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Methodenartikel

Alu-RNA-transfiziertes primäres retinales Pigmentepithel der Maus: Ein pathologisch relevantes In-vitro-Modell für altersbedingte Makuladegeneration

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DOI:

10.3791/68570

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17. Oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir den vollständigen Prozess der Etablierung eines pathologisch relevanten Modells für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) in primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus mittels Alu-RNA-Transfektion.

Zusammenfassung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), insbesondere die nicht-exsudative AMD, erfordert experimentelle Modelle, die die menschliche Pathologie besser nachbilden. Derzeitige in vivo-Modelle sind nach wie vor technisch anspruchsvoll und zeitintensiv, während herkömmliche in vitro-Systeme krankheitsspezifische pathologische Auslöser nicht rekapitulieren können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein retinales Pigmentepithel-Degenerationsmodell (RPE) unter Verwendung von primären Maus-RPE-Zellen zu etablieren, die mit Alu-RNA transfiziert wurden, einem Retrotransposon, das direkt an der Pathologie der geographischen Atrophie beteiligt ist.

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Isolierung von primären RPE-Zellen der Maus, gefolgt von der Alu-RNA-Transfektion, um die RPE-Degeneration zu induzieren. Die Validierung integriert morphologische (hexagonale Architektur), funktionelle (Polaritätsverlust und ZO-1-Disruption des Mausproteins) und molekulare Analyse (quantitative PCR). Als Ergebnis beobachteten wir multifaktorielle Veränderungen, die durch die Alu-RNA-Transfektion ausgelöst wurden: die inflammatorische Zytokinsekretion (Mausgene Ifn-β, Il-6, Tnf-α; p < 0,05) und die zelluläre Seneszenz (Mausgene p21 und p53 Hochregulation; p < 0,05). Im Vergleich zu herkömmlichen akuten Stressmodellen rekapituliert dieses System chronische inflammatorisch-degenerative Kaskaden der AMD durch standardisierte Techniken und stellt so die Reproduzierbarkeit sicher. Durch die Kombination von Aspekten vereinfachter in vitro Assays und komplexer in vivo Modelle könnte dieser Ansatz als vorläufige Plattform für die Erforschung von Retrotransposon-gesteuerten Mechanismen und das Screening potenzieller therapeutischer Kandidaten dienen.

Einleitung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für globale Sehstörungen. Wirksame Behandlungen für nicht-exsudative AMD sind jedoch nach wie vor begrenzt. Daher besteht ein dringender Bedarf an reproduzierbaren und effizienten Forschungsmodellen, um Krankheitsmechanismen aufzudecken und therapeutische Ziele zu identifizieren 1,2. Im Mittelpunkt dieser Bemühungen steht das retinale Pigmentepithel (RPE), eine Monoschicht zwischen der Bruch-Membran (Aderhaut) und den Photorezeptoren (Netzhaut), die eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielt, indem sie die Photorezeptorfunktion unterstützt, die Blut-Netzhaut-Schranke reguliert und die Abfallbeseitigung erleichtert 3,4.

Die Dysfunktion oder der Verlust von RPE-Zellen ist ein hervorstechendes Merkmal vieler degenerativer Erkrankungen der Netzhaut, insbesondere bei AMD, wo die RPE-Dysfunktion einen frühen und entscheidenden Schritt in ihrem Fortschreiten darstellt 2,4,5. Insbesondere bei Patienten mit geographischer Atrophie (GA), der fortgeschrittenen Phase der AMD, führen reduzierte Spiegel des microRNA-verarbeitenden Enzyms Dicer 1 Ribonuklease III (DICER1) zu einer toxischen Akkumulation von Alu-RNA, einem Retrotransposon-Transkript, das direkt mit der RPE-Degeneration verbunden ist und an der Humanpathologie beteiligt ist6.

Traditionelle In-vivo-Modelle, wie z. B. das Natriumiodat-Modell (NaIO3) und das Amyloid-β-Modell (Aβ), behalten die systemische Komplexität der Erkrankung bei, stoßen jedoch auf kritische Einschränkungen. Das NaIO3-Modell induziert schnell oxidativen Stress und RPE-Schäden der Netzhaut, jedoch stört seine akute Toxizität sowohl das RPE als auch die Photorezeptoren, wodurch das chronische pathologische Fortschreiten der AMD nicht nachgeahmt wird und die therapeutische Bewertung der subtilen RPE-Dysfunktion verschleiertwird 7. In ähnlicher Weise führt das Aβ-Modell krankheitsspezifische Stressoren ein, erfordert jedoch im Vergleich zu In-vitro-Ansätzen umfangreiches technisches Know-how und längere Zeiträume 8,9. Herkömmliche in vitro RPE-Modelle, wie H2O2 und Hydrochinon-Expositionsmodelle, haben dagegen keine pathologische Relevanz, da sie krankheitsspezifische Stressoren wie toxische Proteinaggregate oder Entzündungsauslöser nicht rekapitulierenkönnen 1.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Etablierung eines RPE-Degenerationsmodells in primären Maus-RPE-Zellen unter Verwendung von Alu-RNA vor, einer retrotransposon-abgeleiteten nicht-kodierenden RNA, die direkt an der GA-Pathogenese beteiligt ist6. Alu-RNA aktiviert Entzündungswege und beeinträchtigt die Integrität der RPE-Barriere10,11, wodurch die pathologischen Merkmale nachgeahmt werden, die mit nicht-exsudativer AMD verbunden sind. Bei dieser Methode werden RPE-Zellen enzymatisch isoliert und kultiviert, gefolgt von der Induktion der RPE-Degeneration mit Hilfe von Alu-RNA. Darüber hinaus bieten wir ein umfassendes Validierungssystem an, das morphologische (hexagonale Architektur), funktionelle (Barriereintegrität und Polaritätsverlust) und molekulare (Entzündungs- und Seneszenzmarker) Messwerte kombiniert, um dieses Degenerationsmodell zu bewerten.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Tierethikkommission des Shanghai General Hospital genehmigt, das der Shanghai Jiao Tong University School of Medicine angegliedert ist. Dieses Protokoll hält sich strikt an die Vorschriften für die Verwaltung von Angelegenheiten in Bezug auf Versuchstiere (herausgegeben von der Staatlichen Kommission für Wissenschaft und Technologie) und die Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung, die von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erstellt wurden. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle .

1. Isolierung von primären Maus-RPE-Zellen

  1. Vorbereitung von beschichteten Platten
    1. Verdünnen Sie Matrigel in einem Verhältnis von 150 μl Matrigel zu 13 mL DMEM/F12 (Endkonzentration ca. 1,14%).
    2. Beschichten Sie den Boden der Platte gleichmäßig mit dem verdünnten Matrigel (ca. 150 μl für eine 48-Well-Platte). Über Nacht bei 37 °C inkubieren, um ein Gel zu bilden.
  2. Vorbereitung der Lösung
    1. Bereiten Sie das komplette RPE-Kulturmedium mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12) vor, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin.
    2. Bereiten Sie Papain Mix vor, indem Sie 4,5 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) in ein Papain-Fläschchen (100 Einheiten/Fläschchen) geben.
    3. Bereiten Sie den DNase I-Mix vor, indem Sie 500 μl EBSS in ein DNase I-Fläschchen (1.000 Einheiten/Fläschchen) geben.
    4. Bereiten Sie Papain-Verdauungslösung vor, indem Sie 250 μl DNase I Mix zu 4,5 mL Papain Mix hinzufügen (passen Sie das vom Lieferanten bereitgestellte Protokoll an, um eine endgültige Papainkonzentration von 22 IE/ml zu erreichen), wodurch das endgültige Volumen 4,75 mL erreicht wird.
  3. Euthanasie und Gewebeentnahme
    1. Euthanasieren Sie 2-3 Wochen alte Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 5% Natrium-Pentobarbital bei 150-200 mg/kg Körpergewicht. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie und den Tod, indem Sie den Stillstand des Herzschlags und der Atmung bestätigen.
    2. Besprühen Sie den Augenbereich vor der Enukleation gründlich mit 70 % Ethanol, um Oberflächenverunreinigungenzu beseitigen 12,13,14. Drücken Sie vorsichtig auf den periorbitalen Rand, um die Kugel hervorzutreten. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Augapfel zu extrahieren, wobei der Sehnerv für eine leichtere Dissektion erhalten bleibt.
      HINWEIS: Alle Werkzeuge (z. B. Pinzetten, Scheren) sind autoklaviert, und die Eingriffe werden unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt, um die Sterilität zu erhalten.
    3. Tauchen Sie die Augäpfel sofort in steriles, vollständiges RPE-Kulturmedium, das auf 37 °C vorgewärmt ist.
  4. Enzymatischer Aufschluss
    HINWEIS:Alle Schritte, einschließlich des enzymatischen Aufschlusses und der nachfolgenden Verfahren, müssen unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um die Sterilität zu erhalten.
    1. Übertragen Sie den Augapfel in eine Schale und verwenden Sie eine Pinzette, um das anhaftende Bindegewebe und die verbleibenden extraokularen Muskeln unter einem Stereomikroskop zu entfernen.
    2. Spülen Sie die Augen 2x sanft mit vorgekühlter Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS; ohne Ca2+/Mg2+; bei 4 °C).
      HINWEIS: Restliches vollständiges RPE-Kulturmedium kann die enzymatische Aktivität von Papain beeinträchtigen.
    3. Tauchen Sie die Augen vollständig in 1 ml Papain-Verdauungslösung und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 37 °C.
  5. Trennung von RPE-Zellen
    1. Nach dem Aufschluss neutralisieren Sie die enzymatische Aktivität mit vollständigem RPE-Kulturmedium.
    2. Übertragen Sie den Augapfel in eine Schale und entfernen Sie unter einem Stereomikroskop die Hornhaut, die Iris und die Linse und bewahren Sie die hintere Augenmuschel auf.
      HINWEIS: RPE-Zellen wurden während des gesamten Prozesses isoliert und als intakte Blätter gehalten (anstatt in einzelne Zellen zu dissoziieren).
    3. Trennen Sie den Retina-RPE-Komplex von der Aderhaut und schälen Sie dann die RPE-Schicht als durchgehende Blätter in vollständigem RPE-Kulturmedium von der Netzhaut ab. Sammeln Sie die abgelösten RPE-Schichten gleichmäßig in frischem, vollständigem RPE-Nährmedium als Mischung und kultivieren Sie sie anschließend auf Matrigel-beschichteten Oberflächen.
  6. Zellkultur
    1. Aussaat der Mischung in einer Matrigel-beschichteten 24-Well-Platte (8-10 Augäpfel pro Vertiefung auf Deckglas, für die Immunfärbung), einer Matrigel-beschichteten 48-Well-Platte (6-8 Augäpfel pro Well, für qPCR) oder einer Matrigel-beschichteten 96-Well-Platte (5-6 Augäpfel pro Well).
    2. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO2. Führen Sie den ersten Mediumwechsel nach 48 Stunden mit vollständigem RPE-Kulturmedium durch. Wechseln Sie das Medium alle 48 h nach dem ersten Wechsel.
      HINWEIS: Um die Polarität der RPE-Zellen so weit wie möglich zu erhalten, vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Passage, da eine wiederholte Subkultivierung zu einem Verlust der Differenzierung und der funktionellen Integrität führen kann.
  7. Überwachung der Zellmorphologie
    1. Lassen Sie die Zellen eine Monoschicht mit charakteristischer hexagonaler Morphologie bilden. Überwachen Sie die Morphologie unter einem inversen Zellkulturmikroskop.

2. Induktion des RPE-Degenerationsmodells

  1. Alu-RNA-Synthese und -Verifizierung
    1. Synthetisieren Sie Alu-RNA mit einem in vitro Transkriptionssystem.
      HINWEIS: Die Synthese der in unserer Studie verwendeten Alu-RNA basierte auf dem vom Ambati Lab6 beschriebenen Protokoll.
    2. Reinigen Sie die RNA und bestätigen Sie ihre Qualität mit einem Mikrospektrophotometer.
  2. Alu-RNA-Transfektion
    HINWEIS: Wir haben den Tag der primären RPE-Zellaussaat als Tag 0 festgelegt. An Tag 5 wiesen die adhärenten primären RPE-Zellen eine einheitliche Morphologie auf und erreichten eine zelluläre Konfluenz von mehr als 50 %, woraufhin die Alu-RNA-Transfektion mit einem kationischen Lipid-basierten Transfektionsreagenz gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt wurde.
    Zur Validierung der Ergebnisse wurden zwei Kontrollgruppen eingeschlossen: i) eine Negativkontrolle (NC), bei der weder Alu-RNA noch das Transfektionsreagenz zugesetzt und als Ersatz ein Medium mit niedrigem Serumgehalt verwendet wurde; ii) Liposomenkontrolle (LC), bei der Alu-RNA weggelassen wurde, aber die gleiche Menge an Transfektionsreagenz mit niedrigem Serummedium gemischt und auf Zellen aufgetragen wurde, um Lipofektions-assoziierte Effekte zu kontrollieren. Die folgenden Schritte beschreiben das Verfahren der Alu-RNA-Transfektion.
    1. Ersetzen Sie das vorhandene Medium vor der Transfektion durch 300 μl vollständiges RPE-Kulturmedium pro Vertiefung (48-Well-Platte).
    2. Bereiten Sie Transfektionskomplexe mit Alu-RNA und kationischem Reagenz auf Lipidbasis in einem Medium mit niedrigem Serumgehalt vor.
      1. Vorbereiten Mischen Sie 1 mit 1,2 μl kationischem Reagenz auf Lipidbasis und 18,8 μl dem Medium mit niedrigem Serumgehalt. Vorsichtig mischen (nicht vortexen) und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
      2. Vorbereiten Mix 2 mit 6 μl Alu-RNA (100 μg/ml) und 14 μl Medium mit niedrigem Serumgehalt.
      3. Bereiten Sie Transfektionskomplexe vor, indem Sie 20 μl Mix 2 tropfenweise in 20 μl Mix 1 geben.
        HINWEIS: Alu-RNA wurde in einer Endkonzentration von 0,6 μg pro Vertiefung unter Verwendung von 1,2 μl kationischem Reagenz auf Lipidbasis pro Vertiefung transfiziert (1,2 μl Reagenz: 0,6 μg RNA-Verhältnis).
      4. Zum Mischen vorsichtig schnippen. Lassen Sie es dann 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    3. Geben Sie 40 μl/Vertiefung der Transfektionskomplexe in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Stellen Sie die Platte für 48 h in einen 37 °C/5 % CO2 -Inkubator.
    4. Führen Sie qPCR, Immunfärbung und andere experimentelle Verfahren 48 Stunden nach der Transfektion durch.

3. Validierung des Degenerationsmodells

HINWEIS: An Tag 7 wurden umfangreiche Modellvalidierungsexperimente durchgeführt.

  1. Immunfluoreszenzfärbung zur Bewertung der Polarität und Barriereintegrität
    1. Fixieren Sie kultivierte RPE-Zellen mit 4 % methanolfreiem Formaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur. 3 x 10 min mit 1x PBS waschen.
    2. Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 h.
    3. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit den Primärantikörpern anti-ZO1 (1:1.000 Verdünnung in 3 % BSA) und Phalloidin 488 (1:1.000 Verdünnung in 3 % BSA) unter Vermeidung von Licht.
    4. Waschen Sie die Zellen 3 x 10 min schonend mit PBS.
    5. Mit Sekundärantikörpern (1:1.000 Verdünnung in 3 % BSA) 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Waschen Sie die Proben 3 x 10 min mit 1x PBS.
    7. Gegenfärbung mit DAPI (1:1.000 Verdünnung in PBS) für 10 min.
    8. Waschen Sie die Proben 3 x 10 min mit 1x PBS.
    9. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas von der 24-Well-Platte und legen Sie es auf einen Objektträger, der mit einem Tropfen Eindeckmedium vorgeladen ist. Nehmen Sie konfokale Bilder mit einem 40x/0,95-Objektiv auf.
  2. Quantitative PCR (qPCR) für Seneszenz- und Entzündungsmarker
    HINWEIS: Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Mausgen Gapdh) wurde als internes Referenzgen zur Normalisierung der Schwellenwerte für den Zyklus (Ct) verwendet. Alle quantitativen PCR-Reaktionen (qPCR) umfassten drei biologische Replikate pro Versuchsgruppe. Die Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle S1 enthalten.
    1. RNA-Extraktion
      1. Geben Sie Lysepuffer (Total RNA Kit) in die Kulturplatte (1 mL pro 10 cm² Oberfläche) und inkubieren Sie ihn 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      2. Bei 13.400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues RNase-freies Röhrchen.
        HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Proben frei von Rückständen (z. B. klarzelligem Lysat) sind.
      3. 200 μl Chloroform in den Überstand geben, 15 s vortexen und 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      4. Zentrifugieren Sie bei 13.400 × g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie die obere wässrige Phase (~500 μL) in ein neues Röhrchen.
      5. Geben Sie 0,5 Volumen Ethanol in die wässrige Phase. Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
      6. Laden Sie die Mischung auf eine Kieselsäuremembransäule (im Total RNA Kit enthalten). Zentrifugieren Sie bei 13.400 × g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
      7. Geben Sie 500 μl Proteinentfernungspuffer (Total RNA Kit) in die Säule. Zentrifugieren Sie bei 13.400 × g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
      8. Geben Sie 500 μl Waschpuffer (Total RNA Kit) in die Säule. Zentrifugieren Sie bei 13.400 × g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss.
      9. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 3.2.
      10. Zentrifugieren Sie die leere Säule bei 13.400 × g für 2 Minuten, um die Membran zu trocknen.
      11. Eluieren Sie RNA, indem Sie der Membran 30-100 μl RNase-freies Wasser zusetzen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Bei 13.400 × g für 2 min zentrifugieren.
    2. Komplementäre DNA-Synthese (cDNA)
      1. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 nm und 280 nm.
        HINWEIS: Ein Verhältnis von A260/A280 zwischen 1,8 und 2,0 gilt als mit einer akzeptablen RNA-Reinheit verbunden.
      2. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem RNase-freien Röhrchen vor: RNA-Template (500-1.000 ng): X μL (bezogen auf seine Konzentration), 5x Reverse-Transkriptionspuffer: 4 μL, RNasefreies Wasser: bis 20 μL.
      3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 37 °C für 15 Minuten, 85 °C für 5 s und unbegrenztes Halten bei 4 ΰC.
    3. qPCR
      1. Bereiten Sie den qPCR-Mastermix für jede Reaktion vor (insgesamt 10 μl): TB Green (im Premix Taq enthalten): 5 μl, ROX-Farbstoff (im Premix Taq enthalten): 0,2 μl, Forward-Primer (1 μM): 0,2 μl, Reverse-Primer (1 μM): 0,2 μl, RNase-freies Wasser: 3,4 μl, cDNA-Template: 1 μl.
      2. Geben Sie 10 μl des Mastermixes in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
      3. Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden optischen Abdeckung. Bei 300 × g 1 min zentrifugieren.
      4. Führen Sie das folgende Programm auf einem Echtzeit-PCR-System aus: Stufe 1: 95 °C für 30 s; Stufe 2: 40 Zyklen von: 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s; Stufe 3: Analyse der Schmelzkurve.
      5. Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus von Ziel-mRNAs mit der 2-ΔΔCt-Methode 15.

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Ergebnisse

Primäre Maus-RPE-Zellen vor der Alu-RNA-Transfektion
An Tag 0 (Abbildung 1) wurden primäre Maus-RPE-Zellen isoliert und wiesen die charakteristische hexagonale Morphologie auf, die typisch für gesunde RPE-Zellen ist. Diese Zellen behielten eine gut organisierte Monoschicht bei. Die Zellen wurden kultiviert, um eine anfängliche strukturelle Organisation und Bildung von Tight Junctions zu ermöglichen, was durch die hexagonale Form und die gut definierten Grenzen belegt wird...

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Diskussion

Unser Ziel war es, ein reproduzierbares und zugängliches RPE-Verletzungsmodell zu etablieren, das eine hochauflösende Bildgebung und mechanistische Analyse mit minimalen Ressourcenbeschränkungen ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglichte eine klare Visualisierung der Alu-RNA-induzierten strukturellen Disruption im Vergleich zur Kontrollgruppe, einschließlich apikaler Tight-Junction-Fragmentierung und basaler Zytoskelett-Desorganisation durch konfokale Z-Stack-Bildgebung (0,5 μm Schrittweite)....

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch den Aktionsplan für wissenschaftliche und technologische Innovation, das Medical Innovation Research Special Project (23Y11901300), die National Natural Science Foundation of China (82171076) und die Shanghai Municipal Education Commission (2023ZKZD18) unterstützt. Wir danken Professor L.Z für das freundliche Geschenk von Alu RNA.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biologische Sicherheitswerkbank der Serie 1300 Klasse II, Typ A2Thermo Scientific
37°; C/5% CO2 InkubatorThermo Scientific
4% Paraformaldehyd (PFA)ServicebiografieNr. G1101-500ML
humane Alu-RNAGeschenk von L.Z.
Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568 (Ziege)Invitrogen Thermo ScientificNr. A11011
Applied Biosystems MicroAmp selbstklebende optische AbdeckungThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems MicroAmp Optische 96-Well-ReaktionsplattenThermo Fisher Scientific
Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time-PCR-SystemThermo Fisher ScientificReal-Time-PCR-System für die quantitative Genexpressionsanalyse
Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V)BeyotineST023-50g
Carl Zeiss Primovert inverses ZellkulturmikroskopZeissFür die Überwachung der Zellmorphologie
Zentrifuge 5424 REppendorf
ChloroformSigmaPhasentrennung bei der RNA-Extraktion.
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSM900+Cell discover 7)ZeissHochauflösende Bildgebung von Immunfluoreszenzmarkern (z. B. ZO-1 und F-Aktin).
Costar 24/48/96 Well-PlatteCorning
DeckglasThermo Fisher ScientificWird auf einer 24-Well-Platte für die Immunfluoreszenzbildgebung verwendet.
DAPIThermo62248
Digitales TrockenbadMulab
DMEM/F12GibcoMedien zur Züchtung von RPE-Zellen
Dulbecco-Phosphat gepuffert (D-PBS)ShareBioSB-CR017
Graf" s Balanced Salt Solution (EBSS)GibcoAusgewogene Salzlösung, die für die Verdünnung von Papain und DNase I während der RPE-Isolierung verwendet wird.
Ethanol (absolut)SigmaRNA-Fällung und Säulenwäsche.
Fötales Rinderserum (FBS)SigmaFür komplette RPE-Zellkulturmedien
ZangeZum Sezieren
Lipofectamine 3000 (kationisches Transfektionsreagenz auf Lipidbasis)Thermo FischerL300015Um Alu-RNA in RPE-Zellen zu transfizieren
MatrigelCorning356234Matrix (1,14 % Verdünnung) für Beschichtungsplatten zur Unterstützung der RPE-Adhäsion und Polarisation.
Methanolfreies FormaldehydThermo ScientificAlternatives Fixiermittel (4%) zur Konservierung von Epitopen in der Immunfluoreszenz
MikropipetteEppendorf
Nanodrop 2000 SpektralphotometerThermo ScientificMisst die RNA-Konzentration und -Reinheit
Nikon ECLIPSE Ti-S fluoreszierendes inverses MikroskopNikonFluoreszenzbildgebung von gefärbten Proben
Olympus SZX16 StereomikroskopOlympZum Präparieren von Mausaugäpfeln und zur RPE-Isolierung
Opti-MEMGibcoSerumarmes Medium für die Herstellung von Transfektionskomplexen
Papain-DissoziationssystemWorthingtonLK003150Für arbeitendes Enzym
Penicillin-Streptomycin GibcoFür komplette RPE-Zellkulturmedien
Pentobarbital-NatriumsalzSigmaEuthanasie-Agent
Phalloidin 488 Abcam (Englisch)176753Zur Polaritätsbeurteilung
PrimeScript RT Reagenzien-KitTakaraRR037AReverse Transkriptionskit für die cDNA-Synthese (qPCR-Template-Vorbereitung)
RNAsimple Gesamt-RNA-KitTIANGENDP419Zur Extraktion von RNA
TB Grün  Premix Ex Taq  (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420AFür qPCR
ZO-1 Kaninchen Polyklonaler AntikörperProteintech-Technologie21773Zur morphologischen Bewertung

Referenzen

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