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Methodenartikel

Funktion und Histopathologie der Nierenarterie in Verbindung mit Plasma- und Stuhlmetaboliten bei Patienten mit Herzinsuffizienz

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DOI:

10.3791/68583

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9. September 2025

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1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung einer multimodalen Plattform zur Aufklärung der kardialen Metaboliten-getriebenen renalen Gefäßdysfunktion beim kardiorenalen Syndrom vor.

Zusammenfassung

Die Darmmikrobiota und die damit verbundenen Wirt-Mikroben-Co-Metaboliten werden zunehmend als Schlüsselregulatoren des systemischen metabolischen Gleichgewichts und der kardiorenalen Achse anerkannt, insbesondere im Zusammenhang mit dem kardiorenalen Syndrom. Obwohl klinische Beweise darauf hindeuten, dass kardiale Dysfunktionen pathologische Veränderungen der Nieren auslösen oder verschlimmern können, sind die wichtigsten metabolischen Signalmoleküle, die die kardiorenale Achse vermitteln, und die ihnen zugrunde liegenden Mechanismen nach wie vor schwer fassbar. Diese Studie etabliert eine neuartige systematische Forschungsplattform, die kardiometabolische Signaturen mit der Analyse der Nierengefäßfunktion integriert und Folgendes umfasst: (1) Isolierung und Extraktion von Plasma-/Stuhlmetaboliten von Herzinsuffizienzpatienten; (2) Ex-vivo-Isolierung von Nierengefäßen und Primärkulturtechniken; (3) Ein multimodaler Bewertungsrahmen für kardiorenale metabolische Interaktionen, der vaskuläre Funktionsassays, molekulare biochemische Tests für Marker für Nierengefäßverletzungen und histopathologische Analysen umfasst. Im Vergleich zu gesunden Kontrollen beeinträchtigten Metaboliten von Herzinsuffizienzpatienten die Nierengefäßfunktion und induzierten Entzündungsreaktionen, was ihr Potenzial als funktionelle Biomarker beim kardiorenalen Syndrom unterstreicht. Diese Studie konzentriert sich nicht auf einen spezifischen Metaboliten; Daher ist eine weitere Identifizierung und Validierung der spezifischen Arten von Metaboliten, die pathogene Wirkungen ausüben, in zukünftigen Studien unter Verwendung von Analysetechniken wie LC-MS/MS und NMR erforderlich. Die Anwendung dieser Plattform zeigte, dass kardiale Metaboliten, die mit Herzerkrankungen assoziiert sind, die Nierengefäßfunktion und die Homöostase beeinträchtigen. Diese Ergebnisse liefern einen mechanistischen Einblick in die metabolischen Treiber kardiorenaler Interaktionen und bieten ein translationales Werkzeug zur Identifizierung neuer Biomarker und therapeutischer Ziele.

Einleitung

Das kardiorenale Syndrom (CRS) ist eine komplexe pathologische Erkrankung, die durch eine bidirektionale Schädigung zwischen Herz und Nieren gekennzeichnet ist. Die komplizierte Wechselwirkung zwischen diesen beiden Organen wurde erstmals 1836 von Robert Bright beschrieben, der systematisch signifikante strukturelle Veränderungen im Herzen dokumentierte, die mit einer fortgeschrittenen Nierenerkrankung einhergingen1. Die Prävalenz von CRS ist stark mit der Koexistenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und chronischen Nierenerkrankungen (CKD) verbunden. Studien zeigen, dass etwa 30 % der Patienten mit Herzinsuffizienz auch an CNE leiden, während 44 % bis 51 % der Todesfälle bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz direkt auf kardiovaskuläre Ereignisse zurückzuführen sind2.

Das Management von CRS stellt mehrere große Herausforderungen dar. Erstens ist die klinische Versorgung nach wie vor fragmentiert, da es an interdisziplinärer Koordination und Frühwarnmechanismen mangelt, was oft zu verzögerten Interventionen während der Dekompensationsphase3 führt. Zweitens stehen die derzeitigen Behandlungsstrategien vor einem paradoxen Dilemma. Konventionelle Therapien wie Diuretika und Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS)-Hemmer können die Symptome der Herzinsuffizienz lindern4; Ihre längere oder hochdosierte Anwendung kann jedoch das RAAS und das sympathische Nervensystem (SNS) aktivieren, was die renale Hypoxie und Fibrose verschlimmert und letztendlich zur Diuretikaresistenz und Verschlechterung der Nierenfunktion beiträgt5. In ähnlicher Weise können Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren (ACEIs) und Angiotensin-Rezeptor-Blocker (ARBs) zwar kardiorenale Schäden abschwächen, ihr klinischer Einsatz ist jedoch aufgrund von Bedenken hinsichtlich erhöhtem Serumkreatinin oder Hyperkaliämie oft eingeschränkt, da nur 30 % bis 40 % der Patienten eine Langzeittherapie vertragenkönnen 6.

Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein dringender Bedarf, wirksame frühe Biomarker zu identifizieren und ein tieferes Verständnis der CRS-Pathogenese zu erreichen, um die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele zu erleichtern. Die derzeitigen Einschränkungen bei der Identifizierung umsetzbarer Mediatoren des kardiorenalen Crosstalks - insbesondere krankheitsspezifische Metaboliten, die eine direkte Verbindung zwischen kardialer Dysfunktion und Nierengefäßschäden herstellen - behindern jedoch Fortschritte bei der Lösung dieser ungedeckten klinischen Anforderungen. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Metaboliten, die mit Herzerkrankungen assoziiert sind, sowohl als diagnostische Biomarker als auch als mechanistische Treiber des CRS dienen können, indem sie die renale Gefäßhomöostase umprogrammieren, doch ihre raumzeitliche Rolle bei der Initiierung oder Verstärkung von Nierenschäden bleibt schlecht charakterisiert 7,8,9. Jüngste Studien haben gezeigt, dass endogene Metaboliten wie Ceramide Gefäßentzündungen und -umbau aktiv verschlimmern können, insbesondere bei kardiorenalen Erkrankungen, was die breitere Relevanz der Metabolitenerkennung in der Gefäßpathologie unterstreicht10.

Unter den Nierenkompartimenten, die bei CRS betroffen sind, wird das Gefäßsystem zunehmend als primäres und frühes Ziel von Verletzungen anerkannt. Eine endotheliale Dysfunktion in der renalen Mikrozirkulation - gekennzeichnet durch eine beeinträchtigte Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid, oxidativen Stress und eine erhöhte Expression von proinflammatorischen und prothrombotischen Mediatoren - trägt zur mikrovaskulären Verdünnung, erhöhten Gefäßpermeabilität und regionaler Hypoxie bei11. Parallel dazu sind vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs), die für die Regulierung des arteriellen Tonus und der Compliance unerlässlich sind, auch anfällig für metabolische Dysregulation bei CRS. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass krankheitsassoziierte Metaboliten die VSMC-Kontraktilität stören, maladaptiven Umbau fördern und zu einer erhöhten Gefäßsteifigkeit und einer beeinträchtigten Nierenperfusion beitragen können. Trotz ihrer grundlegenden Rolle sind die durch die glatte Muskulatur verursachten Mechanismen der vaskulären Dysfunktion in aktuellen CRS-Modellen noch wenig erforscht 8,12. Diese pathophysiologischen Veränderungen verschlimmern nicht nur die Nierenschäden, sondern fördern auch die maladaptive neurohormonelle Aktivierung und systemische hämodynamische Störungen, wodurch die Herzfunktion weiter beeinträchtigt und das Fortschreiten des CRS fortgesetztwird 13. Die gezielte Behandlung von Nierengefäßschäden bietet somit einen mechanistisch informativen Einblick in die frühe Pathogenese des CRS und einen rationalen Fokus für die Untersuchung der metabolischen Wechselwirkungen zwischen Herz und Niere.

Um diese Lücken zu schließen, priorisiert unsere Studie die systematische Identifizierung und funktionelle Validierung von Herzinsuffizienz-assoziierten Metaboliten als zentrale Regulatoren der CRS-Progression. Diese Arbeit überbrückt die kritische Lücke zwischen der Entdeckung von Biomarkern aus der Beobachtung und der mechanistischen Pathogeneseforschung, indem sie beschreibt, wie diese Metaboliten eine Nierengefäßfunktionsstörung induzieren, Entzündungskaskaden aktivieren und Gewebereparaturmechanismen beeinträchtigen. Traditionelle Modelle, die zur Untersuchung von CRS verwendet werden – einschließlich Tiermodellen, In-vitro-Zellkulturen und Organoiden, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnen werden – haben jeweils Einschränkungen14. Tiermodelle leiden unter Unterschieden zwischen den Spezies, die die klinische Relevanz einschränken. In-vitro-Kulturen fehlt es an Integration auf Organebene, während iPSC-abgeleitete Organoide - obwohl sie in der Lage sind, Interaktionen zwischen Kardiomyozyten und tubulären Epithelzellen zu modellieren - funktionell unausgereift und auf frühe Entwicklungsstadien beschränkt sind15. Darüber hinaus bestehen die derzeitigen vaskulären Organoidsysteme in erster Linie aus endothelialen Monoschichten oder primitiven Mikrogefäßen, denen die kontraktile glatte Muskelschicht und funktionelle Messwerte fehlen, die zur Beurteilung der Reaktionen auf Gefäßebene auf metabolische Schädigung erforderlich sind16.

Im Gegensatz dazu verwendet unsere Plattform humane kardiale Metaboliten und ex vivo humane Nierengefäße, die physiologisch relevante und strukturell intakte ex vivo humane Nierenarterien ermöglichen, was eine physiologisch relevante und mechanistisch informative Analyse der kardiorenalen metabolischen Wechselwirkungen an der vaskulären Grenzfläche ermöglicht. Dies bietet einen einzigartigen Vorteil bei der Modellierung der metabolischen Kommunikation zwischen den Organen, die dem Fortschreiten des kardiorenalen Syndroms zugrunde liegt. Unsere bahnbrechende integrierte kardiorenale Forschungsplattform vereint drei Kerninnovationen: die metabolomische Profilerstellung von Plasma-/Stuhlmetaboliten aus Herzinsuffizienz, ex vivo renovaskuläre Isolations-/Kultursysteme und die multimodale funktionell-molekular-histopathologische Bewertung. Jede Komponente dieser Plattform wurde hinsichtlich Reproduzierbarkeit und translationaler Relevanz optimiert, einschließlich der Verwendung von 200 μl Plasma oder 0,1 g Stuhlmaterial pro Probe, der Inkubation von 2 mm humanen Nierenarteriensegmenten bei 37 °C mit 5 % CO2 für bis zu 24 Stunden und dem quantitativen Nachweis von vaskulären Verletzungsmarkern durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses System entschlüsselt nicht nur das diagnostische Potenzial von Metabolitensignaturen, sondern verknüpft auch direkt ihre kausalen Beiträge zur CRS-Pathologie und ermöglicht so die Identifizierung therapeutischer Ziele durch Kartierung der metabolischen Dysregulation zwischen Organen auf molekularer Ebene. Durch die Verbindung von mechanistischer Entdeckung und klinischer Translation verschiebt dieser duale Paradigmenwechsel das CRS-Management von der reaktiven Symptomkontrolle hin zu proaktiven Biomarker-gesteuerten Interventionen.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten experimentellen Protokolle und Fallmethoden wurden von der Urologischen Abteilung des Peking University First Hospital (Ethical Review Code: 2023yan500-002) und dem Peking Union Medical College Hospital (Zulassungsnummer I-23PJ585) unter strikter Einhaltung der in der Erklärung von Helsinki dargelegten Grundsätze ethisch genehmigt. Für diese Studie rekrutierten wir männliche oder weibliche Patienten, die ab Juli 2019 im Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) stationär behandelt wurden und bei denen von mindestens zwei erfahrenen Kardiologen eine Herzinsuffizienz (HF) diagnostiziert wurde. Insgesamt wurden vier HF-Patienten (HF1-HF4) für die Extraktion von Plasma- und Stuhlmetaboliten eingeschlossen. Von allen Probanden wurde vor ihrer Aufnahme in die Forschung eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Versuchsapparatur und die Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Verarbeitung von Plasma- und Stuhlproben – Extraktion polarer Metaboliten

  1. Musterkollektion
    1. Sammeln Sie alle Plasma- und Stuhlproben in sterilen, vorgekühlten Entnahmeröhrchen und frieren Sie sie nach der Entnahme sofort in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie die Proben bis zur Verarbeitung bei -80 °C.
    2. Um die Stabilität der Metaboliten zu gewährleisten, sollten alle Proben innerhalb eines Gefrier-Auftau-Zyklus verarbeitet werden und das Zeitintervall zwischen Probenentnahme und Extraktion 2 Wochen nicht überschreiten.
      HINWEIS: Diese Maßnahmen wurden ergriffen, um den Abbau von Metaboliten zu minimieren und die Reproduzierbarkeit in nachgeschalteten metabolomischen Analysen zu gewährleisten.
    3. Extrahieren Sie Metaboliten aus Stuhl- und Plasmaproben gemäß den Protokollschritten 1.3 bzw. 1.4.
  2. Studienpopulation
    1. Nehmen Sie Blutdruckmessungen zu Beginn vor und zeichnen Sie die Medikationshistorie aller Teilnehmer auf.
    2. Entnahme von Patientenproben vor einer akuten klinischen Verschlechterung, unter Ausschluss von Personen mit schwerwiegenden metabolischen Komorbiditäten (z. B. Diabetes, primäre Hypertonie), um Störfaktoren bei der metabolomischen Analyse zu minimieren (Ergänzende Tabelle S1).
    3. Erhalten Sie klinische Informationen für jeden Probanden mithilfe von Standardverfahren.
  3. Plasma-Extraktion
    1. Zentrifugieren Sie das Rohserum bei 14.000 × g für 10 min (4-8 °C). Sammeln Sie den Überstand in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Fügen Sie gekühltes (-80 °C) Methanol in HPLC-Qualität hinzu, um eine Methanolkonzentration von 80 % (v/v) zu erreichen. Vorsichtig durch Inversion mischen und bei -80 °C 6-8 h inkubieren.
    3. Zentrifugieren Sie bei 14.000 × g für 10 min (4-8 °C). Den methanolischen Überstand zur metabolomischen Profilierung in frische Röhrchen überführen.
      HINWEIS: Lagern Sie die Plasmaproben nach der Entnahme innerhalb von 2 Stunden in einen -80 °C-Gefrierschrank und minimieren Sie die Gefrier-Tau-Zyklen, um die Stabilität der Metaboliten zu gewährleisten.
  4. Extraktion von Fäkalien
    1. Geben Sie 500 μl Methanol in HPLC-Qualität (vorgekühlt auf -80 °C) in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu frischen oder gefrorenen Stuhlproben. Mit einem Mikrostößel-/Gewebehomogenisator auf Trockeneis für 1-2 min homogenisieren, gefolgt von Vortexen (1 min bei 4-8 °C) und Inkubation bei -80 °C für 4 h.
    2. Zentrifugieren Sie bei 14.000 × g für 10 min (4-8 °C) mit einer gekühlten Zentrifuge. Überstand in neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen; Bei -80 °C bis Schritt 1.4.4 lagern.
    3. Resuspendieren Sie das Pellet mit 400 μl vorgekühltem (-80 °C) Methanol in HPLC-Qualität. Gründlich vortexen (1 min bei 4-8 °C) und bei -80 °C 30 min inkubieren.
    4. Wiederholende Zentrifugation (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Kombinieren Sie die Überstände aus beiden Extraktionsphasen.
    5. Führen Sie eine abschließende Klärzentrifugation durch (14.000 × g, 10 min, 4-8 °C). Der gereinigte Überstand wird für die nachgeschaltete Analyse in sterile 1,5-ml-Röhrchen überführt.
      HINWEIS: Legen Sie die Kotproben nach der Entnahme innerhalb von 2 Stunden in einen -80 °C-Gefrierschrank und minimieren Sie die Gefrier-Tau-Zyklen, um die Stabilität der Metaboliten zu gewährleisten.

2. Isolierung der Nierenarterie

  1. Auswahl der Teilnehmer und Gewebeentnahme
    1. Screenen Sie Patienten, die sich einer radikalen Nephrektomie unterziehen, auf Nierenzellkarzinom. Umfassen Sie nur Personen im Alter von ≥ 18 Jahren ohne metabolische Komorbiditäten (z. B. primäre Hypertonie, Diabetes mellitus). Während der Operation ist histologisch normales Nierenparenchym zu entnehmen, das sich mindestens 3 cm von den Tumorrändern entfernt befindet.
    2. Tauchen Sie die geernteten Proben sofort in sauerstoffhaltigen Krebs-Henseleit-Puffer (4 °C, pH 7,4; Zusammensetzung in mM: 119,0 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 25,0 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 11,0 Glukose). Schließen Sie die Isolationsverfahren innerhalb von 6 Stunden nach der Operation ab.
  2. Vorbereitung des Nierengewebes
    1. Führen Sie einen koronalen Schnitt in 4 °C Krebspuffer durch, um heminephrische Proben mit intakten hilären Strukturen zu erhalten. Führen Sie eine Mikrodissektion mit einem stereomikroskopischen System (40-fache Vergrößerung) durch, um die Äste der Nierenarterie freizulegen und die bogenförmigen Arterien zu identifizieren.
  3. Mikrovaskuläre Dissektion
    1. Erreichen Sie eine präzise Isolierung von arteriellen Segmenten durch sequentielle Entfernung von perivaskulärem Adventitialgewebe mit einer Mikrohornhautschere.
    2. Die arteriellen Segmente mit einem Durchmesser von ca. 500 μm werden erhalten.
    3. Minimieren Sie die endotheliale Scherspannung durch spannungsfreie Manipulation mit Mikrozangen. Die Dissektion wird unter hypothermischen Bedingungen (4 °C) mit Krebspuffer durchgeführt, der alle 15 Minuten erneuert wird, um den physiologischen pH-Wert und die Ionenhomöostase zu erhalten.
      HINWEIS: Die explizite Quantifizierung der arteriellen Abmessungen und der Pufferzusammensetzung, ein thermisch regulierter Arbeitsablauf von der Beschaffung (4 °C) bis zur Verarbeitung (4 °C) und eine vollständige mikrovaskuläre Dissektion innerhalb von 6 Stunden nach der Probenentnahme gewährleisten eine optimale Lebensfähigkeit des Gewebes und eine funktionelle Integrität.

3. Inkubation der Nierenarterie mit Metaboliten von Herzschäden

  1. Gefäßgewebeaufbereitung: Präparieren Sie Nierenarterien mikrochirurgisch unter sterilen Bedingungen und entfernen Sie das anhaftende perivaskuläre Bindegewebe sorgfältig mit einer feinen Augenzange. Die isolierten Nierenarterien werden mit einer sterilen Mikroschere für die anschließende organotypische Kultur in 2-mm-Segmente geschnitten.
  2. Antibiotika-Dekontamination: Waschen Sie die Gefäßsegmente 3 x 5 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit einem dreifachen Antibiotika-/Antimykotika-Cocktail, um die mikrobielle Kontamination zu minimieren und die Sterilität vor der Exposition des Metaboliten zu gewährleisten.
  3. Experimentelle Gruppierung: Weisen Sie die Gefäßsegmente nach dem Zufallsprinzip vier experimentellen Kohorten zu und übertragen Sie sie auf 24-Well-Kulturplatten, die 500 μl Modified Eagle Medium von Dulbecco pro Vertiefung enthalten.
  4. Metaboliten-Intervention
    1. Fügen Sie Metaboliten aus den folgenden Gruppen hinzu: 1) Aus gesundem Kontrollplasma gewonnene Metaboliten (HC-P); 2) Plasma-abgeleitete Metaboliten von Herzinsuffizienzpatienten (HF-P); 3) Gesunde Metaboliten zur Kontrolle von Fäkalien (HC-F); 4) Metaboliten von Patienten mit Herzinsuffizienz (HF-F) aus dem Stuhl.
    2. Rekonstituieren Sie Metabolitenextrakte in Methanol (HPLC-Qualität) und verabreichen Sie 10 μl jedes Extrakts in die entsprechende Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte, die 500 μl Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium und Nierenarteriensegmente enthält (endgültige Lösungsmittelkonzentration von 2 % (v/v)). Äquivalente Mengen des Fahrzeugs (Methanol/PBS-Gemisch) in die Kontrollvertiefungen geben.
  5. Kulturbedingungen: Inkubieren Sie die Plattenanordnungen unter Standard-Zellkulturbedingungen (37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) für 24 Stunden mit einem befeuchteten Inkubator.

4. Ring-Assay der Nierenarterie

  1. Aufhängung und Fixierung des arteriellen Nierenrings
    1. Drahtvorbereitung: Führen Sie zwei parallele 2 cm lange Edelstahldrähte (prääquilibriert in Krebs, 95 % O2/5 % CO2) unter optischer Mikroskopie durch das arterielle Lumen, wobei an beiden Enden ein gleichmäßiger Drahtüberstand sichergestellt wird.
    2. Myograph-Montage: Schalten Sie die Heizung und das Gas ein, um die physiologische Temperatur und Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten. Drähte horizontal in einem temperaturgesteuerten Drahtmyographenbad (Krebs, 95 %Ø 2/5 % CO2) sichern. Stellen Sie die Schraubknöpfe ein, um die natürliche Entspannung des Gefäßes zu erhalten.
  2. Ermittlung der optimalen Anfangsspannung mit gefäßspezifischer Normalisierung
    HINWEIS: Die Ruhespannung wurde mit einem Normalisierungsverfahren eingestellt, um die Ausgangsbedingungen zu standardisieren, die Reaktionsfähigkeit des Gefäßes zu optimieren und die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Äquilibrieren Sie 30 Minuten lang, bevor Sie mit der Normalisierung fortfahren.
    1. Wählen Sie die Normalisierungseinstellungen aus dem DMT-Menü mit den folgenden Parametern: Okularkalibrierung: 1 mm/div; Zieldruck: 13,3 kPa; IC1/IC100-Verhältnis: 0,9 C; Online-Mittelwertbildung: 3 s; Verzögerungszeit: 60 s.
      HINWEIS: Weitere Hintergrundinformationen und Details zur Systemkonfiguration finden Sie in der referenzierten Arbeit17.
    2. Um ein Gefäß zu normalisieren, wählen Sie den gewünschten Kanal aus und füllen Sie den Normalisierungsbildschirm mit Daten. Legen Sie die Gewebeendpunkte basierend auf dem Mikrometermesswert und dem Drahtdurchmesser von 40 μm fest.
    3. Wenden Sie passive Dehnung an und warten Sie 3 Minuten. Verabreichen Sie 60K+ , um eine Kalium-vermittelte Kontraktion zu induzieren, und warten Sie, bis die Kontraktion ein Plateau erreicht. Spülen Sie das Präparat 3 x 5 min mit Krebslösung aus, um das 60K+ auszuwaschen. Berechnen Sie die aktive Kraft, indem Sie die passive Kraft bei jedem Dehnungsniveau von der kaliuminduzierten Kraft subtrahieren, die auf der Kurve aufgezeichnet ist.
    4. Schritt 4.2.3 wiederholen, bis die maximale Wirkkraft erreicht ist. Definieren Sie die optimale Ruhespannung als das Niveau, das die maximale aktive Spannung in jeder Arterie ergibt, wobei die Spitzenreaktionen auf ein hohes K+ als Referenzkontraktionen verwendet werden.
    5. Äquilibrieren Sie den arteriellen Ring für 10 Minuten, bevor Sie weitere Experimente durchführen.
      HINWEIS: Aufgrund der signifikanten interindividuellen Variabilität in Bezug auf Gefäßqualitäten, Dicken und Ursprünge normalisieren Sie jedes Blutgefäß einzeln, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verwenden Sie das Normalisierungsmodul des Drahtmyographensystems, um die geeignete Basisspannung basierend auf dem passiven Durchmesser und den mechanischen Eigenschaften jedes Gefäßes zu bestimmen. Wenden Sie das Verfahren vor der Funktionsprüfung konsequent auf alle Proben an.
  3. Reaktivitätsdetektion von Nierenarterienringen
    1. Um die Auswirkungen verschiedener Metaboliten auf die vaskuläre Kontraktilität zu untersuchen, führen Sie Gefäßkontraktionsfunktionstests an Nierenarterien durch, die mit extrahierten Plasma- und Stuhlmetaboliten von gesunden Probanden und HF-Patienten für 12 Stunden inkubiert wurden. Ausführliche Informationen finden Sie in Abschnitt 3.
    2. Verwenden Sie 60K+ , um eine kaliumvermittelte Kontraktion auszulösen. Stellen Sie sicher, dass jede Kammer 5 ml Krebslösung enthält.
    3. Um Phenylephrin (Phe)-induzierte, konzentrationsabhängige Kontraktionen in Arterienringen zu bestimmen, fügen Sie Phe in Schritten von 10-9 bis 10-4 M hinzu. Beginnen Sie mit der niedrigsten Phe-Konzentration, führen Sie sie in die Kammer ein und warten Sie auf eine stetige Kontraktion.
    4. Markieren Sie die Stelle, an der eine stetige Kontraktion erreicht wird (d.h. notieren Sie den Spannungswert am Plateau), dann gehen Sie zur nächsten Konzentration über. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die endgültige Konzentration erfolgreich zugegeben wurde.
    5. Speichern Sie nach Abschluss des Experiments die Datendatei, und entfernen Sie die Arterienringe. Reinigen Sie die Kammer gut mit einer 8%igen Essigsäurelösung, dann 3 Minuten inkubieren.
    6. Schalten Sie die Heizung und das Gas aus und stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten entfernt wurden, bevor Sie das Gas ausschalten.

5. Histopathologische Untersuchung der Nierenarterie: Hämatoxylin-Eosin-Färbung

HINWEIS: Entsorgen Sie gefährliche Reagenzien und biologische Abfälle in Übereinstimmung mit den institutionellen Biosicherheits- und chemischen Hygieneprotokollen. Insbesondere sollten Xylol und Paraformaldehyd in gekennzeichneten, verschließbaren Behältern für chemische Abfälle gesammelt und in einem dafür vorgesehenen Abzugsbereich gelagert werden, bevor sie von zertifizierten Sonderabfallbehandlern entsorgt werden. Essigsäure, die für die Reinigung der Myographenkammer verwendet wird, muss neutralisiert und gemäß den üblichen Entsorgungsverfahren für saure Abfälle entsorgt werden. Entladen Sie keines dieser Reagenzien in Laborspülen.

  1. Waschen Sie die Arterien in kaltem PBS und fixieren Sie sie über Nacht mit 4% Paraformaldehyd (pH 7,4). Schneiden Sie serielle Schnitte bei 4 μm und verarbeiten Sie sie für die Histologie.
  2. Auf Objektträgern montierte Gewebeschnitte in einem Objektträgertrockner 1 h bei 60 °C inkubieren und sofort in Xylol überführen. Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol (3 x 5 min).
  3. Die Abschnitte einer abgestuften Ethanolhydratation unterziehen: 100 % Ethanol (2 x 5 min), 95 % Ethanol (1 x 5 min), 90 % Ethanol (1 x 5 min), 80 % Ethanol (1 x 5 min), 70 % Ethanol (1 x 5 min), mit Reinstwasser (1 x 5 min) spülen.
  4. Mit Hämatoxylin (0,5 % w/v) für 5 min färben; Anschließend unter fließendem Wasser abspülen.
  5. Mit 1% saurem Alkohol (HCl-Ethanol) für 5-10 s differenzieren und unter fließendem Wasser abspülen.
  6. Die Abschnitte mit 0,6 % Ammoniakwasser blau machen und unter fließendem Wasser abspülen.
  7. Tauchen Sie die Schnitte 2 Minuten lang in Eosinlösung (1 % w/v).
  8. Dehydrieren und reinigen Sie die Abschnitte mit 95 % Ethanol (2 x 5 min), 100 % Ethanol (2 x 5 min) und Xylol (2 x 5 min).
  9. Kurz an der Luft trocknen, bis die optische Transparenz erreicht ist, Eindeckmedium einbinden, mit Deckgläsern abdecken und Deckgläser mit einem neutralen Eindeckmedium verschließen.
  10. Führen Sie Hellfeld-Bildgebung und histomorphometrische Auswertungen durch.

6. Nachweis von molekularen Biomarkern, die mit Nierenschäden assoziiert sind

  1. mRNA-Extraktion der Nierenarterie
    1. Geben Sie das kryokonservierte Gefäßgewebe in flüssigem Stickstoff zu 1 ml RNA-Extraktionsreagenz und geben Sie es zur gründlichen Homogenisierung in einen vorgekühlten Gewebehomogenisator.
    2. 250 μl Chloroform pro 100 μl des Extraktionsreagenzes zugeben, 30 s lang kräftig vortexen und 10 min bei 25 °C inkubieren.
    3. Bei 12.000 × g (10 min, 4 °C) zentrifugieren und die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen überführen.
    4. 500 μl Isopropanol in die wässrige Phase geben, durch Inversion mischen und 20 min bei 25 °C inkubieren.
    5. Bei 12.000 × g (10 min, 4 °C) zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    6. Waschen Sie das Pellet mit 1 mL 75 % Ethanol (2 x 5 min), trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in DEPC-H2O (0,1 % v/v).
      HINWEIS: Überprüfen Sie die RNA-Reinheit (OD260/OD280 = 1,9-2,0) und bestätigen Sie intakte 28S/18S rRNA-Banden.
  2. cDNA-Synthese
    1. 2 μg mRNA + 1 μl Oligo(dT)-Primer mischen, mit DEPC-H2O (0,1 % v/v) auf 8 μl einstellen, 5 min lang auf 70 °C erhitzen und 5 min auf Eis abkühlen lassen.
    2. Bereiten Sie den Reverse-Transkriptions-Mastermix in 10 μl 2x TS-Reaktionsmix, 1 μl RT/RI-Enzymmix und 1 μl gDNA-Entferner vor. Fügen Sie die 12 μl Mastermix zu den 8 μl RNA/Primer-Gemisch aus Schritt 6.2.1 hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl zu erreichen.
    3. Die Mischung aus Schritt 6.2.2 erhitzen. 60 min lang bei 42 °C erhitzen und den Vorgang durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min beenden.
    4. Verdünnen Sie die 20 μl der reversen Transkriptionsreaktion durch Zugabe von 80 μl nukleasefreiem H2O, was zu einem Endvolumen von 100 μl führt (4-fache Verdünnung). Verwenden Sie die verdünnte cDNA als Template für die quantitative PCR.
  3. Quantitative PCR-Analyse
    1. Richten Sie die Reaktion ein, indem Sie 2,0 μl cDNA-Template, 0,5 μl Forward-Primer (10 μM), 0,5 μl Reverse-Primer (10 μM), 10 μl SYBR Green Mastermix (2x) und 7 μL ddH2O mischen.
    2. Führen Sie die PCR mit den folgenden Einstellungen durch: Erstdenaturierung: 95 °C/3 min; 40 Zyklen: 95 °C/30 s; Tm-5 °C/30 s; 72 °C/30 s; Schmelzkurve: 65-95 °C (+0,5 °C/5 s).
    3. Analysieren Sie die Genexpression mit der 2-ΔΔct-Methode. Die Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle S2 dargestellt.

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Ergebnisse

Die Kohorte bestand aus zwei Frauen und zwei Männern im Alter von 46 bis 73 Jahren (Durchschnittsalter: 64,0 Jahre). Die Blutdruckmessungen zu Studienbeginn zeigten einen systolischen Blutdruck von 109 bis 168 mmHg und einen diastolischen Druck von 68 bis 115 mmHg. Alle HF-Patienten hatten eine aufgezeichnete Medikationsanamnese, einschließlich gängiger kardioprotektiver Mittel wie Betablocker, Statine und Thrombozytenaggregationshemmer, mit individuellen Variationen bei Renin-Angiotensin-System-Inhibitoren und Diuretika...

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Diskussion

Neuere Forschungen im Bereich CRS haben die metabolische Reprogrammierung als einen wichtigen pathologischen Mechanismus identifiziert, wobei die Metaboliten die renale Gefäßhomöostase regulieren 7,8,9. Während VSMCs eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Gefäßtonus und der Compliance bei CRS spielen, liefert unsere Studie einen direkten Beweis dafür, dass Metaboliten, die mit Herzverl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2021YFF0501401, 2018YFA0800501 an Y. Z., 2021YFF0501404 an Y. L.), der National Natural Science Foundation of China (82325004 und 92168114 an Y. Z., 82300286 an J. Z., 92168113 an E. D., 82170422 an Y. L.), des Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (Nr. HH22KYZX0047 an E. D.), China Postdoctoral Science Foundation (BX20220023, 2022M720288 an J. Z.), Natural Science Foundation of Beijing (7252157 an J. Z.). Beijing Municipal Natural Science Foundation (7232096 bis Y. L.), Forschungsprojekt des dritten Krankenhauses der Universität Peking im staatlichen Schlüssellabor für vaskuläre Homöostase und Remodellierung (Universität Peking; 2024-VHR-SY-07 bis Y.Z.). Abbildung 1 wurde mit Biorender.com mit genehmigten Lizenzen erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM mit hohem GlukosegehaltGibcoKat# 06-1055-57-1-ACS
PBSSolarbio GmbHKat# P1010
Penicillin-Streptomycin-amphotericin BThermo Fisher ScientificKat# 15240062
PhenylephrinMCEKat#HY-B0769
Reverses TranskriptionssystemPromegaKat# A5001
Stereomikroskopisches SystemLeicaM80
SYBR Green MastermixThermo Fisher ScientificKat# 4309155
Messsystem für GefäßspannungenDMT620 Mio.

Referenzen

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