Methodenartikel

Ein Liposomenmembran-Permeabilitätsassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Phosphatidylinositolphosphatgruppen auf die membranotrope Wirkung des Giftes PLA2

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DOI:

10.3791/68594

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26. September 2025

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen eine kostengünstige Methode zur Beurteilung der liposomalen Membranpermeabilität vor, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken eine überlegene Sensitivität und Auflösung aufweist. Unter Verwendung einer neuartigen verkapselten Ligandensubstitutionsreaktion werden mit dieser Technik Phospholipase A2-induzierte Veränderungen in Modellmembranen nachgewiesen. Dieser leicht in Standardanalysen integrierbare Ansatz verbessert die Auflösung für die Untersuchung der Membranbiophysik und der Toxinwechselwirkungen.

Zusammenfassung

Wir haben einen neuartigen, kostengünstigen und hochsensitiven Assay zur Beurteilung der liposomalen Membranpermeabilität entwickelt, der auf Ligandensubstitutionsreaktionen basiert, an denen Liganden beteiligt sind, die im inneren Volumen von Liposomen eingekapselt sind, und den wir mit einem hydrolytischen Aktivitätsassay (unter Verwendung der Coenzym-A-Acylierung) und einer molekularen Modellierungssimulation kombiniert haben, um zu untersuchen, ob Phosphate des Inositolrings in Phosphatidylinositol Membranen vor den schädlichen Auswirkungen von abnormal exprimierten Enzymen schützen. Eine aberrante Expression der Phospholipasen A2 (PLA2) führt zur Demyelinisierung von Axonen, die die Entwicklung von Multipler Sklerose und Alzheimer auslöst. Um die Wirkung von aberrant exprimiertem PLA₂ nachzuahmen, verwendeten wir die grundlegende Untereinheit des Viperngiftes PLA₂, HDP-2P. Das HDP-2P wurde an Phosphatidylcholin (PC)-Liposomen getestet, die mit Phosphatidylinositol, Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI-4-P) oder Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat (PI-4,5-P2) angereichert waren. Während HDP-2P in PC-Liposomen eine minimale hydrolytische Aktivität und eine nur geringfügig erhöhte Permeabilität zeigte, verbesserte die Anreicherung von PC-Liposomen mit PI sowohl die Hydrolyse als auch die Permeabilität. Bemerkenswert ist, dass PI-4-P und PI-4,5-P₂ die hydrolytische Aktivität von HDP-2P drastisch hemmten und die Durchlässigkeit vollständig reduzierten. Molekulare Modellierungssimulationen zeigten, dass Phosphate des Inositolrings in Phosphatidylinositol den Zugang von Phospholipiden zum aktiven Zentrum von HDP-2P sterisch blockieren und so die Hydrolyse verhindern. Sowohl In-vitro - als auch In-silico-Daten deuten darauf hin, dass phosphorylierte Phosphatidylinositole mit einer verminderten PLA₂-Aktivität verbunden sind, was auf einen möglichen Mechanismus zur Abschwächung einer übermäßigen PLA2-Aktivität hinweist - vermutlich als Mittel zum Schutz der Zellmembranen vor Degeneration.

Einleitung

Phosphatidylinositol (PI) ist ein anionisches Phospholipid, das aus einem Phosphatidsäurerückgrat besteht, das über eine Phosphatgruppe mit Inositol, einem Hexahydroxyring mit sechs Kohlenstoffatomen, verbunden ist. Inositol kann durch Phosphorylierung an den Kohlenstoffpositionen 2, 3, 4, 5 und 6 reversibel in Phosphoinositide umgewandelt werden1. PI und Phosphoinositide kommen in Plasmamembranen und Organellen verschiedener Zellen von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen vor. Siebzig Jahre nach ihrer Entdeckung durch Mable und Lowell Hokin 2,3,4 sind PI und Phosphoinositide immer noch Gegenstand umfangreicher Forschungen, die darauf abzielen, ihre molekularen Mechanismen und ihre Bedeutung für die menschliche Gesundheit zu verstehen 5,6,7.

Abgesehen vom Hirngewebe sind Phosphoinositide typischerweise in niedrigen Konzentrationen vorhanden, die etwa 0,5 bis 1 % der Gesamtlipide im inneren Segel der Plasmamembran ausmachen. Die veröffentlichten Daten deuten darauf hin, dass PI unter physiologischen Bedingungen wahrscheinlich keine wichtige strukturelle Rolle spielt1. Während des Krankheitszustands steigen jedoch die Spiegel von PI und Phosphoinositiden an und sie kippen zum äußeren Segel der Plasmamembran, was darauf hindeutet, dass diese Phospholipide mit der Krankheitsresistenz in Verbindung gebracht werden können1. Obwohl lange Zeit angenommen wurde, dass PI im Vergleich zu Phosphoinositiden eine weniger bedeutende physiologische Rolle spielt, unterstreichen neue Erkenntnisse die Bedeutung von PI-4-P und PI-4,5-P2 in verschiedenen physiologischen Prozessen1. Zu diesen Prozessen gehören die intrazelluläre Signalübertragung, die interzelluläre Signaltransduktion 8,9,10, der Membrantransport 11,12,13, die Modulation der Genexpression1 sowie die Zellproliferation14 und das Überleben1. Trotzdem sind die molekularen Mechanismen, durch die PI und Phosphoinositide diese Prozesse antreiben, nach wie vor wenig verstanden.

PI und Phosphoinositide sind in Gehirngewebezellen reichlich vorhanden, wo sie etwa 10 % der gesamten Phospholipide ausmachen, obwohl ihre Spiegel in den frühen Stadien von Hirnerkrankungen vorübergehend ansteigen können, was darauf hindeutet, dass Phosphoinositide der Entwicklung neurologischer Pathologienentgegenwirken können 1 wie Multiple Sklerose und Alzheimer, die durch axonale Demyelinisierung ausgelöst werden, die durch eine aberrante PLA 2-s-Aktivität verursacht wird15, 16,17. Diese Enzyme gehören zu den verschiedenen Klassen und Gruppen, einschließlich der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2)15 der Gruppe IIA. Erhöhte Spiegel dieser Gruppe von Enzymen finden sich in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Multipler Sklerose und Alzheimer, wo sie zum Abbau der Myelinmembranen beitragen, was zu einer Demyelinisierung führt15. Es wurde auch berichtet, dass sPLA2s aus Schlangengiften die Übertragung an neuromuskulären Synapsen hemmt18,19, was zu Störungen des Zentralnervensystems führt und das periphere neuromuskuläre System nachteilig beeinflusst20.

In dieser Studie untersuchten wir, ob PI und Phosphoinositide Modellphospholipidmembranen vor den Auswirkungen von abnormal exprimierten sPLA 2-Enzymen schützen können. Die Modellmembranen bestanden aus Phosphatidylcholin (PC), dem am häufigsten vorkommenden Phospholipid in allen Zellmembranen von Säugetieren21, angereichert mit einem molaren Verhältnis von 20 % entweder PI, PI-4-P oder PI-4,5-P2. Um die Auswirkungen von aberrant exprimierten sPLA2-Enzymen auf Modellmembranen nachzuahmen, verwendeten wir die basische Untereinheit HDP-2P des sekretorischen Viperngift-Neurotoxins der Gruppe IIA, das neurotoxische PLA2-Enzym 22, dessen hydrolytische Aktivität zuvor an Modell-Myelinmembranen untersucht wurde23.

Für diese Arbeit haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, um Veränderungen in der Permeabilität liposomaler Membranen zu untersuchen, die von HDP-2P beeinflusst werden. Die neuartige Methode basiert auf einer Ligandensubstitutionsreaktion inCuSO-4-Lösung außerhalb der Liposomen, an der einNH-3-Ligand beteiligt ist, der in den Liposomen eingeschlossen ist. Wenn die HDP-2P-induzierte Membranpermeabilität das Austreten von NH3 aus Liposomen ermöglicht, substituiert das freigesetzte Ammoniak über die Reaktion quantitativ vier Wassermoleküle in hydratisierten Kupferionen: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-introduction-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l). Dieser Ligandenaustausch führt zu einer charakteristischen Erhöhung der optischen Dichte der Lösung, die durch Spektrophotometrie (λ = 600 nm) gemessen werden kann und als quantitativer Messwert für Änderungen der Membranpermeabilität dient. Unser auf Ligandensubstitution basierender Ansatz zeigt eine überlegene Sensitivität bei der Beurteilung der Membranpermeabilität im Vergleich zu herkömmlichen Techniken wie 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 und Ionentransportassays29 und bietet gleichzeitig den zusätzlichen Vorteil, dass keine teuren Instrumente erforderlich sind. Diese einfache und kostengünstige Methode, die in Verbindung mit HDP-2P-Messungen der hydrolytischen Aktivität und der In-silico-Simulation der Bindung von PI, PI-4-P und PI-4,5-P2 an die molekulare Oberfläche von HDP-2P angewendet wurde, ermöglichte es uns, den Schluss zu ziehen, dass die Phosphate des Inositolrings in PI die störenden Effekte von HDP-2P auf PC-Membranen, die mit PI-4-P oder PI-4 angereichert sind, aufheben. 5-P2. Sollte sich dieser Befund in weiteren Studien bestätigen, könnte die Fähigkeit der Inositol-Ringphosphate in PI, vor den schädlichen Auswirkungen abnormal wirkender zellulärer Proteine zu schützen und möglicherweise zur Membranstabilität bei Krankheitszuständen mit aberranter Proteinaktivität beizutragen, den Weg für die Entwicklung neuartiger Arzneimittel zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer und Multipler Sklerose ebnen.

Protokoll

1. In-silico-Simulation der HDP-2P-Wechselwirkung mit PI und Phosphoinositiden unter Verwendung von molekularer Modellierungssoftware

  1. Installation und Vorbereitung der Software
    1. Installieren Sie den referenzierten chemischen Zeichnungseditor zum Konstruieren von Ligandenmolekülen, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S1A gezeigt.
    2. Installieren Sie die molekulare Modellierungssoftware für das molekulare Andocken des Liganden an den Rezeptor.
    3. Installieren Sie die Automated Docking Tools für die Liganden- und Rezeptorvorbereitung.
    4. Da die Simulationssoftware für die molekulare Modellierung von der Python-Umgebung abhängt, installieren Sie Python.
  2. Vorbereitung des Liganden
    1. Verwenden Sie zunächst den Editor für chemische Zeichnungen, um die atomaren Koordinaten für die molekularen Strukturen von PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, Cardiolipin und Phosphatidylserin zu erstellen.
      HINWEIS: Das Beispielprotokoll in den folgenden Schritten der Ligandenvorbereitung beschreibt die Schritte nur für PI.
    2. Erstellen Sie die molekulare Struktur von PI mit dem chemischen Zeichnungseditor, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S1B dargestellt, und speichern Sie die Datei im PDB-Format, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S2 gezeigt.
    3. Öffnen Sie die PDB-Datei in der Software für das automatisierte Docking-Tool, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S3A gezeigt.
    4. Fügen Sie Wasserstoffatome hinzu, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S3B gezeigt, und wählen Sie entweder polare oder alle Wasserstoffatome aus, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S4A gezeigt.
      HINWEIS: Wählen Sie nach Abschluss des PI-Andockens mit HDP-2P nur polare Wasserstoffatome aus, um die Visualisierung von polaren oder Wasserstoffbrückenbindungen zu vereinfachen.
    5. Legen Sie das PI-Molekül als Liganden für die Software des automatisierten Docking-Tools fest, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S4B gezeigt.
    6. Speichern Sie den Liganden als PDBQT-Datei, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S5A gezeigt. Achten Sie darauf, dass alle Anleihen drehbar sind.
  3. Vorbereitung des Rezeptors
    1. Laden Sie die PDB-Datei von Phospholipase A2 HDP-2 (PDB-Code 2I0U) herunter, bestehend aus zwei Monomeren, eines ist sauer, enzymatisch inaktiv, A, und das andere ist basisch, enzymatisch aktiv, E. Um enzymatisch inaktives Monomer A zu löschen, importieren Sie die 2I0U-Datei in die molekulare Modellierungssoftware (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S5B), wählen Sie alle Atome des Monomers A aus (Ergänzende Datei 1 - Ergänzende Abbildung S6A), gehen Sie dann zu Bearbeiten und löschen Sie alle Atome des Monomers A (Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S6B). Behalten Sie das enzymatisch aktive Monomer E bei, das nun als Rezeptor bezeichnet wird.
    2. Öffnen Sie die PDB-Datei des HDP-2P-Rezeptors in der Software für das automatisierte Docking-Tool, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S7 gezeigt.
    3. Entfernen Sie alle Wassermoleküle, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S8A gezeigt.
    4. Fügen Sie Wasserstoffatome hinzu, wie in der Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S8B gezeigt. Bitte beachten Sie, dass nach Abschluss des HDP-2P-Dockings mit PI nur noch polare Wasserstoffatome ausgewählt werden müssen, um die Visualisierung von polaren und Wasserstoffbrückenbindungen zu vereinfachen.
    5. Legen Sie den HDP-2P als Rezeptor fest, wie in der Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S9A gezeigt, und speichern Sie sie als PDBQT-Datei. Stellen Sie sicher, dass der Rezeptor ohne drehbare Bindungen eingestellt ist.
  4. Einrichtung von Docking-Parametern
    1. Öffnen Sie sowohl die Liganden- als auch die Rezeptor-PDBQT-Datei.
    2. Rufen Sie die Gitterbox-Setup-Schnittstelle auf, wie in der Ergänzungsdatei 1 - Ergänzende Abbildung S9B gezeigt, und definieren Sie die Größe der Gitterbox (Größe x = 44,644; Größe y = 74,939; Größe z = 43,050) und die Koordinaten des Zentrums (Zentrum x = 25,626; Zentrum y = 9,582; Zentrum z = 41,825), die die gesamte Oberfläche des Rezeptormoleküls vollständig umschließen, wie in der Ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S10A gezeigt.
    3. Schließen Sie die Grid-Box-Setup-Schnittstelle mit den aktuellen Einstellungen, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S10B gezeigt, und speichern Sie die Docking-Parameter in einer config.txt Datei, wie in der Zusatzdatei 1 - Ergänzende Abbildung S11A gezeigt.
  5. Ausführen der Molecular Docking-Software
    1. Starten Sie die molekulare Docking-Software, indem Sie die config.txt Datei verwenden, wie in der ergänzenden Datei 1 - Ergänzende Abbildung S11B gezeigt.
    2. Führen Sie die Dockingberechnung durch (~30-90 min; Ergänzende Akte 1 - Ergänzende Abbildung S12).
    3. Überprüfen Sie die docking_log.txt Datei, um die Andockbewertungen (Bindungsaffinität) zu überprüfen.
    4. Wählen Sie das Andockergebnis mit der niedrigsten Energiekonformation aus.
  6. Analyse von Andockdaten
    1. Verwenden Sie die Software für das automatische Andocken, um die PDBQT-Datei mit dem Andockergebnis zu öffnen.
    2. Analysieren Sie die Liganden-Rezeptor-Bindungsstellen, wobei Sie sich auf das aktive Zentrum des Rezeptors und intermolekulare Wechselwirkungen konzentrieren, einschließlich ionischer, ionenpolarer, polarer und Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen. Erstellen Sie eine Tabelle für PI und Phosphoinositid, das mit dem aktiven Zentrum des Rezeptors interagiert, um die Affinitäten der Bindungsstelle in kcal/mol, geladene und polare Einheiten im PI/Phosphoinositid-Polkopf und HDP-2P-Reste, die an der intermolekularen Bindung beteiligt sind, sowie Arten von Bindungen zu beschreiben, wie in Tabelle 1 und Tabelle 2 gezeigt. Wiederholen Sie das Andocken für jedes Rezeptor-Liganden-Paar 3x, um sicherzustellen, dass es keine Abweichung in den Bindungsstellen, den Bindungsaffinitäten, den geladenen und polaren Einheiten der PI/Phosphoinositid- und HDP-2P-Reste und der Art der Bindungen gibt.

2. Hydrolytische Aktivität von HDP-2P in PC-Liposomen, die mit PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS oder CL angereichert sind, überwacht unter Verwendung des mit freien Fettsäuren acylierten Coenzyms A

HINWEIS: Chloroform, Methanol, NH3 und CuSO4 sind gefährlich. Verwenden Sie immer Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. Verarbeiten Sie alle Protokolle mit diesen Reagenzien unter dem Abzug. Bewahren Sie Chloroform in einer Braunglasflasche auf. Lagern Sie Methanol in brennbaren Schränken fern von Oxidationsmitteln. Halten Sie Methanol von Flammen und Funken fern. Kennzeichnen Sie alle Abfallbehälter für diese Reagenzien und entsorgen Sie sie gemäß den örtlichen Vorschriften zur Entsorgung gefährlicher Abfälle.

  1. Bereiten Sie 100 ml Pufferlösung für die HDP-2P-katalysierte Phospholipidhydrolyse vor, indem Sie 5,55 mg CaCl2 in 0,10 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) lösen.
  2. 50 ml 1,0 M EDTA-Stammlösung werden durch Auflösen von 7,31 g EDTA in deionisiertem destilliertem Wasser (ddH20) hergestellt.
  3. Bereiten Sie 0,54 mM HDP-2P-Stammlösung in 0,10 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) vor. Die Molmasse von HDP-2P beträgt 13,827 kDa.
  4. Die folgenden Stammlösungen von Phospholipiden in einer Konzentration von 10,0 M in einem Chloroform/Methanol-Gemisch (2 zu 1 Vol.-) herstellen: Eigelb L-α-Phosphatidylcholin (PC), Rinderherz-Cardiolipin (CL), L-α-Phosphatidyl-L-Serin (PS), PI, PI-4-P und PI-4,5-P2. Die Molmassen von PC, CL, PS, PI, PI-4-P und PI-4,5-P2 betragen 768 Da, 1.466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da bzw. 1.057 Da, wie weiter unten beschrieben.
  5. Bereiten Sie fünf Proben von PC-Liposomen vor. Zur Herstellung einer Probe von PC-Liposomen werden 75 μl Chloroform/Methanol-Stammlösung von PC in ein Reagenzglas aus Glas gegeben und die Lipide bei 25 °C unter 10 Pa Vakuum 1 h lang getrocknet, bis sich ein Lipidfilm gebildet hat. Hydratisieren Sie den Lipidfilm 1 h lang mit 15 mL Pufferlösung für die Phospholipidhydrolyse bei 25 °C in einem Thermostat. Führen Sie dann die Titanpistole eines 100-150 W Ultraschallspenders in die Lipidsuspension im Glasreagenzglas ein, das in ein Eisbad gestellt wird, und beschallen Sie die Suspension 10 Minuten lang bei einer Frequenz von 22 kHz, wobei 50 % der maximalen Leistung nicht überschritten werden dürfen. Um Titanstaubpartikel zu entfernen, zentrifugieren Sie die Liposomen bei 200 × g (1.270 U/min mit einem 10-cm-Rotor) für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Bereiten Sie Proben von PC-Liposomen vor, die entweder mit CL, PS, PI, PI-4-P oder PI-4,5-P2 im PC- und anderen Lipidmolverhältnis von 4 zu 1 angereichert sind, indem Sie Chloroform/Methanolphospholipid-Stammlösungen - 60 μl PC mit 15 μl CL, PS, PI, PI-4-P oder PI-4,5-P2 - in einem Glasröhrchen mischen. Trocknen Sie dann die Lipide in einem Vakuum von 10 Pa oder 3 h bei Raumtemperatur, hydratisieren Sie den Lipidfilm in einer Pufferlösung für die Phospholipidhydrolyse und beschallen Sie ihn wie oben beschrieben mit Ultraschallwellen.
    HINWEIS: Bereiten Sie für jeden Typ von Liposomen fünf Proben vor.
  7. 1,0 ml aus fünf Proben von jedem oben beschriebenen Liposomentyp werden in getrennte Röhrchen gegeben und 10 μl farblose Coenzym-A-Lösung aus dem NEFA-Kit in jedes Röhrchen gegeben, dann 0,00, 0,93, 1,86, 2,79 oder 3,72 μl 0,54 mM HDP-2P-Stammlösung in getrennte Röhrchen gegeben, um in Liposomenproben das molare HDP-2P/Phospholipid-Verhältnis von 0,000 zu erhalten. 0,001, 0,002, 0,003 bzw. 0,004.
  8. Unmittelbar nach der Zugabe von HDP-2P zu den Liposomen inkubieren Sie die Liposomenproben 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Thermostat und stoppen Sie dann die durch HDP-2P induzierte Phospholipidhydrolyse durch Zugabe von 100 μl EDTA-Stammlösung. Danach die Proben 1 Minute lang vortexen.
  9. Quantifizieren Sie die hydrolytische Aktivität von HDP-2P durch Messung der optischen Dichte liposomaler Proben bei 550 nm mit einem Spektralphotometer, das das Ausmaß messen würde, in dem sich farblose Coenzym-A-Lösung violett verfärbt, wenn sie mit freien Fettsäuren acyliert wird.
  10. Wiederholen Sie den obigen Vorgang noch zwei weitere Male, so dass die durchschnittlichen optischen Dichtewerte aus drei unabhängigen Versuchen abgeleitet werden.
    HINWEIS: Jeder Datenpunkt, der in diesem experimentellen Versuch erhalten wurde, ist der Durchschnittswert der optischen Dichte. Im Idealfall sollte die Standardabweichung der experimentellen Datenpunkte innerhalb von ±5 % des Durchschnitts liegen.

3. Auswirkungen von HDP-2P auf die Permeabilität von liposomalen PC-Membranen, die mit PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS oder CL angereichert sind, gemessen durch eine Ligandensubstitutionsreaktion in CuSO-4-Lösung, an der ein NH-3-Ligand beteiligt ist, der in den Liposomen eingeschlossen ist

HINWEIS: Chloroform, Methanol, NH3 und CuSO4 sind gefährlich. Verwenden Sie immer Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. Verarbeiten Sie alle Protokolle mit diesen Reagenzien unter dem Abzug. Bewahren Sie Chloroform in einer Braunglasflasche auf. Lagern Sie Methanol in brennbaren Schränken fern von Oxidationsmitteln. Halten Sie Methanol von Flammen oder Funken fern. Kennzeichnen Sie alle Abfallbehälter für diese Reagenzien und entsorgen Sie sie gemäß den örtlichen Vorschriften zur Entsorgung gefährlicher Abfälle.

  1. Bereiten Sie 20 ml 0,03 M Stammlösungen für jedes von sechs Phospholipiden - PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2- in Chloroform/Methanol (2 zu 1 Volumen) vor. Die Molekülmassen von PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 betragen 768, 1466, 792, 867, 962 bzw. 1057 Da.
  2. Bereiten Sie 100 mL 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) Puffer mit einer Endkonzentration von 0,05 M CuSO4 vor.
  3. Bereiten Sie 4 ml 1,5 × 10-3 M HDP-2P-Stamm in 0,05 M CuSO4, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) Puffer vor. Die Molmasse von HDP-2P beträgt 13,827 kDa.
  4. Zur Herstellung von 100 mL 0,5 M NH3 Lösung verwenden Sie 25% NH3 Lösung (Dichte 905 g/L30, entspricht 13,30 M [905 g/L × 0,25 M ÷ 17,00 g/L = 13,30 M]). Um also 100 mL 0,5 M NH3 herzustellen, verwenden Sie 3,76 mL 25% NH3 Lösung: (0,5 M × 1.000 mL ÷ 13,30 M) ÷ 10 = 3,76 mL 25% NH3 Lösung. Geben Sie 3,76 ml 25%igeNH-3-Lösung in einen 100-ml-Messkolben und bringen Sie das Volumen mit 0,10 m Tris-HCl (pH 7,4)-Puffer auf 100 mL.
  5. Zur Herstellung von Liposomen mit NH3 im Innenvolumen der Liposomen geben Sie 12,5 ml 0,03 M Stammphospholipidlösung in Chloroform/Methanol in ein Röhrchen und trocknen Sie die Phospholipide in 10 Pa Vakuum oder 3 h bei Raumtemperatur. Hydratisieren Sie den Phospholipidfilm 1 h lang mit 12,5 mL 0,5 M NH3, 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) bei 25 °C in einem Thermostat; dann wird die Lipidsuspension bei einer Frequenz von 22 kHz beschallt, wie in Schritt 2.5 beschrieben, um beschallte Liposomen herzustellen.
    HINWEIS: In der Lösung mit beschallten Liposomen befindet sich NH3 innerhalb und außerhalb der Liposomen.
  6. Um NH3 außerhalb der Liposomen zu eliminieren, dialysieren Sie die Liposomen mit einer Dialysemembran (molekularer Cut-off 1,0 kDa) bei 5 Hut Raumtemperatur gegen 0,10 M Tris-HCl (pH 7,4) unter Verwendung eines Magnetrührers.
    HINWEIS: Die Dialyse für 5 h war ausreichend, um NH3 vollständig zu entfernen, da die Zugabe von 0,5 ml dialysierter Liposomen zu 0,5 ml 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4-Puffer bei 600 nm die gleiche optische Dichte ergab wie die von Liposomen, die ohne NH3 hergestellt und mit demselben Puffer gemischt wurden.
  7. Nach der Dialyse zentrifugieren Sie die Liposomen bei 200 × g für 90 min, wie in Schritt 2.5 beschrieben, um die Liposomen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Liposomen mit 5,0 mL 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) Puffer und teilen Sie die resuspendierten Liposomen in fünf Proben zu je 1,0 mL auf. Zu diesen fünf 1,0-ml-Proben werden 60, 40, 20 und 0 μl 0,10 M Tris-HCl, 0,05 M CuSO4 (pH 7,4) Puffer und dann 0, 20, 40, 60, 80 μl HDP-2P-Stammpuffer hinzugefügt, um in den Liposomenproben die molaren HDP-2P/Phospholipid-Verhältnisse von 0,000, 0,001, 0,002, 0,003 bzw. 0,004 einzustellen.
  8. Inkubieren Sie die Liposomenproben 30 Minuten lang in einem Thermostat bei 37 °C; Messen Sie dann die optische Dichte der Liposomenproben bei 600 nm mit einem Spektralphotometer. Befolgen Sie die in Abschnitt 3 beschriebenen Schritte für alle sechs Liposomenproben und wiederholen Sie dies 3x, um eine dreifache Messung der optischen Dichte für jeden Datenpunkt zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die Standardabweichung experimenteller Datenpunkte sollte immer innerhalb von ±5 % des Durchschnitts liegen.

Ergebnisse

Simulation der molekularen Modellierung von HDP-2P Wechselwirkung mit PI und Phosphoinositiden
Das molekulare Modellierungsprogramm berechnet die besten neun Bindungsstellen auf der molekularen Oberfläche eines Rezeptors (größeres Molekül), der von einem Liganden (kleineres Molekül) anvisiert wird. Diese Stellen werden durch die Freisetzung der neun höchsten Enthalpien bestimmt, die die Stellen mit den besten Bindungsaffinitäten bezeichnen. Die Bindungsaffinitäten werden als negative Werte ausgedrückt, was darauf hindeutet, dass es sich bei der intermolekularen Bindung um einen exothermen Prozess handelt. Im Fall von HDP-2P, das mit PI interagiert, sagte die Simulation vier Bindungsstellen (#3, #6, #7 und #8) für PI auf der molekularen Oberfläche von HDP-2P innerhalb des aktiven Zentrums voraus (Tabelle 1). Zusätzlich wurden die fünf Bindungsstellen für PI außerhalb des aktiven Zentrums von HDP-2P gefunden. Die Notationen der geladenen und polaren Anteile im polaren Kopf von PI sind in Abbildung 1 dargestellt.

Das aktive Zentrum von HDP-2P besteht aus fünf wichtigen Aminosäureresten: Gly30, Gly32, His48, Asp49 und Lys69, die die korrekte Ausrichtung des Phospholipidsubstrats im aktiven Zentrum erleichtern, um eine katalytische Hydrolyse zu gewährleisten. Einige repräsentative angedockte Strukturen zeigen die Bindung von PI an einige Aminosäurereste des aktiven Zentrums, während PI an der Bindungsstelle #6 durch ionische, ionenpolare und Wasserstoffbrückenbindungen mit allen fünf wichtigen Aminosäureresten des aktiven Zentrums bindet (Tabelle 1). Abbildung 2 zeigt, wie PI mit allen fünf wichtigen Aminosäureresten im aktiven Zentrum von HDP-2P an der Bindungsstelle #6 interagiert.

Die Andocksimulation der Wechselwirkung zwischen HDP-2P und PI-4-P, das eine Phosphatgruppe an Position 4 des Inositolrings enthält, sagte nur die Bindungsstelle #1 als die Stelle voraus, an der PI-4-P an das aktive Zentrum von HDP-2P bindet. Insbesondere interagiert PI-4-P an dieser Stelle über ionische, ionenpolare und Wasserstoffbrückenbindungen mit drei wichtigen Aminosäureresten des aktiven Zentrums -- Gly30, Gly32 und Lys69 -- (Tabelle 2). Abbildung 3 veranschaulicht die Wechselwirkung von PI-4-P mit dem aktiven Zentrum von HDP-2P. In den verbleibenden acht Bindungsstellen auf der molekularen Oberfläche von HDP-2P bindet PI-4-P an Stellen außerhalb des aktiven Zentrums.

Die molekularen Docking-Simulationen von HDP-2P-Wechselwirkungen mit PI-4,5-P₂ (das Phosphatgruppen an den Positionen 4 und 5 des Inositol-Rings enthält) zeigten keine Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms an allen neun vorhergesagten Bindungsstellen. Stattdessen bindet PI-4,5-P₂ konsistent an einen rillenartigen Hohlraum neben dem aktiven Zentrum (Abbildung 4) und bildet ionenpolare und Wasserstoffbrückenbindungen mit den drei HDP-2P-Resten Trp31, Gly33 und Gln34).

Während die Bindung von PI-4,5-P₂ an einen rillenartigen Hohlraum in der Nähe des aktiven Zentrums von zellulärem oder Gift PLA2s bisher nicht dokumentiert wurde, sind strukturell analoge Merkmale in den Domänen der Pleckstrin Homologie31 (PH) und der Epsin N-terminalen Homologie32 (ENTH) gut etabliert. Diese Signaldomänen verwenden trotz ihrer nicht-enzymatischen Natur ähnliche hydrophob-polar-kationische Rillenarchitekturen für die spezifische PI-4,5-P2-Erkennung 31,32. Das Vorhandensein eines vergleichbaren Strukturmotivs in HDP-2P eröffnet faszinierende Möglichkeiten entweder der evolutionären Mimikry oder der konvergenten Evolution, um die Erkennung von Membrandomänen durch HDP-2P zu erleichtern. Wenn diese Studie durch andere Methoden weiter verifiziert wird, könnte sie das erste berichtete Beispiel für ein Gift PLA2 darstellen, das einen solchen Mechanismus zur Phosphoinositiderkennung verwendet.

Interessanterweise sagten molekulare Docking-Simulationen von CL und PS, die mit HDP-2P interagieren, die Bindung beider Phospholipide an das aktive Zentrum von HDP-2P an acht von neun Bindungsstellen voraus, während sich die einzige Bindungsstelle von CL und PS außerhalb des aktiven Zentrums nicht in dem furchenartigen Hohlraum befand (Daten nicht gezeigt). Es ist auch erwähnenswert, dass PC wie PI an vier von neun Bindungsstellen an das aktive Zentrum von HDP-2P bindet und sowohl PI als auch PC, wie CL und PS, nicht an den rillenartigen Hohlraum binden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphatgruppen auf dem Inositolring von PI eine hohe Bindungsaffinität zu dem furchenartigen Hohlraum haben, der sich neben dem aktiven Zentrum befindet. Strukturanalysen haben analoge furchenartige Hohlräume mit hydrophoben polar-kationischen Oberflächenflecken in der Nähe des katalytischen Zentrums sowohl in zellulären33- als auch in venom34 PLA2-Enzymen identifiziert. Die Bindung von Phosphoinositiden an diese Hohlräume kann physiologisch signifikante Konformationsänderungen induzieren und möglicherweise die enzymatische Aktivität hemmen. Bemerkenswert ist, dass PI-4,5-P2 unter den Phosphoinositiden besonders schlechte Substrateigenschaften aufweist - humanePLA-2-Isoformen (zytosolische, calciumunabhängige und sezernierte Typen) zeigen eine minimale bis nicht nachweisbare hydrolytische Aktivität gegenüber PI-4,5-P235. Dies deutet darauf hin, dass die Bindung von Phosphoinositid an diese konservierten strukturellen Merkmale eher eine eigene physiologische Funktion (z. B. allosterische Hemmung) als katalytische Funktionen in der gesamten PLA-2-Superfamilie erfüllen könnte, was einer zukünftigen experimentellen Überprüfung bedarf.

Hydrolytische Aktivität von HDP-2P in PC-Liposomen, die mit PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS oder CL angereichert sind, überwacht mit Coenzym A, das mit freien Fettsäuren acyliert ist.
Die hydrolytische Aktivität von HDP-2P an liposomalen Proben wurde unter Verwendung von Coenzym-A-Lösung bewertet. Die Coenzym-A-Lösung ist farblos, färbt sich aber nach der Acylierung durch freie Fettsäuren, die während der Phospholipidhydrolyse freigesetzt werden, die durch HDP-2P katalysiert wird, violett. Die daraus resultierende Zunahme der optischen Dichte, die dem Ausmaß der Coenzym-A-Acylierung entspricht, wurde spektrophotometrisch bei 550 nm gemessen. Daher ist die Zunahme der optischen Dichte in liposomalen Proben, die mit Coenzym A und HDP-2P behandelt wurden, direkt proportional zur hydrolytischen Aktivität von HDP-2P.

Abbildung 5 zeigt die hydrolytischen Aktivitätskurven in Abhängigkeit vom molaren Verhältnis HDP-2P/Phospholipid in verschiedenen liposomalen Proben. Die hydrolytische Aktivität von HDP-2P wird in beliebigen Einheiten (a.u.) der optischen Dichte (OD) ausgedrückt, die bei 550 nm gemessen wird. Wir haben keine Kalibrierungskurve erstellt, um die a.u.-Werte mit den molaren Konzentrationen freier Fettsäuren in Beziehung zu setzen, da unsere experimentellen Versuche zeigten, dass Fettsäuren in organischen Lösungsmitteln, wenn sie zu wässrigen Lösungen hinzugefügt wurden, die Coenzym A und Acyl-Coenzym A-Synthetase enthielten, bei 550 nm keine nachweisbare OD-Änderung hervorriefen. Dies deutet darauf hin, dass solche Fettsäuren eher Mizellen bilden, als an Coenzym A zu binden. Im Gegensatz dazu binden nur membrangenerierte Fettsäuren (die durchPLA2-Aktivität produziert werden) an membranassoziiertes Coenzym A, was zu einer messbaren OD-Veränderung führt. Die amphipathische Natur von Coenzym A - mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Regionen auf seiner molekularen Oberfläche - lokalisiert es bevorzugt an der Membran-Wasser-Grenzfläche, was die Bindung von Fettsäuren, die durch die PLA2-Aktivität produziert werden, an Coenzym A erleichtert. Unter diesen Testbedingungen ist es jedoch nicht möglich, die molare Konzentration von Fettsäuren zu bestimmen. Aus diesem Grund drücken Forscher, die den Coenzym-A-Assay verwenden, die hydrolytische Aktivität von PLA2 in beliebigen Einheiten von OD aus, gemessen bei 550 nm20.

Die höchste Zunahme der optischen Dichte, die der größten hydrolytischen Aktivität von HDP-2P entspricht, wurde in PC-Liposomen beobachtet, die mit CL oder PS angereichert waren. Dieser Befund stimmt gut mit der höchsten Anzahl von Bindungsstellen für CL und PS im aktiven Zentrum von HDP-2P überein. Die hydrolytische Aktivität von HDP-2P in PC-Liposomen, die mit PI angereichert waren, war 3,0- bzw. 2,5-fach niedriger als in Liposomen, die mit CL bzw. PS angereichert waren, aber höher als in reinen PC-Liposomen. Dies deutet darauf hin, dass die Bindungsaffinität zum aktiven Zentrum von HDP-2P von PI höher ist als die von PC, obwohl beide Lipide die gleiche Anzahl von Bindungsstellen im aktiven Zentrum haben.

Diese offensichtliche Diskrepanz kann durch strukturelle Unterschiede in den polaren Kopfgruppen von PI und PC erklärt werden. Während PC ein neutrales Molekül ist, erstreckt sich seine kationische Trimethylammoniumgruppe nach außen in die Lösung, während seine anionische Phosphatgruppe näher am hydrophoben Bereich der Membran positioniert ist. Diese Ladungsverteilung in der PC-Kopfgruppe kann eine elektrostatische Abstoßung gegen das Basis-HDP-2P erzeugen, wodurch dessen Bindungsaffinität verringert wird. Im Gegensatz dazu macht die saure Natur von PI es zu einer attraktiveren Lipidspezies für die Interaktion mit dem basischen HDP-2P, was seine höhere hydrolytische Aktivität im Vergleich zu reinen PC-Liposomen erklären könnte.

Die hydrolytische Aktivität von HDP-2P in PC-Liposomen, die mit PI-4-P angereichert sind, deutet auf eine minimale katalytische Hydrolyse von Phospholipiden hin, wie in Abbildung 5 gezeigt. Bemerkenswert ist, dass die optische Dichtekurve von PC-Liposomen, die mit PI-4,5-P angereichert waren, auf eine vollständige Aufhebung der hydrolytischen Aktivität durch HDP-2P in dieser Liposomenprobe hinweist. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den Docking-Simulationen überein, die eine Bindungsstelle für PI-4-P im aktiven Zentrum von HDP-2P vorhersagen, während PI-4,5-P2 überhaupt keine Bindungsaffinität zum aktiven Zentrum zeigt. Dies deutet darauf hin, dass die an den Inositolring gebundenen Phosphatgruppen die Bindung des Phospholipids an das aktive Zentrum von HDP-2P behindern. Wir schlagen vor, dass sich die Phosphatgruppen auf dem Inositolring nach außen in die Lösung erstrecken und durch Bindung an HDP-2P über ionische und ionenpolare intermolekulare Wechselwirkungen HDP-2P auf Abstand von der Membranoberfläche halten und so die Membran vor der hydrolytischen Aktivität von HDP-2P schützen. Dies steht im Einklang mit neueren Befunden, die zeigen, dass humane zytosolische, calciumunabhängige und sezernierte PLA2-Enzyme kaum oder keine nachweisbare hydrolytische Aktivität gegenüber den Substraten PI-4-P und PI-4,5-P2 zeigten35.

HDP-2P-induzierte Permeabilitätsänderungen in liposomalen PC-Membranen, die mit PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS oder CL angereichert sind: Bewertung über eine Ligandensubstitutionsreaktion in CuSO-4-Lösung mit verkapseltem NH₃

Der Einfluss der hydrolytischen Aktivität von HDP-2P auf die Membranpermeabilität von PC-Liposomen, die mit PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS oder CL angereichert sind, wurde anhand einer Ligandensubstitutionsreaktion in einem komplexen Ionensystem untersucht, bei dem der substituierende Ligand im inneren Volumen der Liposomen eingekapselt war. Diese einfache und zuverlässige Methode basiert auf der Verdrängung von vier Wassermolekülen, die als Liganden im Komplexion [Cu(H2O)6]2+ wirken, durch NH3

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

Während des Prozesses der Substitution von Wassermolekülen durch NH3 im Komplexion [Cu(H2O)6]2+ geht die hellblaue Farbe von [Cu(H2O)6]2+ in die dunkelblaue Farbe von [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ über. In einem System, in dem NH3 im inneren Volumen der Liposomen eingekapselt ist und [Cu(H2O)6]2+ in der externen Lösung vorhanden ist, deutet diese Farbänderung -- spektrophotometrisch überwacht -- auf eine Erhöhung der liposomalen Membranpermeabilität für NH3 hin.

Um ein solches System zu etablieren, haben wir eine Phospholipiddispersion in Tris-HCl-Puffer, der NH3 enthält, beschallt und dabei beschallte Liposomen mit NH₃ innerhalb und außerhalb der Liposomen gebildet. Externes NH3 wurde durch Dialyse entfernt, wonach CuSO4-Lösung zu der Liposomenprobe hinzugefügt wurde, die NH3 in ihrem inneren Volumen enthielt. Anschließend behandelten wir die Liposomen mit HDP-2P und überwachten Veränderungen der optischen Dichte spektrophotometrisch.

Um die optimale Wellenlänge für die Messung optischer Dichteänderungen zu bestimmen, haben wir die Absorptionsspektren von [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ in einer 0,025 M CuSO4, 0,100 M NH3 Lösung und [Cu(H2O)6]2+ in einer 0,025 M CuSO4 Lösung unter Verwendung von sichtbarem Licht im Bereich von 500 nm bis 900 nm aufgenommen. Wie in Abbildung 6 gezeigt, ergab die Bestrahlung bei 600 nm eine maximale Extinktion für [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ und eine minimale Absorption für [Cu(H2O)6]2+, was uns dazu veranlasste, 600 nm als optimale Wellenlänge für unsere Membranpermeabilitätsexperimente zu wählen.

Abbildung 7 zeigt, dass die Membranpermeabilität für NH₃ bei PC-Liposomen, die mit anionischem CL und PS angereichert sind, am höchsten ist. Diese Beobachtung stimmt mit unseren zuvor berichteten Daten überein, die zeigen, dass HDP-2P, ein PLA2 der Gruppe IIA, effizient mit dem anionischen Phospholipid Palmitoyloleoyl-glycerophosphoglycerol interagiert, was zu einer Substrathydrolyse führt - ein Effekt, der bei dem neutralen Phospholipid Palmitoyloleoylglycerophosphocholin36 nicht beobachtet wird. Im Allgemeinen weisen die meisten PLA2-Enzyme der Gruppe IIA eine signifikant höhere hydrolytische Aktivität gegenüber anionischen Phospholipidenauf 33,37,38. Die Permeabilität von PC+PI-Liposomen ist geringer als die von PC+CL- und PC+PS-Liposomen, bleibt aber höher als die von reinen PC-Liposomen. Diese Ergebnisse stimmen gut mit den Ergebnissen von Docking-Simulationen und hydrolytischen HDP-2P-Aktivitätsassays überein. Mit anderen Worten, es wird erwartet, dass lyposomale Proben, die eine geringe Permeabilität aufweisen, strukturell stabil sind, da HDP-2P nicht in der Lage ist, Phospholipide zu hydrolysieren, und aufgrund einer geringeren Affinität von HDP-2, an PI und Phosphoinositide zu binden, wie durch die molekularen Docking-Daten vorhergesagt wird (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4). Daher sollten die hydrolytische Aktivität des Enzyms HDP-2P (Abbildung 5) und die Membranpermeabilität, wie in Abbildung 7 gezeigt, positiv korreliert sein.

Bei den Liposomen PC+PI-4-P und PC+PI-4,5-P2 nahm die Permeabilität nach der Behandlung mit HDP-2P jedoch nicht zu. Während die Permeabilitätsergebnisse in PC+PI-4,5-P 2-Liposomen gut mit Docking-Simulationen und HDP-2P-hydrolytischen Aktivitätsdaten für dieselben Liposomen korrelieren, stimmt das Fehlen einer erhöhten Permeabilität in PC+PI-4-P-Liposomen nicht vollständig mit den Ergebnissen der hydrolytischen Aktivität überein, da in diesen Liposomen ein geringer Grad an hydrolytischer Aktivität aufgezeichnet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein leichter lokalisierter Anstieg der hydrolytischen Aktivität in PC+PI-4-P-Liposomen die Doppelschichtpackung von Phospholipiden nicht in einem Maße stört, das die Membranpermeabilität für NH3 verändern würde.

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Abbildung 1: Notationen der geladenen und polaren Anteile des polaren Kopfes von Phosphatidylinositol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Interaktion von PI mit dem aktiven Zentrum von HDP-2P, vorhergesagt für die Bindungsstelle #6 durch molekulare Docking-Software. PI wird in der Stick-Darstellung und HDP-2P in der Linien- (Diagramm links) und Moleküloberfläche (Diagramm rechts) angegeben. Für die Stabdarstellungen steht Smaragd für Kohlenstoff, Orange für Phosphor, Rot für Sauerstoff und Weiß für Wasserstoff. Für die molekulare Oberfläche und die Linien steht Grün für Kohlenstoff, Blau für Stickstoff, Rot für Sauerstoff, Weiß für Wasserstoff und Gelb für Schwefel. Gelbe gestrichelte Linien kennzeichnen intermolekulare Bindungen. Pfeile zeigen auf Aminosäurereste in der aktiven Mitte. Abkürzungen: PI = Phosphatidylinositol; HDP-2P = basische Untereinheit des Viperngiftes Phospholipase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Interaktion von PI-4-P mit dem aktiven Zentrum von HDP-2P, vorhergesagt für die Bindungsstelle #1 durch molekulare Andocksoftware. PI-4-P ist in der Stick-Darstellung und HDP-2P in den Darstellungen Linien (Diagramm links) und Moleküloberfläche (Diagramm rechts) angegeben. Bei den Stäbchen steht Smaragd für Kohlenstoff, Orange für Phosphor, Rot für Sauerstoff und Weiß für Wasserstoff. Für molekulare Oberflächen und Linien steht Grün für Kohlenstoff, Blau für Stickstoff, Rot für Sauerstoff, Weiß für Wasserstoff und Gelb für Schwefel. Gelbe gestrichelte Linien kennzeichnen intermolekulare Bindungen. Pfeile zeigen auf Aminosäurereste in der aktiven Mitte. Abkürzungen: PI-4-P = Phosphatidylinositol-4-phosphat; HDP-2P = basische Untereinheit des Viperngiftes Phospholipase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Interaktion von PI-4,5-P2 mit der molekularen Oberfläche von HDP-2P, vorhergesagt für die Bindungsstelle #6 durch molekulare Docking-Software. PI-4,5-P2 bindet an eine rillenartige Höhle, die sich unterhalb des aktiven Zentrums von HDP-2P befindet. Die fünf wichtigsten Aminosäurereste im aktiven Zentrum sind in der Drei-Buchstaben-Notation angegeben. PI-4,5-P2 ist in der Stick-Darstellung und HDP-2P in der Liniendarstellung (Diagramm links) und Moleküloberfläche (Diagramm rechts) angegeben. Bei den Stäbchen steht Smaragd für Kohlenstoff, Orange für Phosphor, Rot für Sauerstoff und Weiß für Wasserstoff. Für molekulare Oberflächen und Linien steht Grün für Kohlenstoff, Blau für Stickstoff, Rot für Sauerstoff, Weiß für Wasserstoff und Gelb für Schwefel. Abkürzungen: PI-4,5-P2 = Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat; HDP-2P = basische Untereinheit des Viperngiftes Phospholipase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Hydrolytische Aktivitätskurven aus Proben von Liposomen bei verschiedenen molaren HDP-2P/Phospholipid-Verhältnissen. Liposomen aus PC+CL (dunkelgrün), PC+PS (orange), PC+PI (dunkelblau), PC+PI-4-P (blau), PC+PI-4,5-P2 (grün) und PC (violett). Die Werte für die optische Dichte in beliebigen Einheiten stellen die Mittelwerte für dreifache Messwerte bei 550 nm dar. Fehlerbalken zeigen die SD der dreifachen Messwerte an. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den optischen Dichtewerten zwischen den Liposomenproben wurde anhand der ANOVA bewertet, wobei alle p-Werte deutlich unter 0,05 lagen. Abkürzungen: PC = Phosphatidylcholin; CL = Rinderherz-Cardiolipin ; PS = Phosphatidylserin; PI = Phosphatidylinositol; PI-4-P = Phosphatidylinositol-4-phosphat; PI-4,5-P2 = Phosphatidylinositol-4,5-diphosphat; a.u. = beliebige Einheiten; HDP-2P = basische Untereinheit des Viperngiftes Phospholipase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Absorptionsspektren von wässrigen Lösungen von Kupferkomplexen. Kupferkomplexe [Cu(H2O)6]2+ (orange Linie) und [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (blaue Linie), bestrahlt durch sichtbares Licht im Bereich von 500 nm bis 900 nm. Der Kupferkomplex [Cu(H2O)6]2+ wurde in einer Lösung von 0,025 M CuSO4 und der Kupferkomplex [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ in einer Lösung von 0,025 M CuSO4 mit 0,100 M NH3 hergestellt. Die Absorptionswerte in dieser Abbildung für jeden Datenpunkt sind die Mittelwerte der Absorptionsmessungen, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen die SD aus den dreifachen Messwerten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Permeabilitätskurven der Membran aus Proben von Liposomen. Liposomen aus PC+CL (violett), PC+PS (blau), PC+PI (dunkelblau), PC+PI-4-P (dunkelgrün), PC+PI-4,5-P2 (orange) und PC (grün) in verschiedenen HDP-2P/ Phospholipid-Molverhältnissen. Die Permeabilitätswerte der Membran werden als optische Dichtewerte in beliebigen Einheiten (a.u.) ausgedrückt, gemessen bei 600 nm. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert der dreifachen Messwerte dar. Fehlerbalken zeigen die SD der dreifachen Messwerte an. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den optischen Dichtewerten zwischen den Liposomenproben wurde anhand der ANOVA bewertet, wobei alle p-Werte deutlich unter 0,05 lagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vorhergesagte Affinitätsbindungsenergien für Kandidatenmolekülkomplexe von HDP-2P mit PI. Molekulare Modellierungssimulationen wurden verwendet, um die Arten von Bindungen und Bindungsstellenaffinitäten sowie die geladenen und polaren Einheiten sowohl der Phosphatidylinositol-Kopfgruppe als auch der HDP2P-Aminosäurereste vorherzusagen, die an ihren intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt sind. Die geladenen und polaren Gruppen von Phosphatidylinositol sind in Abbildung 1 hervorgehoben. Beachten Sie, dass Pb in NHpbδ+ eine Peptidbindung bezeichnet. Abkürzungen: PI = Phosphatidylinositol; HDP-2P = basische Untereinheit des Viperngiftes Phospholipase. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Vorhergesagte Affinitätsbindungsenergien für Kandidatenmolekülkomplexe von HDP-2P mit PI-4-P. Molekulare Modellierungssimulationen wurden verwendet, um die Arten von Bindungen und Bindungsstellenaffinitäten sowie die geladenen und polaren Einheiten sowohl der Phosphatidyl-Inositol-4-phosphat (PI-4-P)-Kopfgruppe als auch der HDP2P-Aminosäurereste, die an ihren intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt sind, vorherzusagen. Beachten Sie, dass Pb in NHpbδ+ eine Peptidbindung bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Arbeitsablauf beim molekularen Andocken. Überblick über das molekulare Docking-Verfahren mit AutoDock, einschließlich Ligandenkonstruktion, Rezeptorvorbereitung, Grid-Box-Setup und Durchführung von Docking-Simulationen zur Vorhersage von PI-HDP-2P-Wechselwirkungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie untersuchten wir, ob Phosphatgruppen, die kovalent an den Inositolring in Phosphatidylinositol (PI) gebunden sind, den Abbau von Phospholipidmembranen durch das Phospholipase A2 (PLA2) Enzym verhindern können. Um das Fortschreiten des Abbaus der Phospholipidmembran zu beurteilen, der durch die hydrolytische Aktivität von PLA2 verursacht wird, haben wir eine einfache, aber hochempfindliche und genaue Methode zur Messung der Veränderungen der Membranpermeabilität entwickelt, die mit fortschreitender struktureller Degradation zunehmen sollte.

Das Verfahren basiert auf einer Ligandensubstitutionsreaktion, an der der Hexaaquakupfer(II)-Komplex [Cu(H2O)6]2+ beteiligt ist, der in der wässrigen Umgebung außerhalb der Phospholipid-Liposomen suspendiert ist, während Ammoniak (NH 3) in den Liposomen eingekapselt ist. Ammoniak hat eine höhere Affinität zu Cu2+ als Wassermoleküle, aber NH3 muss die liposomale Membran durchdringen, um in die äußere wässrige Phase zu gelangen, wo es H2O-Moleküle in [Cu(H2O)6]2+ ersetzt. Wenn die strukturelle Integrität der liposomalen Membran aufgrund der PLA-2-katalysierten Phospholipidhydrolyse beeinträchtigt wird, erleichtert eine erhöhte Membranpermeabilität für NH3 die Ligandensubstitution, was zu einer Farbänderung vom Hellblau von [Cu(H2O)6]2+ zum Dunkelblau von [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ führt. Wir haben diese Umwandlung quantitativ verfolgt, indem wir mit Hilfe der Spektrophotometrie die Änderung der optischen Dichte bei 600 nm aufgezeichnet haben.

Wir haben zuvor 1H-NMR mit dem paramagnetischen Ionenferrocyanid [Fe(CN)6]3- verwendet, um Veränderungen der Membranpermeabilität zu untersuchen, die durch HDP-2P24 und durch Kobragift-Kardiotoxine24,25,26,27,28,39 beeinflusst werden. Wir haben auch eine Reihe von Fluoreszenz- und Phosphoreszenzsonden verwendet, um die Auswirkungen von Kobragift-Kardiotoxinen auf die Durchlässigkeit liposomaler Membranen zu untersuchen 20,23,40. Ferrocyanid- und Fluoreszenz-/Phosphoreszenzsonden sind jedoch große unphysiologische molekulare Einheiten, die Lipidmembranen durchdringen, wenn die Membranintegrität erheblich beeinträchtigt wird. Im Gegensatz dazu verwendet unser neuartiger Ligandensubstitutionsassay NH₃ - einen kleinen, natürlichen zellulären Metaboliten, der in der Lage ist, Lipidmembranen bei subtilen Störungen der Lipidpackung zu durchdringen. Diese erhöhte Sensitivität unserer neuartigen Membranpermeabilitätsmethode wird durch ihre Fähigkeit belegt, Veränderungen der Membranpermeabilität bei einem molaren Verhältnis von HDP-2P/Lipid von 0,001 zu erkennen, verglichen mit 0,004, die für den Nachweis von ¹H-NMR/Ferrocyanid erforderlich sind23.

In der gleichen Studie untersuchten wir mit Hilfe der Erythrosinphosphoreszenzlöschung durch Ferrocen die Auswirkungen von HDP-2P auf den Lipidaustausch zwischen den Membranen, gemessen an der Veränderung des Verhältnisses der Erythrosinlebensdauer in Testproben (τn) zu der in der Kontrollprobe (τ0)23. Bei einem molaren Verhältnis von HDP-2P/Lipiden von 0,004 sank der τn/τ0-Wert auf 0,423, was auf einen Zustand der Membranfluidität hinweist, der für zweiwertige Kationen durchlässig ist24. So detektiert unser NH₃-basierter Ligandensubstitutionsassay die Membranpermeabilität bei einem molaren Verhältnis von HDP-2P/Lipid von 0,001, während herkömmliche Assays (1H-NMR/Ferrocyanid und Phosphoreszenzsonden-Quenching) die Membranpermeabilität erst bei einem molaren Verhältnis von 0,004 nachweisen. Dies zeigt, dass unser NH3-basierter Assay viermal sensitiver ist als herkömmliche Assays.

Die außergewöhnliche Sensitivität unseres NH3-basierten Assays lieferte Permeabilitätsdaten, die eng mit den hydrolytischen Aktivitätsmessungen korrelierten, mit nur einer offensichtlichen Diskrepanz: PC+PI-4-P-Liposomen zeigten eine unbedeutende Hydrolyse ohne Permeabilitätsänderungen, was darauf hindeutet, dass eine minimale lokale Lysophospholipid-/Fettsäureproduktion die globale Lipidpackung nicht beeinflusst, was die strukturelle Integrität und Permeabilität der Membran nicht beeinflusst. Daher zeigte diese Studie, dass die Ligandensubstitutionsreaktion in einem komplexen Ionensystem, an dem ein Ligand beteiligt ist, der im inneren Volumen von Liposomen eingekapselt ist, Ergebnisse lieferte, die hervorragend mit den hydrolytischen Aktivitätsdaten von HDP-2P übereinstimmten. Diese Ergebnisse stimmten wiederum stark mit In-silico-Studien über die Bindung von PI und Phosphoinositiden an die molekulare Oberfläche von HDP-2P überein.

Insgesamt zeigte die AutoDock-Simulation in der vorliegenden Studie, dass PI an vier von neun identifizierten Bindungsstellen an das aktive Zentrum bindet, während PI-4-P nur an einer der neun vorhergesagten Stellen an das aktive Zentrum bindet. Die hydrolytische Aktivität von HDP-2P in PC+PI-4-P-Liposomen war etwa 5x geringer als in PC+PI-Liposomen. Darüber hinaus sagten In-silico-Studien keine Bindung von PI-4,5-P2 an das aktive Zentrum von HDP-2P voraus. Konsistent zeigten PLA-2-Aktivitätsassays und Experimente mit Ligandensubstitutionsreaktionen, dass PI-4,5-P2 sowohl die Phospholipidhydrolyse als auch die Erhöhung der Membranpermeabilität vollständig hemmte, während PI-4-P eine geringere, nicht signifikante hydrolytische Aktivität aufwies und Veränderungen der Membranpermeabilität vollständig verhinderte. Diese Beobachtungen stimmen gut mit In-vitro-Aktivitätsstudien von humanen zytosolischen, calciumunabhängigen und sezerniertenPLA-2-Enzymen gegenüber PI, PI-4-P und PI-4,5-P2überein 35. Diese Studien zeigten, dass nur zytosolisches PLA2 der Gruppe IVA eine relativ hohe katalytische Aktivität gegenüber PI und PI-4-P aufwies, während seine Aktivität gegenüber PI-4,5-P2 kaum nachweisbar war. Alle anderen getesteten PLA2 Enzyme zeigten keine Aktivität gegenüber PI-4,5-P235. Dieser Mangel an Aktivität wurde auf die hochgradig hydrophilen Phosphatgruppen auf dem Inositolring zurückgeführt, die die produktiven Wechselwirkungen zwischen der Membranoberfläche und denPLA2-Enzymen stören35. Wir vermuten, dass die Ausdehnung von Phosphatgruppen auf dem Inositolring nach außen in die Lösung und ihre Fähigkeit, ionenpolare und Wasserstoffbrückenbindungen mit Rückständen des rillenartigen Hohlraums von HDP-2P zu bilden, wahrscheinlich verhindert, dass HDP-2P sich der Membranoberfläche nahe genug nähert, um seine hydrolytische Aktivität auszuüben, wodurch die Membran stabilisiert und der Abbau von Phospholipidmembranen durch HDP-2P reduziert wird, was für Zellen schädlich sein kann, indem Zelltodwege aktiviert werden. Dieser Mechanismus scheint mit der potenziellen schützenden Rolle von Phosphoinositiden bei Krankheitszuständen mit abweichender Enzymaktivität übereinzustimmen.

Die starke Korrelation zwischen den Ergebnissen von Membranpermeabilitätsassays, hydrolytischen Aktivitätsmessungen und molekularen In-silico-Docking-Studien unterstreicht die Zuverlässigkeit der Ligandensubstitutionsreaktionsmethode. Dieser Ansatz, bei dem ein in Liposomen eingekapselter Ligand verwendet wird, erweist sich als genaues und effektives Werkzeug zur Beurteilung von Änderungen der Membranpermeabilität, die durch strukturelle Störungen in der stabilen Doppelschichtorganisation von Phospholipiden verursacht werden. Obwohl wir anerkennen, dass molekulare Docking-Studien mit AutoDock, die in diesem Artikel vorgestellt werden, kein vollständiges Verständnis dafür liefern, wie Phospholipide dynamisch und longitudinal mit HDP-2P interagieren können, müssen in Zukunft molekulardynamische Studien durchgeführt werden, um zusätzliche molekulare Mechanismen zu identifizieren, wie HDP-2 Phospholipid-Doppelschichten, die aus verschiedenen Phospholipiden bestehen, permeabilisieren kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die Durchführung von Molekulardynamik-Studien hohe Rechenressourcen erfordert, wie z. B. Hochleistungsrechner und Cluster, die an vielen akademischen Einrichtungen mit begrenzten Ressourcen und Forschungsmitteln nicht verfügbar sind. Schließlich erkennen wir die Verwendung eines starren Rezeptors (HDP-2P) in der vorliegenden Technikarbeit und das Fehlen einer Lösungsmittel-/Membranumgebung an. Wir möchten jedoch betonen, dass die Durchführung molekularer Dockings von HDP-2P mit verschiedenen Phospholipiden unter Verwendung eines starren Rezeptors der konventionelle Ansatz ist, um erste Docking-Studien durchzuführen, um einen ersten Durchgang von angedockten Kandidatenstrukturen zu identifizieren, die in Zukunft mit einem flexiblen Rezeptor verfolgt werden können, sobald die kritischen Aminosäurereste innerhalb der katalytischen Seite, die an Substrate binden, identifiziert sind, um sich auf molekulare Regionen zu konzentrieren, die flexibel gemacht werden können in Verfolgen Sie molekulare Docking-Studien und in einer solvatisierten Umgebung. Daher kann die Zusammenarbeit mit anderen Institutionen, die über mehr Ressourcen verfügen, eine Möglichkeit sein, einige der ersten Ergebnisse von AutoDock zu bestätigen und zusätzliche molekulare Mechanismen von Substrat-Enzym-Wechselwirkungen zu identifizieren.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Ligandensubstitutionsreaktionsmethode, bei der ein in Liposomen eingekapselter Ligand verwendet wird, effektiv auf Untersuchungen der Membranpermeabilität in verschiedenen membranvermittelten Prozessen angewendet werden kann. Dazu gehören unter anderem Liganden-Rezeptor-Interaktionen, Lipid-Protein-Interaktionen, Intermembranaustausch, Membranfusion und -spaltung sowie neuromuskuläre Kontraktionen. Darüber hinaus birgt dieser Ansatz ein erhebliches Potenzial für die Erforschung membranotroper Pharmazeutika. Gleichzeitig erkennen wir, dass neuartige Methoden in Modellmembranen zwar von unschätzbarem Wert sind, um spezifische Mechanismen von Membraninteraktionen zu entschlüsseln, ihre inhärenten Vereinfachungen jedoch ihre Fähigkeit einschränken, die strukturelle, kompositorische und funktionelle Komplexität biologischer Membranen in vivo vollständig zu replizieren. Es ist daher unerlässlich, Daten aus Modellsystemen mit Vorsicht zu interpretieren und die Ergebnisse nach Möglichkeit mit zellulären oder organismischen Modellen zu validieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Studien in diesem Artikel wurden durch das Start-up-Stipendium der Beijing Chaoyang KaiWen Academy (E.S.G.) und durch den SEPA Award, NIH 5R25MD019151-03 (R.K.D.) unterstützt. Die Arbeiten zur Vorbereitung von HDP-2 wurden durch einen Zuschuss der Russischen Wissenschaftsstiftung Nr. 24-15-00280 (Y.N.U.) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Maryam Barancheshmeh für das Schreiben des Drehbuchs und die Entwicklung des Videos über die Anwendung der molekularen Docking-Simulation, das nach der Veröffentlichung dieses Forschungsartikels erstellt wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Grunduntereinheit HDP-2P des V. nikolskii-Vipergifts PLA2, HDP-2, 98,5 % Reinheit;Institut für Bioorganische Chemie, MoskauHDP-2 isoliert laut Potokol in PMID:18083205. HDP-2P, gereinigt aus HDP-2 durch DEAE Sephadex A-50   
Cardiolipin (Herz, Rinder) (Natriumsalz), >99 %MacklinC916138
Coenzym A, FUJIFILM Wako' s NEFA kit Lexington, MA, USA
Dialyseröhre Cellulosemembran Molekulargewichtsabgrenzung 1,0 kDaSigma Aldrich Trading Co. Ltd., Shanghai, China 
Digital gesteuertes Wassertank-Thermostat & nbsp;YoungGuangMing Medical Instruments Ltd. Co., Peking, China;
Elektronisches hochpräzises analytisches Gewicht FA2004 Shanghai Maiyi Ltd. Co., China
JingHua 752 UV-Sichtbarkeitsspektrophotometer  Shanghai Jinghua Instruments Co., Ltd., Shanghai, China
L-α-phosphatidyylcholin (Ei, Huhn),≥ 95%MacklinL799415
L-α-phosphatidylinositol (Leber, Rinder) (Natriumsalz),≥ 99%MacklinL780292
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (Gehirn, Schwein) (Ammoniumsalz),≥ 99%MacklinL996223
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphat (Gehirn, Schwein) (Ammoniumsalz), 99 %MacklinL970250
L-α-phosphatidylserin (Gehirn, Schweine) (Natriumsalz), >99 %MacklinL864755
Magnetischer Rührer JB-3 Shanghai Leici JB-3
pH-Meter PHS-3C Shanghai INESA Scientific Instruments Co., Ltd., China
TGL-16B Mikrozentrifuge Shanghai 3 Anting Co., Shanghai, China
Ultraschallspender Yt-JY96-IIN Shanghai Yetuo technology Co., Ltd., China
Vakuumpumpe TW-1MTingwei Co. Ltd., Wenling, China

Referenzen

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Schlagwörter

Liposomenpermeabilit tPhosphatidylinositolphosphatePhospholipase Aktivit tmolekulare ModellierungLiposomenhydrolysePhosphatidylcholin LiposomenInositolphosphatgruppenMembranschutz
Ein Liposomenmembran-Permeabilitätsassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Phosphatidylinositolphosphatgruppen auf die membranotrope Wirkung des Giftes PLA2
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