Methodenartikel

Dual-modale molekulare Kartographie: Integration der Multiplex-mRNA-Detektion mit der Protein-Imaging-Massenzytometrie

DOI:

10.3791/68616

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14. November 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Hematopoietic Biology & Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für den Multiplex-mRNA-Nachweis mit Protein-Imaging-Massenzytometrie in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, Protein und mRNA im selben Assay nachzuweisen, hilft uns zu verstehen, wie sich die Zelle auf eine Ankunft vorbereitet und welche Signale sie erhält, wenn sie in der Umgebung, in der sie sich befindet, reist und interagiert. Die Bildgebung mit höherem Plexus ermöglicht nun die gleichzeitige Charakterisierung von räumlich aufgelöster mRNA (räumliche Transkriptomik) und Proteinen (räumliche Proteomik). Um Redundanzen zu vermeiden, können diese Analyten in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Es gibt viele Technologien, die viele Proteine und wenige mRNAs oder die Umkehrung ermöglichen, aber da die zentral wirkenden Analyten Proteine sind, konzentriert sich dieses Manuskript auf die Integration der Protein-Imaging-Massenzytometrie (IMC) mit der mRNA-In-situ-Hybridisierung (ISH) unter Verwendung von Metallsonden. Dies ermöglicht es uns zu verstehen, welche Botschaften die Zelle aussendet oder schnell in die Welt sendet, während sie in ihrer Mikroumgebung kommuniziert. Es überwindet auch Einschränkungen im Zusammenhang mit dem Nachweis von sezernierten Proteinen oder schwierigen Markern, die normalerweise nur mit Antikörpern schwer zu quantifizieren und zu visualisieren sind. Dieses Protokoll minimiert auch den Bedarf an Kompensationen oder Nachbearbeitungen, wie er bei Methoden mit höheren Plex-Fluoreszenzen auftritt, da es in einem auf Metallsonden basierenden Detektionssystem weder einen fluoreszierenden spektralen Spillover noch gewebespezifische Autofluoreszenzüberlegungen gibt.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krebserkrankungen weisen bei verschiedenen Patienten strukturelle und funktionelle Unterschiede auf. Die Tumormikroumgebung (TME), die sich aus normalen und bösartigen Zellen zusammensetzt, ist bei den Patienten heterogen. Die Metastasierung resultiert daraus, dass ein Rest des Primärtumors in Form von Zellclustern und Einzelzellen in den Blutkreislauf gelangt, was Hinweise auf den Krankheitsverlauf und das therapeutische Ansprechen gibt 1,2. Die Komplexität dieser Mikroumgebungen muss verstanden werden1. Obwohl Tumoren eine große Anzahl von Zelltypen umfassen, basiert der klinische Standard histologisch auf einem einzigen Marker, der sich allmählich zu verändernbeginnt 1,2. Multiplex-Bildgebungstechnologien haben neue Richtungen in der Pathologie eröffnet. Ortsaufgelöste Proteomik, Genomik, Metabolomik und Lipidomik von menschlichen Krebserkrankungen sind nun mit einer Einzelzellauflösung vonoder nahe der Einzelzellauflösung 3,4,5,6 möglich.

Diese Technologien können die heterogenen zellulären Lokalisationen und Wechselwirkungen in Tumoren entschlüsseln. Die Verwendung der geeigneten Einzelzell-Bioimaging-Methodik ermöglicht die Erstellung von Profilen vieler krankheitsassoziierter Protein-Biomarker in Patientenbiopsien, um die Entwicklung von Krebstherapien zu informieren. Erkenntnisse aus räumlichen zellulären Karten werden in der Lage sein, die Wahl einer Kombinationstherapie zu treffen, die Krebserkrankungen effizient eliminieren kann, indem sie Off-Targets, Resistenz und Rückfallreduziert 1. Es geht um die Fähigkeit, diese vielen unterschiedlichen Technologien, die typischerweise nicht harmonisch auf demselben Gewebeabschnitt zusammenarbeiten, gewerkschaftlich zu organisieren7. Dieses Protokoll, das in Abbildung 1 visuell dargestellt ist, bietet die Möglichkeit, sowohl die Proteomik als auch eine gezielte Untergruppe von mRNAs im selben Gewebeschnitt und in derselben Zelle gleichzeitig mit einer höheren Plexität zu untersuchen, als dies mit gleichzeitiger fluoreszierendem Protein+RNA-ISH8 möglich ist. Dies kann auch als Brücke für die parallele Analyse 3,4,6 dienen, mit dem Ziel, die Analyse der Daten zu entwirren. Während der duale Nachweis vorhanden ist, kann man auch Zellen untersuchen, die die mRNA-Produktion schnell eingeleitet haben, bei denen das sezernierte Protein jedoch aufgrund der begrenzten Empfindlichkeit und der fehlenden Signalverstärkung, die bei direkt markierten Primärantikörpermethoden inhärent ist, nicht nachweisbar bleibt, was den Nachweis von sekretierten Molekülen besonders schwierig macht. Das folgende Protokoll wurde von einer 12-Plex-Fluoreszenz/chromogenen Detektion angepasst, um für die metallbasierte Detektion mittels thiolreduzierter modifizierter Sonden für die gleichzeitige Detektion in IMC anwendbar zu sein.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendet formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebe von zuvor unbehandelten Patientinnen, die sich einer primären zytoreduktiven Operation bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom unterziehen. Alle klinischen Daten wurden aus dem Repositorium der Abteilung für gynäkologische Onkologie und Reproduktionsmedizin im Rahmen von Protokollen gewonnen, die vom Institutional Review Board der University of Texas MD Anderson genehmigt wurden. Es wurde eine schriftliche Einverständniserklärung der Patienten eingeholt und die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt.

1. Vorsichtsmaßnahmen und Vorbereitungen

  1. Verwenden Sie immer nukleasefreies Wasser (NFW), um alle benötigten Reagenzien vorzubereiten.
  2. Führen Sie alle Schritte mit Kunststoffbehältern und ohne die Verwendung von Glas durch, um die Bindung von Metall an Glas und Metallverunreinigungen zu reduzieren.
  3. Halten Sie den Arbeitsbereich sehr sauber und besprühen Sie Oberflächen und Pipetten mit RNase Dekontaminationslösung, gefolgt von 70% Ethanol, das mit NFW hergestellt wurde.
  4. Konjugieren Sie thiolierte mRNA-Detektionssonden (T1-T12) über einen Malemid-Linker an geeignete Metalle, wie von Schulz et al.7 beschrieben, der in protocol.io in der Materialtabelle näher beschrieben wird.
    HINWEIS: Proteinziele sollten so gewählt werden, dass sie die Position einer Zelle im Gewebe anzeigen (strukturelle Marker), identifizieren, welche Zellen vorhanden sind (phänotypische Marker) und was die Zellen tun (funktionelle Marker). Da einige funktionelle Marker transient exprimiert werden, ermöglicht die Einbeziehung von mRNA-Zielen die Identifizierung von Zellen, die diese Ziele erzeugen.

2. Probenvorbereitung und -vorverarbeitung

  1. Gewebeschnitte über Nacht im trockenen Backofen bei 60 °C backen.
  2. Entparaffinierung durchführen: Drei Runden Xylol für 5 Minuten pro Runde und 10 Runden Rehydrierung (100 % Ethanol (EtOH) x2, 95 % EtOH x2, 70 % EtOH x2, 50 % EtOH x2, 30 % EtOH x2), für 3 Minuten pro Runde. Mit 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) einmal 2 Minuten lang waschen. Je nachdem, wie viele Proben gleichzeitig verarbeitet werden, verwenden Sie konische 50-ml-Röhrchen (max. 2 Objektträger) oder 350 ml-IHC-Färbekassetten (max. 24 Objektträger).
    HINWEIS: Dieser Entparaffinierungsschritt wird zwar empfohlen, ist jedoch optional und abhängig vom Gewebetyp.
  3. Tragen Sie eine Lösung von 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten auf, indem Sie die Gewebeobjektträger in einem 50-ml-Röhrchen mit genügend PFA-Lösung inkubieren, um den Gewebeschnitt zu bedecken.
  4. Heat Induced Antigen Retrieval (HEIR) mit Mikrowelle: Füllen Sie mit einer temperaturüberwachten Mikrowelle ein Tablett mit pH 6 HEIR Antigen Retrieval Puffer (350 mL) und die restlichen Tabletts mit NFW. Legen Sie die Gewebeschnitte in ein Färbegestell für Objektträger und legen Sie sie in das Tablett mit dem Antigen-Retrieval-Puffer.
    HINWEIS: Stellen Sie bei der Antigen-Entnahme sicher, dass der Antigen-Entnahmepuffer vor der Verwendung Raumtemperatur (RT) hat.
  5. Führen Sie 15 Minuten lang eine Antigengewinnung bei 107 °C durch und lassen Sie die Gewebeobjektträger dann 20 Minuten lang in einer chemischen Haube bei RT abkühlen.
  6. Spülen Sie das Befeuchtungspapier während der Antigenentnahme mit Wasser ab, legen Sie es in eine Färbeschale für Objektträger zur Feuchtigkeitskontrolle und stellen Sie die Schale in einen Hybridisierungsofen bei 60 °C.
  7. Spülen Sie die Objektträger 3 Minuten lang in RNase-freiem TBS und trocknen Sie sie dann 3 Minuten lang.

3. Protease-Behandlung

  1. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine hydrophobe Barriere um jeden Gewebeabschnitt. Lassen Sie die Barriere ca. 2 min vollständig trocknen.
  2. Legen Sie die trockenen Objektträger in den Objektträgerhalter der Feuchtigkeitsschale, indem Sie die Schwenkklemme öffnen.
  3. Fügen Sie so viele Tropfen Protease hinzu, dass der Gewebeabschnitt vollständig bedeckt ist. Nehmen Sie die vorgewärmte Feuchtekontrollschale (60 °C, Schritt 2.6) aus dem Hybridisierungsofen und setzen Sie den Objektträgerhalter in die Feuchtekontrollschale ein. Verschließen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale wieder und stellen Sie sie wieder in den Hybridisierungsofen ein. Bei 40 °C 30 min inkubieren.
  4. Bereiten Sie während dieser Inkubation RNA-ISH-Assay-Materialien vor.
    1. Bereiten Sie 500 ml 1x RNA-ISH-Waschpuffer vor, indem Sie den 50x Stamm mit NFW verdünnen. Bei RT bis zu einem Monat lagern.
      HINWEIS: Wenn im 50x-Waschpuffer Niederschläge auftreten, resuspendieren Sie den Puffer, indem Sie den Puffer 10-20 Minuten lang auf 40 °C erhitzen, bevor Sie den 1x-Waschpuffer vorbereiten.
  5. Bereiten Sie 1 l DTBS-T (0,5 % Tween) in NFW vor, indem Sie 5 mL Tween zu 1 l DPBS-T hinzufügen.
  6. Vorbereiten von RNA-ISH ZZ-paired Target Probes:
    1. mRNA-Sondenvorräte und RNA-ISH-Verdünnungsmittel bei 40 °C im Trockenofen für 10 min erwärmen. Wirbeln Sie die Sonden vor und schleudern Sie sie in einer Tisch-Minizentrifuge nach unten.
    2. Bereiten Sie 1x Mix (bis zu 12 Sonden, Tabelle 1) vor, indem Sie die 50x Sonden mit RNA-ISH-Verdünnungsmittel verdünnen und sicherstellen, dass genügend Endvolumen vorhanden ist, um den gesamten Gewebeabschnitt abzudecken.
    3. Vortex gut und lassen Sie die gemischten Sonden und das RNA-ISH-Verdünnungsmittel bis zur Verwendung bei RT.
  7. Entfernen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale aus dem Hybridisierungsofen und entfernen Sie den Objektträgerhalter. Stellen Sie das Blech wieder in den Ofen.
  8. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in NFW unter leichtem Rühren für 5 min.
  9. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem NFW für 5 min.

4. Hybridisierung von Zielsonden

  1. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern. Nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setzen Sie den Schieberegler in das Blech ein.
  2. Fügen Sie so viel von der entsprechenden Sondenmischung hinzu, dass jeder Gewebeabschnitt vollständig bedeckt ist. Schließen Sie das Blech und schieben Sie es für 2 h bei 40 °C in den Ofen.
  3. Das Reagenz RNA-ISH Amplifier 1 (ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T1 bis T4) wird 30 min vor Ende der Inkubation bei RT äquilibriert, um es in Schritt 5.2 zu verwenden.
  4. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale aus dem Hybridisierungsofen und entfernen Sie den Objektträgerhalter. Stellen Sie das Blech wieder in den Ofen.
  5. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer unter leichtem Rühren für 2 min.
  6. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem 1x Wash Buffer für 2 min bei RT.

5. RNA-ISH-Verstärker hybridisieren 1

  1. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und legen Sie die Objektträger in den Objektträgerhalter der Feuchtigkeitsschale. Setzen Sie den Objektträgerhalter in die Feuchtigkeitskontrollschale ein.
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 1 und fügen Sie ihn hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Schließen Sie das Tablett und stellen Sie es für 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen. Platzieren Sie das Reagenz RNA-ISH Amplifier 2 (ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T5 bis T8) bei RT, um es in Schritt 6.2 zu verwenden.
  3. Entfernen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale aus dem Hybridisierungsofen und entfernen Sie den Objektträgerhalter. Stellen Sie das Blech wieder in den Ofen.
  4. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer unter leichtem Rühren für 2 min.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.

6. RNA-ISH-Verstärker hybridisieren 2

  1. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern. Nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setzen Sie den Diahalter in das Blech ein
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 2 und fügen Sie ihn hinzu, um jeden Abschnitt abzudecken. Schließen Sie das Tablett und stellen Sie es für 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen.
  3. Platzieren Sie das Reagenz RNA-ISH Amplifier 3 (ZZ-Schwanzbäume für die Schwänze T9 bis T 12) bei RT, um es in Schritt 7.2 zu verwenden. Entfernen Sie den Objektträgerhalter aus dem Fach. Stellen Sie das Blech wieder in den Ofen.
  4. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer unter leichtem Rühren für 2 min.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.

7. RNA-ISH-Verstärker hybridisieren 3

  1. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern. Nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setzen Sie den Diahalter in das Blech ein
  2. Vortex RNA-ISH Amplifier 3 und fügen Sie ihn hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Schließen Sie das Tablett und stellen Sie es für 30 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen.
  3. Bereiten Sie während der Inkubation die Metall-Oligos-Mischung für Schritt 8 vor. Jedes Oligo wird in einer Konzentration von 1:15 verwendet (aus 10 μM Stamm, wobei darauf zu achten ist, dass genügend Endvolumen vorhanden ist, um den gesamten Gewebeschnitt abzudecken). Gut vortexen und die gemischten Metalloligos bis zur Verwendung bei RT belassen. Nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und entfernen Sie dann den Schiebehalter aus dem Blech. Stellen Sie anschließend das Blech wieder in den Ofen
  4. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer unter leichtem Rühren für 2 min.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem 1x Wash Buffer für 2 min bei RT.

8. Hybridisierung von Metalloligos

  1. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern. Nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setzen Sie den Schieberegler in das Blech ein. Mischmetall-Oligos, die in Schritt 7.3 (vor Gebrauch Vortex) hergestellt wurden, zugeben.
  2. Schließen Sie das Tablett und stellen Sie es für 45 min bei 40 °C in den Hybridisierungsofen.
  3. Entfernen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale aus dem Hybridisierungsofen und entfernen Sie den Objektträgerhalter. Stellen Sie das Blech wieder in den Ofen.
  4. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in 1x Waschpuffer unter leichtem Rühren für 2 min.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem 1x Wash Buffer für 2 min bei RT.

9. Metallkonjugierte Antikörper

  1. Um unspezifische Stellen zu blockieren, tragen Sie genügend Volumen des Blockierungspuffers auf, um den gesamten Gewebeschnitt abzudecken, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT.
  2. Während der Inkubation wird die Antikörpermischung für die Verwendung in Schritt 10.1 vorbereitet, indem die Antikörper (Tabelle 1) in Antikörperverdünnungspuffer verdünnt werden.

10. Inkubation mit metallkonjugierten Antikörpern

  1. Nach der Inkubation des Blocking-Puffers verwerfen Sie den Blocking-Puffer von den Gewebeobjektträgern und geben Sie genügend Volumen des Ab-Mixes (aus Schritt 9.2) ab, um den gesamten Gewebeschnitt abzudecken.
  2. Stellen Sie den Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie ihn über Nacht (~16 h) bei 4 °C.

11. DNA-Färbung

  1. Bereiten Sie frische Ir-Interkalator-Lösung vor.
    1. Aus einer 500 μM Stammlösung wird eine Arbeitslösung im Maßstab 1:2000 in RNase-freiem TBS hergestellt. Die Arbeitslösung kann aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden (nicht einfrieren/auftauen).
  2. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in TBS-T Puffer unter leichtem Rühren für 5 min.
  3. Wiederholen Sie die Wäsche in TBS-T.
  4. Färben Sie Objektträger mit Ir-Arbeitslösung (aus Schritt 11.1.1) für 5 min bei RT.
  5. Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträgerhalter, der mit NFW vorgewaschen ist. Waschen Sie die Objektträger in TBS-T Puffer unter leichtem Rühren für 5 min.
  6. Wiederholen Sie die Wäsche in TBS-T.
  7. Zweimal in ELS waschen, 5 min (langsam umrühren).
  8. Tauchen Sie den Objektträger schnell in ddH2O, um eine Kristallisation der im TBS vorhandenen Salze auf dem Gewebe zu vermeiden.
  9. Trocknen Sie den Objektträger unter einer Chemikalienhaube (10 min) und lagern Sie ihn bis zur Bildaufnahme bei 4 °C.

12. Bilderfassung

  1. Laden Sie den Objektträger in die Ablationskammer von IMC.
  2. Erfassen Sie ein Panoramabild, um den Bereich of Interest (ROI) zu identifizieren.
  3. Bilden Sie ROIs in der Bilderfassungssoftware ab.
  4. Wenden Sie die Akquisitionsvorlage an.
  5. Passen Sie die Laserleistung (Ablationsenergie) basierend auf dem Probentyp an. Der Standardwert ist auf 0 dB eingestellt.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Ablationsenergie mit mehreren kleinen Gewebebereichen (30 μm x 30 μm) zu testen und die Leistung jedes Mal um 1 dB zu erhöhen. Wählen Sie die niedrigste Ablationsenergie, die die Probe freigibt, ohne sich in den Objektträger einzubrennen. Normalerweise ergibt sich daraus eine Laserleistung von 3-4 dB. Gelegentlich, wenn das Gewebe dicker ist als empfohlen, erhöht sich die Laserleistung auf 5 dB.
  6. Starten Sie die Laserablation. Das System richtet den Laser auf den ROI und abliert die metallmarkierten Proteine, wodurch Aerosolfahnen erzeugt werden, die an den ICP-Brenner (Induktiv gekoppeltes Plasma) übertragen werden, wo die Wolken im Plasma verdampft, zerstäubt und ionisiert werden.
  7. Messen Sie die Menge jedes Isotops, die vom Detektor gemessen und in Daten umgewandelt wird.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, Protein und mRNA im selben Assay nachzuweisen, hilft uns zu verstehen, wie sich die Zelle auf eine Ankunft vorbereitet, aber auch, welche Warteschlangen sie auf ihrem Weg und in Interaktion mit ihrer Umgebung erhält. Wie in den repräsentativen Daten zu sehen ist, sind mRNA- und Proteinnachweise kritische Komponenten in der räumlichen biologischen Forschung, da die unteren Nachweisgrenzen je nach Fortschritt der Markierungs-, Detektor- und/oder Bildgebungsschritte eine groß...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex-Multi-Omics ist eine entscheidende Weiterentwicklung der gesammelten Daten, die auf Interaktionen von Zelle zu Zelle und von Zelle zu Nachbarschaft abzielt, die sich auf das Fortschreiten und die Behandlung der Krankheit auswirken. Die Analyse dieser Daten in derselben Probe und damit in derselben Zelle ist von entscheidender Bedeutung, da viele Proteinziele vorübergehend exprimiert werden oder sich in mRNA und Proteinexpressionsniveau unterscheiden, so dass eine gezielte mRNA-...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jared K. Burks ist Berater bei Standard BioTools.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde in Zusammenarbeit mit der Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility durchgeführt, die teilweise von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant P30 von M. D. Anderson CA016672 unterstützt wird. Diese Forschung wurde auch teilweise durch den Support Grant Development Award des MD Anderson's Cancer Center, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters unterstützt. Die Bemühungen der JKB wurden teilweise durch das P30 CA016672 und den NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1 unterstützt. Die Bemühungen des SFB wurden teilweise von der Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 und 891490), der Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research, dem MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1 unterstützt. Die Bemühungen von SFB, JKB und BG wurden teilweise durch den Zuschuss 1U01CA294459-01 unterstützt. Die Autoren danken Samuel Mok, der die verwendeten Proben geschnitten und zur Verfügung gestellt hat.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.Protocols.IOdx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2Oligonukleotid-Polymer-Konjugation zur Bildgebung der Massenzytometrie V.2 
10x TBS RNAse-freiThermo Fisher Scientific J62780. K7Für intermittierende Waschen zwischen den Schritten
ACD HybEZ II HybridisierungssystemACD Biotechne321711Ofen für Backpapier-Folien
AntikörperverdünnerDakoS0809 Antikörper-Verdünnungspuffer
Antikörper: B7-H3BethylA700-025CF, A700-026CFKlon: BLR025F, BLR026F
Antikörper: B7-H4Thermo Fisher Scientific 14-5949-82Klon: H74
Antikörper: BRD4(6F11)BethylA700-005CFKlon: BL-151-6F11
Antikörper: CCR6R& DMAB195-100Klon: 53103
Antikörper: CD11bAbcam ab209970Klon: EPR1344
Antikörper: CD25Abcam ab215378Klon: EPR6452
Antikörper: CD278/ICOSCST 89601BFKlon: D1K2T
Antikörper: CD31Abcam ab207090Klon: EPR3094
Antikörper: CD33Abcam ab238784Klon: SP266
Antikörper: CD3e CST85061BFKlon: D7A6E
Antikörper: CD4Abcamab181724Klon: EPR6855
Antikörper: CD44Thermo Fisher Scientific MA1-10225Klon: IM7
Antikörper: CD45Thermo Fisher Scientific 14-9457-82Klon: CD45-2B11
Antikörper: CD8aCST 85336BFKlon: D8A8Y
Antikörper: CXCL13R& DAF801Klon: Polyklonal
Antikörper: CXCR5R& DMAB190-100Klon: CXCR5
Antikörper: Gamma-H2AXBethylA700-053CFKlon: BLR053F
Antikörper: Granzym BSanta CruzSC-8022 XKlon: 2C5
Antikörper: KAP1BethylA700-014CFKlon: BL-248-2G6
Antikörper: Ki67BethylA700-021CFKlon: BLR021E
Antikörper: LCK CST2984BFKlon: D88
Antikörper: MFAP5N/AN/APMID: 31332047 / Klon: 130A  (Hinweis: individuell entworfen) 
Antikörper: SMACST56856BFKlon: 1A4
Antikörper: VEGFSTB-Fluidigm3163028DKlon: G153-494
Antikörper: VISTACST64953BFKlon: D1L2G
AZ-AR1 Elegance Citra BioGeneXHK546-XAKAntigenrückgewinnungspuffer
Ethylalkohol 100 % (200 Proof)Pharmco111000200Für die Deparaffinisierung
EZ – Retriever IRBioGeneXMW016-IRAntigenentnahmesystem für FFPE-Gewebeschnitte
HybEZ II HybridisierungssystemACD Biotechne321710Das System besteht aus: HybEZ-Ofen (PN 321710/321720), einem Feuchtigkeitskontrollblech (PN 310012) und HybEZ-Befeuchtungspapier (2 Blätter PN 310025), EZ-Batch-Waschblech (PN 321717), EZ-Batch-Folienhalter (PN 321716)
ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Pen VectorLabsH-4000Hydrophober Barrierestift
IR-Interkalator-LösungThermo Fisher Scientific NC1038184Verwendet zur Identifizierung von nuklearen Zellen
KERATIN 18.8.CST 4546BFKlon: C51
MetalloligosVerschiedeneVerschiedeneMetallanhänger von T1 bis T12, je nachdem, welcher benötigt wird, reicht von T1 bis T12
Nukleasefreies Wasser (NFW)Corning 46-000-CM Um alle Geräte zu reinigen und vorzubereiten und bei Bedarf als Verdünner zu verwenden
RNAscope Protease Plus ACD Biotechne322331 Verwendet zur Permeabilisierung von Zellmembranen von Proben
RNAscope EZ-Batch SchlittenträgerhalterACD Biotechne310017Entwickelt, um bis zu 20 Objektträger manuell in Chargen effizient zu verarbeiten
RNAscope HiPlex12 Reagenzien Kit v2 ACD Biotechne324409Reagenzien für RNAScope
RNAscope HiPlex-Sonde – ZielsondenACD BiotechneVerschiedeneSie reichen von T1 bis T12, je nachdem, was benötigt wird.
RNaseZap RNase-DekontaminationslösungThermo Fisher ScientificAM9782Eine Oberflächendekontaminationslösung, die RNases zerstört
Färbegeister-Mikroskop-Objektträger-Korbhalter 24 Plätze chemisch resistenter KunststoffOptimal Wissenschaftlich3028Zum Färben mehrerer Objektträger
Tween 20Thermo Fisher Scientific AAJ20605APFür intermittierende Waschen zwischen den Schritten
Ultravision-ProteinblockThermo Fisher Scientific TA125PBQBlockpuffer

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  2. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  3. Parolini, M., et al. Microplastic contamination in snow from western Italian Alps. Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).
  4. Carstens, J. L., et al. Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer. Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).
  5. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).
  6. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  7. Schulz, D., et al. Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry. Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  10. Mok, S. C., et al. A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2. Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).
  11. Yeung, T. L., et al. Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).
  12. Ogura, H., et al. Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction. Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).
  13. Murakami, M., et al. Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells. J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).
  14. Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation. Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).
  16. Aspord, C., et al. Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).
  17. Votava, M., et al. The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy. BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).
  18. Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion. J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).
  19. Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis. J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).
  20. Kalia, V., et al. Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).
  21. Cancino-Díaz, J. C., et al. Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein. J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).
  22. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  23. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  24. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  25. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  26. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).
  27. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  28. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. In situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  29. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).
  30. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  31. Glasson, Y., et al. Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology. Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).

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