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MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

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DOI:

10.3791/68617

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7. Oktober 2025

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

Zusammenfassung

Bei der Verwendung herkömmlicher sondenbasierter In-situ-Hybridisierungs-Nachweismethoden (ISH) sind microRNAs (miRNAs) aufgrund ihrer Größe von 19 bis 25 Nukleotiden schwer zu erfassen. Da miRNAs jedoch wichtige epigenetische Regulatoren sind, die zu einer normalen Physiologie und zahlreichen pathologischen Zuständen beitragen, ist es wichtig, das raumzeitliche Verhalten von miRNAs zu verstehen, um ihre Funktion auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu entschlüsseln. Daraus ergibt sich ein klarer Bedarf an adäquaten Erkennungs- und Visualisierungstechniken. Aus diesem Grund haben wir die MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch Locked-nucleic-acid in situ HybridizatioN (MARLIN) entwickelt, die unter Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung und Locked-Nukleinsäure-Sonden (LNA), die auf eine miRNA abzielen, entwickelt und optimiert wurde. Diese Methode kann miRNA mit Multiplex-Proteinexpression quantifizieren, was die Quantifizierung von intrazellulärer und extrazellulärer miRNA innerhalb der Tumormikroumgebung (TME) mit hoher Sensitivität und Reproduzierbarkeit ermöglicht. Der kombinierte Einsatz von miRNA-Detektions- und Protein-Capture-Assays kann auch ein umfassendes Verständnis der zellulären Funktionen und Regulationsmechanismen innerhalb dieser TME liefern.

Einleitung

microRNAs
Obwohl microRNAs (miRNAs) mit einer Länge von 19 bis 25 Nukleotiden unglaublich klein sind, sind diese einzelsträngigen RNA-Moleküle starke Regulatoren bei der Genexpression und modulieren Boten-RNAs (mRNAs) posttranskriptionell durch sequenzspezifische Wechselwirkungen1. Im Wesentlichen wirken miRNAs als negative Regulatoren, indem sie an Ziel-mRNAs binden und je nach Grad der Komplementarität entweder deren Translation verhindern oder ihren Abbau durch mRNA-Spaltung fördern, was letztendlich zu einer verminderten Proteinproduktion aus dem Zielgen führt. Während miRNAs im Grunde nicht-kodierende RNA sind, befinden sich immer noch etwa 40% aller miRNAs in Introns oder Exons von proteinkodierenden Genen2. Der funktionelle Zweck von miRNAs umfasst mehrere wichtige biologische Prozesse wie Zellproliferation, Angiogenese, Apoptose usw. Insbesondere wurde die Dysregulation von miRNAs mit der Tumorgenese in Verbindung gebracht, da die aberrante Expression spezifischer miRNAs und die miRNA-vermittelte Genregulation mit der onkogenen Transformation bei mehreren Krebsarten in Verbindung gebracht wurde3.

Seit ihrer Entdeckung wurden miRNAs aufgrund ihrer gewebespezifischen Expressions- und Regulationsfunktionen bei verschiedenen Krankheiten ausgiebig erforscht, wobei ihre Dysregulation mit vielen Krankheiten verbunden ist, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und verschiedene Krebsarten 4,5,6. Die Expressionsmuster von miRNAs können mit Krebsart, -stadium und klinischen Variablen korreliert werden, was das miRNA-Profiling zu einem wertvollen Werkzeug für die Krebsdiagnose und -prognosemacht 4,5,6,7. Die Entdeckung neuer miRNAs wurde auch durch Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie beschleunigt, wodurch das Verständnis der Beteiligung von miRNA an verschiedenen biologischen Prozessen verbessertwurde 8. Die Bedeutung von miRNAs wurde durch den Nobelpreis für Medizin 2024 unterstrichen, der Victor Ambros und Gary Ruvkun für ihre Entdeckung der Funktion von miRNA bei der posttranskriptionellen Regulation verliehenwurde 9.

Als wertvolle Biomarker für die Diagnose und Prognose von Krankheiten wurde das therapeutische Potenzial von miRNAs erforscht, was zur Entwicklung von miRNA-zielgerichteten Medikamenten führte. Das therapeutische Potenzial von miRNAs in der Krebsbehandlung liegt in ihrer Fähigkeit, Genmodule koordiniert zu regulieren und so möglicherweise normale zelluläre Funktionen wiederherzustellen10. Bisher wurden miRNA-basierte Krebstherapien entweder als Monotherapie oder in Kombination mit bestehenden zielgerichteten Therapien entwickelt, um das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern und die Heilungsraten zu erhöhen11. Das dynamische Spektrum von miRNAs hat sie zu unverzichtbaren Ressourcen für innovative Krebsbehandlungsstrategien gemacht. Im Zusammenhang mit therapeutischer Resistenz hat sich das Targeting von miRNAs als vielversprechend erwiesen, um das Wiederauftreten und die Resistenz gegen traditionelle Krebsbehandlungen zu reduzieren, was das Überleben der Patienten möglicherweise verbessert, indem es auf Krebszellen abzielt12. Durch die Erforschung der Rolle von miRNAs bei der Modulation der Aktivitäten verschiedener Zelltypen in der Tumormikroumgebung (TME) können möglicherweise einzigartige und klinisch relevante Krebsbehandlungen entdeckt werden.

Verfügbare Assays zum Nachweis von miRNAs
Derzeit beruht die gebräuchlichste Methode zur miRNA-Messung auf extrahierter RNA für die quantitative Echtzeit-PCR (q-RT-PCR) oder Next Generation Sequencing (NGS), wobei der räumliche Kontext verloren geht. Es gibt Unternehmen, die TaqMan microRNA-Assays anbieten, die zielspezifische Stammschleifen-Primer für die cDNA-Synthese verwenden, und SYBR Green Farbstoff-basierte Chemikalien mit universeller cDNA-Synthese. Diese Assays bieten eine hohe Sensitivität und Spezifität und können auf einer Reihe von q-RT-PCR-Instrumenten durchgeführt werden. Leider können TaqMan-Assays keine absolute Quantifizierung liefern, was zu Problemen wie falsch positiven Ergebnissen und Variabilität der Ergebnisse führenkann 13. Trotz ihrer hohen Empfindlichkeit kann die Anwendung dieser Assays in verschiedenen Probentypen durch die Notwendigkeit einer umfangreichen Probenvorbereitung und mögliche Interferenzen durch andere Komponenten in der Probe eingeschränkt werden.

Next-Generation-Sequencing (NGS): miRNA-seq wird immer beliebter für die differentielle Expressionsanalyse über das gesamte miRNom von Bioflüssigkeiten. Ein Vorteil von NGS-Technologien wie miRNA-seq besteht darin, dass sie massive parallele Analysen der genomweiten Expression von miRNAs ermöglichen, was die Quantifizierung einzelner miRNAs, die Identifizierung von Sequenzvariationen und die Entdeckung neuer miRNAs ermöglicht14. Ein wesentlicher Nachteil von sequenzierungsbasierten Methoden, wie z. B. dem IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit, ist die Induktion quantitativer Verzerrungen, die die Genauigkeit von differentiellen Expressionsanalysen beeinträchtigen, was zum großen Teil auf die Homologie und die geringeren Leselängen der miRNAs zurückzuführenist 14. Darüber hinaus können das Vorhandensein von isomiRs (Varianten, die sich in Sequenz oder Länge von der kanonischen miRNA-Sequenz unterscheiden) und technischen Artefakten die Dateninterpretation erschweren, was möglicherweise zu Fehlerkennungen und Störfaktoren in Biomarker-Assays führenkann 14. Auch verschiedene Tools für die miRNA-seq-Datenanalyse, wie z. B. sRNAbench und miRDeep2, können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, was sich auf die Konsistenz und Zuverlässigkeit der Entdeckung neuartiger miRNA auswirkt15,16. Selbst so etwas wie die Microarray-Technologie kann in den meisten Fällen unzureichend sein. Obwohl sie eine leistungsstarke Hochdurchsatzplattform für den Nachweis von miRNA oder Genexpressionsniveaus bieten kann und somit für genomweite Studien geeignet ist, ist die Technologie immer noch durch die Anzahl der zuvor identifizierten miRNAs begrenzt und kann miRNA-Ziel-Interaktionen nicht direkt verifizieren, was ihren Nutzen in funktionellen Studien einschränkt17.

Der wichtigste Faktor, der hier beim Vergleich all dieser verfügbaren Optionen hervorgehoben werden kann, ist der fehlende räumliche Kontext. Sie liefern keinen Kontext in Bezug auf die Gewebemorphologie oder die räumlich-zeitliche Verteilung innerhalb der Zellen. Die Visualisierung des raumzeitlichen Verhaltens von miRNAs ist notwendig, um ihre Funktion auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu entschlüsseln. Derzeit sind miRNAscope in situ Hybridization (ISH)-Assays zugänglich, die in der Regel chromogene Nachweismethoden verwenden. Diese Assays ermöglichen zwar die Visualisierung von miRNA mit Einzelzellauflösung, aber die Ergebnisse sind von geringer Qualität, was es schwierig macht, zwischen der miRNA-Expression und dem Hintergrund der Probe zu unterscheiden. Im Allgemeinen produzieren viele von ihnen minderwertige Assays, die unzuverlässig sind und in der Regel eine manuelle Quantifizierung erfordern.

Aus diesem Grund haben wir die MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN (MARLIN) unter Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbung (durch Opal-Protein-Färbung) und gesperrten Nukleinsäuresonden (LNA) entwickelt, die auf eine miRNA abzielen, in formalin-fixierten paraffineingebetteten (FFPE) Geweben. Wir erreichten dies durch die Implementierung eines Tyramid-Signalamplifikationssystems (TSA), das durch einen Anti-Digoxigenin (DIG) Meerrettichperoxidase (HRP)-Konjugat-Antikörper aktiviert wird. Das HRP fungiert als Katalysator für die TSA, während das Anti-DIG an der LNA-Sonde befestigt wird. Dieser Assay ist von besonderem Nutzen, um die essentielle Natur von miRs bei der posttranskriptomischen Modifikation mit Proteinen und möglicherweise anderen RNAs gleichzeitig zu verstehen. Darüber hinaus bietet MARLIN aufgrund des Fehlens eines kommerziell verfügbaren Assays, der sowohl die miRNA- als auch die Proteinexpression quantifizieren kann, eine effektive Möglichkeit, die In-situ-Beziehungen von miRs und Proteinen in FFPE-Proben zu verstehen.

Die ersten Ergebnisse der Quantifizierung von miR-181c-3p mit MARLIN zeigten die Machbarkeit einer parallelen Analyse von miRNAs und Proteinen im nativen räumlichen Kontext von humanem ovarialem FFPE-Gewebe. Über dieses Beispiel hinaus ist es theoretisch möglich, basierend auf den Komponenten von MARLIN unter Verwendung kommerzieller Fluoreszenzmultiplex-Fluorophore wie Alexa Fluor oder anderer niedermolekularer Farbstoffe auf bis zu vier Proteine zu expandieren18.

Da diese Methode Variationen von Standard-Histologiemethoden verwendet, sollte sie bei geeigneter Sonden- und Antikörperauswahl mit anderen FFPE-Geweben von Säugetieren kompatibel sein. Diese Methodik bewahrt die räumliche Architektur und ermöglicht die Quantifizierung der zellulären und subzellulären miRNA- und Proteinkolokalisation. Dieser Ansatz adressiert eine kritische Lücke in der räumlichen Biologie, indem er die Co-Expressionsmuster und die räumliche Verteilung von miRNAs und Proteinen kartiert, die direkt in nativen Gewebearchitekturen kontextualisiert werden können. Hier stellen wir MARLIN mit einer detaillierten grafischen Übersicht in Abbildung 1 vor. Während das vorgestellte Protokoll für miR-181c-3p optimiert ist, können andere miR untersucht werden, sofern ein geeignetes Sondendesign vorhanden ist. Kritische Parameter für diese Methode sind unter anderem: die Beurteilung der Gewebequalität und die Optimierung der Sondenkonzentrationen. Es wird empfohlen, die RNA-Integrität des Gewebeblocks mit einer DV200-Metrik zu beurteilen, indem zwei 10-μm-Schnitte verwendet und die RNA mit einem Protokoll extrahiert wird, das alle RNA-Fragmentgrößen beibehält. Proben mit einem DV200-Score von mehr als 50 oder besser und die Konzentrationen des Protokolls müssen systematisch getestet werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll verwendet formalinfixiertes, paraffineingebettetes (FFPE) Gewebe von humanen Eierstocktumorgewebeschnitten von Patientinnen mit HGSC. Diese Proben wurden von zuvor unbehandelten Patientinnen entnommen, die sich einer primären zytoreduktiven Operation bei Eierstockkrebs unterzogen. Alle Proben und klinischen Daten wurden aus dem Eierstockkrebs-Repository der Abteilung für gynäkologische Onkologie und Reproduktionsmedizin im Rahmen von Protokollen gewonnen, die vom Institutional Review Board der University of Texas MD Anderson genehmigt wurden. Die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten wurde vom Personal an der Rezeption eingeholt, und die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt.

1. Vorbereitung des Gewebes

  1. Backen Sie alle FFPE-Proben über Nacht bei 60 °C und reinigen Sie jedes Gerät und jedes Werkzeug mit RNAse-freiem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte etwa 5 μm dick sind.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für Eierstocktumoren optimiert, kann aber nach weiteren Tests möglicherweise auch mit anderen Gewebetypen verwendet werden.
  2. Führen Sie eine Entparaffinisierung mit drei Runden Xylol für 5 Minuten pro Runde und 10 Runden Rehydrierung für 3 Minuten pro Runde durch (100 % Ethanol (EtOH) 2x, 95 % EtOH 2x, 70 % EtOH 2x, 50 % EtOH 2x, 30 % EtOH 2x). Mit 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) einmal 2 Minuten lang waschen.
    HINWEIS: Dieser Entparaffinierungsschritt wird zwar empfohlen, ist jedoch optional und abhängig vom Gewebetyp.
  3. Nach der Entparaffinisierung und Rehydrierung eine Lösung aus 3% Wasserstoffperoxid (H2O2) für 10 min auftragen. 2 min mit 1x ELS, 2x waschen. Tragen Sie dann eine Lösung aus 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten auf. 2 min mit 1x ELS, 2x waschen.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und sollte nur für Fettgewebe oder Proben in Betracht gezogen werden, die zur Ablösung neigen.
  4. Fahren Sie mit der ersten Runde der Antigen-Entnahme fort. Dieses Protokoll verwendet das EZ-Retriever IR System. Befolgen Sie die Anweisungen des Systems, während Sie die Proben 15 Minuten lang in frischen EZ-AR1-Puffer bei 95 °C getaucht haben. 20 Min. abkühlen lassen.
  5. 2 min mit 1x ELS waschen. Dann für 2 min mit 1x TBS-T (1x TBS mit 0,1% Tween), 2x.

2. Protein-Anwendung

  1. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine Barriere um jeden Gewebeabschnitt.
  2. 1x Antikörper-Blockierungslösung (ausreichend, um die gesamte Gewebefläche abzudecken) zugeben und 30 min bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer (Umgebungs- und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
  3. Anschließend wird der erste Primärantikörper mit der gleichen Blockierungslösung verdünnt, so viel aufgetragen, dass die gesamte Gewebefläche bedeckt ist, und 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert.
    HINWEIS: Während der Entwicklung dieses Protokolls wurde Anti-CD8 in einer Verdünnung von 1:75 verwendet.
  4. 2 min in 1x ELS-T, 3x waschen. Fügen Sie dann das Anti-Ms + Rb HRP hinzu und lassen Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer (Umgebungs- und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
  5. 2 min in 1x ELS-T, 3x waschen. Das erste Fluorophor mit dem Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100 verdünnen und 10 min bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde ein 690-nm-Emissionsfluorophor verwendet. Von diesem Zeitpunkt an wird empfohlen, für den Rest des Eingriffs nach dem Auftragen der ersten Runde Fluorophor nur minimale Beleuchtung zu verwenden.
  6. 2 min in 1x ELS-T, 3x waschen. Beginnen Sie die zweite Runde der Antikörperfärbung mit der zweiten Runde der Antigengewinnung in der Mikrowelle, indem Sie die Proben erneut 15 Minuten lang in frischen EZ-AR1-Puffer bei 95 °C tauchen und dann 20 Minuten lang abkühlen.
  7. 2 min mit 1x ELS waschen. Dann 2 min mit 1x ELS-T, 2x waschen.
  8. Tragen Sie die 1x Antikörper-Blockierungslösung erneut für 30 min in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur (Umgebungs- und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) auf.
  9. Den zweiten Primärantikörper mit der gleichen Blockierungslösung verdünnen, so viel auftragen, dass die gesamte Gewebefläche bedeckt ist, und über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer mindestens 16 Stunden inkubieren lassen.
    HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde Anti-EpCAM in einer Verdünnung von 1:200 verwendet.
  10. Beginnen Sie den nächsten Tag mit einer 2-minütigen Wäsche in 1x TBS-T, 3x. Geben Sie dann das Anti-Ms + Rb HRP hinzu und lassen Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer (Umgebungs- und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) inkubieren.
  11. 2 min in 1x ELS-T, 3x waschen. Das zweite Fluorophor mit dem Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100 verdünnen und 10 min bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer inkubieren.
    HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde ein 620-nm-Emissionsfluorophor verwendet.

3. Anwendung der Sonde

  1. 2 min in 1x ELS-T, 3x waschen.
  2. Starten Sie die dritte und letzte Antigen-Entnahme mit EZ-AR1 Elegance in der Mikrowelle bei 107 °C für 15 min. 20 Min. abkühlen lassen. 3 min in 1x ELS waschen.
  3. RNAscope Protease Plus (ausreichend, um den gesamten Gewebebereich abzudecken) auftragen und 30 min bei 40 °C halten. Benutze einen Ofen. 5 min in 1x ELS, 2x waschen.
  4. Führen Sie die Sondenvorbereitung durch Denaturierung bei 90 °C für 4 min der miRNA-LNA-Sonde durch. Verdünnen Sie die Sonde dann sofort mit miRNA-ISH-Puffer. Wirbeln und drehen Sie die Sondenlösung.
    HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurde die Zielsonde miR-181c-3p in einer Verdünnung von 1:250 verwendet.
  5. Setzen Sie die Sonde auf (ausreichend, um den gesamten Gewebebereich abzudecken) und stellen Sie sie für 1 h bei 60 °C in den Ofen. 5 min in 5x Kochsalz-Natriumcitrat (SSC)-Puffer waschen.
  6. Fünf strenge Waschgänge in SSC, vorgewärmt auf 60 °C, in der folgenden Reihenfolge und Verdünnungen für 5 Minuten pro Runde: eine Runde mit 5x SSC, zwei Runden mit 1x SSC und zwei Runden mit 0,2x SSC.
  7. 5 min in 0,2x SSC bei Raumtemperatur waschen. Mit Blockierungspuffer 30 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Verwenden Sie eine Kombination aus 1x TBS und 0,5% Blockierungsreagenzpulver, stellen Sie sicher, dass die Blockierungslösung vor dem Auftragen vortext und geschleudert wird.
  8. Tragen Sie ein Anti-Digoxigenin (Maus) HRP-Konjugat auf (für diese Proben wurde eine Verdünnung von 1:500 verwendet) und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
  9. 5 min waschen in 1x TBS-T, 3x Eine empfohlene Verdünnung von 1:50 des Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3 (TSA+Cy3) Fluorophor für 10 min in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur (Umgebungstemperatur und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) auftragen. Stellen Sie sicher, dass Sie die TSA+Cy3-Lösung vor dem Auftragen vortexen und drehen.
  10. 5 min in 1x ELS-T, 3x waschen.

4. Nukleare Färbung und Montage

  1. Tragen Sie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Arbeitslösung (ausreichend, um die gesamte Gewebefläche abzudecken) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer (Umgebungsfeuchtigkeit und unkontrollierte Luftfeuchtigkeit) auf.
    HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde eine Verdünnung von 1:1000 verwendet, wobei der DAPI-Arbeitsbestand in TBS verdünnt wurde.)
  2. 5 min in 1x ELS-T, 3x waschen. Wenn Sie fertig sind, kleben Sie Deckgläser mit Eindeckmitteln an und lassen Sie die Dias 10 Minuten trocknen. Lagern Sie Objektträger bei 4 °C im Dunkeln zwischen 24 und 72 Stunden vor der Bildgebung und bis zu drei Monate danach.

5. Bildgebung und Analyse

  1. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Objektträger-Rastermikroskop (bevorzugt) mit 40-facher Vergrößerung.
  2. Führen Sie eine anschließende quantitative Analyse durch, um Puncta unter Verwendung von DAPI und Protein-Gegenfärbung für die Zellsegmentierung und Phänotypisierung aufzuzählen.
    HINWEIS: Während dieses Protokolls wurde die Bildgebung mit einem Phenoimager HT verwendet. Vollständige Objektträgerscans wurden mit einer 40-fachen Vergrößerung unter Verwendung geeigneter Filter für die vorhandenen Fluorophore aufgenommen, und die Multiplexbilder wurden dann als OME-TIFF-Dateien exportiert. Die gescannten Bilder wurden dann zur quantitativen Analyse in die Visiopharm Bildanalysesoftware hochgeladen.

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Ergebnisse

Beim Testen dieses Protokolls ist es wichtig, zwei serielle Abschnitte derselben repräsentativen Probe zu haben, um Genauigkeit und Vergleich zu gewährleisten. In diesem Fall wurde eine Probe von hochgradigem Eierstockkrebs (HGSC) verwendet, um die Ergebnisse zu vergleichen. Es wurden ein Kontrollobjektträger (Abbildung 2A-B) verwendet, der nur die miRNA-Färbung durchläuft, und ein Testobjektträger, der sowoh...

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Diskussion

Obwohl die Bedeutung von miRNAs anerkannt und verstanden wird, werden Beobachtungen sowohl der normalen Entwicklung als auch der Krankheitszustände derzeit durch die Schwierigkeit behindert, miRNAs mit Standardmethoden zu untersuchen. Der Mangel an in situ Methoden führte zur Entwicklung von MARLIN (miRNA FISH Assay). Angesichts der Homologie und der kurzen Länge von miRNAs wird es zu einer Herausforderung, ihre Position und Wirkung auf die posttranskriptomische Regulation zu vi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten uns bei den folgenden Personen bedanken: Chi Lam Au Yeung und Manjunath Nimmakayalu, die während der Entwicklung des Assays Teil des Dissertationskomitees von Basant waren. Auch Samuel Mok, der die verwendeten Proben geschnitten und zur Verfügung gestellt hat. Abschließend danken wir Johan Doré und Dan Winkowski, die uns bei der Analyse und dem Einsatz der Visiopharm-Software umfassend unterstützt haben. Diese Forschung wurde teilweise von der Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 und 891490), der Sie Foundation und dem Stephanie C. Stelter Endowment Fund finanziert. Diese Forschung wurde in Zusammenarbeit mit der Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility durchgeführt, die teilweise von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant P30 CA016672 von M. D. Anderson und den NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1 von Jared Burks unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) pH 7,6 Thermo Fisher Scientific  J62662  K7Für intermittierende Waschen zwischen den Schritten
1x Opal-Antikörper-Verdünner/Block Akoya BiosciencesARD1001EAProteinblockierende Lösung
1x Plus AutomatisierungsverstärkungsverdünnerAkoya Biosciences FP1609Verwendet zur Verdünnung von Opalfluorophoren
20x Konzentrat  Kochsalz-Natriumcitrat (SSC) PufferSigma-AldrichS6639-1LFür miRNA-Waschungen nach der Probe-Hybridisierung
4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) Thermo Fisher Scientific/ InvitrogenEN62248 / 62248Für die nukleare Färbung
ACD HybEZ II HybridisierungssystemACD Biotechne321711Ofen zur Temperaturregulierung während des miRNAscope-Protokolls verwendet
Anti-CD8 (D8A8Y), Rabbit mAbZell-Signalisierungstechnologien85336SBeispiel für einen primären Antikörper, der zur Optimierung dieses Protokolls verwendet wird
Anti-Digoxigenin (Maus) HRP-KonjugatRevvity Health Sciences Inc.NEF832001EASekundäres Reagenz, das für den Nachweis von miRNA verwendet wird
Anti-EpCAM (E6V8Y), Rabbit mAbZell-Signalisierungstechnologien93790Beispiel für einen primären Antikörper, der zur Optimierung dieses Protokolls verwendet wird
Blockierendes ReagenzpulverAkoya Biosciences FP1012miRNA-Blockierungslösung
Ethylalkohol 100 % (200 Proof)Pharmco111000200Für die Deparaffinisierung
EZ-AR1-PufferBioGeneXHK521-XAKVerwendet zur Antigenentnahme von FFPE-Gewebeschnitten im Proteinschritt
EZ-AR1 Elegance-PufferBioGeneXHK546-XAKVerwendet für die Antigenentnahme von FFPE-Gewebeschnitten im miRNA-Probeschritt
EZ-Retriever IR-SystemBioGeneXMW015-IRMikrowelle zur Antigenentnahme von FFPE-Gewebeschnitten verwendet
Wasserstoffperoxidlösung 30% Sigma-Aldrich HX0640-5 Zur Gewebevorbereitung. Hilft, die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren und stark gefärbte Produkte zu erzeugen
miR-181c-3p miRNA-SondeQiagen339112Beispiel für eine miRNA-Sonde, die zur Optimierung dieses Protokolls verwendet wird
miRCURY LNA miRNA ISH Puffersatz (FFPE)Qiagen339450 Verwendet zur Verdünnung der miRNA-Sonde
Opal 620Akoya Biosciences FP1495001KTFluorophor zur Identifizierung des primären Antikörpers
Opal 690 Akoya Biosciences FP1497001KTFluorophor zur Identifizierung des primären Antikörpers
Opal Anti-Ms + Rb HRPAkoya BiosciencesARH1001EASekundärer Antikörper als Detektionsmittel verwendet
Pierce 16 % Formaldehyd (w/v), methanolfreiThermo Fisher Scientific28908Um 3,7 % PFA für die Gewebevorbereitung herzustellen
ProLong-Diamant-AntifadeThermo Fisher ScientificP36970Montagemedien
RNAscope Protease PlusACD Biotechne322331Zur Permeabilisierung von Gewebeschnitten  durch teilweise Proteinverdauung & Ziel-miRNA-Moleküle freizulegen
RNAse-freies Wasser Corning 46-000-CM Alle Geräte zu reinigen und vorzubereiten und bei Bedarf als Verdünner zu verwenden, nbsp;  
Tween 20Sigma-AldrichP1379-25MLUm TBS-T herzustellen
Tyramidsignalverstärkung plus Cyanin 3Akoya Biosciences NEL744001KTFluorophor zur Identifikation von miRNA
U6- und Scramble-miRNA-SondenQiagen339459Optionale Steuersonden
Xylenes histologischer GradThermo Fisher ScientificUN1307Für die Deparaffinisierung

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