dem Platzieren in der Zellkultur wird die kohlenstoffbeschichtete Seite der Scheiben mit einer Glimmentladungsvorrichtung glüht, um sie hydrophil zu machen (z. B. 0,26 mbar mit einem Strom von 20 mA für 40 s). Sterilisieren Sie dann die Scheiben, indem Sie sie 15 Minuten lang UV-Licht aussetzen.
      HINWEIS: Wenn Sie länger als 30 Minuten UV-Licht ausgesetzt sind, kann die Kohlenstoffbeschichtung beschädigt werden.
    2. Legen Sie die Scheiben mit einer sterilen Pinzette auf den Boden einer Kulturschale mit Medien und stellen Sie sicher, dass die Scheiben nicht schwimmen. Säen Sie die Zellen vorsichtig darauf aus. Falls die Saphirscheiben in den Zellkulturmedien schwimmen, glüht sie bei Wiederholung des Experiments für längere Zeit.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die "2" richtig ausgerichtet ist, d.h. dass die kohlenstoffbeschichtete Seite nach oben zeigt. Gewünscht ist eine Zell-Monoschicht auf den Scheiben mit einer finalen Konfluenz von ~80%. Das Zellwachstum auf den Saphirscheiben kann sich von dem in der umgebenden Kulturschale unterscheiden. Überprüfen Sie die Verteilung und Qualität der Zellen auf den Scheiben mit einem inversen Lichtmikroskop, bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren. Die Verteilung der Zellen kann verbessert werden, indem die Platte beim Aussäen der Zellen sanft geschaukelt wird.
      Für Suspensionszellen sind kohlenstoffbeschichtete Saphirscheiben mit Poly-L-Lysin abzudecken oder Kapillaren zu verwenden, wie unter15 beschrieben. Setzen Sie mit Poly-L-Lysin bedeckte Scheiben keinem UV-Licht aus, da dies die Poly-L-Lysin-Beschichtung beschädigen kann.
    3. Führen Sie jede gewünschte Behandlung der Zellen durch (z. B. Infektion, medikamentöse Behandlung), während Sie die Saphirscheiben an Ort und Stelle halten. Gehen Sie vorsichtig mit den Scheiben um, um ein Ablösen von Zellen oder Kratzen der Kohlenstoffschicht zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen entsprechend. Führen Sie eine chemische Präfixierung mit z. B. 2,5 % Glutaraldehyd, 1 % Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,3) oder 4 % Paraformaldehyd gemäß den örtlichen Vorschriften durch, bevor Sie die Proben in den Hochdruckgefrierschranktransportieren 1,7,22.
      HINWEIS: Bevor infizierte Proben Labore mit Biosicherheitsstufe verlassen, müssen alle für das Modellsystem geltenden lokalen Biosicherheitsvorschriften eingehalten werden.

figure-protocol-1
Abbildung 2: Hochdruckgefrieren. (A) Saphirscheiben mit einer Kohlenstoffschicht mit "2" (links) oder einem Koordinatensystem für korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (rechts). (B) Schematische Darstellung eines SD-Gold-Spacer-SD-Sandwiches, wie es für das Hochdruckgefrieren vorbereitet wird. Die auf den Scheiben gezüchteten Zellen stehen sich gegenüber und sind so in dem engen Hohlraum geschützt. (C) Halterung für das Hochdruckgefrieren, die ein SD-Sandwich enthält. (D) Materialien und Vorrichtungen zum Beladen des HPF-Halters: (1) Heizplatte, (2) Stereomikroskop, (3) Filterpapier, (4) Reaktionsgefäß mit 1-Hexadecen, (5) Pinzette, (6) Unbeschichtete SDs, (7) Petrischale mit goldenen Abstandshaltern, (8) HPF-Halter. (E) Einrichtung des HPF-Systems: (1) LN-Box zum Umfüllen von gefrorenen Proben (siehe auch F), (2) Haartrockner zur Beschleunigung des Aufwärmens des HPF-Halters nach dem Einfrieren, (3) Stickstoff-Dewar zum Nachfüllen der LN-Box. (F) LN-Box zur Aufbewahrung von gefrorenen Proben nach dem Hochdruckgefrieren mit einer zentralen Wanne (gestrichelter Umriss), in der der HPF-Halter geöffnet und SDs sicher gehandhabt werden können. Materialien, die direkt nach dem Hochdruckgefrieren benötigt werden: (1) Halterung für bis zu sechs Probenbehälter, (2) Isolierpinzette, (3) Probenbehälter mit Deckel. Die Behälter enthalten kleine Löcher und kleine Gewichte (z. B. eine Schraube), so dass sie in flüssigen Stickstoff eintauchen. Abkürzungen: SD = Saphirscheibe; HPF = Hochdruck-Gefrierschrank; LN = flüssiger Stickstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie

  1. Hochdruck-Gefrieren
    HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt das Hochdruckgefrieren mit dem referenzierten Hochdruck-Gefrierschrank (HPF, Tabelle der Materialien). Die beschriebenen Schritte sollten sich bei anderen Maschinen nicht wesentlich unterscheiden, da sie dem gleichen Zweck dienen.
    1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Hochdruck-Gefrierschrank einzurichten. Stellen Sie eine ausreichende Versorgung mit flüssigem Stickstoff sicher (Abbildung 2E), schalten Sie die Maschine ein und führen Sie einen Testlauf durch.
    2. Richten Sie einen Arbeitsbereich ein, um die Festplatten in den HPF-Halter zu laden (Abbildung 2D). Halten Sie folgende Gegenstände bereit: eine Heizplatte (1), ein Stereomikroskop (2), Filterpapierstücke (3), Reaktionsröhrchen mit Hexadecen als Füllstoff (4), eine Pinzette (5), leere/unbeschichtete Saphirscheiben zum Einfrieren einer ungeraden Anzahl von SDs mit Zellen (6), Goldspacer (7) und den HPF-Halter (8, Ausschnitt in Abbildung 2C).
    3. Bereiten Sie einen Arbeitsbereich für die Handhabung von gefrorenen Proben vor (Abbildung 2E,F). Bevor Sie mit dem Hochdruckgefrieren beginnen, bereiten Sie die folgenden Geräte vor:
      1. Bereiten Sie die LN-Box vor und befüllen Sie sie mit flüssigem Stickstoff (Abbildung 2E, F), um die Handhabung und den Transfer der gefrorenen Saphirscheiben aus dem HPF-Halter in die Speicherkapseln vorzubereiten.
      2. Halten Sie einen kleinen Dewar (3 in Abbildung 2E) bereit und füllen Sie ihn mit flüssigem Stickstoff: Bereiten Sie sich darauf vor, die LN-Box während des Gefriervorgangs mehrmals mit flüssigem Stickstoff zu füllen.
      3. Halten Sie eine isolierte Pinzette (2 in Abbildung 2F) bereit.
      4. Bereiten Sie Probenbehälter vor, in denen die Saphirscheiben nach dem Hochdruckgefrieren aufbewahrt werden (Lagerkapseln, 3 in Abbildung 2F). Achten Sie darauf, dass sie einen Deckel und mehrere Löcher zum Eingießen von flüssigem Stickstoff und kleine Gewichte (z. B. kleine Schrauben oder ähnliches) haben, um sicherzustellen, dass sie nicht schwimmen. Beschriften Sie die Behälter vor Gebrauch und kühlen Sie sie in der LN-Box vor.
        HINWEIS: Wir verwenden BEEM-Kapseln als Aufbewahrungskapseln.
    4. Bewahren Sie die Proben in einem Inkubator in der Nähe des Hochdruckgefrierschranks auf, wenn die Zellen nicht vorangestellt wurden oder, falls dies nicht möglich ist, auf einer beheizten Platte (1 in Abbildung 2D), um die physiologischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) so lange wie möglich aufrechtzuerhalten.
    5. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen auf den Saphirscheiben und eine gute Zellqualität vorhanden sind, bevor Sie mit dem Hochdruckgefrieren beginnen. Untersuchen Sie dazu die Scheiben mit einem Inverslichtmikroskop.
    6. Führen Sie ein Hochdruck-Einfrieren durch.
      1. Nehmen Sie eine Saphirscheibe mit einer Pinzette aus der Kulturschale und legen Sie sie mit der kohlenstoffbeschichteten Seite nach oben in den HPF-Halter (Abbildung 2C) ("2" ist ablesbar). Entfernen Sie zuvor überschüssige Medien, indem Sie die Scheibe schnell in Filterpapier tauchen, aber achten Sie darauf, dass die Zellen nicht trocken fallen.
      2. Tauchen Sie einen goldenen Abstandshalter in Hexadecen und legen Sie ihn vorsichtig auf die Saphirscheibe. Nehmen Sie eine zweite Saphirscheibe und positionieren Sie sie mit der kohlenstoffbeschichteten Seite nach unten auf dem goldenen Abstandshalter, so dass ein Saphirscheibe - Goldabstandshalter - Saphirscheibensandwich entsteht, wobei die Zellen zueinander zeigen. Stellen Sie sicher, dass keine Luft im Sandwich-Hohlraum eingeschlossen ist.
      3. Schließen Sie den HPF-Halter. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig, aber schnell durch, um die Belastung der Probe zu minimieren, insbesondere bei lebenden Zellen, denen kein Präfix vorangestellt wurde.
        HINWEIS: Bei Proben, die krebserregende, erbgutverändernde oder fortpflanzungsgefährdende (CMR) Substanzen enthalten, wie z. B. chemische Fixiermittel, laden Sie den HPF-Halter unter einen Abzug, um die Exposition zu minimieren.
      4. Starten Sie den Einfriervorgang. Setzen Sie den HPF-Halter schnell in den Hochdruck-Gefrierschrank ein, verriegeln Sie ihn gemäß den Herstellerangaben und leiten Sie den Gefriervorgang ein.
    7. Entnehmen Sie die vitrifizierten Proben aus dem HPF-Halter. Übertragen Sie schnell die Spitze des HPF-Halters, der die nun gefrorenen Saphirscheiben trägt, in die vorgekühlte LN-Box. Nehmen Sie die Scheiben vorsichtig aus dem HPF-Halter in die zentrale Wanne in der LN-Box (gestrichelte Linie in Abbildung 2F). Erwärmen Sie danach den HPF-Halter und entfernen Sie alle Ethanolreste oder Hexadecen, bevor Sie mit dem Zusammenbau des nächsten Sandwiches beginnen.
      HINWEIS: Stellen Sie von nun an sicher, dass alles, was die Scheiben berührt, in flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist. Führen Sie die Übertragungsschritte schnell in einer Stickstoffatmosphäre durch und lagern Sie die Scheiben in flüssigem Stickstoff, um ein Auftauen der Probe zu vermeiden. Üben Sie den Transfer des Halters von der HPF in die LN-Box im Voraus, um einen reibungslosen und schnellen Übergang zu gewährleisten. Der Erwärmungsprozess des Halters kann nach dem Einfrieren mit einem Fön beschleunigt werden (2 in Abbildung 2E).
    8. Nachdem Sie die Saphirscheiben aus dem Halter genommen haben, legen Sie sie in die etikettierten Behälter, entweder zum Transfer in die Gefriersubstitutionsvorrichtung oder zur Lagerung von flüssigem Stickstoff bis zur weiteren Verarbeitung. Wenn die Saphirscheiben nach der HPF dicht aneinander gestapelt sind, verwenden Sie ein Skalpell, um die Saphirscheiben vor dem Einfrieren zu trennen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Scheiben nicht zu brechen und Scherkräfte zu vermeiden. Planen Sie für diesen Schritt genügend Zeit ein.
  2. Einfrieren-Substitution
    1. Richten Sie die Gefrier- und Substitutionsvorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Füllen Sie den Flüssigstickstoff-Dewar und starten Sie das Programm zum Vorkühlen der Probenkammer auf -90 °C. Stellen Sie sicher, dass genügend flüssiger Stickstoff für den gesamten Substitutionsprozess vorhanden ist.
      HINWEIS: Die beteiligten Chemikalien sind gefährlich. Führen Sie alle Schritte unter einem Abzug durch und halten Sie die lokalen Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien (EHS) ein.
    2. Bereiten Sie die Gefriersubstitutionslösung vor, die 0,1 % (w/v) Uranylacetat, 0,2 % (w/v) Osmiumtetroxid (OsO 4) und 5 % (v/v) Wasser in Aceton enthält. Um ein Volumen von 6 mL herzustellen (ausreichend zum Befüllen von 24 Kryofläschchen, was der maximalen Kapazität des hier verwendeten Substitutionsgeräts entspricht), gehen Sie folgendermaßen vor:
      1. Wiegen Sie 6 mg Uranylacetat in ein Glasgefäß mit dichtem Deckel ab.
      2. 300 μl 4 % (w/v) Osmiumtetroxid in Wasser geben.
      3. Schließen Sie das Gefäß und beschallen Sie es 5 Minuten lang, um das Uranylacetat aufzulösen.
      4. Fügen Sie 5,7 ml Aceton hinzu, mischen Sie die Lösung und verteilen Sie sie gleichmäßig in Kryoröhrchen, die mit dem Gefriersubstitutionsgerät kompatibel sind.
    3. Die geschlossenen Kryofläschchen mit der Gefrier-Substitutionslösung in die vorgekühlte Gefrier-Substitutionsvorrichtung bei -90 °C geben und warten, bis die Lösung ebenfalls auf -90 °C abgekühlt ist (ca. 20 min).
    4. Füllen Sie die LN-Box mit flüssigem Stickstoff. Um die Saphirscheiben in das Gefrier-Substitutionsgerät zu übertragen, kühlen Sie eine Pinzette, ein Skalpell und eine Zange (oder eine große Pinzette) in flüssigem Stickstoff vor.
    5. Verwenden Sie die vorgekühlte große Pinzette, um die Vorratskapseln mit den unter hohem Druck gefrorenen Proben aus dem Lagertank in die LN-Box zu überführen.
      HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um ein Auftauen der Proben zu verhindern. Bei der Verarbeitung von Proben direkt nach dem Hochdruckgefrieren kann dieser Schritt übersprungen werden.
    6. Übertragen Sie die unter hohem Druck eingefrorenen Proben in das Gefrier-Substitutionsgerät. Trennen Sie die Saphirscheiben nacheinander und bewahren Sie sie in flüssigem Stickstoff auf. Übertragen Sie jede Scheibe schnell einzeln in ein Kryofläschchen mit Gefrier-Substitutionslösung, um sicherzustellen, dass die Scheibe vollständig eingetaucht ist. Schließen Sie das Kryofläschchen und setzen Sie es sofort wieder in die Gefrier-Substitutionsvorrichtung ein.
      HINWEIS: Bewahren Sie das Kryofläschchen während des Transfers in der Atmosphäre mit flüssigem Stickstoff auf, um ein Erwärmen der Substitutionslösung zu verhindern, jedoch nicht in flüssigem Stickstoff, um ein Einfrieren zu verhindern. Halten Sie die Durchstechflasche mit den Fingern nahe am Deckel, um ein Erwärmen der Substitutionslösung zu vermeiden. Gehen Sie vorsichtig mit der Substitutionslösung um, da sie giftige Substanzen enthält.
    7. Sobald alle Festplatten in das Substitutionsgerät übertragen wurden, starten Sie den Freeze-Substitutionsprozess. Stellen Sie das Gerät so ein, dass die Temperatur während 16 Stunden allmählich von -90 °C auf 0 °C angehoben wird, mit einem 1-stündigen Inkubationsschritt bei 0 °C, gefolgt von einem allmählichen Anstieg auf 20 °C über 1 h.
    8. Sobald die Proben 20 °C erreicht haben, fahren Sie direkt mit dem Waschen der Proben für 3 x 30 min mit 100% Aceton fort.
      HINWEIS: Lassen Sie die Zellen auf den Scheiben nicht trocken fallen. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter einem Abzug durch. Sammeln Sie alle Abfälle in einem geeigneten Behälter und entsorgen Sie ihn gemäß den örtlichen EHS-Vorschriften.
  3. Einbettung
    1. Epoxidharz nach Herstellerangaben frisch zubereiten.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Epoxidharz unter einem Abzug durch. Wir empfehlen, aufgrund der niedrigeren Viskosität und damit der besseren Probeninfiltration für jedes Einbettungsverfahren frisches Harz vorzubereiten.
    2. Um die Proben voreinzubetten, inkubieren Sie die Proben in einer Lösung, die 1/3 Epoxidharz und 2/3 Aceton enthält, für 1 h. Die Lösung durch 2/3 Epoxidharz und 1/3 Aceton ersetzen und 3 h inkubieren. Tauschen Sie die Lösung gegen 100% Epoxidharz aus und lassen Sie sie über Nacht bei geöffnetem Fläschchendeckel inkubieren, damit das restliche Aceton verdunsten kann.
    3. Am nächsten Tag werden die Saphirscheiben in neue, beschriftete Reaktionsgefäße umgefüllt, die mit frisch aufbereitetem Epoxidharz gefüllt sind. Positionieren Sie die Scheiben waagerecht, gestützt von der Wand des Reaktionsgefäßes, und stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Zellen im Reaktionsgefäß nach oben zeigt (die "2" ist unter einem Stereomikroskop lesbar). Stellen Sie die Reaktionsgefäße bei geöffnetem Deckel bei 60 °C in einen Ofen und lassen Sie das Epoxidharz mindestens 48 h polymerisieren.
      HINWEIS: Wenn ein Saphirscheibenfragment eingebettet werden muss, betten Sie es mit Hilfe einer polymerisierten Spitze eines Harzblocks eines früheren Experiments ein: Legen Sie die Spitze in das Reaktionsröhrchen, füllen Sie das Röhrchen mit frischem Harz und legen Sie die zerbrochene Scheibe auf die polymerisierte Spitze.
      Mit Epoxidharz verunreinigte Einweg-Verbrauchsmaterialien sollten bei 60 °C in einen Ofen gestellt werden, damit das Harz vor der Entsorgung vollständig polymerisieren kann. Pinzetten und andere Gegenstände können vorher mit Ethanol abgewischt werden.
    4. Die Spitze eines geschlossenen Reaktionsrohrs wird ca. 10 s lang in flüssigen Stickstoff getaucht. Entfernen Sie anschließend den Harzblock aus dem Reaktionsrohr, indem Sie das Reaktionsrohr auf den Tisch schlagen. Die Saphirscheibe löst sich leicht von der Kohlenstoffschicht, die auf den eingebetteten Zellen verbleibt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Ihr Einbettmedium die durch die Behandlung mit flüssigem Stickstoff induzierten Temperaturänderungen toleriert.
  4. Erstellung von STEM-Tomographie-Schnitten
    1. Bereiten Sie Schnitte vor, die viel dicker als ultradünne Schnitte für die TEM-Bildgebung sind, in der Regel zwischen 800 nm und 1 μm.
      HINWEIS: Die Vorbereitung der Schnitte für die STEM-Tomographie unterscheidet sich geringfügig von der herkömmlichen Ultramikrotomie. Für ein detailliertes Protokoll, das die Vorbereitung von STEM-Tomographie-Schnitten beschreibt, verweisen wir auf Walther et al.15 und Villinger et al.10.
      Bevor Sie mit der Erstellung von STEM-Tomographie-Schnitten fortfahren, vergewissern Sie sich, dass die Qualität der Zellen gut ist. Führen Sie dazu ultradünne Schnitte (~70 nm) und TEM-Analysen durch (Abbildung 3D,E).
    2. Sammeln Sie die Abschnitte auf Kupfergittern mit parallelen Stäben, so dass keine Gitterstäbe den Elektronenstrahl blockieren, wenn die Probe in hohe Winkel gekippt wird. Für eine bessere Schnittbefestigung behandeln Sie die Gitter mit 0,01 % Poly-L-Lysin: Bereiten Sie ein kleines Aliquot aus 0,01 % Poly-L-Lysin aus einer 0,1 %igen Stammlösung vor, tauchen Sie die Gitter in das Aliquot, trocknen Sie sie vorsichtig ab, indem Sie den Rand des Gitters über ein Filterpapier ziehen. Entlade die Gitter und verwende sie, um die Abschnitte zu sammeln.
    3. Behandeln Sie Schnitte mit kolloidalem Gold als Referenzmarker für die Ausrichtung der Neigungsreihen (siehe Abschnitt 3).
    4. Tragen Sie eine Carbonschicht auf die Abschnitte auf, um sie zu stabilisieren und leitfähiger zu machen.

figure-protocol-2
Abbildung 3: Qualitätskontrolle durch TEM-unterschiedliches Erscheinungsbild von Zellen nach Einbetten, Trimmen und ultradünnem Schnitten. (A) In Epoxidharz eingebettete Zellen nach der Entfernung der SD. Die Carbonschicht mit der eingeritzten "2" verbleibt auf den in Harz eingebetteten Zellen und ist deutlich sichtbar. Die nahezu transparenten Zellen sind gleichmäßig über die Blockfläche verteilt. (B) Getrimmte Blockfläche vor der Mikrotomie. Ein Teil der zerkratzten 2 ist noch auf der Oberfläche des Harzblocks sichtbar. (C) 70 nm dünne Schnitte, die auf einem TEM-Gitter montiert sind. (D) TEM-Übersicht über einen gesamten ultradünnen Schnitt. Beachten Sie die Löcher im Schnitt (weiße Pfeilspitzen), die durch unvollständige Harzinfiltration entstanden sind und ein häufiges Artefakt sind. (E) Vergrößerte Ansicht einer ausgewählten Zelle, die in (D) mit einem weißen Rechteck markiert ist. Ähnlich wie bei (D) ist eine unvollständige Einbettung an der Plasmamembran sichtbar (weiße Pfeilspitzen); Der Rest der Zelle zeigt jedoch eine gute Konservierung und Einbettung. Maßstabsleisten = 100 μm (D), 10 μm (E). Abkürzungen: SD = Saphirscheibe; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Bildgebung

  1. Erfassung der STEM Tilt-Serie
    1. Richten Sie das Mikroskop gemäß den Richtlinien des Herstellers ein. Stellen Sie die korrekte Ausrichtung des Strahls sicher.
    2. Füllen Sie den Flüssigstickstoff-Dewar vorsichtig am Mikroskop auf.
    3. Wählen Sie den richtigen Tomographie-Halter in der Mikroskop-Bediensoftware aus.
    4. Setzen Sie das Gitter in die Halterung ein. Achten Sie darauf, dass die Stäbe des Gitters senkrecht zur Kippachse ausgerichtet sind, um zu verhindern, dass die Stäbe den Elektronenstrahl bei hohen Neigungswinkeln blockieren.
    5. Setzen Sie die Halterung in das Mikroskop ein.
    6. Richten Sie den Balken aus, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
      1. Laden Sie die vom Hersteller bereitgestellte Ausrichtungsdatei. Öffnen Sie das Strahlventil und arbeiten Sie vorerst im TEM-Modus . Stellen Sie eine Vergrößerung von ca. 20.000x ein und stellen Sie den Standardfokus ein, indem Sie STD Focus drücken.
      2. Suchen Sie nach einem Loch in der Probe. Dies ist im Modus mit geringer Vergrößerung einfacher ( LowMag drücken).
      3. Stellen Sie sicher, dass keine Blende eingesetzt ist. Legen Sie die Spot-Größe auf 1 und Alpha auf 3 fest. Minimieren Sie den Strahl auf dem Bildschirm, indem Sie die Helligkeitstaste gegen den Uhrzeigersinn drehen und mit den Strahlverschiebungstasten zentrieren.
      4. Korrekte Ausrichtung der Pistole: Wählen Sie im Ausrichtungsfenster der Mikroskop-Bediensoftware die Option Pistole und den Anodenwobbler aus. Passen Sie die Symmetrie des Strahls mit den Tasten DEF/STIG an. Vergewissern Sie sich, dass die Bewegung des Strahls auf dem Leuchtstoffschirm homogen ist. Verschieben Sie den hellsten Punkt mit den SHIFT-Tasten in die Mitte des Bildschirms. Deaktivieren Sie alle, wenn Sie fertig sind.
      5. Korrigieren Sie die Kondensatorstigmatoren: Wählen Sie im selben Ausrichtungsfeld CLA und den HT-Wobbler aus. Mit den DEF/STIG-Tasten einstellen, um eine homogene Bewegung zu erzielen.
      6. Kondensorlinsenblende einstellen: Maximiere den Strahl auf dem Leuchtstoffbildschirm, indem du die Helligkeitstaste im Uhrzeigersinn drehst. Setzen Sie die kleinste Kondensorlinsenblende ein und stellen Sie sicher, dass sie durch Wechsel der Helligkeit korrekt im Strahl ausgerichtet ist. Wenn sich der Strahl auf dem Bildschirm asymmetrisch bewegt, stellen Sie die Blende manuell mit den manuellen Blendenantrieben ein. Wenn die Apertur auf dem Leuchtstoffschirm verzerrt erscheint, korrigieren Sie die Kondensorstigmatoren CLA erneut mit DEF/STIG (vorheriger Schritt 3.1.6.5).
      7. Wechseln Sie in den STEM-Modus (wählen Sie ASID).
        HINWEIS: Sie können den Dialog zur Objektiventspannung nach 5-10 s unterbrechen.
      8. Verschieben Sie den Tisch in einen dünnen, kontrastreichen Bereich des Samples. Drücken Sie STD Focus und entfernen Sie alle Blenden. Wechseln Sie zu einer Vergrößerung von 25.000 mit einer Spotgröße von 1,5 nm, stellen Sie die Kameralänge zwischen 80 und 120 cm ein und wählen Sie den Spot-Modus.
      9. Ändern Sie den Z-Wert des Goniometers, bis das Ronchigramm auf dem Bildschirm sichtbar ist. Ändern Sie die Kameralänge, wenn das Ronchigramm schwach ist. Wenn es nicht rund ist, verwenden Sie die Taste COND Stig , um es einzustellen.
      10. Setzen Sie die kleinste Blende des Kondensorobjektivs ein. Verwenden Sie die manuellen Blendenantriebe, um die Blende um das Ronchigramm herum zu zentrieren.
    7. Setzen Sie den entsprechenden Melder ein. Verwenden Sie je nach Forschungsfrage den Hellfelddetektor und/oder den Dunkelfelddetektor. Aktivieren Sie den Scan-Modus und erfassen Sie ein erstes Testbild der Probe.
    8. Wählen Sie eine Vergrößerung, die größer ist als die für das Tomogramm gewünschte (höher als 800.000x). Korrekte Fokussierung und Hornhautverkrümmung: Führen Sie dies in der Nähe, aber nicht direkt in der Region of Interest (ROI) durch, um Strahlschäden an kritischen Probenbereichen zu vermeiden.
      HINWEIS: Die goldenen Passermarken können diesen Schritt erleichtern.
    9. Stellen Sie die euzentrische Höhe ein, um sicherzustellen, dass der ROI über den gesamten Neigungsbereich zentriert bleibt (d. h. -72 ° bis 72 °). Wählen Sie ein Merkmal in der Nähe des ROI aus, bringen Sie es in die Mitte, fokussieren, korrigieren Sie den Astigmatismus und neigen Sie den Tisch schrittweise auf - 72°. Passen Sie die Z-Position des Halters an, um die Funktion zentriert zu halten, und passen Sie bei Bedarf Kontrast und Helligkeit an. Wiederholen Sie dies bei Bedarf, indem Sie es schrittweise auf +72° neigen.
    10. Wählen Sie das Sichtfeld aus, indem Sie zurück zum ROI navigieren, fokussieren und ein Übersichtsbild erhalten (Abbildung 4). Stellen Sie die gewünschte Vergrößerung für die Erfassung von Neigungsreihen ein.
    11. Richten Sie die automatische Neigungsserienerfassung von Bildern von -72° bis +72° und alle 1,5° ein.
    12. Um mechanischen Effekten entgegenzuwirken, die beim Umschalten der Richtung der Tischneigung auftreten, beginnen Sie die Neigungsreihe mit einem größeren Winkel als dem, mit dem Sie die Bildgebung beginnen möchten. Wenn Sie von -72° bis 72° fotografieren, neigen Sie zunächst den Tisch von 0° bis -74° und beginnen Sie dann mit der Bildaufnahme auf dem Weg zu +72°, wobei Sie das erste Bild bei -72° aufnehmen.
    13. Starten Sie die automatische Erfassung der Neigungsreihen. Stellen Sie sicher, dass die dynamische Fokussierung in der Erfassungssoftware aktiviert ist.
      HINWEIS: Wenn die Erfassung der Neigungsreihe vorzeitig beendet wird, korrigieren Sie die euzentrische Höhe. Insbesondere bei höheren Vergrößerungen kann dies zu Problemen bei der automatischen Erfassung von Neigungsreihen führen, da der ROI aus dem Sichtfeld migriert wird.
      Eine häufig verwendete Software für die STEM- und TEM-Tomographie ist SerialEM. Kirchweger et al.20 haben ein Videoprotokoll für die Kryo-STEM-Tomographie mittels SerialEM veröffentlicht, das sich leicht an die STEM-Tomographie bei Raumtemperatur anpassen lässt.

figure-protocol-3
Abbildung 4: Erfassung der Kippreihen. (A) 200 kV STEM. (B) STEM-Überblick über eine unter hohem Druck eingefrorene, gefriersubstituierte Zelle, die in Epoxidharz eingebettet ist. Die in (C-E) gezeigte Neigungsreihe wurde an der Position erfasst, die mit dem weißen Rechteck markiert ist. (C-E) Ausgewählte Bilder einer Neigungsserie, die von -72° bis +72° aufgenommen wurde. Goldtreuhänder auf beiden Seiten des Schnitts werden für die rechnerische Tomogramm-Rekonstruktion verwendet. Gehäufte Passermarken, wie sie mit den weißen Ellipsen markiert sind, können nicht für die Rekonstruktion des Tomogramms verwendet werden, sind aber bei hohen Neigungswinkeln gut erkennbar. Diese oder ähnliche Strukturen außerhalb des interessierenden Bereichs sind nützlich, um die euzentrische Höhe einzustellen. Maßstabsleiste = 1 μm (B). Abkürzung: STEM = Rastertransmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Tomogramm-Rekonstruktion und -Segmentierung

  1. Führen Sie eine Tomogramm-Rekonstruktion durch (z. B. mit der Etomo-Software des IMOD-Softwarepakets23).
    1. Führen Sie die erste Ausrichtung der Neigungsreihe durch, und rekonstruieren Sie das Tomogramm mit Hilfe der gewichteten Rückprojektion.
      HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll finden Sie auf der IMOD-Website: IMOD Tomography Guide (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html). Zur Verarbeitung von Bildern, die mit dem Dunkelfelddetektor aufgenommen wurden, wird auf die zuvor publizierte Arbeit11,13 verwiesen.
  2. Segmentieren Sie zelluläre Strukturen (z. B. mit Software wie 3DMOD aus dem IMOD-Paket oder KI-basierten Lösungen).

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die STEM-Tomographie bietet die Möglichkeit, dickere Schnitte als die TEM-Tomographie mit isotroper Auflösung im Nanometerbereich abzubilden und bietet im Vergleich zur FIB-REM-Tomographie einen relativ zeiteffizienten Bildgebungs-Workflow. In der Virologie ist dies besonders nützlich, da es die Abbildung einer großen Anzahl ultrastruktureller Merkmale für die statistische Analyse in 3D oder bei der Suche nach seltenen Ereignissen ermöglicht. Hier zeigen wir zwei repräsentative Ergebnisse, die zeigen, wie die MINT-Tomographie im Hinblick auf diese beiden Aspekte eingesetzt werden kann.

Visualisierung von knospenden rekombinanten VSV-Virionen

Es gibt eine Vielzahl von Viren, die Partikel unterschiedlicher Form und Größe bilden. Um die Form von Virionen in einer Virussuspension zu analysieren, reicht oft eine einfache Methode wie die Negativfärbung TEM aus. Schwieriger ist es, die Morphologie von Virionen im zellulären Kontext zu charakterisieren. Dies gilt insbesondere für Viren, die Partikel mit anisotroper Morphologie bilden, wie z. B. Rhabdoviridae. VSV ist ein Rhabdovirus, das kugelförmige Virionen von ~180 nm Länge bildet. In Suspensionszellen sind die Virionen zufällig ausgerichtet, was es schwierig macht, die Geschossform in 2D-Bildern immer zu erkennen (Abbildung 5A-C). Um die Geschossform aller rekombinanten VSV-Virionen in einer Probe richtig zu definieren, ist eine 3D-Methode mit isotroper Auflösung erforderlich, die auch volumetrische Informationen über einen ausreichend großen Probenbereich liefern kann. Ein STEM-Tomogramm kann viele vollständige Virionen in einem einzigen Datensatz enthalten (Abbildung 5D,E). Dadurch ist es möglich, eine hohe Anzahl von Virionen für die statistische Analyse abzubilden, auch wenn nur ein Tomogramm pro Zelle aufgenommen wird. Im Vergleich dazu würde ein TEM-Tomogramm eines 200 nm mächtigen Abschnitts nur wenige vollständige rekombinante VSV-Virionen erfassen (wie in Abbildung 5E markiert).

figure-results-1
Abbildung 5: STEM-Tomographie von rekombinanten VSV-Knospenstellen. (A-C) Details aus einem virtuellen Schnitt eines STEM-Tomogramms, das aus einem 800 nm dicken Schnitt gewonnen wurde, zeigen, dass die Geschossform aufgrund der unterschiedlichen Ausrichtung der Virionen (A,B) nicht immer sichtbar ist. (C) Nur Virionen, die parallel zur Betrachtungsebene ausgerichtet sind, stellen sich als wohldefinierte Kugeln dar. (D) Knospende Stellen von rekombinantem VSV ähneln großen Clustern von Virionen ohne bevorzugte Orientierung. (E) Die Seitenansicht des Tomogramms zeigt die Fähigkeit, mit Hilfe der STEM-Tomographie viele vollständige rekombinante VSV-Virionen in einem Schnitt zu erfassen. Der virtuelle Bildstapel hat an dieser Position eine Dicke von ca. 600 nm. Die gestrichelten Linien stellen die ungefähre Dicke eines Schnitts für die TEM-Tomographie (200 nm) dar, in dem nur wenige vollständige kugelförmige Virionen enthalten wären. Maßstabsleiste = 500 nm (D). Abkürzungen: STEM = Rastertransmissionselektronenmikroskopie; VSV = vesikuläres Stomatitis-Virus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbau von EF-C-Peptid-Nanofibrillen

Im Rahmen der Gentherapie sind transduktionsverstärkende Peptid-Nanofibrillen zu einem interessanten Thema geworden. In einer kürzlich veröffentlichten Studie24 wurde die korrelative Bildgebung mittels Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) und STEM Tomographie (FRET-3D-CLEM) eingesetzt, um die Aufnahme und den Abbau von EF-C Peptid-Nanofibrillen zu untersuchen. Hohe FRET-Wirkungsgrade, die den nahe beieinander liegenden FRET-Paaren entsprechen, emittieren eine rote Fluoreszenz, die den assemblierten Fibrillen entspricht. Niedrige FRET-Wirkungsgrade, die FRET-Paaren entsprechen, die weit voneinander entfernt sind, emittieren grüne Fluoreszenz, die zerlegte Fibrillen darstellt. Beide Signale treten in Zellen auf, wenn sie dabei sind, EF-C-Peptid-Nanofibrillen aufzunehmen und abzubauen. Bereiche, in denen hohe und niedrige FRET-Wirkungsgrade zu finden sind, werden gelb dargestellt (Abbildung 6A).

figure-results-2
Abbildung 6: Bildgebung des Abbaus von EF-C-Peptid-Nanofibrillen durch korrelative FRET-Bildgebung und STEM-Tomographie (FRET-3D-CLEM). (A) Konfokale Mikroskopie einer Zelle, die mit EF-C-Nanofibrillen inkubiert wurde, die mit einem FRET-Paar markiert wurden. Grüne Signale entsprechen vermeintlich zerlegten Fibrillen. Rot entspricht vermeintlich intakten Fibrillen. Gelb entspricht Bereichen, in denen eine Mischung aus rotem und grünem Signal erkannt wird. Nu Kern. (B) STEM-Übersicht eines 800 nm dicken Schnitts aus derselben Zelle. (C) Die Position des Tomogramms wird angezeigt. Das Bild ist eine Komposition aus zwei Bildern, die in verschiedenen Schnitten aufgenommen wurden, da die Zelle teilweise durch das Balkengitter auf einem der Schnitte blockiert wurde. Der Zellkern ist in A, B und C mit Nu markiert. (C) Virtueller Schnitt aus dem Tomogramm. Rote Pfeilspitzen markieren Bereiche, die sich mit roten Fluoreszenzsignalen überlappen. Die STEM-Tomographie bestätigt das Vorhandensein von intakten Fibrillen. Die grüne Pfeilspitze zeigt auf eine Region mit zerlegten Fibrillen. (D) Segmentierung des Tomogramms. Ein endozytiertes Filopodium klemmt die Vesikelmembran ab (weißer Pfeil). Das große Volumen, das mit einem STEM-Tomogramm untersucht werden kann (hier ungefähr: 7 μm x 7 μm x 550 nm), erleichtert die Beobachtung eines solch seltenen Ereignisses. (E) Virtuelle Abschnitte 19, 24 und 29 des Tomogramms. Bei einer Pixelgröße von 6,8 nm liegen die Abschnitte jeweils 27,2 nm auseinander. Die Abbildung ist eine Reproduktion der von Rauch-Wirth et al.24 veröffentlichten Daten. Maßstabsleisten = 5 μm (A), 1 μm (C). Abkürzungen: STEM = Rastertransmissionselektronenmikroskopie; FRET = Foerster Resonanz Energieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Visualisierung wurde mit diesem korrelativen Ansatz durchgeführt, um zu bestätigen, dass EF-C-Fibrillen von der Zelle aufgenommen und anschließend abgebaut werden. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es uns, Zellen für die Elektronenmikroskopie auszuwählen, die rote und grüne Signale liefern, um das ultrastrukturelle Erscheinungsbild zu vergleichen, das mit den verschiedenen Fluoreszenzsignalen korreliert. STEM-Tomogramme aus derselben Zelle zeigen, dass das rote Signal entweder von Fibrillen stammen kann, die sich noch außerhalb der Zelle befinden, oder scheinbar frisch durch Makropinozytose internalisiert wird (Abbildung 6C). Darüber hinaus überprüfte CLEM, dass das grüne Signal tatsächlich von abgebauten Fibrillen stammte (Abbildung 6B,C, die in Lysosomen zu finden ist (Abbildung 6C, größtes Vesikel). Aufgrund des großen Volumens, das durch die STEM-Tomographie zugänglich ist, und der 3D-Visualisierung der Strukturen ist es einfacher, das Signal aus der Lichtmikroskopie mit ultrastrukturellen Merkmalen zu korrelieren und zu interpretieren. Darüber hinaus können mit diesem Ansatz seltene Ereignisse, wie z.B. das Abkneifen von Filopodien im Lysosom (Abbildung 6D,E, weißer Pfeil), nachgewiesen werden.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die STEM-Tomographie bietet eine mit der TEM-Tomographie vergleichbare Auflösung in Kombination mit der Möglichkeit, Volumina mit einer Dicke von bis zu 1 μm zu untersuchen. Wir halten es daher für ideal für die Darstellung virusinduzierter Veränderungen intrazellulärer Strukturen, wie z.B. Membranumbau 4,6,25, Knospung von Virionen7 oder Endozytose5. Abhängig von der Forschungsfrage können auch andere VolumeEM-Techniken in Betracht gezogen werden. Für eine Technik, die ein größeres Gesichtsfeld bei vergleichbarer Auflösung bietet, empfehlen wir die FIB-REM-Tomographie. Die FIB-REM-Tomographie ist langsamer als die STEM-Tomographie, wenn ein vergleichbares Volumen mit ähnlicher Auflösung abgebildet wird, da die Bildgebungszeit mit zunehmender Auflösung zunimmt. Oft wird dies dann durch die Abbildung kleinerer Sichtfelder gegenläufig ausgemessen. Darüber hinaus wäre eine z-Auflösung von 6,8 nm (Abbildung 6) beim Ionenstrahlfräsen eine technische Herausforderung. Daher ist das FIB-REM optimal für die Abbildung größerer Strukturen wie ganzer Zellen und Gewebe 9,10,26,27, wenn auch in der Regel mit (isotropen) Pixelgrößen von mehreren Dutzend Nanometern. Darüber hinaus zeigen FIB-SEM-Tomogramme keine "Missing Wedge"-Effekte, was typisch für Tomogramme ist, die aus einer Tilt-Serie rekonstruiert werden. Darüber hinaus werden mit der Entwicklung von Plasma-FIB-Maschinen derzeit Alternativen auf dem Feld eingeführt, die ein schnelleres und dennoch präzises Fräsen ermöglichen.

Wenn eine hohe Auflösung in z nicht entscheidend ist, kann die TEM- oder REM-Bildgebung von Serienschnitten eine Alternative sein, die es ermöglicht, ein sehr großes Gesichtsfeld in kurzer Zeit zu untersuchen28,29, jedoch in der Regel mit anisotroper Auflösung. In der TEM-Tomographie können verschiedene Tomogramme aus seriellen Dickschnitten kombiniert werden30,31. Das Gleiche ist in der MINT-Tomographie möglich; Angesichts der Dicke der zu untersuchenden Abschnitte ist es jedoch weniger notwendig, eine Reihe von Tomogrammen zu kombinieren. In der Virologie wird die TEM-Tomographie häufig zur Charakterisierung des virusinduzierten Membranumbaus eingesetzt 32,33,34,35. Während die TEM-Tomographie selbst wertvolle Einblicke in den Replikationszyklus von Viren liefert, würden die meisten Anwendungsfälle von der Fähigkeit der STEM-Tomographie profitieren, dickere Volumina abzubilden. Dies gilt insbesondere für Virionen mit einer anisotropen Morphologie, wie z.B. Rhabdoviridae, bei denen die TEM-Tomographie nur wenige vollständige Virionen in einem Tomogramm erfassen kann35, oder für die Abbildung mehrerer umhüllender Virionen in einem Replikationskompartiment mit einer Größe des zytoplasmatischen Virusanordnungskomplexes (cVAC) des humanen Cytomegalievirus (HCMV)4.

Die STEM-Tomographie unter kryogenen Bedingungen bietet weitere funktionelle Einblicke19 und ein Videoprotokoll steht zur Verfügung20. Unser Protokoll unterscheidet sich durch den Arbeitsablauf bei der Probenvorbereitung, der die Probe nicht im nativen Zustand konserviert, sondern eine nahezu native ultrastrukturelle Konservierung ermöglicht. Während die STEM-Tomographie von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben nicht die ultrastrukturelle Konservierung und atomare Auflösung erreichen kann, die bei kryogener EM zu sehen ist, profitiert sie von den Vorteilen einfacherer Geräte, stabilerer Proben und eines höheren Durchsatzes.

Die folgenden Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Methode:

Zunächst ein klares Ziel des bildgebenden Experiments. Aufgrund des arbeitsintensiven Charakters der Technik ist ein gut geplantes Experiment mit einem klaren Ziel für die Bildgebung erforderlich. Detailliertes Wissen über das Modellsystem -- Zelllinie und Virus -- sollte im Vorfeld mit anderen Methoden gewonnen werden, die weniger schwierig durchzuführen sind. Daher ermutigen wir dazu, die Infektiositätsraten in lichtmikroskopischen Vorversuchen zu optimieren und die experimentellen Bedingungen an das biologische System anzupassen. Zu den Optimierungsparametern gehören die Anzahl der Zellen, die Multiplizität der Infektion (MOI) und Zeitpunkte basierend auf dem Virus und dem abzubildenden Ereignis. Dadurch wird ein hoher Anteil an auswertbaren Zellen in der Probe sichergestellt.

Zweitens, eine qualitativ hochwertige Probenvorbereitung. Wir betonen die Bedeutung einer qualitativ hochwertigen Probenvorbereitung. Gegenwärtig betrachten wir die Vitrifikation durch Hochdruckgefrieren als Goldstandard für dicke Proben wie Zellen. Die Gefriersubstitution, Einbettung und anschließende Bildgebung bei Raumtemperatur ist in Kombination mit der STEM-Tomographie eine robuste Methode, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine stabile Routine für die Probenvorbereitung zu etablieren. Zu diesem Zweck möchten wir die Literatur zum Hochdruck-Gefrieren14,21 hervorheben. Wenn eine weniger giftige Gefrier-Substitutionslösung verwendet werden soll, empfehlen wir die Verwendung von Kaliumpermanganat als Ersatz für Osmiumtetroxid, wie von Schauflinger et al.36 beschrieben.

Schließlich sollte ein reibungsloser Arbeitsablauf für die Erfassung von Kippreihen, einschließlich eines gut ausgerichteten Mikroskops, in Übereinstimmung mit den Benutzeranweisungen des STEM etabliert werden, der von Mikroskop zu Mikroskop unterschiedlich ist. Die Etablierung eines reibungslosen Arbeitsablaufs hängt auch vom Scan-Generator und der Bildaufnahmesoftware ab.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR und MD sind Mitarbeiter der Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, einem Pharmaunternehmen mit Interesse an der Entwicklung und Herstellung von virusbasierten Produkten. Dies hatte keinen Einfluss auf die Gestaltung des Papiers; Daher berichten wir über keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Veröffentlichung ist Teil der Global Development Technology Strategy und wurde vom Global Technology Management bei Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals unterstützt. Wir danken Renate Kunz und Jana Apolloni für die hervorragende technische Unterstützung und die hilfreiche Diskussion rund um die Probenvorbereitung. Wir danken Reinhard Weih für die hervorragende Unterstützung bei technischen Fragen und bei der Gerätewartung. Wir danken Torsten Friedrich für das hilfreiche Gespräch und die Unterstützung bei der Einrichtung des Mikroskops. Die Arbeiten von Clarissa Read, Julia LaRoche und Jan Münch wurden durch ein Cooperative Research Centre Grant der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB1279) gefördert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-HexadecänMerck KGaA8220640500
200-Kupfer-Gitter mit ParallelstäbenPlano GmbHG2014C
37 & Grad; C-TrocknungskammerBinder GmbH9010-0323
AcetonVWR international GmbH20066330
DDSAElektronenmikroskopiewissenschaften13710
DiamantmesserDiatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30Elektronenmikroskopiewissenschaften13600
Embed-812-HarzElektronenmikroskopiewissenschaften14900
EM-WerkzeugeTVIPS GmbHTVIPS-Software: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
Ethanol zu 100 %Merck KGaA1.00983.2511
FilterpapierVWR international GmbH516-0812
Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mLVWR international GmbH548-0625
FormvarElektronenmikroskopiewissenschaften15830-25
Freeze-Substitutionseinheit Leica EM AFS2Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmAURION Immuno Gold Reagenzien & Zubehör425.011
Goldes Kiefernloch & Oslash; 2000 & mu; mScience Services GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen KupferPlano GmbHNH6C
HeizplatteMEDAX GmbH & Kompanie KG12501
Hochvakuumverdampfungssystem BAF 300BAL-TEC AG
Hochdruckgefrierschrank Wohlwend HPF Compact 01Ingenieurbüro M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
FlüssigstickstofftankH.Erben GmbH94500
Stickstoff (Flüssigkeit)VWR international GmbH-
NMAElektronenmikroskopiewissenschaften19000
OsmiumtetroxidChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
Ofen 120 °C; CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
Poly-L-Lysin 0,1 % w/v aq. LösungTed Pella, Inc.18026
Safe-Lock-Röhren 0,5 mLEppendorf SE0030 121.023
Probenbehälter (Beem-Kapseln)Plano GmbHG360-1
Saphirscheibendurchmesser 3 x 0,16 mmIngenieurbüro M. Wohlwend GmbH500
Ultramicrotome Leica EM UC7Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
UranylacetatRiedel de Haë n AG31697
UV-LichtkammerDiniesELG100S

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

STEM TomografieHochdruckgefrierenGefriersubstitution3D Bildgebungvirusinfizierte ZellenHarzeinbettungVesikul res Stomatitis Viruskorrelative Licht ElektronenmikroskopieVirion Morphogenese

Verwandte Artikel