Mögliche Rolle der PGE 2-EP4-CA2+ Signalachse bei posttraumatischer Osteoarthritis

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die Etablierungs- und Bewertungsmethoden von Osteoarthritis-Rattenmodellen systematisch durch Vergleich zu skizzieren und wissenschaftliche Beweise für die unterschiedliche Pathogenese zwischen akuter mechanischer Verletzungsinduzierter und chronischer metabolischer/umweltfaktorinduzierter Osteoarthritis zu liefern. Das ACLT-Modell steht dabei im Vordergrund, wobei Veränderungen im EP4-Ca2⁺-mitochondrialen Dysfunktionsweg im Vordergrund stehen.

Zusammenfassung

Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die durch ein Trauma oder starke mechanische Belastung ausgelöst wird und zu Gelenkknorpeldegeneration und Funktionseinschränkungen führt. Prostaglandin E2 (PGE₂) trägt wesentlich zum Knorpelabbau nach mechanischer Schädigung bei, indem es seinen Rezeptor, den Prostaglandin-E-Rezeptor 4 (EP4), auf Chondrozytenmembranen aktiviert. Die Homöostase des Gelenkknorpels beruht in erster Linie auf dem dynamischen Gleichgewicht zwischen Knorpelabbau und -reparatur, ein Prozess, der von Chondrozyten fein reguliert wird. Es wurde gezeigt, dass der Ca²⁺/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CAMKII)-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung der Chondrozytenfunktion spielt. In dieser Studie beobachteten wir eine erhöhte Expression von EP4, Inositol 1,4,5-Trisphosphatrezeptor (IP3R) und phosphoryliertem CaMKII in Interleukin-1 beta (IL-1β) stimulierten Chondrozyten, was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen EP4-Signalweg und Kalziumdysregulation hindeutet. Es gibt jedoch noch keine direkten Beweise für die Beteiligung der EP4-Ca2⁺/CaMKII-Achse an der PTOA. Weitere Untersuchungen mit genetischen oder pharmakologischen Eingriffen sind notwendig, um diesen möglichen Mechanismus aufzuklären. Diese Ergebnisse bieten eine vorläufige Grundlage für die Erforschung der Kalziumhomöostase und des EP4-Signalwegs als Ziele für die PTOA-Behandlung.

Einleitung

Obwohl körperliche Aktivität wegen ihrer gesundheitlichen Vorteile weithin beworben wird, bleibt sie eine der Hauptursachen für Verletzungen des Bewegungsapparates der unteren Gliedmaßen, die zu verschiedenen unerwünschten Ergebnissen führen können¹. Unter diesen ist PTOA zu einer zunehmenden Belastung für Jugendliche und junge Erwachsene geworden, die in jungen Jahren Gelenkverletzungen erleiden². Alarmierend ist, dass etwa 48-52% der Personen, die sportbedingte Gelenkverletzungen erleiden, innerhalb von 11-17 Jahren eine PTOA entwickeln ^3,4. Das Kniegelenk, eines der am häufigsten verletzten Gelenke im Jugendsport und in der Freizeit, ist im Verlauf von Gelenkverletzungen zu PTOA besonders gefährdet. Eine prospektive Studie berichtete, dass Personen mit Knieverletzungen ein 10-fach höheres Risiko haben, 12-20 Jahre nach der Verletzung an röntgenologisch bestätigter Kniearthrose zu erkranken, verglichen mit unverletzten Personen⁵. Darüber hinaus haben röntgenologische Untersuchungen bei jungen Erwachsenen gezeigt, dass Fußballerinnen mit Verletzungen der vorderen Kreuzbanddurchtrennung (ACLT) ein Risiko von 51 % haben, innerhalb von 12 Jahren an PTOA zu erkranken, während männliche Spieler ein Risiko von 41 % innerhalb von 14 Jahren haben⁵. Diese Ergebnisse unterstreichen die langfristigen negativen Auswirkungen von sportbedingten Gelenkverletzungen auf die Gesundheit des Bewegungsapparates. Daher ist das Verständnis der irreversiblen pathologischen Mechanismen, die der PTOA-Entwicklung zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung, um geeignete Interventionsstrategien zu identifizieren, die darauf abzielen, das Fortschreiten der Krankheit zu mildern.

Eine frühe Dysregulation der Ca2⁺ -Homöostase ist einer der Schlüsselindikatoren für die Initiierung von PTOA⁶. Ca2⁺ bindet an Calmodulin (CaM) und bildet einen^Ca2+/CaM-Komplex, der mit CaMKII interagieren kann, seine autoinhibitorische Konformation auflöst und die Kinaseaktivität reguliert⁷. Sowohl bei humaner als auch bei muriner OA ist die Expression von phosphoryliertem CaMKII (der aktivierten Form von CaMKII) erhöht, während die Verwendung von CaMKII-Inhibitoren diese Erhöhung der Phosphorylierungsniveaus blockiert, was zu einer Zerstörung des Gelenkknorpels führt⁸, was die wichtige regulatorische Rolle von Ca2⁺/CaMKII bei der Vermittlung der OA-Knorpelhomöostase zeigt. Normalerweise werden diese Veränderungen entscheidend durch die Aktivierung von Entzündungsmechanismen bei der PTOA-Entwicklung beeinflusst. Ein hoher Gehalt an PGE₂ als wichtiger entzündungsfördernder Schmerzmediator beeinflusst das Fortschreiten der Arthrose, indem er den EP4-Rezeptor aktiviert. Insbesondere verbessert der bedingte Knockout von EP4 im Gelenkknorpel die Knorpelbildung und den anabolen Stoffwechsel, während er die Hypertrophie und den Katabolismus der Chondrozyten hemmt, wodurch die Regeneration von stabilem, reifem Gelenkknorpel anstelle von Faserknorpel gefördert und Gelenkschmerzen gelindert^{werden 9}. Angesichts der entscheidenden Rolle des Ca2⁺/CaMKII-Signalwegs in der Chondrozytenphysiologie und der anerkannten Beteiligung des EP4-Rezeptors an der Progression der Osteoarthritis sollte in dieser Studie untersucht werden, ob die EP4-Aktivierung mit Veränderungen des Kalzium-Signalwegs und der mitochondrialen Dysfunktion während der PTOA-Entwicklung verbunden ist. Obwohl der kausale Zusammenhang zwischen EP4 und Ca²⁺-Dysregulation noch nicht bestimmt ist, deuten die Daten auf einen möglichen mechanistischen Zusammenhang hin, der weitere Untersuchungen rechtfertigt.

Diese Studie konzentriert sich auf die möglichen Mechanismen, die die Aktivierung des EP4-Rezeptors mit dem Ca²⁺-Signalweg und der mitochondrialen Dysfunktion während der PTOA-Entwicklung verbinden. Im Vergleich zu traditionellen diagnostischen Methoden, wie z.B. bildgebenden Verfahren, die das Fortschreiten der PTOA erkennen, und aktuellen therapeutischen Ansätzen, wie z.B. nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs) zur Linderung der Symptome, zielt unser Ansatz darauf ab, frühe intrazelluläre Signalstörungen in der PTOA-Pathogenese aufzudecken. Diese mechanistischen Erkenntnisse ermöglichen ein genaueres Verständnis des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit und bieten neue Wege für eine frühzeitige Diagnose und gezielte Interventionen. Daher etablierte diese Studie ein PTOA-Rattenmodell, das durch eine vordere Kreuzbanddurchtrennung (ACLT) induziert wurde, um mechanische Verletzungen nachzuahmen, die häufig bei Sportlern mit eingeschränkter motorischer Kontrolle während akuter oder chronischer körperlicher Aktivität auftreten. Dieses Modell dient als optimale Darstellung posttraumatischer mechanischer Gelenkschäden und bietet eine reproduzierbare Plattform, um sowohl histopathologische Veränderungen als auch die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu untersuchen. Eine fettreiche Ernährung plus Exposition gegenüber feuchter Umgebung (FD) dient als Positivkontrolle, die darauf abzielt, metabolische und umweltbedingte Risikofaktoren im Zusammenhang mit chronischer Osteoarthritis zu simulieren. Ersteres modelliert akute Verletzungen, die durch mechanisches Trauma verursacht werden, während letzteres ein natürlich vorkommendes Krankheitsmodell darstellt, das durch Stoffwechselstörungen und Umweltfaktoren induziert wird, obwohl die endgültige Pathogenese in dieser Gruppe möglicherweise nicht der EP4-Ca²-mitochondrialen Achse folgt.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Tierethikkommission des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine überprüft und genehmigt (ethische Zulassungsnummer: 2024014-2). Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den vom Staatsrat der Volksrepublik China festgelegten Vorschriften über die ethische Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

1. Tiere

1. Verwenden Sie gezüchtete Ratten mit Sprague-Dawley (SD), um mögliche Störeffekte im Zusammenhang mit dem Östruszyklus zu reduzieren. Wählen Sie für dieses Experiment insgesamt neun männliche SD-Ratten im Alter von 4 Wochen und einem Gewicht zwischen 90 g und 100 g aus.
   HINWEIS: Diese Ratten wurden von einem lizenzierten Lieferanten von Labortieren in China bezogen (Zertifikatsnummer: 20240410Aazz0619000774).
2. Halten Sie alle Tiere in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung (SPF). Halten Sie eine kontrollierte Umgebung bei einer Temperatur von 24 ± 2 °C mit einer durchschnittlichen Luftfeuchtigkeit von 60 ± 1 % und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus aufrecht.
3. Stellen Sie sicher, dass die Ratten freien Zugang zu angesäuertem Wasser und einer Standardnahrung für Nagetiere haben.

2. Tiermodellbau und Intervention

1. Akklimatisieren Sie die Ratten für einen Zeitraum von 2 Wochen im Fütterungszentrum. Ordnen Sie die Ratten im Alter von 6 Wochen nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein: Kontrollgruppe, PTOA-Gruppe und FD-Gruppe, mit drei Ratten in jeder Gruppe.
2. Pflegen Sie die Kontrollgruppe unter Standardbedingungen.
3. Anästhesieren Sie die PTOA-Gruppe mit Isofluran (4% zur Induktion und 1%-2% zur Erhaltung).
4. Die beidseitigen Kniegelenke werden über einen Längsschnitt der Haut mit einem medialen parapatellaren Zugang operativ freigelegt.
5. Führen Sie die ACLT mit einem Skalpell durch und bestätigen Sie die vollständige Durchtrennung durch einen positiven Test der vorderen Schublade.
   HINWEIS: Es wurde eine bilaterale ACL-Transsektion durchgeführt, um die Konsistenz des Modells zu gewährleisten und die individuelle Variabilität zu reduzieren. Die Daten von beiden Knien wurden gemittelt, um einen Wert pro Tier für die Analyse zu erhalten.
6. Bringen Sie die Ratten der FD-Gruppen regelmäßig in eine klimatisierte Kammer, die sich in derselben Einrichtung befindet. Unterziehen Sie diese Ratten einer fettreichen Diät.
   HINWEIS: Die fettreiche Diät enthielt 20 % Saccharose, 15 % Schmalz, 1,2 % Cholesterin, 0,2 % Natriumcholat, 10 % Kasein, 0,6 % Calciumhydrogenphosphat, 0,4 % Kalksteinpulver, 0,4 % Vormischung und 52,2 % Grundfutter. Das Nährwertprofil des Kontrollfutters war wie folgt: 19 % Protein, 31 % Fett und 50 % Kohlenhydrate, mit einem Kalorienverhältnis von 17 % Protein, 37 % Fett und 46 % Kohlenhydraten.
7. Halten Sie die Umgebungsbedingungen in der Klimakammer bei einer Temperatur von 24 ± 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 90 ± 4 % und einem täglichen Lichtzyklus von 12 Stunden aufrecht.
   HINWEIS: Aufgrund des erhöhten Risikos des Bakterienwachstums in einer so hohen Temperatur- und Feuchtigkeitseinstellung sollten Sie Trinkwasser und Lebensmittel sterilisieren und täglich auffüllen, um die Kontamination zu minimieren. Die Gesamtdauer der experimentellen Intervention betrug 12 Wochen.

3. Ganganalyse (Fußabdrücke)

1. Führen Sie die Fußabdruckanalyse 12 Wochen nach Beginn der Behandlung bei den Modellratten mit einer zuvor beschriebenen Methode durch¹⁰.
2. Bestrich die Bauchflächen der Hinterpfoten der Ratten mit roter Tinte, und sie durften einen 100 cm langen und 8 cm breiten Weg entlanglaufen, der mit weißem Papier bedeckt war.
3. Um die Ratten zur Bewegung anzuregen, platzieren Sie am Ende des Weges eine dunkle Kammer, um die Vorwärtsbewegung zu fördern.
4. Führen Sie drei aufeinanderfolgende Messungen durch, um Durchschnittswerte für jeden Parameter zu erhalten, einschließlich Schrittlänge und Schrittlänge, die zur Beurteilung von Unregelmäßigkeiten verwendet wurden.
5. Bestimmen Sie die Schrittlänge (cm), indem Sie die Strecke messen, die dieselbe Hinterpfote zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten zurücklegt.
6. Definieren Sie die Schrittlänge (cm) als horizontalen Abstand zwischen der linken und der rechten Hinterpfote.
7. Miss den Pfotenwinkel (°) als den Winkel zwischen der zweiten Zehe und dem Fersenbein, relativ zu einer horizontalen Linie¹¹.
8. Messen Sie die Schrittlänge, die Schrittlänge und den Pfotenwinkel direkt auf den gescannten Fußabdruckbildern mit der Image-Pro Plus-Software (Version 6.0) und verwenden Sie die integrierten Werkzeuge zur Entfernungs- und Winkelmessung.
   HINWEIS: Diese Gangparameter sind entscheidend für die Identifizierung subtiler Funktionsbeeinträchtigungen in den frühen Stadien der Arthrose. Die Patienten können eine reduzierte Schritt- und Schrittlänge aufweisen, um schmerzhafte Gelenke zu schützen, während ein erhöhter Zehenausstreckungswinkel und eine Gangasymmetrie häufig als kompensatorische Reaktionen auf schmerzinduzierte Gelenkinstabilität auftreten.

4. Messung des Gelenkdurchmessers

1. Messen Sie den Verbindungsdurchmesser mit einem kalibrierten Spiralmikrometer (mm), nachdem Sie in jeder Gruppe modelliert haben.
   HINWEIS: Mit fortschreitender Arthrose zeigen die Patienten in der Regel Gelenkschwellungen und Schmerzen. Ein höherer Grad der Schwellung kann auf ein schwereres Stadium der Erkrankung hinweisen.

5. Messung der Griffkraft

1. Messen Sie die Griffkraft der Hinterbeine mit einem digitalen Griffkraftmessgerät, das mit einem Traktionsgitter ausgestattet ist, einem Kraftmessgerät, das mit einem Traktionsgitter ausgestattet ist (90 mm × 90 mm).
   1. Halten Sie die Ratte vorsichtig am Schwanz und an der Haut im Nacken.
   2. Senken Sie das Tier ab, bis seine Hinterbeine das Gitter fest greifen, und ziehen Sie das Tier dann gleichmäßig horizontal entlang der Achse des Kraftsensors, bis es seinen Griff löst.
   3. Wiederholen Sie den Test dreimal pro Tier. Notieren Sie den höchsten Wert als maximale Griffstärke.
      HINWEIS: Während der Prüfung der Griffkraft der Hintergliedmaßen immobilisieren Sie die Vordergliedmaßen, indem Sie sie auf eine Kartonoberfläche kleben, um ein versehentliches Einrasten der Vordergliedmaßen mit dem Zuggitter zu verhindern. Eine verminderte Griffkraft ist ein Hinweis auf eine verminderte Muskelfunktion und mögliche schmerzbedingte motorische Defizite im Zusammenhang mit osteoarthritischer Progression.

6. Isolierung und Kultur von primären Chondrozyten

1. Isolieren Sie primäre Chondrozyten von 6 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten.
2. Präparieren Sie die Hüftköpfe und Tibiaplateaus, um etwa 100-150 mg Knorpelgewebe zu sammeln.
3. Waschen Sie das Tuch zweimal mit PBS, das 1 % Penicillin-Streptomycin enthält.
4. Den Knorpel in 5 ml 0,25 % Trypsin-EDTA bei 3 °C für 30 min verdauen.
5. Den Knorpel in 1-2 mm³ Stücke schneiden und in 10 mL 0,2 % Kollagenase II bei 37 °C für 4 h auf einem Schüttler mit konstanter Temperatur weiter verdauen.
6. Die Zellsuspension wird durch ein 70-μm-Zellsieb filtriert, 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in DMEM/F12-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.
8. Inkubieren Sie die Zellen bei 3 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂.

7. Behandlung von Zellen

1. Zählen Sie die isolierten Chondrozyten mit einem Hämozytometer.
2. Die Chondrozyten werden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 0,1 ml vollständigem Kulturmedium (DMEM/F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin) ausgesät.
3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Inkubator für 24 Stunden, um eine Adhäsion zu ermöglichen.
4. Um ein in-vitro-Entzündungs-PTOA-Modell zu etablieren, behandeln Sie adhärente Chondrozyten 48 Stunden lang mit IL-1β (10 ng/ml), sobald die Zellkonfluenz etwa 80% erreicht.
5. Für die FD-Positivkontrolle wird Palmitinsäure (PA, CAS-Nr. 57-11-4) in Chloroform in einer Verdünnung von 1:1000 gelöst, um eine 500 μM-Stammlösung herzustellen.
   1. Wenn der Zellkonflugrad etwa 80 % erreicht, fügen Sie 1 μl der PA-Stammlösung pro 1 ml Kulturmedium hinzu, um eine PA-Endkonzentration von 500 nM zu erreichen. Behandeln Sie Chondrozyten mit dieser Lösung für 48 h.
6. Geben Sie 1 μl Chloroform (Vehikelkontrolle) pro 1 ml Kulturmedium zu Kontrollzellen ohne PA.

8. Probenentnahme, Entkalkung und Einbettungsvorbereitung

1. Die Tiere werden 12 Wochen nach der Intervention durch Inhalation einer Überdosis Isofluran (≥5%) in einer verschlossenen Kammer für mindestens 5 Minuten eingeschläfert und die vollständige Beendigung der Atmung und des Herzschlags bestätigt.
   HINWEIS: Diese Methode wurde von der Ethikkommission der Tiere genehmigt und entsprach den nationalen Richtlinien für die humane Euthanasie von Versuchstieren.
2. Entnehmen Sie beide Kniegelenke von drei Ratten pro Gruppe (n = 3, gesamt = 6 Knie) für die histologische Untersuchung.
3. Fixieren Sie die Proben in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei einem Verhältnis von Gewebe zu Fixiermittel von mehr als 1:20 für mehr als 48 Stunden auf einem Schüttler bei °C.
4. Spülen Sie das Taschentuch 1-2 h lang unter fließendem Leitungswasser ab, um Reste des Fixiermittels zu entfernen.
5. Entkalken Sie das Gewebe in 0,5 M EDTA-Lösung (pH 7,4, ~15%) bei einem Gewebe-zu-Lösung-Verhältnis von 1:20 für 21 Tage bei 3 °C und ersetzen Sie es alle 3 Tage durch eine frische Lösung.
6. Beurteilen Sie den Abschluss der Entkalkung, indem Sie den Knochen mit einer Nadel auf Erweichung untersuchen.
7. Waschen Sie entkalkte Tücher 2 h unter fließendem Leitungswasser und legen Sie sie in Einbettkassetten.
8. Dehydrieren Sie die Proben durch eine abgestufte Ethanolreihe: 75 % Ethanol für 2 Stunden (oder über Nacht), 80 % Ethanol für 2 Stunden, 95 % Ethanol für 0,5 Stunden und zweimal absolutes Ethanol für 60 Minuten. Anschließend 20 min in 1:1 Xylol:Ethanol eintauchen.
9. Reinigen Sie das Gewebe zweimal (10 min und 60 min) in Xylol.
10. Gewebe mit Paraffin in der folgenden Reihenfolge infiltrieren: Xylol:Paraffin (1:1) für 15 min, weiches Paraffin bei 52-5 °C für 1 h (zweimal), dann hartes Paraffin bei 56-5 °C für 30 min.
11. Betten Sie Gewebe mit einem Paraffin-Einbettungssystem (z. B. Leica, eingestellt auf 6 °C) ein und übertragen Sie die Blöcke für 2 Stunden auf eine -2 °C-Kühlplatte.
12. Paraffinblöcke werden mit Hilfe eines Mikrotoms sagittal bei μm Dicke geschnitten.
13. Bänder in einem 4 °C warmen Wasserbad schweben lassen und auf saubere Objektträger aufhängen.
14. Montierte Abschnitte an der Luft trocknen und im 60 °C Ofen 2 h backen, um Paraffinreste zu entfernen.
15. Entparaffinisieren Sie die Schnitte, indem Sie nacheinander in Xylol (10 min), frisches Xylol (10 min), absolutes Ethanol (5 min), frisches absolutes Ethanol (5 min), 90 % Ethanol (5 min) und 75 % Ethanol (5 min) eintauchen und dann vor dem Färben mit Leitungswasser abspülen.

9. Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung

1. Eintauchende deparaffinisierte und rehydrierte Gewebeschnitte wurden 3-5 min lang bei Raumtemperatur (RT; ~2 °C) in eine 0,5%ige Hämatoxylin-Färbelösung getaucht, gefolgt von einer gründlichen Spülung unter fließendem Leitungswasser.
2. Die Schnitte kurz 2-5 s lang mit Hämatoxylin-Differenzierungslösung behandeln und unter fließendem Leitungswasser abspülen.
3. Führen Sie die Bläuung durch, indem Sie die Abschnitte 2-5 s lang in Hämatoxylin-Bläuungslösung tauchen und anschließend spülen.
4. Dehydrieren Sie die Abschnitte jeweils 5 min lang in 85 % und 95 % Ethanol und färben Sie sie dann 5 min lang in 0,05 % Eosin Y (alkoholisch).
5. Dörren Sie zweimal in absolutem Ethanol (je 5 min), dann in Xylol (5 min), gefolgt von frischem Xylol (5 min).
6. Montieren Sie die Abschnitte mit neutralem Balsam und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
   HINWEIS: In gut erhaltenem Knorpel färbt Hämatoxylin die Zellkerne blau und Eosin die Matrix rosa. Geschädigter Knorpel zeigt Chondrozytenverlust, Flimmern und eine unorganisierte Matrix.

10. Safranin O - schnelle grüne (SOFG) Färbung

1. Färben Sie die Abschnitte mit 2% Fast Green Lösung für 1-5 min bei RT. Waschen Sie es unter fließendem Leitungswasser, bis der Knorpel farblos wird.
2. Schnitte in 1%iger Salzsäure 10-15 s kurz differenzieren, dann gründlich unter fließendem Wasser abspülen.
3. Färbeabschnitte mit 0,2%iger Safranin O-Lösung für 5-10 s färben, dann durch viermaligen Wechsel von absolutem Ethanol (je 3-5 s) schnell dehydrieren.
4. Klare Schnitte in Xylol (5 min), gefolgt von frischem Xylol (5 min).
5. Dias mit neutralem Balsam befestigen und mit Deckglas abdecken.
   HINWEIS: Safranin O färbt Knorpelproteoglykane rot, während Fast Green Knochen-/Fasergewebe grün färbt. Der Verlust von Rot weist auf eine Verarmung und Degeneration des Proteoglykans hin.
6. Bewerten Sie histologische Veränderungen mit dem Bewertungssystem der Osteoarthritis Research Society International (OARSI). Messen Sie die Breite des Gelenkspalts und die Knorpeldicke, um die strukturelle Degeneration zu beurteilen. Nehmen Sie Bilder unter einem Lichtmikroskop (z. B. ECLIPSE Ti2-E) bei 4× (Maßstabsleiste = 50 μm) und 20x (Maßstabsleiste = 10 μm) auf.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Imaging-Software des Systems für die Bilderfassung und ImageJ (v1.48v) für die Analyse. Kalibrieren Sie Bilder über Analysieren > Skalieren mit einem Mikrometer. Quantifizieren Sie für jedes Gelenk fünf Zufallsfelder aus drei sagittalen Schnitten mit Hilfe einer verblindeten Analyse durch drei unabhängige Beobachter.

11. Mikro-μ CT

1. Präparieren Sie die Kniegelenke von Ratten 12 Wochen nach dem Eingriff und fixieren Sie sie sofort 24 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd bei RT, um die Gewebemorphologie zu erhalten.
2. Spülen Sie die fixierten Proben mit PBS und lagern Sie sie bis zum Scannen in 70%igem Ethanol.
3. Montieren Sie jede Kniegelenksprobe vor dem Scannen auf einen speziellen Probenhalter. Richten Sie das Gelenk entlang seiner Längsachse aus, um Bewegungsartefakte zu minimieren.
4. Führen Sie Mikro-μCT-Scans mit einem Mikro-μCT-System mit den folgenden Scanparametern durch: Röntgenspannung 70 kV, Strom 100 μA und Leistung 7 W.
5. Erfassen Sie vier Bilder pro Projektion und stapeln Sie sie, um die Bildqualität zu verbessern, mit einer Rotationsschrittweite von 0,72°, was eine vollständige 360°-Drehung ermöglicht.
6. Stellen Sie die resultierende Voxelgröße (Schichtdicke) auf 15 μm ein, um hochauflösende Bilder zu erhalten, die für die Analyse trabekulärer Knochen geeignet sind.
7. Definieren Sie die Region of Interest (ROI) zwischen der proximalen Tibiawachstumsfuge und dem Tibiaplateau, wobei Sie sich auf den subchondralen Knochen sowohl des Femurs als auch der Tibia konzentrieren.
8. Rekonstruieren Sie die Rohscandaten mit Hilfe einer Rekonstruktionssoftware in Schnittbilder.
9. Importieren Sie die rekonstruierten Bildstapel in eine geeignete Software für die quantitative morphometrische Analyse.
10. Beurteilen Sie wichtige Parameter wie Knochenvolumenfraktion (BV/TV, %), Knochenmineraldichte (BMD, g/cm³) und Trabekeltrennung (Tb.Sp, mm).
11. Verwenden Sie für die qualitative und dreidimensionale Visualisierung eine 3D-Visualisierungssoftware, um volumetrische Renderings der Knochenmikroarchitektur zu erstellen.
12. Führen Sie eine visuelle Bewertung durch, um die strukturelle Integrität und die in den quantitativen Daten beobachteten morphologischen Veränderungen zu bestätigen.
    HINWEIS: Die gesamte Bildverarbeitung und -analyse wurde von verblindeten Bedienern durchgeführt, um unverzerrte Ergebnisse zu gewährleisten.

12. Elisa

1. Betäuben Sie die Ratten 12 Wochen nach der Intervention. Legen Sie die Bauchschlagader vorsichtig frei und präparieren Sie sie, um Blutproben zu entnehmen.
2. Lassen Sie das gesammelte Blut 30 min lang bei RT gerinnen und zentrifugieren Sie es dann bei 755 × g (entspricht 3000 U/min, mit einer Zentrifuge mit einem Rotorradius von 7,5 cm) bei °C für 15 min.
3. Trennen und lagern Sie das Serum für die anschließende Messung des PGE₂-Spiegels mit einem handelsüblichen ELISA-Kit.
4. Parallel dazu werden primäre Chondrozyten gesät und 24 h lang kultiviert, gefolgt von einer Behandlung mit IL-1β und PA für 48 Stunden, gemäß dem etablierten Zellbehandlungsprotokoll. Sammeln und analysieren Sie nach der Intervention die Kulturüberstände auf PGE₂-Konzentration mit demselben ELISA-Kit.

13. Quantitative RT-PCR

1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus Zellproben mit einem kommerziellen RNA-Extraktionsreagenz (TRIzol).
2. Synthetisieren Sie cDNA mit einem Reverse Transkriptionskit (mit gDNA-Entferner) und lagern Sie die resultierende cDNA bei -8 °C für die nachfolgende Analyse.
3. Führen Sie eine quantitative PCR mit SYBR Green durch und berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus mit der 2-ΔΔCt-Methode.
   HINWEIS: Die verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: β-Aktin vorwärts: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-Aktin-Umkehrung: CTGACCCATACCCACCATCAC; EP4 vorwärts: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 vorwärts: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 nach vorne: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 Rückseite: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. Westliche Blotting-Analyse

1. Lysieren Sie die Zellen mit RIPA-Puffer 30 min lang auf Eis.
2. Trennen Sie die Proteinproben mit SDS-PAGE für 90 min, dann übertragen Sie sie für 2 h auf Nitrozellulosemembranen.
3. Blockieren Sie die Membranen mit 5% BSA und waschen Sie sie mit phosphatgepufferter Lösung.
4. Führen Sie Immunblotting mit spezifischen Antikörpern durch.
   HINWEIS: Die Antikörper und ihre jeweiligen Verdünnungen waren wie folgt: Anti-MMP9 (1:1000), Anti-Kollagen II (1:1000), Anti-COX2 (1:1000), Anti-CaMKII (1:1000), Anti-p-CaMKII (1:1000), Anti-IP3R (1:1000), Anti-Cyt-C (1:1000) und Anti-β-Aktin (1:2000).
5. Nach der Inkubation über Nacht mit Primärantikörpern die Membranen mit TBST waschen und 1 h mit Sekundärantikörpern inkubieren: Maus-HRP (1:2000) oder Kaninchen-HRP (1:2000) im Dunkeln.
6. Führen Sie nach einer weiteren Wäsche mit TBST einen Proteinnachweis mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Kit durch.
7. Analysieren Sie die Daten mit der ImageJ-Software (Version 1.48v).

15. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Züchten Sie Chondrozyten auf Deckgläsern in 12-Well-Platten, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
2. Nach einer Behandlung mit IL-1β und PA für 48 Stunden oder ohne Behandlung als Kontrolle fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei RT.
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS mit 0,2% Triton X-100 für 15 min.
4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS (jeweils 5 Minuten) und inkubieren Sie sie dann mit dem Primärantikörper (Anti-IP3R, 1:200 Verdünnung) in Antikörperverdünnungspuffer bei °C über Nacht.
5. Setzen Sie die Zellen 1 h lang einer Verdünnung von 1:500 Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper aus.
6. Färben Sie die Zellen 10 min lang mit 5 μg/mL DAPI-Lösung.
   HINWEIS: Die Fluoreszenzbilder wurden mit einer 40-fach-Objektivlinse (Maßstabsbalken = 2 μm) aufgenommen. Alle Bilder wurden mit der ZEN-Software verarbeitet und mit ImageJ (Version 1.48v) nach einheitlichen Kalibrierungsverfahren quantifiziert.

16. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit GraphPad Prism (Version 8.0.2) durch.
2. Bevor Sie parametrische Tests anwenden, werten Sie die Daten für die Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test und für die Homogenität der Varianz mit den Brown-Forsythe- und Bartlett-Tests aus.
3. Verwenden Sie eine unidirektionale ANOVA, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Tukey, für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen, und wenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten Student's t-Test für Vergleiche mit zwei Gruppen an.
4. Betrachten Sie einen P-Wert kleiner als 0,05 als statistisch signifikant.
5. Präsentieren Sie alle Daten als mittlere ± Standardabweichung (SD) von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse

ACLT-induzierte PTOA zeigt im Vergleich zu FD-induzierter chronischer KOA eine vorzeitige Knorpelzerstörung und Verhaltensdefizite (Abbildung 2 und Abbildung 3)
Gelenkspaltverengung und Knorpeldegeneration sind die primären Folgen von OA. Frühere Studien haben Übergewicht und Umweltfaktoren (z. B. feuchtes Klima) als potenzielle Faktoren für den Beginn von OA identifiziert^12,13

Diskussion

Im Vergleich zu chronischer Arthrose, die durch Umwelt- und Ernährungsfaktoren induziert wird, führt ein ACLT-induziertes Gelenktrauma zu einem schnelleren Fortschreiten der Erkrankung. Unsere Ergebnisse, die auf Verhaltensbewertungen wie Gelenkschwellungen, Griffkraft der Hintergliedmaßen und Ganganalyse basieren, zeigten signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe, der PTOA-Gruppe und der Positivkontrollgruppe, die durch Umwelt- und Ernährungsfaktoren induziert wurden. Nach 1...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2% Kollagenase II	Sigma-Aldrich, Vereinigte Staaten von Amerika	CAS-Nr.: 9001-12-1	Primäre Chondrozytenisolierung und -kultur
0,2 % Triton X-100	Beyotime, China	ST795	Immunfluoreszenz
0,25 % Trypsin-EDTA	Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.	AR1071	Entkalkung
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco, Vereinigte Staaten von Amerika	25200072	Primäre Chondrozytenisolierung und -kultur
4% Paraformaldehyd-Fixierlösung	Biyuntian, China	P0099-3L	Fixierung des Gewebes
Anti-CaMKII-Antikörper	Huabio, China	ET1608-47	Western-Blot (1:1000)
Anti-Kollagen II Antikörper	Abcam, Großbritannien	AB34712	Western-Blot (1:1000)
Anti-COX2-Antikörper	Abcam, Großbritannien	AB179800	Western-Blot (1:1000)
Anti-Cyt-C Antikörper	Selleck, China	Nr. F2534	Western-Blot (1:1000)
Anti-IP3R-Antikörper (B-2)	Santa Cruz, Vereinigte Staaten von Amerika	SC-377518	Western-Blot (1:1000)
Anti-MMP9-Antikörper	Abcam, Großbritannien	AB76003	Western-Blot (1:1000)
Anti-p-CaMKII Antikörper	Selleck, China	Nr. F0342	Western-Blot (1:1000)
Anti-β-Aktin Antikörper	Zellsignaltechnik (CST), USA	8H10D10	Western-Blot (1:2000)
BSA-Blockierungslösung	Sigma Aldrich, USA	N/A	5% BSA für Western Blot Blocking
Zentrifuge (5424 R)	Eppendorf, Deutschland	N/A	755 & mal; g Zentrifugationsgeschwindigkeit
Chloroform	Sigma Aldrich, USA	N/A	Lösungsmittel für PA
Klimatisierte Kammer (RXZ-158A)	Inländischer Hersteller, China	N/A	Modell für feuchte Umgebung
Farb-Reverse-Transkriptions-Kit	Invitrogen, Suzhou, China	N/A	cDNA-Synthese
CTAn Software	Bruker	Versionen 1.9 und 4.1	Für die quantitative morphometrische Analyse
CTVol-Software	Bruker	Version 2.0	Für qualitative und dreidimensionale Visualisierung
DAPI Färbelösung	Beyotime, China	N/A	Kernfärbung (5 & Mikro; g/ml)
Digitales Griffkraftmessgerät	Puxin-Instrument	N/A	Messung der Griffkraft der Hintergliedmaßen
DMEM/F12 Mittel	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	N/A	Zellkulturmedium
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)	Aladdin	N/A	Entkalkung des Knochengewebes
ELISA-Kit für PGE2	Elabscience, Wuhan, China	PGE2E-EL-0034	ELISA-Nachweis
Erweitertes Chemilumineszenz-Kit	Millipore, USA	WBKLS0500	Western-Blot-Nachweis
Ethanol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 64-17-5	Dehydrierung des Gewebes
Fötales Rinderserum (FBS)	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	N/A	10 % Konzentration für die Kultur
FITC-gekennzeichnetes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Beyotime, China	P0179 Bausatz	Immunfluoreszenz (1:500)
GraphPad Prisma	GraphPad Software, USA	Version 8.0.2	Datenanalyse
Hämatoxylin und Eosin (H& E) Färbe-Set	Servicebio, Wuhan	Nr. G1005	Histologie
IL-1β	PeproTech, Vereinigte Staaten von Amerika	400-01B	10 ng/ml für PTOA-Zellmodell
BildJ	NIH, USA	Ausführung 1.48v	Bildanalyse
Image-Pro Plus Software	Medienkybernetik	Version 6.0	Quantitative Ganganalyse aus gescannten Fußabdrücken
Isofluran	Shanghai Yaji Biologisch	YS1412C	Anästhesie für die Tierchirurgie
Leica Embedding Center	Leica Mikrosysteme	EG1160	Einbettung von Paraffin
Leica Mikrotom	Leica Mikrosysteme	RM2235	Schneiden von in Paraffin eingebettetem Gewebe
Leica Wasserbad	Leica Mikrosysteme	HI1210	Schwimmende Paraffin-Abschnitte
Lichtmikroskop (ECLIPSE Ti2-E)	Nikon, Japan	N/A	Histologische Beobachtung
Mikro-CT-Scanner (ZKKS-MCT-Sharp)	Inländischer Hersteller, China	N/A	Bildgebung von Knochen
Maus-HRP-Sekundärantikörper	Zellsignaltechnik (CST), USA	7076	1:2000 Verdünnung
NIS-Elements Bildgebungssoftware	Nikon	N/A	Aufnahme und Analyse von Mikroskopbildern
NRecon Software	Bruker, Deutschland	Version 1.6	CT-Rekonstruktion
Palmitinsäure (PA)	Sigma Aldrich, USA	Nr. P0500	500 & Mikro; M-Lager für FD-Zellenmodell
Paraffinwachs zum Schneiden, Pathologiequalität, Schmelzpunkt 52-54 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258797-500g	Wird zur Paraffineinbettung während der Gewebeverarbeitung verwendet
Paraffinwachs zum Schneiden, Pathologiequalität, Schmelzpunkt 56-58 ° C	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	Y258799-500g	Wird für die abschließende Einbettung von Hartwachs in Gewebeschnitte verwendet
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Gibco / Thermo Fisher	C10010500BT	Zellwäsche und Gewebespülung
Penicillin-Streptomycin	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	N/A	1% für Zellkulturen
PVDF-Membran (0,45 &Mikro; m)	Millipore, USA	IPVH00010	Western-Blot-Membran
Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper	Zellsignaltechnik (CST), USA	7074	1:2000 Verdünnung
Rote Tinte	HELD	HELDIN 204	Footprint-Tracking in der Ganganalyse
RIPA Lyse Puffer	Keygen, China	N/A	Protein-Extraktion
Safranin O– Schnelles Grünfärbe-Kit	Servicebio, Wuhan	Nr. G1053	Histologische Färbung
Spiral-Mikrometer (Nonius-Messschieber)	Huangshan, China	N/A	Messung der Fugenbreite
Software zur Analyse des subchondralen Knochens (CTAn)	Bruker, Deutschland	Versionen 1.9 und 4.1	Morphometrische Analyse
SYBR Grüner PCR-Mastermix	AG Scientific, China	N/A	qPCR-Analyse
Western-Blot-Reagenzien (RIPA-Puffer, SDS-PAGE-Gelkomponenten, Ladepuffer, TBST, etc.)	Beyotime Biotechnology (China)	N/A (wird als Gruppeneintrag verwendet)	Alle Routinereagenzien, die für Western-Blotting-Verfahren verwendet werden
Xylol	Guangdong Guangshi Reagent Technology Co., Ltd.	CAS: 1330-20-7	Reinigung von Gewebe