Das Design und die Anwendung von inhibierenden Peptiden für eine schnelle in vitro Herunterregulierung posttranslationaler Modifikationsniveaus an einer bestimmten Stelle

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Designspezifikationen, Qualitätskontrollstandards und das funktionale Verifizierungssystem von TAT-PIP, einem posttranslationalen modifikationshemmenden Peptid, umreißt.

Zusammenfassung

Proteine sind die primären Ausführer von Lebensaktivitäten und werden auf transkriptioneller, translationaler und posttranslationaler Modifikationsebene (PTM) reguliert. Darüber hinaus stellt PTM einen komplizierteren Mechanismus zur Regulierung von Proteinaktivitäten dar, da ein Protein im Allgemeinen verschiedene Arten von PTMs und mehrere Stellen für ein spezifisches PTM aufweist. Die Plasmidtransfektion oder das Lentivirus und das Adenovirus könnten beim ersten Screening der funktionell wichtigen PTM-Stelle unter allen identifizierten Stellen verwendet werden; Diese Methoden stehen jedoch immer vor Herausforderungen wie geringer Effizienz beim Zell- und Gewebeeintritt, zeitaufwändige und hohe Kosten, potenzielle Immunreaktion usw. Um dies zu beheben, haben wir kürzlich eine Art rekombiniertes Peptid namens TAT-PIP entwickelt und erfolgreich eingesetzt, ein TAT-konjugiertes PTM-inhibitorisches Peptid. TAT-PIP besteht aus einem TAT-Modul, das den Zell- und Gewebeeintritt erleichtert, und einem PIP-Modul, das das PTM an Zielstellen durch kompetitive Bindung spezifisch herunterreguliert. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Designspezifikationen, Qualitätskontrollstandards und das funktionale Verifizierungssystem von TAT-PIP umreißt. Im Abschnitt "Design" beschreiben wir die Konsistenz, die optionale Länge, die Spezifität und die Konservierung von TAT-PIP. Als nächstes stellen wir die Anforderungen an die Qualitätsprüfung von TAT-PIP vor, die seine Wirksamkeit und Sicherheit garantieren. In der Anwendung des TAT-PIP-Teils führten wir den Konzentrationsgradiententest von TAT-PIP, den Inkubationsprozess der getesteten Zellen und den anschließenden phänotypischen Nachweis ein. Zusammenfassend beschreiben wir eine effektive Methode zum Screening von PTM-Stellen, indem wir eine bestimmte Stelle selektiv ausschalten und den resultierenden Phänotyp beobachten, um auf seine Funktion zu schließen. Aufgrund der geringen Synthesekosten und der hohen Effizienz überwindet dieses Verfahren die Einschränkungen bestehender Technologien, wie z. B. der Plasmidtransfektion.

Einleitung

Proteine sind die primären Ausführer von Lebensaktivitäten, und ihre biologischen Regulationsprozesse umfassen zwei Kernaspekte der Genexpressionsregulation: die Gentranskription und die mRNA-Translation. In den letzten Jahrzehnten hat sich die posttranslationale Modifikation (PTM) jedoch zu einem weiteren unverzichtbaren Mechanismus zur Regulierung der zellulären Funktionen entwickelt¹. Die Phosphorylierung, das den Forschern bekannteste PTM, spielt eine besonders wichtige Rolle bei physiologischen Funktionen. Nachdem beispielsweise die extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) durch die MEK-Kinase an den Stellen Thr202 und Tyr204 phosphoryliert wurde, ändert sich ihre Konformation, wodurch das aktive Zentrum freigelegt wird, das nachgeschaltete Zielproteine, wie z. B. Transkriptionsfaktoren², aktiviert. Im Gegensatz dazu wird bei der Phosphorylierung des N-terminalen Ser9 von GSK-3β durch die Akt/PKB-Kinase seine Substratbindungstasche blockiert, was zu einem Verlust der Kinaseaktivität³ führt. Die Ubiquitinierung ist ein weiteres wichtiges PTM, das verschiedene zelluläre Prozesse durch die kovalente Bindung von Ubiquitin-Molekülen an Substratproteine reguliert. Ubiquitin enthält 7 Lysinreste (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) und ein N-terminales Methionin (M1). Die Verknüpfung von Ubiquitin-Ketten an verschiedenen Stellen verleiht den Substratproteinen unterschiedliche Schicksale. Die Hauptfunktion der K48-verknüpften Ubiquitinierung besteht darin, Substratproteine für den Abbau durch das Proteasom^{zu markieren 4}. Umgekehrt besteht die primäre Funktion der K63-verknüpften Ubiquitinierung darin, eine nicht-degradative Signaltransduktion durchzuführen, wie z. B. die Reparatur von DNA-Schäden, Entzündungsreaktionen und Endozytose⁵. In den letzten Jahren wurde mit der rasanten Weiterentwicklung der Proteomik-Technologien eine zunehmende Anzahl neuartiger PTMs entdeckt. Neben der klassischen Acetylierung wurden neuartige Acylierungen wie Propionylierung, Crotonylierung und Glutarylierung identifiziert⁶. Im Bereich der Histonmodifikationen stört die Histon-Laktosylierung die RNA m⁶A-Modifikation und die Homöostase der Immunmikroumgebung⁷. Im Bereich der Nicht-Histon-Modifikationen ist die Verringerung der ATP5O-Crotonylierung ein wesentlicher nachteiliger Faktor für die Herunterregulierung des Phospholipidstoffwechsels⁸.

Die Erforschung von PTM erfordert eine systematische Weiterentwicklung der Analyse des PTM-Proteoms⁹. Dieses Gebiet umfasst zwei große Forschungsrichtungen: die Analyse von PTM-Profilen auf der Ebene des gesamten Proteoms und die umfassende Identifizierung der PTM-Stellen eines bestimmten Proteins. Obwohl die moderne Massenspektrometrie verschiedene Arten von PTMs und die spezifischen Stellen effektiv identifizieren kann, bleibt das Screening und die Validierung wichtiger funktioneller Stellen eine zentrale wissenschaftliche Herausforderung, die den Forschungsfortschritt einschränkt. Die Etablierung effizienter Standort-Screening-Strategien ist der erste Schritt, um die Funktion der wichtigsten regulatorischen Standorte zu klären. Traditionelle Methoden umfassen die Konstruktion mutierter Plasmide für bestimmte Stellen (inaktivierende Mutationen, aktivierende Mutationen), deren Einführung in Zielzellen durch In-vitro-Transfektionstechniken und die systematische Bewertung von Veränderungen phänotypischer Indikatoren wie Zellproliferation, Apoptose und oxidativem Stress. Diese Strategie stößt jedoch bei transkriptionell stummen Zellmodellen wie Eizellen und primären Gewebekultursystemen auf erhebliche technische Hindernisse. Obwohl das lentivirale oder Adenovirus-Transduktionssystem das Problem der Transfektionseffizienz teilweise lösen kann, steht seine Anwendung vor doppelten Herausforderungen: hohe wirtschaftliche Kosten und geringe Penetrationseffizienz von Viruspartikeln in vitro-Gewebemodellen. Während die Strategie, mutierte Knock-in-Mäuse zu konstruieren, extrem langlebig und kostspielig ist. Insgesamt ist es dringend erforderlich, dass wirtschaftliche und effiziente Strategien für das Erstscreening von funktionell wichtigen PTM-Standorten entwickelt werden.

In den letzten Jahren hat unser Team erfolgreich eine schnelle PTM-Herunterregulierungstechnik namens TAT-PIP, TAT-conjugated PTM inhibitory peptide, entwickelt und eingesetzt, die auf der kompetitiven Hemmung von Polypeptiden basiert. Sein Hauptvorteil ist seine Universalität und hohe Effizienz bei der Durchführung eines Vorscreenings von funktionell wichtigen PTM-Stellen, was eine entscheidende Grundlage für eingehende Analysen der molekularen Mechanismen wichtiger PTM-Stellen bietet. Diese Studie erläutert systematisch den prinzipiellen Rahmen und den Implementierungsprozess von TAT-PIP und demonstriert seine Wirksamkeit bei der Regulierung des PTM-Spiegels an einem bestimmten Ort anhand repräsentativer experimenteller Daten.

Protokoll

1. Entwerfen der TAT-PIP-Sequenz

HINWEIS: TAT-PIP besteht aus zwei Teilen von Peptiden (Abbildung 1): Der N-terminale Teil ist TAT, CYGRKKRRQRRR, der für jeden TAT-PIP unverändert bleibt und dabei helfen kann, effizient in in vitro kultivierte Zellen oder in vivo-Gewebe einzudringen; der C-terminale Teil ist eine Polypeptidsequenz um die spezifische PTM-Stelle (Abbildung 1, normalerweise Lysin im Symbol "K", rot hervorgehoben) eines Objektproteins. Die Länge des PIP beträgt etwa 10-15 AA-Reste (wenn länger, steigen die Kosten; wenn kürzer, nimmt die Spezifität signifikant ab).

1. Optimieren Sie die PIP-Sequenz durch Blast-Analyse (Abbildung 2).
   1. Melden Sie sich bei https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ an, klicken Sie auf die Blastp-Suche nach Proteinsequenzen.
   2. Kopieren Sie die Zielproteinsequenz in das Fenster zum Eingeben der Abfragesequenz .
   3. Wählen Sie unter Suche auswählen die Option Standarddatenbanken aus. Wählen Sie in der Programmauswahl die Option blastp (Protein-Protein BLAST). Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche BLAST (BLAST ) (Abbildung 2B).
   4. Wählen Sie Peptidsegmente mit höchster Spezifität als Kandidaten-PIPs aus.
2. Führen Sie einen Homologievergleich zwischen Menschen und Mäusen für den endgültigen PIP durch.
   1. Melden Sie sich bei https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ an, klicken Sie auf die Blastp-Suche nach Proteinsequenzen.
   2. Kopieren Sie die Sequenzen des Proteins sowohl von menschlichen als auch von Mausspezies und fügen Sie sie in das Eingabesequenzfeld ein.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden, um die Ergebnisse zu erhalten.
   4. Wählen Sie einen PIP mit 100% Homologie zwischen Mensch und Maus (Abbildung 2C).
3. Bestimmen Sie die Zusammensetzung von TAT-PIP, das aus dem N-terminalen TAT und dem C-terminalen PIP besteht.

2. Synthese und Qualitätsverifizierung von TAT-PIP

1. Wählen Sie ein Unternehmen mit umfangreicher Projekterfahrung, um mit Massenspektrometrie eine Peptidreinheit von nicht weniger als 98 % sicherzustellen und Verunreinigungen zu vermeiden, die nachfolgende Experimente beeinträchtigen könnten.
   HINWEIS: Der Endotoxingehalt des Polypeptids sollte ≤10 betragen und frei von Krankheitserregern sein.

3. Die Anwendung von TAT-PIP

1. Verwenden Sie pathogenfreies Reinstwasser, um TAT-PIP aufzulösen, um eine Stammkonzentration von 10 mg/ml zu erreichen. Geben Sie das Material in kleine Röhrchen ab, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, die zu einer teilweisen Denaturierung führen.
   HINWEIS: Die Zugabe von 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) trägt zum Schutz der Struktur von TAT-PIP bei.
2. Behandeln Sie Zellen mit TAT-PIP.
   1. Kultur humaner embryonaler Nieren-293T-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO₂).
      HINWEIS: Nach der Aussaat wurden die Zellen etwa 12 Stunden lang kultiviert, und die TAT-PIP-Behandlung wurde durchgeführt, als die Konfluenz etwa 70 % erreichte.
   2. Verdünnen Sie das gelöste TAT mit PBS auf 1 mg/ml und geben Sie es dann 24 h lang in der entsprechenden Dosierung (empfohlene Endkonzentration des Kulturmediums: 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml) direkt in das Zellkulturmedium.
   3. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit dem Original-Nährmedium.
   4. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um das Ausmaß der Herunterregulierung des PTM zu überprüfen.
      HINWEIS: Basierend auf Erfahrungen und nachfolgenden experimentellen Ergebnissen beträgt die optimale Endkonzentration von TAT-PIP 0,1 mg/ml.

4. Westlicher Blot

1. Bereiten Sie Zellproteinproben vor.
   1. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), fügen Sie 200 μl starken Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer (mit Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]-Proteaseinhibitor) in das Zellpellet hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang für die Vorlyse, kratzen Sie sie mit einem Zellschaber ab.
   2. Beschallung des Gemischs mit einem Ultraschallbrecher bei 12 % Energieintensität für 5 s.
   3. Das Zelllysat 30 min auf Eis kühlen und bei 13400 g bei 4 °C 10 min zentrifugieren.
   4. Der Überstand, der Proteine enthält, wird in ein vorgekühltes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. 1/4 Volumen 5x Probenpuffer in den Überstand geben (Endkonzentration 1x).
   5. Die Mischung einreiben, 5 min in einem trockenen Thermostat auf 95 °C erhitzen und 2 min auf Eis kalt stellen.
   6. Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit einem Bradford-Assay an einem Nanotropfen.
2. Führen Sie eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch.
   1. Verwenden Sie für die SDB-PAGE ein 12 % auflösendes Gel und ein 4 % Stapelgel.
   2. Pipettieren Sie die Proteinproben entsprechend dem angegebenen Volumen in die Vertiefungen.
   3. Schalten Sie das Elektrophoresegerät ein und lassen Sie es zunächst 30 Minuten lang bei 80 V, 300 mA laufen, um die Banden an der Grenzfläche zwischen dem Stapel- und dem Auflösungsgel auszurichten. Lassen Sie dann 45 Minuten lang bei 120 V, 300 mA laufen, um die Proteine aufzulösen.
   4. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel mit Hilfe einer Schnelltransferapparatur auf die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran.
3. Durchführen von Blockierung, Antikörperinkubation und Visualisierung.
   1. Blockieren Sie die PVDF-Membran in 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur (RT).
   2. Die Membran wird mit dem Primärantikörper, der über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator auf 1:1000 % in 5 % Magermilch/PBST verdünnt wird, inkubiert.
   3. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST (je 10 min).
   4. Die Membran wird mit dem Sekundärantikörper 1:1000 in 5 % Magermilch/TBST bei RT 1 h lang inkubiert.
   5. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST (je 10 min).
   6. Belichten Sie die Membran in einer Zeitreihe (5 s, 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s), um das optimale Bild unter einem elektrogenerierten Chemilumineszenz-Gerät (ECL) zu erhalten.

5. Funktionelle Validierung von TAT-PIP in in vitro kultivierten Zellen

1. Erkennen Sie den Gehalt an zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
   1. Platte 293T-Zellen mit einer optimalen Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/Well in einer 24-Well-Kulturplatte.
   2. Behandeln Sie die Zellen 24 Stunden lang mit TAT-konjugiertem Histon3-Lysin-116-Crotonylierungs-inhibitorischem Peptid (THCIP) (0,1 mg/ml) und waschen Sie die Zellen dann mit PBS.
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit 10 μM Dichlor-Dihydro-Fluorescein-Diacetat (DCFH-DA) in serumfreiem DMEM bei 37 °C im Dunkeln für 20 min.
   4. Nehmen Sie Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop auf und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit der Messfunktion in ImageJ.
      HINWEIS: Es wurde der FITC-Filtersatz mit einem Emissionsfilter von 465-495 nm, einem dichroitischen Spiegel 505A und einem zweiten Emissionsfilter von 512-550 nm verwendet.
2. Zellproliferations-Assay
   1. Keimen Sie 293T-Zellen mit einer optimalen Dichte von 1 x 10⁵ Zellen pro Well in einer 24-Well-Kulturplatte.
   2. Geben Sie 10 μl CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung.
   3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2 h.
   4. Zeichnen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader auf und subtrahieren Sie das Hintergrundsignal von den Blind-Wells (Medium + CCK-8).
   5. Normalisieren Sie die Daten, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen.
3. Nachweis des zellulären ATP-Spiegels
   1. Lysieren Sie die Zellen mit einem Lysepuffer. Das Lysat wird bei 12.000 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand für die anschließende Analyse.
   2. Verdünnen Sie die ATP-Standardlösung mit dem Lysepuffer, um einen Konzentrationsgradienten von 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM und 5 μM zu erzeugen.
   3. Geben Sie 20 μl ATP-Nachweislösung in jede Vertiefung, die entweder den Zellüberstand oder den ATP-Standard enthält.
   4. Messen Sie sofort das Lumineszenzsignal mit einem Mikroplatten-Reader.
      1. Klicken Sie auf Plattenlayout und wählen Sie die entsprechende Plattenvorlage in Plattenvorlage ändern aus, um Muster (Standards und Muster) einzurichten.
      2. Klicken Sie dann links auf Protokoll , wählen Sie die Schaltfläche Chemilumineszenz und klicken Sie dann auf Start , um die Erkennung zu starten.
   5. Generieren Sie aus den Lumineszenzsignalen der ATP-Standards eine Standardkurve und verwenden Sie diese, um die ATP-Konzentration im Zellüberstand zu quantifizieren.

Ergebnisse

Diese Studie beschreibt eine Strategie, die TAT-PIP verwendet, um den PTM-Spiegel eines Zielproteins an einer bestimmten Stelle auf der Grundlage kompetitiver Hemmung herunterzuregulieren. In einem typischen Beispiel wird der TAT-PIP hier speziell in THCIP umbenannt. Es besteht aus zwei Funktionsmodulen: (1), dem N-terminalen zellpenetrierenden Peptid TAT (CYGRKKRRQRRR), das es THCIP ermöglicht, in Zellen einzudringen; (2) die C-terminale Sequenz um K116 von H3, AIHAKRVTIMPKD, die spezifisch mit dem endogenen H3 konkurri...

Diskussion

In diesem Protokoll sind die folgenden Schritte von entscheidender Bedeutung. Zunächst befasst sich das TAT-PIP-Design mit der Spezifität des Peptids. Zweitens, optimieren Sie die Anwendung und die Endkonzentration; Die optimierte Konzentration muss sorgfältig getestet werden, um einen effizienten und schnellen Knockdown zu erreichen. Drittens, um die Wirkung des TAT-PIP zu verifizieren, werden mehrere Experimente empfohlen, anstatt sich auf ein einzelnes Experiment zu verlassen, um sein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Automatisches multifunktionales Bildgebungssystem	Tanon	4600	Der Belichtungsmesser identifiziert und visualisiert die Zielproteinbanden, indem er die Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzsignale auf der Membran nach der Entwicklungsbehandlung detektiert.
Zellzählkit-8	GLPBIO	GK10001	Basierend auf der Korrelation zwischen der metabolischen Lebensfähigkeit der Zellen und der Zellzahl bewertet diese Methode die proliferative Kapazität von Zellen durch Messung der Reduktionsfähigkeit von Zellen zu CCK-8-Reagenzien
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)		Das modifizierte Eagle's Medium (DMEM) von Gibco 11995065 Dulbecco ist ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums einer Vielzahl von Säugetierzellen.
ECL-Chemilumineszenz-Substrat	Biosharp	BL520B	ECL-Substrate erzeugen durch Chemilumineszenzreaktionen Lichtsignale, die den Nachweis spezifischer Proteine oder Nukleinsäuren ermöglichen.
Elektrophoresegerät	Tanon	EPS600	Die Hauptaufgabe des Elektrophoresegeräts besteht darin, biologische Makromoleküle zu trennen und zu analysieren ‌
Erweitertes ATP-Assay-Kit	Beyotime	S0027	Das Kit kann den ATP-Spiegel von Proben effektiv nachweisen
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	16000-044	Fötales Rinderserum (FBS) liefert essentielle Nährstoffe und Wachstumsfaktoren für den Zellerhalt und das Zellwachstum.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	Das Gerät ist hocheffizient und in der Lage, innerhalb von 15 Minuten einen schnellen Proteintransfer vom Polyacrylamidgel zur PVDF-Membran zu erreichen
Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus Corporation	IX73	Die Fluoreszenzmikroskopie verwendet ultraviolettes Licht als Lichtquelle, um das untersuchte Objekt zu bestrahlen, damit es Fluoreszenz emittiert, und dann die Form und Position des Objekts unter dem Mikroskop.
NanoDrop2000 Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer	Thermo Scientific	2000	NanoDrop wurde verwendet, um die Konzentration der DNA- oder
	BioRAD zu	1620177	Diese Art von PVDF-Membran hat eine ausgezeichnete chemische Beständigkeit und eine hohe Proteinbindungsfähigkeit
ROS-Assay-Kit	Beyotime	S0033S	Das Kit kann den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies in Zellen
genau nachweisenTAT-Konjugater H3K16 Crotonylierungshemmendes Peptid	Nanjing Taopu Biotechnology Co. Ltd	CN218107533U	Es kann spezifisch mit dem endogenen H3 konkurrieren, das bei K16
TBST	Biosharp	BL602A	TBST kann irrelevante Substanzen auf der Membran reinigen, experimentelle Fehler reduzieren und die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse sicherstellen ‌
Ultraschallbrecher	LICHEN	LC-AUD-150P	Zu den Hauptfunktionen des Geräts gehören Zellfragmentierung, Partikeldispersion und Emulgierung
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Mikroplatten-Reader können eine quantitative Hochdurchsatzanalyse von biologischen Proben durchführen, indem sie die optischen Signale (wie Absorption, Fluoreszenz oder Lumineszenz) von Proben in Mikrotiterplatten detektieren

RNA-PVDF-Membran bestimmen