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Methodenartikel

Mehrstufige Mikrodissektion und funktionell-strukturelle Profilierung humaner Nierenarterienäste

1.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/68579

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5. September 2025

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung und funktionelle Bewertung von arteriellen Ästen der menschlichen Nieren vorgestellt, das präklinische Studien für die pharmazeutische Entwicklung erleichtert.

Zusammenfassung

Die Dysfunktion der Nierengefäße spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese mehrerer klinischer Erkrankungen, einschließlich akuter Nierenschädigung, renaler Ischämie und Bluthochdruck, was zu erheblichen Herausforderungen im klinischen Management führt und sich negativ auf die Patientenergebnisse auswirkt. Die Isolierung und funktionelle Charakterisierung intranierender Arterien ist entscheidend für die Aufklärung der Mechanismen, die der renalen Gefäßdysfunktion, insbesondere im Zusammenhang mit Nierenschäden, zugrunde liegen, und für die gezielte therapeutische Entwicklung. Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind standardisierte Ansätze zur Isolierung und funktionellen Beurteilung menschlicher intranierender Arterien über verschiedene Verzweigungsebenen hinweg nach wie vor unterentwickelt. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Rahmen für die systematische Isolierung und multimodale Bewertung intranierender arterieller Äste, einschließlich funktioneller und struktureller Bewertungen sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen. Die Methodik umfasst drei Schlüsselkomponenten: (1) präzise anatomische Identifizierung und Mikrodissektion von intrarenalen Arterien aus Spendernieren, begleitet von Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung zur strukturellen Bestätigung; (2) strenge Normalisierungsverfahren in der Drahtmyographie zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Messung; und (3) quantitative Analyse vasomotorischer Reaktionen mit Hilfe von Präzisionsdrahtmyographie-Techniken. Die Normalisierung basiert auf der Muskellängen-Spannungs-Beziehung, bei der die inkrementelle Dehnung der arteriellen Segmente eine optimale Ruhespannung herstellt, um die Aktin-Myosin-Überlappung zu maximieren und dadurch maximale kontraktile Reaktionen hervorzurufen. Bei der Drahtmyographie werden isolierte Gefäßsegmente zwischen zwei parallelen Drähten aufgehängt, was eine präzise Messung der Gefäßspannung ermöglicht. Durch die Anwendung strenger Normalisierungsprotokolle ermöglicht diese Technik eine reproduzierbare und zuverlässige Quantifizierung der vaskulären Reaktivität über verschiedene pathophysiologische Bedingungen und pharmakologische Interventionen hinweg.

Einleitung

Die Niere ist ein lebenswichtiges Organ, das für die Aufrechterhaltung der menschlichen Homöostase durch die Beseitigung von Stoffwechselabfällen, den Elektrolythaushalt und die Flüssigkeitsregulierung verantwortlich ist - Funktionen, die einen außergewöhnlich hohen Blutfluss erfordern. Unter physiologischen Bedingungen erhalten die Nieren etwa 25 % des gesamten Blutvolumens, das pro Minute vom Herzen gepumpt wird (Herzzeitvolumen), was ihre wesentliche Rolle für den systemischen Blutfluss und die entscheidende Bedeutung der Nierenperfusion für die Aufrechterhaltung des allgemeinen physiologischen Gleichgewichts unterstreicht1. Das arterielle Nierensystem reguliert diese massive Blutabgabe präzise, um die GFR aufrechtzuerhalten und sich gleichzeitig an systemische hämodynamische Veränderungen anzupassen. Folglich stellt die Beeinträchtigung der Nierenperfusion einen kritischen pathologischen Mechanismus dar, der zu einer verminderten glomerulären Filtrationsrate (GFR) bei Erkrankungen wie akutem Nierenversagen und renaler Ischämie beiträgt. Darüber hinaus tritt sie häufig sekundär zu systemischen Erkrankungen auf, die den renalen Blutfluss beeinträchtigen, einschließlich Schock, Herzfunktionsstörung und Sepsis 2,3,4,5. Die Nierenarterie durchläuft eine sequentielle Verzweigung innerhalb der Niere und teilt sich zunächst in interlobäre Arterien, die durch die Nierensäulen zwischen den Markpyramiden verlaufen. Beim Erreichen des kortikomedullären Übergangs bilden diese Gefäße bogenförmige Arterien, die sich entlang der Grenze zwischen Rinde und Medulla wölben. Aus diesen krummlinigen Gefäßen treten interlobuläre Arterien aus, die radial in das kortikale Parenchym eindringen und schließlich über afferente Arteriolen Blut in die glomerulären Kapillaren leiten, um einzelne Nephrone zu perfundieren 1,6,7. Interlobäre, bogenförmige und interlobuläre Arterien bilden die wichtigsten Widerstandsgefäße in der Niere und dienen als primäre Regulatoren der intrarenalen Hämodynamik und Druckkontrolle 1,8. Die genaue Isolierung und Charakterisierung dieser Gefäße ist entscheidend für die Aufklärung der grundlegenden Mechanismen der renalen Perfusionshomöostase9. Darüber hinaus bietet ihre heterogene vaskuläre Reaktivität unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen einen strategischen Rahmen für die Entwicklung neuartiger gefäßerweiternder Wirkstoffe mit renal-protektivem Potenzial10,11.

Derzeit werden klinische bildgebende Verfahren (z. B. Ultraschall) routinemäßig eingesetzt, um Veränderungen des Nierenblutflusses zu überwachen. Die experimentellen Methoden in der Grundlagenforschung zur direkten Beurteilung der renalen Gefäßspannung, einer Schlüsseldeterminante der Nierenperfusion, sind jedoch nach wie vor begrenzt 12,13,14,15. Das Drahtmyographie-System ist eine etablierte experimentelle Plattform, die Spannungsänderungen in kleinen biologischen Geweben in vitro misst, einschließlich Blutgefäßen, Luftröhre 16,17,18, mit Durchmessern von 50 μm bis 10 mm 16,19,20. Obwohl die Drahtmyographie in Tierversuchen weit verbreitet ist, begrenzen Unterschiede in der Gefäßstruktur und -funktion zwischen den Spezies das Ausmaß, in dem Nagetiergefäße die menschliche Gefäßphysiologie repräsentieren können21. Daher ist die genaue Identifizierung und Isolierung der humanen intrarenalen Arterien auf verschiedenen anatomischen Ebenen (interlobär, bogenförmig und interlobulär) von entscheidender Bedeutung, um umfassende in vitro Untersuchungen ihrer physiologischen Eigenschaften sowie krankheitsbedingter Funktionsveränderungen und pathologischer Schädigungsmechanismen zu ermöglichen. In Kombination mit pharmakologischen Interventionen mit verschiedenen vasoaktiven Verbindungen ermöglicht dieses System die dynamische Bewertung und quantitative Aufzeichnung von Vasokonstriktions-/Vasodilatationsreaktionen in isolierten arteriellen Ringen und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gefäßreaktivität unter kontrollierten experimentellen Bedingungen 19,22,23.

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methodik für die präzise anatomische Lokalisierung und Mikrodissektion menschlicher intarenal Arterienäste (interlobäre, bogenförmige und interlobuläre Arterien), gefolgt von einer funktionellen Charakterisierung unter Verwendung eines in vitro vaskulären Spannungsüberwachungssystems, um ihre differentielle Reaktivität gegenüber vasoaktiven Arzneimitteln zu beurteilen und dadurch sowohl strukturelle als auch funktionelle Unterscheidungen zwischen diesen Gefäßsegmenten zu etablieren. Durch die Kombination der anatomischen Lokalisation mit pharmakologischem Reaktivitätsprofiling und histopathologischer Analyse etablieren wir eine ex vivo-Plattform , die eine umfassende Bewertung regionenspezifischer vaskulärer Reaktionen auf vasoaktive Wirkstoffe ermöglicht.

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Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll und die hier beschriebenen Beispiele wurden von der Urologischen Abteilung des Ersten Krankenhauses der Universität Peking geprüft und genehmigt (Zulassungsnummer 2023yan500-002) und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Teilnehmer haben vor der Teilnahme eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben.

1. Vorbereitung der Lösung

  1. Bereiten Sie Krebs-Ringer-Lösung (Krebs) vor, die 119,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 und 11,0 mM D-Glucose bei einem pH-Wert von 7,4 enthält.
  2. Bereiten Sie eine kaliumreiche Salzlösung (60K+) vor, die 64,0 mM NaCl, 60 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 25,0 mM NaHCO3, 1,2 mM KH2PO4 und 11,0 mM D-Glukose bei einem pH-Wert von 7,4 enthält.

2. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: Lagern Sie Arzneimittel gemäß den Angaben im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) unmittelbar nach Erhalt der Arzneimittel.

  1. Bereiten Sie das Phenylephrin (Phe, 10-1 M auf Lager) vor, indem Sie 167,21 mg Phenylephrin in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Die Stammlösung wird bei -80 °C gelagert und am Tag der Anwendung auf 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M verdünnt.
  2. Bereiten Sie das Acetylcholin (ACh, 10-2 M auf Lager) vor, indem Sie 18,166 mg Acetylcholin in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Stammlösung bei -80 °C lagern und am Tag der Anwendung auf 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 M als Arbeitskonzentration verdünnen.

3. Entnahme von Nierengewebe und Isolierung der intrarenalen Arterie

  1. Rekrutierung von erwachsenen Patienten, bei denen ein Nierenzellkarzinom diagnostiziert wurde, das histologisch durch präoperative Kernnadelbiopsie oder intraoperativen Schnellschnitt bestätigt wurde.
    HINWEIS: Patienten, die für eine radikale Nephrektomie vorgesehen sind, werden speziell ausgewählt, da ihre chirurgischen Proben Zugang zu intakten intrarenalen arteriellen Segmenten bieten, die sich distal der Tumorränder befinden. Diese Segmente können präzise präpariert und isoliert werden, was eine detaillierte Untersuchung der menschlichen Nierengefäßphysiologie ohne Beeinträchtigung durch bösartiges Gewebe ermöglicht. Die histologische Bestätigung gewährleistet eine genaue Identifizierung des Karzinoms und eine klare Abgrenzung der Tumorgrenzen, wodurch die Auswahl normaler, tumorfreier arterieller Segmente für experimentelle Untersuchungen erleichtert wird.
    1. Ausschluss von Patienten mit signifikanten Komorbiditäten (Bluthochdruck, Diabetes mellitus oder andere systemische Erkrankungen), um störende Einflüsse auf die Gefäßfunktion zu vermeiden und so die Zuverlässigkeit und Relevanz physiologischer Bewertungen zu erhöhen.
      HINWEIS: Die Proben für dieses Experiment wurden von Patienten entnommen, die im Ersten Krankenhaus der Universität Peking einer radikalen Nephrektomie unterzogen werden sollten.
  2. Sammeln Sie während der radikalen Nephrektomie frisch herausgeschnittene menschliche Nierenproben und tauchen Sie sie sofort in eiskalte Krebslösung, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Nur makroskopisch normal erscheinende Regionen distal der Tumorränder bleiben für die arterielle Dissektion erhalten (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Für eine optimale Isolierung der intrarenalen Arterie sollte angrenzendes gesundes Gewebe während der radikalen Nephrektomie als kortikomedullärer Keil in voller Dicke entnommen werden, wodurch der gesamte arterielle Baum von den kortikalen bis zu den medullären Gefäßen erhalten bleibt.
    1. Lagern Sie das herausgeschnittene Gewebe sofort in 200 ml kalter Krebslösung. Stellen Sie den Behälter auf Eis und transportieren Sie ihn in einer isolierten Kühltasche innerhalb von 2 h nach der Entnahme ins Labor. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des gesamten Transports vollständig untergetaucht bleibt, um die Lebensfähigkeit und strukturelle Integrität für die anschließende Dissektion und Funktionsanalyse zu erhalten.
      HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit des Gewebes und die physiologische Funktion zu erhalten, sollte der gesamte Prozess der Isolierung und anschließenden Lagerung in Krebslösung bei 4 °C innerhalb von 6 h abgeschlossen sein 24,25,26,27. Die Lösung sollte während der Eingriffe regelmäßig ausgetauscht werden, um die Sauerstoffversorgung und die Lebensfähigkeit des Gewebes aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Entfernung von Blutbestandteilen aus dem Gefäßlumen zu erleichtern.
  3. Identifizieren Sie die koronale Ebene visuell, indem Sie den Nierenhilum lokalisieren und den Schnitt so ausrichten, dass er sowohl durch das Nierenbecken als auch durch die laterale konvexe Grenze verläuft. Halbieren Sie die Niere mit einem sterilen Skalpell entlang der koronalen Ebene, um zwei symmetrische Hälften zu erhalten. Dieser Ansatz legt die innere Architektur frei, einschließlich der Nierenpyramiden und -säulen, und erleichtert so die genaue Identifizierung und anschließende Dissektion der intrarenalen Arterien (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Um die Trennung der Nierenarterien zu erleichtern, sollte zuerst ein Teil des Nierenbeckens, der Nierenpyramiden und des Fettes auf der Querschnittsfläche entfernt werden, um mehr Blutgefäße freizulegen (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu durchtrennen.
  4. Trennen Sie unter einem Stereomikroskop die interlobären, bogenförmigen und interlobulären Arterien sorgfältig mit einer Mikrodissektionschere und einer Pinzette in einer 10 cm großen Kulturschale mit schwarzem Boden (Abbildung 1C).
    ANMERKUNG: Bei der menschlichen Niere verläuft die Arteria interlobulus durch die Nierenpyramiden, wobei sie die dickste Gefäßwand unter den drei arteriellen Ästen 1,8 aufweist und einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1-2 mm aufweist. Am kortikomedullären Übergang geht die Arteria interlobäris in die Arteria arcuatus über und bildet entlang der kortikomedullären Grenze einen halbkreisförmigen Bogen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 500 μm. Die Blutgefäße verzweigen sich weiter in die Nierenrinde, die die interlobuläre Arterie ist, mit der dünnsten Gefäßwand und dem kleinsten Durchmesser von etwa 200 μm unter den dreien (Abbildung 1C). Darüber hinaus liefert die anatomische Lokalisation bei der Unterscheidung der drei Gefäßäste wichtigere Informationen als die Messung des absoluten Gefäßdurchmessers 1,8.
    1. Entfernen Sie vorsichtig umliegendes Gewebe und Fett aus den Arterien und reinigen Sie sie gründlich in einer 10 cm großen Kulturschale mit schwarzem Boden (Abbildung 1B).
  5. Verwenden Sie die isolierten Nierenarterien (interlobuläre, bogenförmige und interlobäre Arterien) für die folgenden Experimente:
    1. Bereiten Sie arterielle Segmente für die histologische Verarbeitung vor, indem Sie isoliertes Gewebe sorgfältig auf eine standardisierte Länge von ca. 3 mm zuschneiden, die für die Paraffineinbettung und histologische Schnitte geeignet ist. Fixieren Sie jede Probe 1 h lang in 2 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur, um die Gewebemorphologie zu erhalten. Nach der Fixierung ist das Verfahren mit den Standardprotokollen für Dehydratisierung, Reinigung und Paraffineinbettung für die anschließende Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) gemäß den etablierten histologischen Protokollen durchzuführen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Für mögliche histologische Untersuchungen können die Proben gemäß den etablierten histologischen Protokollen der Masson-Trichrom-Färbung zur Beurteilung der Kollagenablagerung oder der Verhoeff-Van Gieson (EVG)-Färbung zur Visualisierung elastischer Fasern unterzogenwerden 28,29.
    2. Für Untersuchungen der Gefäßfunktion sind die intrarenalen Ringe bis zum Test in eiskalter Krebslösung aufzubewahren. Die arteriellen Ringe sollten vollständig untergetaucht sein.
      HINWEIS: Für nachfolgende molekulare Assays wie Western Blot/qPCR frische Proben nach der Dissektion sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann bei -80 °C nach zuvor veröffentlichten Verfahren lagern, um die RNA-Integrität zu erhalten und einen Proteinabbau zu verhindern30,31.

4. Befestigung des Arterienrings

  1. Identifizieren Sie die interlobäre, bogenförmige und interlobuläre Arterie anhand ihrer unterschiedlichen anatomischen Positionen (Abbildung 1C) und Durchmesserbereiche (Abbildung 2) und schneiden Sie sie dann vorsichtig mit einer Mikrodissektionsschere in etwa 2 mm lange Ringe für Gefäßfunktionsuntersuchungen (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Lagern Sie jeden isolierten arteriellen Ring sofort separat in 5 ml eiskalter Krebslösung bis zur Funktionsprüfung. Wählen Sie für die Funktionsprüfung unverzweigte Gefäßringe mit einer Länge von 1,5 bis 2,0 mm mit sauberen senkrechten Schnitten. Schließen Sie Ringe über 2,0 mm aus, um Montageschwierigkeiten zu vermeiden, oder Ringe unter 1,5 mm, um instabile Zugaufzeichnungen zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie alle arteriellen Ringe (aus interlobären, bogenförmigen und interlobulären Arterien separat) vor, wie in Schritt 4.1 erwähnt, und bringen Sie sowohl Krebs- als auch 60K+ -Lösungen auf Raumtemperatur. Schalten Sie dann den angeschlossenen Computer ein, gefolgt von dem Drahtmyographensystem, das sicherstellt, dass alle Komponenten ordnungsgemäß initialisiert sind, bevor Sie mit den Experimenten fortfahren.
  3. Bevor Sie die arteriellen Ringe in die Drahtmyographenkammern einbauen, spülen Sie jede Kammer zweimal mit 5 ml Krebslösung, um die Sauberkeit zu gewährleisten und Restsubstanzen zu entfernen, und geben Sie dann 5 ml Krebslösung in jede Kammer.
    1. Erhitzen Sie die Lösung auf 37 °C mit dem eingebauten Temperaturkontrollsystem des Myographen. Gleichzeitig wird die Lösung über eine angeschlossene Gasleitung kontinuierlich mit Gas (einem Gemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2) belüftet, um während des Experiments eine angemessene Sauerstoffversorgung und ein angemessenes pH-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten.
  4. Für jeden Arterienring werden zwei 3 cm lange Führungsdrähte mit einem Durchmesser von 40 μm vorbereitet und die isolierten Arterienringe vorsichtig in eine weitere 10 cm lange Kulturschale mit schwarzem Boden mit Krebslösung überführt.
    HINWEIS: Für Blutgefäße mit unterschiedlichen Durchmessern sollten unterschiedliche Durchmesser von Führungsdrähten gewählt werden. Für den arteriellen Ring mit einem Durchmesser von etwa 100 μm oder weniger ist ein 15 μm Führungsdraht erforderlich; Liegt der Durchmesser zwischen 100 μm und 200 μm, wird ein 25 μm Führungsdraht verwendet; Wenn der Durchmesser größer als 200 μm ist, kann ein 40 μm Führungsdraht verwendet werden. Für die Konsistenz des Versuchs wird empfohlen, für alle Gefäße des gleichen Typs innerhalb eines einzigen Versuchs den gleichen Durchmesser zu verwenden. 19. Urheberrecht
  5. Führen Sie den ersten Führungsdraht vorsichtig in den arteriellen Ring in der Schale ein, biegen Sie eine Seite des Führungsdrahts um 90° und übertragen Sie ihn dann in die Kammer, um ihn mit den vom Gerät bereitgestellten Spezialschrauben zum Festziehen der Schrauben im Uhrzeigersinn auf dem Probenhalter zu fixieren (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Der Führungsdraht wird eingeführt, um die strukturelle Unterstützung während der Übertragung des Arterienrings zu gewährleisten, wenn er auf dem Probenhalter montiert wird, wodurch durch die Handhabung verursachte Beschädigungen oder Verzerrungen minimiert werden.
  6. Bevor Sie den Arterienring an der Halterung befestigen, notieren Sie die Gefäßlänge und -breite. Platzieren Sie den arteriellen Ring zwischen den beiden Haltern (Abbildung 3C) und lesen Sie die Mikrometerskala ab, wobei 1 Skala 10 μm darstellt. Subtrahieren Sie den Skalenwert, der gemessen wird, wenn sich die Halterungen kaum berühren (Abbildung 3D), um die Länge und Breite des Arterienrings zu bestimmen.
  7. Fädeln Sie einen weiteren Führungsdraht durch das Blutgefäß und fixieren Sie ihn schließlich auf der anderen Seite. Wickeln Sie den Führungsdraht im Uhrzeigersinn um die Befestigungsschrauben auf beiden Seiten und stellen Sie sicher, dass er fest mit der Oberfläche des Probenhalters verbunden ist.
    HINWEIS: Während des gesamten Fixationsprozesses ist es notwendig, das Ziehen des Blutgefäßes oder das Zerkratzen der Innenwand des Blutgefäßes mit dem Führungsdraht zu vermeiden, um eine Beschädigung des Gefäßendothels zu vermeiden. Der Führungsdraht sollte in einer einzigen Lage ohne Überlappung um die Befestigungsschraube gewickelt werden. Die beiden Führungsdrähte sollten sich auf derselben horizontalen Ebene parallel zueinander befinden und sich nicht schneiden. Stellen Sie außerdem nach dem Befestigen des Führungsdrahtes den Probenhalter auf beiden Seiten näher ein. Sie sollten jedoch nahe beieinander liegen, ohne sich tatsächlich zu berühren, um Kräfte zu vermeiden, wie in Abbildung 3E und Abbildung 3F gezeigt.
  8. Bauen Sie die Kammer wieder in das Drahtmyographensystem ein. Decken Sie dann den Deckel ab und lüften Sie das Gas. Schließen Sie den Sensor an und öffnen Sie die Datenerfassungssoftware für die Gefäßspannungsmessung.

5. Behälterspezifische Normalisierung zur optimalen Bestimmung der Anfangsspannung

HINWEIS: Die Etablierung stabiler Ausgangsbedingungen, definiert als optimale Ruhespannung für maximale kontraktile Reaktionsfähigkeit, ist entscheidend für reproduzierbare Funktionsmessungen. Aufgrund inhärenter interindividueller physiologischer Unterschiede weisen menschliche Blutgefäße jedoch im Vergleich zu tierischen Blutgefäßen eine größere Variabilität der mechanischen Ausgangseigenschaften auf 32,33,34,35,36. Diese Faktoren, kombiniert mit der intrinsischen vaskulären Heterogenität (z. B. strukturelle und funktionelle Unterschiede in Durchmesser, Wandstärke und kontraktilen Eigenschaften), führen zusammen zu signifikanten Schwankungen der Ausgangsspannung. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wird daher empfohlen, jedes Blutgefäß einzeln zu normalisieren. Das Drahtmyographensystem verfügt über ein spezielles Normalisierungsmodul, das eine präzise Bestimmung der Basisspannung für jedes Gefäß ermöglicht.

  1. Montieren Sie die arteriellen Ringe in der Kammer wie in den Schritten 4.1 bis 4.8 beschrieben. Starten Sie die Diagrammaufzeichnung, stellen Sie den Kanal auf Null (Abbildung 4A), lassen Sie die Stabilisierung mindestens 30 Minuten lang zu und stellen Sie den Kanal dann erneut auf Null, bevor Sie mit der Normalisierung fortfahren.
  2. Wählen Sie im DMT-Menü die Option Normalisierungseinstellungen (Abbildung 4B), und stellen Sie die Parameter wie folgt ein (Abbildung 4C):
    1. Okularkalibrierung (mm/div): 1; Solldruck (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; Zeit für die Online-Mittelung (Sekunden): 3; Verzögerungszeit (Sekunden): 60.
      HINWEIS: IC1 bezeichnet den inneren Gefäßumfang bei maximaler Wirkkrafterzeugung, während IC100 den Umfang darstellt, der einem transmuralen Druck von 100 mmHg entspricht. Menschliche Nierenarterien weisen eine erhebliche Variabilität zwischen den Proben auf, die eine Standardisierung erfordert, im Gegensatz zu Tiermodellen, die konsistente vaskuläre Eigenschaften für die experimentelle Bestimmung und Wiederverwendung des IC1/IC100-Verhältnisses aufweisen. Aufgrund erheblicher Unterschiede im Gefäßdurchmesser, in der Wandstärke und in den mechanischen Eigenschaften zwischen den einzelnen menschlichen Proben muss jedes Gefäß einer unabhängigen Normalisierung unterzogen werden, um seine einzigartigen Basiseigenschaften zu ermitteln. Das Verhältnis von 0,9 wurde daher hier als Platzhalter für die Protokollinitialisierung etabliert und in der Praxis in diesem Protokoll nicht verwendet.
  3. Wählen Sie den Kanal aus, der der Zielarterie entspricht, öffnen Sie den Normalisierungsbildschirm aus dem DMT-Menü (Abbildung 4C) und füllen Sie ihn mit den entsprechenden Daten:
    1. Endpunkte des Gewebes: a1 sollte 0 sein, a2 sollte die Länge des Gefäßes (in mm) sein; Drahtdurchmesser: 40 μm (geben Sie den Durchmesser des verwendeten Drahtes ein); Mikrometermesswert: Der Wert aus der Mikrometerskala, klicken Sie auf Punkt hinzufügen , um den Punkt aufzuzeichnen.
  4. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Punkt hinzufügen , um den ersten Punkt aufzuzeichnen und den Normalisierungsvorgang zu starten.
  5. Wenden Sie passive Dehnung an, warten Sie 3 Minuten, geben Sie den Mikrometerwert als nächsten Punkt ein und fügen Sie dann 5 ml 60K+ hinzu, um eine kaliumvermittelte Gefäßkontraktion auszulösen (Abbildung 5).
  6. Warten Sie, bis die Kontraktion ein Plateau erreicht. Waschen Sie dann die 60K+ -Lösung 3 Mal mit 5 mL Krebslösung aus und berechnen Sie die aktiven Kraftdaten aus der Spur, indem Sie die passive Kraft bei jeder Dehnung von der kaliumaktivierten Kraft subtrahieren (Abbildung 5).
  7. Wiederholen Sie die Schritte 5.5 bis 5.6 ("Stretch-60K+ Stimulation-Wash"), bis die aktive Kraft ihr Maximum erreicht, und bestimmen Sie dann die optimale Basisspannung, bei der die aktive Kraftproduktion des Gefäßes maximal ist (Abbildung 5).
  8. Äquilibrieren Sie den arteriellen Ring in der Kammer für 10 Minuten, bevor Sie mit den nächsten Schritten des Experiments fortfahren.

6. Nachweis der Reaktivität des Nierenarterienrings

  1. Stellen Sie sicher, dass das Krebsvolumen in jeder Kammer 5 mL beträgt, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
  2. Um die Phenylephrin-induzierte konzentrationsabhängige Kontraktion zu bewerten, wenden Sie kumulatives Phe in Schritten von halben Logarithmus (10-9 bis 10-4 M) an37.
  3. Beginnen Sie mit der niedrigsten Phe-Konzentration (10-9 M). Geben Sie 5 μl Phe-Stamm (10-6 M) in die Kammer mit 5 ml Krebs-Puffer, überwachen Sie kontinuierlich und warten Sie, bis sich die Kontraktion stabilisiert hat (2-3 Minuten unveränderte Spannung), markieren Sie den Punkt und fügen Sie dann die nächste Konzentration in Schritten von einem halben log hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zum Erreichen der Endkonzentration (10-4 M), wobei die Überwachung durchgehend konstant ist (Abbildung 6).
  4. Waschen Sie die Kammer für zusätzliche Drogentests mindestens 5 Mal mit warmen 5 ml Krebslösung, bis die Spannung wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt und mindestens 10 Minuten lang stabil bleibt.
  5. Um die Acetylcholin-induzierte konzentrationsabhängige Vasodilatation zu bewerten, wenden Sie kumulatives ACh in Schritten von halbem Logarithmus (10-8 bis 10-5,5 M) an.
    HINWEIS: Im normalen Gefäßsystem dient die Reaktion auf Acetylcholin (ACh) als funktioneller Indikator für die endotheliale Integrität37,38. Die vasodilatatorische Reaktion auf ACh spiegelt die Endothelfunktion durch NO-vermittelte Entspannung in gesunden Gefäßen wider. Unter pathologischen Bedingungen kann diese Reaktion jedoch aufgrund einer beeinträchtigten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) und/oder veränderter Rezeptorsignalwege abgeschwächt oder aufgehoben werden.
  6. Die Gefäße mit 10-4 M Phe vorkontrahieren, 5 μl Phe-Stamm (10-1 M) in die Kammer mit 5 ml Krebspuffer geben und 15 Minuten lang inkubieren. Ausgehend von der niedrigsten ACh-Konzentration 5 μl Ach-Stamm (10-5 M) in die Kammer mit 5 ml Krebspuffer geben, kontinuierlich überwachen und auf die Reaktion der Vasodilatation warten (bestätigt durch anhaltende Spurenerkennung), den Punkt markieren und dann mit der nächsten Konzentration fortfahren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle getestet sind (Abbildung 7).
  7. Schließen Sie das Experiment ab, indem Sie die Datei speichern und die arteriellen Ringe entfernen. Reinigen Sie die Kammer gründlich, indem Sie 3 Minuten lang mit 10 ml 8%iger Essigsäurelösung inkubieren und dann 3 Mal mit 10 ml Wasser spülen. Inkubieren Sie anschließend 3 Minuten lang in 10 ml 95%igem Ethanol und spülen Sie es erneut 3 Mal mit 10 ml Wasser aus. Schalten Sie abschließend sowohl die Heizung als auch das Gas aus und stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten entfernt wurden, bevor Sie das Gas abstellen.

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Ergebnisse

Bei der menschlichen Niere verläuft die Arteria interlobäris zwischen den Nierenpyramiden entlang der entsprechenden Vene. Diese Arterie zeichnet sich durch eine relativ dicke Gefäßwand und eine deutliche Fettgewebsumhüllung aus und erfordert eine besonders sorgfältige Dissektion. Das umgebende Fettgewebe sollte sorgfältig entfernt werden, um eine übermäßige Krafteinwirkung während des Isolationsverfahrens zu vermeiden (Abbildung 1C).

Die Arteria arcuatus ist anat...

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Diskussion

Die Stabilität der renalen Perfusion dient sowohl als kritisches therapeutisches Ziel als auch als Fenster in die hämodynamische Pathophysiologie39,40. Wir stellen ein Protokoll für die hierarchische Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Nierenarterien aus frischen Nephrektomieproben vor, das erhebliche Lücken in den aktuellen Methoden schließt. Im Gegensatz zu bestehenden Ansätzen, die auf Leichenproben oder Tierm...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken den Freiwilligen für ihre Teilnahme an dieser Studie und danken auch dem chirurgischen Personal der Urologischen Abteilung des Ersten Krankenhauses der Universität Peking für die Bereitstellung von Nierengewebe. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Beijing Municipal Natural Science Foundation (F251013 zu Y. Z., 7232096 zu Y. L.); Chinesische Wissenschaftsstiftung (82325004, 92168114 zu Y. Z., 82170422 zu Y. L.); Nationales Schlüssel-F&E-Programm von China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 bis Y. Z., 2021YFF0501404 bis Y. L., 2023YFC2415500 bis L. Y.); Forschungsprojekt des dritten Krankenhauses der Universität Peking im staatlichen Schlüssellabor für vaskuläre Homöostase und Remodellierung (Universität Peking; 2024-VHR-SY-07 bis Y.Z.); 2023 Beijing Municipal Health Commission Capital Medical Science and Technology Innovation Achievement Transformation Excellent Promotion Program Project (YC202301QX0162 an L. Y.); National High Level Hospital Clinical Research Funding (Scientific and Technological Achievements Transformation Incubation Guidance Fund Project of Peking University First Hospital, 2024CX24 to L. Y.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetylcholinchloridSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, DeutschlandNr. A6625
Kulturschale mit schwarzem BodenDanish Myo Technology, Aarhus, Dänemark300412
CaCl2Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA501330
D-GlukoseSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA610219
Dumont PinzetteDanish Myo Technology, Aarhus, Dänemark300413
Geuder PräparierschereDanish Myo Technology, Aarhus, Dänemark400431
FührungsdrahtDanish Myo Technology, Aarhus, Dänemark400447Durchmesser 40 & Mikro; m
KclSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100781
LabChart Professional Version 8.3 ADInstruments, Australien-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100288
Multi-Myographen-System Danish Myo Technology, Aarhus, Dänemark620 Mio.
NaClSangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaA100865
PhenylephrinSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, DeutschlandNr. P6126

Referenzen

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