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RNA in situ Hybridisierung mit sequentieller Protein-Immunfluoreszenz im Tandem-Assay

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DOI:

10.3791/68615

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10. Oktober 2025

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1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die RNA-in-situ-Hybridisierung mit sequentieller Protein-Immunfluoreszenz im Gewebe auf einer automatisierten Plattform, um gezielte räumliche Multiple Omics auf zellulärer Ebene zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Funktionalität von Zellen innerhalb eines Wirts hängt nicht von isolierten Signalen ab. Stattdessen müssen alle Komponenten, von den kleinsten RNA-Molekülen bis zu den größten Proteinen, im menschlichen Körper harmonisch und koordiniert zusammenarbeiten. Daher ist die Bedeutung von Ansätzen, die räumliche Untersuchungen auf zellulärer Ebene über mehrere Omics hinweg integrieren, von größter Bedeutung für das Verständnis von Zell-Zell-Interaktionen und des Fortschreitens von Krankheiten. Die Zerlegung des Proteoms und des Transkriptoms im selben räumlichen Assay hilft uns zu verstehen, wie nicht nur das, was eine Zelle ausführen soll (RNA), sondern auch, wie sie diese Anweisungen im Kontext der Mikroumgebungsnische ausführt, in der sie sich befindet (Protein). Dieses Manuskript konzentriert sich auf die Integration von sequentieller Immunfluoreszenz (SeqIF) mit RNA-in-situ-Hybridisierung (ISH) mit einem mikrofluidikgesteuerten On-Tissue-System für die Hochdurchsatz-Protein- und RNA-Untersuchung in einem räumlichen Kontext (seqRNA-ISH+seqIF), das es ermöglicht, bis zu 12 RNA- und 24 Proteinziele in einem einzigen Lauf hinzuzufügen, wobei zusätzliche Proteinziele über Sequenzielle Durchläufe. Diese Methode bietet eine sequentielle zielgerichtete Multiomics-Plattform, die keine Berücksichtigung der Fluorophorkompatibilität und eine umfangreiche Optimierung für ein höheres Plexing erfordert. Auf diese Weise kann man verstehen, welche Nachrichten die Zelle aussendet oder in ihre Mikroumgebung sendet. Dieser gezielte Ansatz hilft dabei, ganze Transkriptom-Methoden zu validieren und gleichzeitig die Wechselwirkungen zwischen der RNA und den Proteinen genauer zu untersuchen.

Einleitung

Die komplexe Funktionsweise von Zellen im menschlichen Körper beruht auf einem komplizierten Zusammenspiel von Signalen, von kleinen RNA-Molekülen bis hin zu großen Proteinen, die alle aufeinander abgestimmt sind1. Diese Interaktion unterstreicht die Bedeutung integrativer Ansätze, die räumliche Interaktionen auf zellulärer Ebene über verschiedene Omics-Schichten hinweg untersuchen 2,3. Solche Methoden sind unerlässlich, um die Komplexität der Zell-Zell-Interaktionen und des Krankheitsverlaufs zu verstehen. Viele traditionelle Methoden, wie z. B. die Durchflusszytometrie4 und die Einzelzellsequenzierung5, Zellisolate werden verwendet, um disaggregierte Proben zu untersuchen und die Massenverhältnisse der in einer bestimmten Probe vorhandenen Phänotypen zu identifizieren. Die Isolierung von Zellen für die Analyse kann jedoch eine Aktivierung oder phänotypische Veränderungen induzieren, die ihre ursprüngliche Biologie und Funktion in situ möglicherweise nicht genau widerspiegeln 6. Fortschrittliche Methoden der Raumbiologie bieten neue Strategien, um Zellen und ihre Mikroumgebung zu untersuchen, ohne den Kontext der Gewebearchitektur und die räumlichen Beziehungen zu benachbarten Zellen über mehrere Molekültypen hinweg zu beeinträchtigen 2,7.

Die Integration von Transkriptom- und Proteomanalysen in ein und demselben räumlichen Assay, ohne einzelne Zellen zu isolieren, bietet einen umfassenden Überblick über die zelluläre Funktion8. Diese Methode baut auf Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-i-n-situ-Hybridisierungsmethoden (FISH) auf, schließt jedoch keine Proteinase-Verdaue ein, die sequentielle Proteinabfragen erschweren8. Die Flexibilität des Ansatzes, der auf einen einzelnen Abschnitt angewendet werden kann, bietet eine räumlich höhere Auflösung und weniger Bildverarbeitung für die Integration und Ausrichtung von Abschnitten. Dieser Ansatz bietet Einblicke sowohl in die von einer Zelle empfangenen Anweisungen (RNA) als auch in deren Ausführung (Protein) innerhalb ihrer spezifischen Mikroumgebungsnische. Durch die Kombination dieser Informationsschichten können Forscher tiefere Einblicke in das zelluläre Verhalten und die Kommunikation gewinnen.

Es gibt zwar manuelle Methoden, aber die jüngsten Fortschritte in den Spatial-Omics-Technologien haben komplexere Analysen mit einer größeren Anzahl von Proteommarkern ermöglicht, die mittels manuellem Multiplexing untersucht wurden9. Zu diesen Ansätzen gehörten die Weiterentwicklung sowohl von Protein- als auch von RNA-ISH-Assays 10,11,12,13,14 und automatisierte Methoden, die systemspezifische konjugierte Antikörper erfordern 15,16,17, bildgebende Massenzytometrie (IMC)18,19,20 und andere automatisierte fluoreszierende sequentielle Proteommethoden, die handelsübliche primäre und sekundäre Antiboedien verwenden 2,21,22. Diese Technologien haben entweder die Proteomik oder die Kombination von Transkriptomik und Proteomik mit gezielten Ansätzen ermöglicht und visualisieren in der Regel sowohl die RNA über Sonden als auch Proteine über Antikörper, die auf ähnlichen Konjugaten basieren, so dass gleichzeitig oder sequenziell RNA und Protein mit derselben Methodik oder denselben Instrumenten gemeinsam nachgewiesen werden können. Durch einen umfassenden Überblick über die zelluläre Aktivität zielen diese Ansätze darauf ab, unser Verständnis der zellulären Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung zu verbessern. Es bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Komplexität zellulärer Interaktion zu entschlüsseln und möglicherweise neue Einblicke in normale physiologische Prozesse und Krankheitsmechanismen zu gewinnen.

Dieses Protokoll bietet eine Anleitung für die Integration von RNA-in-situ-Hybridisierung (ISH) mit sequenzieller Immunfluoreszenz (SeqIF) mit einem mikrofluidikgesteuerten On-Tissue-System. Dies stellt ein Hochdurchsatzwerkzeug für die Untersuchung von RNA und Protein in ihrem nativen räumlichen Kontext dar. Diese Methode (seqRNA-ISH+seqIF) ermöglicht es, bis zu 12 RNA- und 24 Proteinziele in einem einzigen Lauf zu erreichen, wobei zusätzliche Proteinziele über aufeinanderfolgende Läufe hinzugefügt werden können. Während sich dieses Protokoll auf ein bestimmtes mikrofluidisches System konzentriert, können die Richtlinien für die Gewebehandhabung, die RNA-Qualitätssicherung sowie die Richtlinien für die Auswahl und Titration von Antikörpern an andere Methoden angepasst werden. Diese Methode verwendet jedoch eine pH-9,0-Antigen-Retrieval für eine effiziente, proteasefreie Epitop-Retrieval, die die Stabilität der Proteomik verbessert und gleichzeitig eine gezielte Transkriptomik bietet, im Gegensatz zu herkömmlicher RNA-ISH bei pH 6,0 mit Protease, um die Zugänglichkeit der RNA-Sonde zu erhöhen, aber das Proteomnicht zu erhalten 8. Die seqRNA-ISH+seqIF-Methode ist in Abbildung 1 visuell dargestellt und zeigt die RNA-FISH-Amplifikation mit anschließender Spaltung, bevor eine Primär-Sekundär-Antikörperpaarungsmethode verwendet wird, die eine schonende chemische Entfernung von Primär- und Sekundärantikörpern verwendet. Der sequentielle Charakter des seqIF und der Detektion überwindet viele der Einschränkungen im Zusammenhang mit der Fluorophorkompatibilität durch die Verwendung sequentieller Methoden23. Dies reduziert den Bedarf an umfangreichen Optimierungen, die bei der gleichzeitigen Färbung in High-Plex-Methoden erforderlich sind, die eine Kompensation der spektralen Überlappung erfordern23.

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Protokoll

Dieses Protokoll verwendet formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebeschnitte, die von behandlungsnaiven hochgradigen serösen Ovarialkarzinompatientinnen entnommen wurden, die sich einer primären zytoreduktiven Operation unterzogen haben. Alle klinischen Daten wurden aus dem Repositorium für Eierstockkrebs der Abteilung für gynäkologische Onkologie und Reproduktionsmedizin im Rahmen von Protokollen gewonnen, die vom Institutional Review Board der University of Texas MD Anderson genehmigt wurden. Die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten wurde vom Personal an der Rezeption eingeholt, und die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt.

HINWEIS: Alle Reagenzien werden, sofern nicht anders angegeben, in nukleasefreiem deionisiertem Wasser verdünnt.

1. Korrigieren und Einbetten von Proben

HINWEIS: Die Wahl der Fixier- und Fixierungsdauer wirkt sich stark auf die Leistung von Assays aus, und im Allgemeinen werden räumliche Assays am häufigsten mit FFPE durchgeführt, da dadurch die pathologische Architektur erhalten bleibt. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von FFPE-Gewebe, daher wird das folgende Protokoll für FFPE-Gewebeproben empfohlen. Die RNA-Qualität wird jedoch durch die Fixierungsprozesse beeinflusst, ebenso wie die Protein-Epitope, jedoch in geringerem Maße. Diese Fixierungsmethoden, die unvollständige Fixierung und der Probenabbau können die unspezifische Bindung in der Antikörper-basierten Proteomik erhöhen. Drittens wird die konstitutive Fluoreszenz in der Regel während der FFPE-Verarbeitung abgeschreckt, aber einige Fluorophore bleiben mäßig bestehen und müssen getestet werden, um sicherzustellen, dass sie abgeschreckt werden.

  1. Schneiden Sie das Gewebe auf eine Dicke von ≤ 5 mm, um eine gleichmäßige Fixierung zu gewährleisten und fettinduzierte Diffusionsbarrieren zu vermeiden. Fixieren Sie die Schnitte sofort in 10 % phosphatgepuffertem Formalin (pH 7,0) bei 4 °C für 24 h, um RNA und Protein24 zu optimieren.
  2. Verarbeiten Sie fixierte Gewebe in einem Gewebeprozessor oder manuell verarbeitet Sie mit den folgenden Schritten
    1. Dehydrieren Sie Gewebeschnitte in molekularem Ethanol in nukleasefreiem Wasser von (70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x für jeweils 1 h).
    2. Tauchen Sie das Gewebe dann 2 Mal für jeweils 1 h bei Raumtemperatur (~23 °C) in Xylol.
  3. Paraffinwachs auf 60 °C erwärmen. Tauchen Sie die Taschentuchbox 2 Mal für jeweils 1 Stunde in Paraffinwachs.
  4. Legen Sie das aufgeblasene Taschentuch und richten Sie die Taschentücher in die Form, füllen Sie es mit frischem Paraffinwachs und kühlen Sie es schnell auf 4 °C25 ab.
    HINWEIS: Die besten Ergebnisse für RNA werden erzielt, wenn alle Schritte innerhalb von 48 Stunden abgeschlossen werden.

2. Bewertung der RNA-Qualität

  1. Verwenden Sie drei serielle Abschnitte, indem Sie entweder alle drei Folien parallel ausführen oder Steuerfolien vor dem Zielbereich ausführen, um sicherzustellen, dass die Blockierung ausreichend ist. Die gepaarten Positivkontrollsonden zielen auf Housekeeping-Gene ab, um die Gewebequalität und räumliche Integrität im gesamten Gewebe zu beurteilen, die durch Ausdauerunterschiede beeinflusst werden können. Zu den häufig verwendeten Kontrollen gehören UBC (ein hoch exprimierendes Gen), PPIB (moderate Expression) und POLR2A (niedrige Expression)26. Verwenden Sie Negativkontrollsondensätze, wie z. B. Dab1 (eine Bodenbakterien-RNA) auf jedem Nachweiskanal. Optional können alle Positiv- und Negativkontrollsonden neben den Zielsonden auch an derselben Probe angebracht werden. Platzieren Sie in diesem Setup die Negativregler von Dab1 in den Kanälen T2 bis T4, weisen Sie T1, T5 und T9 Positivregler von der niedrigsten zur höchsten Expression zu und stellen Sie sicher, dass die Zielsonden die verbleibenden Kanäle belegen.
    OPTIONAL: Zusätzlich kann es bei Proben mit unbekannter RNA-Qualität sinnvoll sein, einen Verteilungswert 200 (DV200-Score) zu bestimmen. DV200-Werte von über 30 werden dringend empfohlen, wobei Proben mit höherer Qualität von50 oder höher bevorzugt 27 sind. Dieser Score ist ein Hinweis auf die Qualität der RNA, und eine höhere Probenqualität erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass RNA-ISH effektiv wirkt27.

3. Vorsichtsmaßnahmen und Vorbereitungen für RNA

HINWEIS: Es empfiehlt sich, den Bereich der RNasen zu dekontaminieren und abzuwischen und dann den Arbeitsbereich vor der Verarbeitung mit 70 % Ethanol zu besprühen. Zusätzlich zur Verwendung eines RNase-freien Bereichs sollten Sie immer saubere Handschuhe, einen Laborkittel und eine Maske tragen, um die Einführung von RNasen aus der Haut oder dem Atem zu minimieren. Verwenden Sie nur RNase-freies Wasser und Verbrauchsmaterialien und vermeiden Sie den Griff in Versorgungsbeutel. Diese Vorsichtsmaßnahmen sowie die Kühlung und Trockenheit von Gewebe/Objektträgern sind für die Aufrechterhaltung der RNA-Integrität während der Experimente unerlässlich.

  1. Schneiden Sie die Schnitte mit einem Mikrotom auf positiv geladene Objektträger und platzieren Sie den interessierenden Bereich in der Mitte des Objektträgers, der mit dem Bildbereich übereinstimmt (variiert je nach System; hier sind es ca. 12,5 mm x 12,5 mm).
    HINWEIS: Beachten Sie, dass die ideale Dicke für jeden Abschnitt zwischen 4 und 6 μm für FFPE-Gewebe liegt.
  2. FFPE-Objektträger in einem trockenen, RNAse-freien Ofen mit dem Gewebe nach oben bei 60 °C für mindestens 1 h und bis über Nacht für Fettgewebe oder Gewebe, das sonst zur Ablösung neigt, backen.
  3. OPTIONALE Vorbehandlung
    HINWEIS: Während die Vorbehandlung optional ist, sind bestimmte Schritte zusätzlich optional, wie unten beschrieben.
    1. Bereiten Sie 3 % Wasserstoffperoxid vor: Geben Sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen 5 ml 30 % Wasserstoffperoxid zu 45 ml 1x PBS. Das restliche Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur (~23 °C), den Deckel mit Parafilm gesichert, bis zu drei Monate lagern.
      HINWEIS: Wasserstoffperoxid ist ein starkes Oxidationsmittel. Von brennbaren Materialien, Wärmequellen und Metallen fernhalten. Verwendung in einem Bereich mit chemischem Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA; z. B. Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel). Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Einatmen. Spülen Sie die Haut 15 Minuten lang mit Wasser, wenn sie exponiert ist. Suchen Sie einen Arzt auf, wenn Sie es einnehmen oder einatmen. Höhere Konzentrationen können schwere Verbrennungen verursachen und sich mit organischen Materialien oder bestimmten Metallen entzünden oder explodieren. Geben Sie immer Wasserstoffperoxid in das Wasser, um heftige Reaktionen zu vermeiden.
    2. Bereiten Sie 3,7 % Formaldehyd vor: Geben Sie in einen chemischen Abzug 1 ml 16 % Formaldehyd pro 3,3 ml 1x PBS. Lagern Sie Formaldehyd, das mit Parafilm umwickelt ist, bis zu drei Monate.
      HINWEIS: Formaldehyd kann schwere Augenschäden und Atemwegsreizungen verursachen und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Eine längere oder wiederholte Exposition kann zu Hautsensibilisierung und allergischen Reaktionen führen. Verwenden Sie es nur in einem chemischen Abzug und tragen Sie geeignete PSA (Handschuhe, Schutzbrille/Gesichtsschutz, Maske, Laborkittel usw.). Vermeiden Sie Hautkontakt, Augenkontakt und Einatmen. Von Wärmequellen und offenem Feuer fernhalten. Entsorgen Sie Paraformaldehyd und kontaminierte Materialien als Sondermüll und bereiten Sie nach Möglichkeit nur die für den sofortigen Gebrauch benötigte Menge vor.
    3. Entparaffinisieren Sie, indem Sie den Gewebeobjektträger waschen, indem Sie ihn in konische 50-ml-Röhrchen legen, die Folgendes enthalten: Xylol (40 mL) für 3 Wäschen à 5 min in einem chemischen Abzug.
      OPTIONAL: Anstelle von Xylol kann ein histologisches Clearingmittel verwendet werden, das jedoch möglicherweise Rückstände von Paraffin hinterlässt und die Bildqualität beeinträchtigt. Dabei werden die Scheiben in konische 50-ml-Röhrchen gelegt, die Folgendes enthalten: Histologie-Clearingmittel ohne Xylolbasis (40 mL) für zwei Waschgänge zu je 15 Minuten. Schnitte von Blöcken, die mit Bienenwachs hergestellt werden, können mit Nicht-Xylol schwer zu entwachsen sein. Bei unbekannten Wachs-Paraffin-Gemischen wird empfohlen, Xylol mit den richtigen Sicherheitsvorkehrungen zu verwenden. Xylol ist eine gefährliche und brennbare Substanz, und eine längere Exposition kann das Zentralnervensystem, die Leber und die Nieren schädigen. Verwenden Sie es nur in einem chemischen Abzug und tragen Sie PSA (z. B. Handschuhe, Masken und Laborkittel). Entsorgen Sie Xylol und kontaminierte Materialien als Sondermüll. Im Falle einer Exposition sofort einen Arzt aufsuchen.
    4. Rehydrieren Sie, indem Sie den Gewebeobjektträger waschen, indem Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen geben, das Folgendes enthält: 100 % Ethanol (40 mL) für 2 Wäschen für jeweils 3 Minuten; 95% Ethanol (40 mL) für 2 Wäschen à 3 min; 70% Ethanol (40 mL) für 2 Wäschen à 3 min; 50% Ethanol (40 mL), für 2 Wäschen à 3 min; 30% Ethanol (40 mL) für 2 Wäschen à 3 min; 1x PBS-Wäsche (40 mL) für 1 Wäsche bei 2 min.
    5. Die Peroxidase blockiert das Gewebe, indem sie das Gewebe bei Raumtemperatur (~23 °C) in eine Feuchtigkeitskammer legt und das Gewebe mit ca. 100-200 μl 3% Wasserstoffperoxid bedeckt, für 1 Waschgang à 10 min, dann das Gewebe mit 1x PBS-Waschgang (40 mL) waschen, für 2 Waschgänge à 2 min.
      HINWEIS: Die Peroxidase-Blockierung ist optional und löscht verbleibende Peroxidase-Enzyme im Gewebe, um unspezifische Färbungen zu reduzieren und die Autofluoreszenz des Gewebes zu reduzieren. Dies ist besonders wichtig für Gewebe mit hoher Autofluoreszenz, wie Knochenmark, Niere, Leber, Lunge, Darm und Gehirn, bei denen starke Hintergrundsignale die Bildgebung in den TRITC- und FITC-Emissionsbanden beeinträchtigen können 28,29,30,31,32.
    6. Führen Sie eine Formaldehydfixierung durch, indem Sie das Gewebe in eine Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur legen und das Gewebe mit ca. 100-200 μl 3,7 % Formaldehyd bedecken, für 1 Wäsche à 10 min, dann waschen Sie das Gewebe mit 1x PBS-Wäsche (40 ml), für 2 Wäschen à 2 min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, wird aber für fettreiches Gewebe oder andere Gewebe empfohlen, die Probleme beim Anhaften von Objektträgern haben.

4. Antigen-Rückgewinnung

HINWEIS: Die hier empfohlene und beschriebene Entparaffinierungs- und Antigen-Retrieval-Methode unterscheidet sich von der vom Hersteller für seqRNA-ISH+seqIF empfohlenen Methode, bei der ein kontrolliertes Wärmeantigen-Retrievalgerät mit großer Kapazität verwendet wird.

  1. Heat Induced Antigen Retrieval (HEIR) mittels Mikrowelle
    1. Geben Sie in einer temperaturüberwachten Mikrowelle ausreichend handelsübliche pH 9,0 HEIR-Pufferlösung (ca. 250 ml) hinzu, um die Objektträger im Objektträgerhalter unter dem Thermometer abzudecken, falls zutreffend.
      HINWEIS: Die Antigengewinnung für RNA erfolgt in der Regel bei einem pH-Wert von 6,0, die folgenden Methoden gelten jedoch für einen pH-Wert von 9,0, um eine höhere Effizienz der Antikörperbindung zu gewährleisten.
  2. Legen Sie die Objektträger in Pufferlösung in die Mikrowelle und balancieren Sie leere Kammern gegebenenfalls mit doppelt destilliertem Wasser aus. Erhitzen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 107 °C in der Mikrowelle (die Gesamtzeit beträgt in der Regel 30 Minuten, bis der HEIR-Puffer die Temperatur erreicht hat).
  3. Kühlen Sie die Objektträger, indem Sie sie ca. 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einen chemischen Abzug legen.
  4. Waschen Sie die Objektträger in 1x PBS in einem konischen 50 mL-Röhrchen (40 mL) für 1 Wäsche für 2 min.
  5. Lagern Sie Objektträger in einem Objektträger-Versandbeutel mit Schraubverschluss oder einem konischen 50-ml-Röhrchen, das mit 1x PBS (oder einem handelsüblichen Multifärbepuffer) gefüllt ist, und fahren Sie sofort fort oder lagern Sie sie bis zu 7 Tage lang bei 4 °C, idealerweise jedoch weniger als 72 Stunden, bevor Sie mit seqRNA-ISH+seqIF fortfahren.

5. Stammlösungen vorbereiten

  1. Bereiten Sie 40x RNA-Imaging-Puffer vor
    1. Bereiten Sie 40x RNA-Imaging-Puffer vor, indem Sie 400 mg pulverförmigen RNA-Imaging-Puffer und 25 ml nukleasefreies deionisiertes Wasser kombinieren
    2. Die resultierende Lösung wird vortext, bis sie vollständig aufgelöst ist, und anschließend in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert (1 mL pro Röhrchen)
    3. Einfrieren und bis zu drei Monate bei -20 °C lagern, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie 20x Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Puffer (SSC) vor
    1. 157,3 g Natriumchlorid (NaCl) und 88,2 g Natriumcitrat (Na3C6H5O7) werden in 800 ml nukleasefreiem deionisiertem Wasser gelöst.
    2. Messen Sie den pH-Wert und titrieren Sie tropfenweise auf pH 7,0 mit 1 M Salzsäure (HCl).
    3. Autoklav zum Sterilisieren.
      HINWEIS: Sterile 20x SSC kann auch von verschiedenen Unternehmen erworben werden. Nach dem Öffnen bei Raumtemperatur bis 4 °C lagern.
    4. Bereiten Sie 4x SSC-Puffer vor, indem Sie 1 mL 20x SSC-Stamm mit 4 mL nukleasefreiem deionisiertem Wasser kombinieren

6. Sequentielle RNA-ISH + sequentielle Immunfluoreszenz

HINWEIS: Alle hierin beschriebenen Schritte wurden von dem Herstellerprotokoll für das seqRNA-ISH+seqIF angepasst, das in der Materialtabelle beschrieben ist, da die meisten Reagenzien als systemkompatible, kommerzielle Reagenzien identifiziert werden. Diese Reagenzien werden vom Hersteller identifiziert und/oder bereitgestellt und so konzipiert, dass sie mit dem System kompatibel sind. Modifikationen sind möglich und werden in der Diskussion beschrieben, erfordern jedoch möglicherweise zusätzliche Tests und fluidisches Waschen, um Ablagerungen zu verhindern. Die Software berechnet das Gesamtvolumen der benötigten Reagenzien, nachdem das Panel und das Protokoll entworfen und eingegeben wurden. Es werden jedoch empfohlene Änderungen vorgestellt. Das Gesamtvolumen hängt immer davon ab, wie viele Zyklen und Ziele pro Protokoll verwendet werden. Die Antikörper- und RNA-ISH-Verdünnungen werden jedoch nicht vom System berechnet, es sei denn, jede einzelne Kombination wird als eindeutiges Element in die Datenbank eingetragen. Für dieses Protokoll werden 400 μl Antikörpercocktail pro Probenträger benötigt.

  1. Vorbereitung des Systems
    1. Spülen Sie vor der Anwendung von seqRNA-ISH+seqIF alle Mikrofluidika gründlich mit nukleasefreiem Wasser.
    2. Außerhalb des Systems mit RNAse-Dekontaminationslösung besprühen, gefolgt von 70 % Ethanol.
  2. Bereiten Sie allgemeine Reagenzien vor
    1. Waschpuffer: 50 mL 20x systemkompatibler, kommerzieller Multifärbepuffer + 950 mL nukleasefreies deionisiertes Wasser
    2. Wasser: 100 ml nukleasefreies deionisiertes Wasser.
    3. Ethanol: 100 mL of 70% Ethanol.
    4. Imaging-Puffer: 16 mL 10x systemkompatibler, kommerzieller Imaging-Lösung + 140 mL nukleasefreies deionisiertes Wasser + 4 mL systemkompatibler, kommerzieller Imaging-Schaft.
    5. Elutionspuffer: 152 der systemkompatibelen, kommerziellen, Elutionslösung 1 + 8 der systemkompatibelen, kommerziellen, Elutionslösung 2
    6. Quenching Buffer: 130 mL nukleasefreies deionisiertes Wasser + 14 mL systemkompatibel, kommerziell, Quenchlösung 1 + 16 mL systemkompatibel, kommerziell, Quenchlösung 2.
  3. Bereiten Sie Färbereagenzien für das RNA-ISH-Protokoll vor
    HINWEIS: Dieser Schritt kann am Vorabend abgeschlossen und bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden. Während die Empfehlungen des Herstellers besagen, dass gepoolte Sonden bis zu einem Jahr lang verwendet werden können, wird aufgrund von Kontaminationsbedenken nicht empfohlen, Sonden mehr als eine Woche im Voraus zu poolen. Bei Sonden ist es am besten, sie vor der Verwendung auf und ab zu klopfen oder vorsichtig auf und ab zu pipettieren und vorsichtig zu zentrifugieren, um sie nach unten zu schleudern.
    1. Laden Sie eine systemkompatible, kommerzielle, proteinasefreie Permeabilisierungslösung mit 500 μl pro Objektträger in ein systemkompatibles Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Kombinieren Sie RNA-ISH-Verstärker auf der Grundlage eines Zyklus (Tabelle 1) für insgesamt 500 μl pro Objektträger für jeden der folgenden Punkte in einem systemkompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen: i) ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T1 bis T4, ii) ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T5 bis T8, iii) ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T9 bis T 12.
    3. Poolschwanz-Baum-spezifische, auf Verstärker abgestimmte Fluorophore für insgesamt 500 μl pro Objektträger für jedes der folgenden Elemente in einem systemkompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen: i) Fluorophor für Baum T1 bis T4, ii) Fluorophor für Baum T5 bis T8, iii) Fluorophor für T9 bis T 12.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist lichtempfindlich
    4. Bereiten Sie 1 ml einer 1:200-Verdünnung von kommerziellem DAPI (Stammkonzentration von 1 mg/ml) in kommerziellem Multifärbepuffer vor, der mit nukleasefreiem deionisiertem Wasser pro Objektträger hergestellt wird
      HINWEIS: Das Verfahren wurde gemäß dem Hersteller durchgeführt, der DAPI als Teil der Standardreagenzien enthält. Bei der Verwendung von kundenspezifischen DAPI-Formulierungen, die mit N,N-Dimethylformamid (DMF) verdünnt sind, können die Verdünnungen variieren und es müssen Titrationstests durchgeführt werden. Es wird jedoch empfohlen, eine Konzentration um 1:1000-1:2000 einer Stammkonzentration von 1 mg/ml zu verwenden. In der Regel ist dies in einer höheren Konzentration als bei manuellen Färbeprotokollen, da es mehrere Bildgebungs- und Stripping-Runden überstehen muss. DAPI-Fresh-Made-Formulierungen in DMF sind in der Regel heller als kommerziell erhältliche DAPI-Formulierungen. Reagenzien mit Formamid, wie z.B. DAPI, sind unter einem chemischen Abzug zu verteilen. Formamid kann Reproduktionstoxizität und Organschäden verursachen und steht im Verdacht, krebserregend zu sein. Verwenden Sie geeignete PSA (z. B. Handschuhe und Laborkittel).
    5. Bereiten Sie den RNA-ISH-Imaging-Puffer unmittelbar vor der Verwendung mit 12.125 Nuklease-freiem deionisiertem Wasser, 1,5 mL des 10x Imaging-Puffers B und 275 μL des 40x Imaging-Puffers A (aufgetaut oder frisch hergestellt) vor
    6. Bereiten Sie bis zu 10 Paare von Primärantikörpern (die primären Proteinantikörper sind in Tabelle 2 aufgeführt) für seqIF gemäß titrationsgetesteten Verdünnungen in kommerziellem Multifärbepuffer für insgesamt 400 μl pro Objektträger in einem systemkompatiblen Mikrozentrifugenröhrchen vor. Stellen Sie sicher, dass jeder Zyklus von seqIF nur einen primären Antikörper pro Wirtsspezies enthält.
    7. Sekundäre Fluorophore (Tabelle 3) plus DAPI gemäß den primären Antikörperkombinationen in Schritt 6.3.7 für seqIF gemäß titrationsgetesteten Verdünnungen herstellen. In Mehrfachfärbepuffer mit insgesamt 400 μl pro Zyklus in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit mindestens 1 ml Totvolumen verdünnen. Beispielkonzentrationen für sekundäre Alexa Fluor-Antikörper und DAPI sind wie folgt: 1:200 Verdünnung für Alexa Fluor 555, 1:400 Verdünnung für Alexa Fluor 647, 1:1800 Verdünnung für DAPI (ab 1 mg/mL DAPI in DMF)
      HINWEIS: Dieser Schritt ist lichtempfindlich. Die Hinzufügung von DAPI zu den Sekundärinstrumenten entspricht nicht dem Protokoll des Herstellers, da es dazu beitragen kann, die DAPI-Expression über mehrere Zyklen von seqIF aufrechtzuerhalten, was bei der Ausrichtung der Bilder nach dem Lauf hilft. Die meisten Bildverarbeitungssoftwares, wie z. B. die in diesem System enthaltene, verwenden das DAPI-Signal, um die Ausrichtung der zyklischen Bildgebung für die Fluoreszenzkolokalisierung zu bestätigen.
  4. System-Initialisierung
    1. Laden Sie jedes der Reagenzien aus Schritt 6.3 in der vom System vorgegebenen Reihenfolge. Beachten Sie, dass die Reihenfolge im Allgemeinen wie oben beschrieben ist, aber stellen Sie immer sicher, dass die Reagenzien mit dem Ort übereinstimmen, an dem sie geladen werden
    2. Legen Sie den entnommenen Antigen-Objektträger in den Halter ein und stellen Sie sicher, dass das Objektträger-Bildgebungsfenster in der Mitte des Bildgebungsraums ausgerichtet ist, bevor Sie den systemkompatiblen Mikrofluidik-Chip darauf platzieren und verriegeln.
      HINWEIS: Mikrofluidik-Chips können für seqIF-Titrationstests wiederverwendet werden, wenn sie bis zu einem weiteren Mal gereinigt und ordnungsgemäß gelagert werden, solange die Dichtungen intakt bleiben. Mikrofluidik-Chips können aufgrund einer möglichen Kontamination nicht wiederverwendet werden, wenn ein RNA-Panel ausgeführt wird.
    3. Bereiten Sie die Spaltlösung vor, indem Sie 1,35 ml 4x SSC und 150 mL handelsübliche 10x Spaltlösung mischen.
      HINWEIS: Die 10x Spaltlösung oxidiert schnell und wird in einer Glasampulle gelagert, die nur unmittelbar vor der Verwendung in einem seqRNA-ISH+seqIF-Versuchslauf aufgebrochen werden sollte.

7. Systemlauf

  1. Die ungefähre Laufzeit für zwei Objektträger an einem 12-Plex-seqRNA-ISH mit einem 20-Plex-Protein seqIF beträgt 48 h für ein 12,5 cm x 12,5 cm großes Bildgebungsfenster.
  2. Nach Abschluss des seqRNA-ISH+seqIF-Laufs kann der Objektträger entnommen und in 1x PBS gelagert oder sofort für zusätzliches seqIF (für bis zu 40 Proteine) verwendet werden.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Mikrofluidik des Systems vor und nach jedem Lauf mit nukleasefreiem Wasser zu reinigen und zu spülen, um das Kontaminationspotenzial zu verringern.

8. OPTIONAL: Bild- und statistische Analyse

  1. Fahren Sie mit der Bild- und statistischen Analyse über Bildanalyse- oder Pathologieanalyse-Tools fort.

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Ergebnisse

Als Beispiel für diese Methode haben wir die folgende seqRNA-ISH (Tabelle 1) + SeqIF (Tabelle 2 und Tabelle 3) auf zwei Objektträgern eines humanen hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms durchgeführt.

Abbildung 2 zeigt die Überlagerung von seqRNA-ISH+seqIF auf einer Probe von Ovarialtumorgewebe. Strukturproteinmarker wie Kollagen 1 werden zur Identifizierung von Tumorregionen verwendet, während phänotypische und fu...

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Diskussion

Der wichtigste Schritt bei der Vorbereitung und Handhabung von Proben ist die Verringerung der RNAse-Kontamination. Dies kann durch die Verwendung von Masken erreicht werden, um eine Kontamination durch den Atem zu verhindern, und durch das Abwischen der Arbeitsflächen mit einer RNase-Dekontaminationslösung und 70%igem Ethanol, das mit nukleasefreiem Wasser hergestellt wird. Für FFPE-Objektträger ist es am besten, mehrere, benachbarte Objektträger aus FFPE-Blöcken für seqRNA-ISH+seqIF zu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde teilweise von der Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 und 891490), der Sie Foundation und dem Stephanie C. Stelter Endowment Fund finanziert. Diese Forschung wurde in Zusammenarbeit mit der Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility durchgeführt, die teilweise von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant P30 CA016672 von M. D. Anderson und den NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1 von Jared Burks unterstützt wird.

Wir möchten uns auch bei Emily Martersteck von Lunaphore für die technische Unterstützung und Schulung bedanken.

Der/die Autor(en) erhielten im Rahmen eines Early-Access-Programms von Bio-Techne einen Satz RNAScope-Ziel- und Kontrollsonden zu einem reduzierten Preis, und einige Reagenzien wurden für die Verwendung in dieser Studie kostenlos zur Verfügung gestellt. Der Hersteller spielte keine Rolle bei der Studienplanung, der Datenerhebung und -analyse oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Für die Kernfärbung (das in dieser Studie verwendete Arzneimittel, 62247 wurde eingestellt)
50 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenThermo Fisher Scientific339652Wird für Aliquots & Gemischte Sekundärlösungen
70% steriler Isopropanol-AlkoholTexwipe (englisch)TX3270Für die Dekontamination von Oberflächen
AntikörperVerschiedenVerschiedenWird für primäre Ziele verwendet und variiert je nach verwendetem Kanal
APOE - Host: Maus, Klon: 960318Forschung & Forschung DMAB41443-100(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
aSMA - Host: Maus, Klon: 1A4CSTArtikel-Nr.: 69319SF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Autocut-MikrotomLeica14051956472Schneiden von Gewebe
CD10 - Host: Kaninchen, Klon: E5P7SCST65534S(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD11c - Host: Kaninchen, Klon: D3V1ECSTArtikel-Nr.: 93233SF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD163 - Wirt: Kaninchen, Klon: D6U1JCST93498S(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD163 - Wirt: Kaninchen, Klon: ja51-30InvitrogenMA5-32684(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD20 - Host: Maus, Klon: L26BethylA500-017ACF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD31 - Host: Maus, Klon: 3F8E2ProteinTech (Englisch)66065-2-IG(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD33 - Wirt: Kaninchen, Klon: BLR061GBethylA700-061CF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD4 - Wirt: Kaninchen, Klon: EPR6855Abcam (Englisch)Artikel-Nr.: ab181724(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD45 - Wirt: Kaninchen, Klon: BL-178-12C7BethylNr. A700-012(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD45RO - Host: Maus, Klon: UCHL1BethylA500-020ACF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD56 - Wirt: Kaninchen, Klon: BLR152JBethyl99746(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD66b - Wirt: Kaninchen, Klon: BLR111HInvitrogenMA5-44413(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD68 - Host: Maus, Klon: KP-1Biolegende916104(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD8 - Host: Maus, Klon: C8/144BBiolegende372902(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
CD86 - Wirt: Kaninchen, Klon: E2G8PCSTArtikel-Nr.: 76755SF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Spalte 1A1 - Host: Maus, Klon: E3E1XCST66948S(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
DNA LoBind Röhrchen 2mLEppendorf22431048Wird für gemischte RNA-Sondenlösungen verwendet
Drierit 21005 zeigt Trockenmittel anCole-Palmer21005Trockenmittel für Exsikkator
Edge-Rite Mikrotom-KlingenThermo Fisher Scientific / Invitrogen4280LHistologie - Wird beim Schneiden von Proben verwendet
Ethylalkohol 100% (200 Proof)Pharmco111000200Zur Entparaffinierung
EZ-AR2 Elegance PufferBioGeneXHK547-XAKWird zur Antigengewinnung von FFPE-Gewebeschnitten verwendet
FOXP3 - Wirt: Kaninchen, Klon: PolyklonalBethylA700-034CF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenNr. A-21425(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) F(ab')2-Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 555
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenA-48289/A-21237(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) F(ab')2-Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ Plus 647
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenNr. A-21430(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) F(ab')2-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 555
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenNr. A-21246(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) F(ab')2-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor™ 647
GZMB - Wirt: Kaninchen, Klon: PolyklonalProteinTech (Englisch)Artikel-Nr.: 13588-1-AP(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
HS-POLR2A-T1ACD BiotechneArtikel-Nr.: 310457-T1Menschliche Sonde mit geringer Expression
HS-PPIB-T5ACD BiotechneArtikel-Nr.: 313907-T5Kontrolle der menschlichen Mid-Exprimationssonde
HS-UBC-T9ACD BiotechneArtikel-Nr.: 310047-T9Menschliches High drückt Kontrolle aus
Wasserstoffperoxid-Lösung 30%Sigma-AldrichNr. HX0640-5Zur Gewebevorbereitung. Hilft, die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren und stark gefärbte Produkte zu erhalten. Zur Herstellung einer 3%igen Wasserstoffperoxidlösung
Ker8/18 - Host: Maus, Klon: PolyklonalProteinTech (Englisch)66187-1-PBS(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
LRP5 - Wirt: Kaninchen, Klon: HPA030505SigmaHPA030505-100UL(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Lunaphore 20x Multifärbe-PufferBio-TechneBU06Wird als Verdünnungsmittel und zum Waschen für den COMET verwendet
Lunaphore COMET ChipBio-TechneMK03Mcirofluidik-Chip für COMET-Instrument
Lunaphor-KometBio-TechneCM10-SSeq-IF Autostainer
Lunaphor-Elutions-Puffer-KitBio-TechneBU07-LLösung 1 & Lösung 2 für die Elutionsschritte des COMET
Lunaphore Imaging Puffer KitBio-TechneBU09Gelöster Stoff & Lösungsmittel, das für die Bildgebung während des COMET-Laufs verwendet wird
Lunaphor-Quenching-PufferBio-TechneBU08-LLösung 1 & Lösung 2 für die Abschreckschritte des COMET
MikropipetteVerschiedenN/Azur Reagenzienvorbereitung
Periostin - Wirt: Maus, Klon: 1A11A3ProteinTech (Englisch)66491-1-PBS(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Pierce 16% Formaldehyd (w/v), MethanolfreiThermo Fisher Scientific28908Zur Herstellung von 3,7 % PFA für die Gewebevorbereitung
Sonde 320102 Eingang (T2-Kanal)ACD Biotechne300040Negativkontrolle DapB in T2
Sonde 320102 Eingang (T3-Kanal)ACD Biotechne300040Negativkontrolle DapB in T3
Sonde 320102 Eingang (T4-Kanal)ACD Biotechne300040Negativkontrolle DapB in T4
RNAscope HiPlex Spalt-StammlösungBio-TechneP/N 324399Reagenz zum Spalten während des RNAScope-Assays
RNAscope HiPlex Pro für COMET 12-Plex, 20-Objektträger KitBio-Techne322075Reagenzien & Puffer für RNAScope
RNAscope HiPlex Sonde - Hs-APOE-T2ACD BiotechneArtikel-Nr.: 433093-T2(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-APOE-T2
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-ARG1-T4ACD BiotechneArtikel-Nr.: 401581-T4(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-ARG1-T4
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-CD274-T1ACD BiotechneArtikel-Nr.: 600863-T1(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS-Sonde - HS-CD274-T1
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-CD40-T6ACD BiotechneArtikel-Nr.: 445973-T6(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-CD40-T6
RNAscope HiPlex-Sonde - Hs-CXCL1-01-T12ACD BiotechneArtikel-Nr.: 1256473-T12(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-CXCL1-01-T12
RNAscope HiPlex Sonde - HS-GZMB-T7ACD BiotechneArtikel-Nr.: 468453-T7(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - Hs-GZMB-T7
RNAscope HiPlex Sonde - Hs-IFNG-T3ACD BiotechneArtikel-Nr.: 310503-T3(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - Hs-IFNG-T3
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-IL23A-T8ACD BiotechneArtikel-Nr.: 562853-T8(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-IL23A-T8
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-IL6-T9ACD BiotechneArtikel-Nr.: 400883-T9(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-IL6-T9
RNAscope HiPlex Sonde - Hs-TNFa-T11ACD BiotechneArtikel-Nr.: 310423-T11(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-TNFa-T11
RNAscope HiPlex Sonde - Hs-VEGFa-T5ACD BiotechneArtikel-Nr.: 423163-T5(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - Hs-VEGFa-T5
RNAscope HiPlex-Sonde - HS-VISTA-T10ACD BiotechneArtikel-Nr.: 491513-T10(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Early Access RNAscope & Handel; HiPlex CS Sonde - HS-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS Negativ-KontrollsondeACD Biotechne324347Vollständiges 12-Plex-Negativ-Bedienfeld vom Hersteller empfohlen. DapB in T1-T12.
RNAscope HiPlex12 CS Positivkontrollsonde-HsACD Biotechne324317Vollständiges 12 Plex Human Positive Control Panel vom Hersteller empfohlen. Hs -RTU zur Verfolgung des Housekeeping-Gens in den Kanälen T1 bis T12: Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
RNAsefreies WasserCorning46-000-CMZur Reinigung und Vorbereitung aller Geräte und bei Bedarf als Verdünnungsmittel zu verwenden
RNaseZap RNase DekontaminationslösungThermo Fisher ScientificAM9782Eine Oberflächendekontaminationslösung, die RNasen zerstört
RNeasy FFPE-BausatzQiagen73504 & 19093Für die RNA-Extraktion & DV200 Messung
Folien-MailerSimport ScientificM9504MAZur Aufbewahrung von Objektträgern in flüssigem Puffer.
Chirurgisches Design Industrielle Rasierklinge für alle ZweckeThermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236Histologie - Wird beim Schneiden von Proben verwendet
TOX 1/2 - Host: Hase, Klon: E613QCSTArtikel-Nr.: 62886SF(Hinweis: Spezifisch für diese Studie) Primärprotein Antikörper
Histologische Xylol-QualitätThermo Fisher ScientificUN1307Zur Entparaffinierung

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