Method Article

Sequentielle Detektion von Biomolekülen in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben mit massenspektrometrischer Bildgebung

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein massenspektrometrisches Bildgebungsprotokoll für den sequentiellen Nachweis von Metaboliten, N-verknüpften Glykanen und tryptischen Peptiden in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben vor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gewebe sind komplexe zelluläre Umgebungen, die aus einer Vielzahl von Zelltypen und Biomolekülen bestehen, die alle miteinander interagieren, um die Funktionen des Organs auszuführen. Traditionell beinhalteten Techniken zur Analyse von Biomolekülen wie Metaboliten, Glykanen und Proteinen die Homogenisierung von Gewebe, wodurch alle räumlichen Informationen zerstört wurden. Diese traditionellen Methoden erschwerten das vollständige Verständnis komplexer intra- und extrazellulärer molekularer Wechselwirkungen. Die Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) hingegen bewahrt nicht nur die räumlichen Informationen von Biomolekülen im Gewebe, sondern ermöglicht auch den Nachweis mehrerer Klassen von Analyten aus demselben Gewebeschnitt durch sequentielle Analyse mit einer Auflösung von nahezu einer einzelnen Zelle. Dies ermöglicht es uns, ein vollständigeres Bild der molekularen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Klassen von Biomolekülen abzuleiten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Schritte zur Durchführung der massenspektrometrischen Bildgebung von Metaboliten, N-verknüpften Glykanen und tryptischen Peptiden nacheinander aus demselben Gewebeschnitt mit einer Auflösung von 20 μm. Eine gewissenhafte Berücksichtigung der Reihenfolge, in der die Klassen von Analyten abgebildet werden, zusammen mit einer sorgfältigen Behandlung der Schnitte, um die Integrität zu gewährleisten, ermöglicht es, mehrere qualitativ hochwertige Bilder aus demselben Schnitt zu sammeln. Diese Daten können anschließend mit anderen räumlichen Omics-Daten (Transkriptomik, Immunhistochemie usw.) integriert werden, die aus seriellen Schnitten gesammelt wurden, wobei dieselbe Zelle in diesen angrenzenden Abschnitten analysiert werden kann.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist eine leistungsstarke Technik, die den Nachweis und die Visualisierung von Hunderten bis Tausenden von Biomolekülen aus dünnen Gewebeschnitten ermöglicht, ohne dass a priori die genauen Moleküle im Gewebe bekannt sein müssen, was sie zu einem hervorragenden Werkzeug für die Entdeckung von Biomarkernmacht 1. Während verschiedene Arten von MSI von verschiedenen Labors verwendet werden, darunter die Desorptions-Elektrospray-Ionisation (DESI)2,3, die Infrarot-Matrix-unterstützte Laser-Desorption-Elektrosprüh-Ionisation (IR-MALDESI)4 und die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS)5, bleibt die matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) die am häufigsten verwendete und vielseitigste. Die meisten Klassen von Biomolekülen können durch MSI nachgewiesen werden, indem die Probenvorbereitung angepasst wird, einschließlich des Waschens/Vorbehandelns des Gewebes, des enzymatischen Aufschlusses und der verwendeten Matrix/des verwendeten Lösungsmittels 6,7. MALDI MSI wird zum Nachweis von Metaboliten, Lipiden, Glykanen, Proteinen und proteolytischen Peptiden verwendet.

MSI-Studien wurden in einer Vielzahl von klinischen und präklinischen Studien verwendet, um unter anderem die Krankheitsmechanismen besser zu verstehen 8,9, die Einstufung und das Staging von Krebszu verbessern 10,11, das Behandlungsergebnisvorherzusagen 12, die Diagnosezu verbessern 13 und die molekularen Tumorränderzu bestimmen 14. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich auf den Nachweis nur einer einzigen Klasse von Analyten. Oft ist es jedoch von Interesse, mehr als eine Klasse von Biomolekülen aus derselben Probe zu analysieren. Traditionell wird dies mit seriellen Schnitten von Geweben durchgeführt. In jüngerer Zeit wurden jedoch Beispiele für die sequentielle Analyse mehrerer Analytklassen aus demselben Gewebeschnitt gezeigt. Zum Beispiel haben Yagnik et al. eine Lipidbildgebung von gefrorenem Gewebe demonstriert, gefolgt von MALDI-Immunhistochemie aus derselben Sektion für die Zelltypklassifizierung15. Clift et al. haben die sequentielle Anwendung von PNGaseF, Kollagenase und Trypsin in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten für die Bildgebung von N-verknüpften Glykanen, extrazellulären Matrixproteinen bzw. allgemeinen Proteinen gezeigt16. Escobar et al. demonstrierten die sequentielle Analyse von N-verknüpften Glykanen, O-GlcNAc und tryptischen Peptiden aus demselben Schnitt von gefrorenem Gewebe17. Diese Art von Experimenten wird durch eine sorgfältige experimentelle Planung durchgeführt, bei der zuerst die am leichtesten verlorenen Analyten analysiert werden, gefolgt von denen, die im Gewebe stabiler sind. In vielen Fällen tragen die Waschungen, die zur Entfernung unerwünschter Molekülklassen verwendet werden, dazu bei, andere Klassen von Molekülen6 zu verbessern, eine Eigenschaft, die ausgenutzt werden kann, wobei jede Wäsche, die die zuvor aufgetragene Matrix entfernt, auch dazu beiträgt, das Signal der nächsten Klasse von Analyten zu verstärken, die abgebildet werden sollen.

Kürzlich haben wir einen Workflow für die sequentielle Analyse von Metaboliten, N-verknüpften Glykanen und tryptischen Peptiden aus demselben Abschnitt von FFPE-Eierstockkrebsgewebe veröffentlicht18. Hier stellen wir den detaillierten Arbeitsablauf für die Analyse dieser drei Klassen von Biomolekülen aus demselben Gewebeschnitt vor; Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Unseres Wissens ist dies das erste Protokoll, das diesen Arbeitsablauf für die sequentielle Bildgebung von FFPE-Gewebe detailliert beschreibt. Kurz gesagt, die Gewebeschnitte werden mit Xylol entwachst, bevor sie mit einer 1,5-Diaminonaphthalin-Matrix (10 mg/ml in 50 % Acetonitril) beschichtet werden, um die Bildgebung von Metaboliten im negativen Ionenmodus zu ermöglichen. Die Matrix wird dann entfernt, die Abschnitte rehydriert und mit Antigenen zurückgewonnen, bevor sie mit PNGase F (0,1 μg/μl in Ammoniumbicarbonat) besprüht werden, um N-verknüpfte Glykane in situ freizusetzen. Nach der Inkubation werden die Schnitte mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) (10 mg/ml in einer Matrix von 70 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure) beschichtet und im Positiv-Ionen-Modus abgebildet. Anschließend wird die Matrix wieder entfernt, die Rehydratation und die Antigengewinnung wiederholt, und die Schnitte werden mit Trypsin (0,075 μg/μl in Ammoniumbicarbonat) besprüht und inkubiert, bevor sie erneut mit CHCA-Matrix (10 mg/ml in 70 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure) beschichtet und im Positiv-Ionen-Modus abgebildet werden. Alle Lösungen sollten unmittelbar vor der Verwendung frisch hergestellt werden, und wenn möglich, sollten die Experimente an 3 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Kommt es zu Verzögerungen, sollten die Abschnitte in einem -80 °C heißen Gefrierschrank unter Austrocknung gelagert werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendet formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebe von zuvor unbehandelten Patientinnen, die sich einer primären zytoreduktiven Operation bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom unterziehen. Alle klinischen Daten wurden aus dem Repositorium für Eierstockkrebs der Abteilung für gynäkologische Onkologie und Reproduktionsmedizin im Rahmen von Protokollen gewonnen, die vom Institutional Review Board der University of Texas MD Anderson genehmigt wurden. Die schriftliche Einverständniserklärung der Patienten wurde vom Personal an der Rezeption eingeholt, und die Studien wurden in Übereinstimmung mit anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt.

1. Probenvorbereitung für die Metabolitenbildgebung

HINWEIS: Dieses Protokoll geht davon aus, dass Schnitte von formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe (4 μm Dicke) bereits auf Glasobjektträger montiert wurden, da klinische Proben in der Regel von Histotechnikern innerhalb eines klinischen Pathologiekerns geschnitten werden müssen. Da die hier vorgestellte Arbeit auf dem referenzierten TOF-Instrument durchgeführt wird, verringert die orthogonale TOF-Messung den Bedarf an leitfähigen Objektträgern, die traditionell in MSI-Experimenten verwendet werden. Die Verwendung von Standard-Objektträgern ist auch förderlicher für die Standard-Arbeitsabläufe in klinischen Pathologielaboren und ermöglicht die Verwendung von Archivgewebe, das sich bereits auf Objektträgern befindet.

  1. Machen Sie mit einem Diamantstift Passermarken an den vier Ecken der Folie.
  2. Entparaffinieren Sie die Schnitte durch Eintauchen in histologisches Xylol für 3 min.
    HINWEIS: Xylol ist schädlich und sollte in einem chemischen Abzug verwendet werden.
  3. Die Abschnitte 3 Min. in frisches Xylol tauchen.
  4. Lassen Sie die Folie bei Raumtemperatur trocknen.
  5. Platzieren Sie die Folie in einem Folienadapterziel.
  6. Erfassen Sie ein optisches Bild des Objektträgers mit einem Flachbettscanner mit einer Auflösung von 4.800 dpi.
  7. Stellen Sie eine MALDI-Matrix her, indem Sie 15 mg 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) in 1,5 ml 50% ACN auflösen. Beschallen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, ~5 min. Filtern Sie die Matrixlösung, bevor Sie sie in die Probenschleife laden.
    HINWEIS: DAN steht im Verdacht, krebserregend zu sein und sollte mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden. Das Matrixsprühen sollte in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
  8. Besprühen Sie den Objektträger mit DAN-Lösung mit einem Roboter-Reagenziensprühgerät mit den folgenden Parametern: Bahngeschwindigkeit - 1.200 mm/s; Spurabstand - 3 mm; Temperatur der Düse - 60 °C; Düsenhöhe - 40 mm; Durchflussrate - 100 μL/min; Pässe - 4; N 2 Druck - 10 psi; Muster - CC
  9. Tragen Sie 0,5 μl roten Phosphor in Methanol suspendiert auf eine bekannte Stelle auf dem Objektträger auf.

2. Datenerfassung zur Metaboliten-Bildgebung

  1. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in einen Objektträgeradapter II und laden Sie sie in ein timsTOF fleX MALDI QTOF-Massenspektrometer.
  2. Laden Sie die entsprechende Methode für die Datenerfassung im negativen Ionenmodus in timsControl mit tims OFF. Wenn sich das Gerät nicht bereits im negativen Ionenmodus befand, warten Sie nach dem Polaritätswechsel für die Äquilibrierung mindestens 25 Minuten, bevor Sie kalibrieren und Daten mit den folgenden Geräteparametern für Metaboliten sammeln: m/z-Bereich - 50 - 600; Laserscan-Bereich - 16,0 μm sowohl in X als auch in Y; Resultierende Feldgröße - 20,0 μm sowohl in X als auch in Y; Laserschüsse - 150; Laser-Fluenz - ~30%; Trichter 1 RF - 150,0 Vpp; Trichter 2 RF - 200,0 Vpp; Mehrpolige HF - 200,0 Vpp; Kollisionsenergie - 10,0 eV; Kollision RF - 500,0 Vpp; Übertragungszeit - 55.0 μs; PrePulse-Speicher - 5,0 μs (Ergänzende Abbildung S1).
  3. Führen Sie ein Zielprofil (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt generieren ") und eine Fokusanpassung (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt anpassen ") auf der Registerkarte "Probenträger" durch. Passen Sie die Laserposition in X und Y bei Bedarf auf der Laserlasche an, um sicherzustellen, dass der Laser genau auf das Fadenkreuz ausgerichtet ist.
  4. Sammeln Sie ein Spektrum von rotem Phosphor, indem Sie mindestens fünf Sätze Laserschüsse von der Stelle auf dem Objektträger summieren.
  5. Führen Sie eine Kalibrierung durch, indem Sie auf der Registerkarte Kalibrierung auf die Schaltfläche Kalibrieren klicken. Entfernen Sie alle Peaks mit sehr geringer Intensität oder hohem ppm-Fehler.
    HINWEIS: Auch Phosphorcluster (P2 und P4) geben in der Regel ein sehr schwaches Signal. Die Kalibrierungspunktzahl sollte 100 % betragen, bevor Sie auf "Akzeptieren" klicken. Wenn nicht, löschen Sie das summierte Spektrum und erwerben Sie ein neues.
  6. Starten Sie die flexImaging-Software . Die GUI für die Bildaufnahme wird automatisch gestartet.
  7. Wählen Sie im Fenster Imaging-Ausführung auswählen die Option Neue Imaging-Ausführung auswählen aus.
  8. Wählen Sie im Fenster Workflow auswählen die Option Klassischer Workflow aus.
  9. Geben Sie im Fenster Datenspeicher einen Namen für die Imagingausführung und ein Ergebnisverzeichnis für die Daten an.
    HINWEIS: Leerzeichen sollten nicht in Dateinamen verwendet werden.
  10. Wählen Sie im Fenster Erfassungseinstellungen die Option Benutzerdefinierte Messbereiche aus, und geben Sie 20 in das Feld Rasterbreite ein. Klicken Sie auf Durchsuchen , um die zuvor erstellte timsControl-Methode auszuwählen.
  11. Klicken Sie im Fenster "Beispielbild " auf "Durchsuchen ", um das optische Bild auszuwählen, das mit dem Flachbettscanner aufgenommen wurde.
  12. Führen Sie im Fenster "Teach-Beispiel" eine Dreipunktausrichtung zwischen dem optischen Bild und dem Objektträger durch. Bewegen Sie dann den Probenträger auf das erste geätzte Passerzeichen auf dem Objektträger und richten Sie das Fadenkreuz in timsControl auf ein bestimmtes Merkmal in der Ätzung aus. Vergrößern Sie das Bild (100 % Zoom empfohlen), stellen Sie das Beispielbild auf Teach-Punkte festlegen und klicken Sie auf dieselbe Stelle im optischen Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch 2x für insgesamt drei Teach-Punkte. Klicken Sie auf Weiter , um die Schulung abzuschließen.
  13. Klicken Sie auf OK , um den Assistenten für neue Imagingausführungen zu beenden.
  14. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Teasens, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche Probenträger positionieren klicken. Vergrößern Sie die Ansicht und klicken Sie auf ein markantes Merkmal des vierten (unbenutzten) Passermarkenpunkts im Bild; Der Probenträger fährt innerhalb von timsControl an diese Position. Vergewissern Sie sich, dass das Fadenkreuz mit dem ausgewählten Feature ausgerichtet ist. Wenn sie nicht ausgerichtet sind, löschen Sie das Teachen in flexImaging und wiederholen Sie den Teach-Vorgang, um die Genauigkeit zu verbessern.
  15. Wählen Sie in der Software das Werkzeug "Polygon-Messbereich hinzufügen " aus und skizzieren Sie die Gewebe, die abgebildet werden sollen. Mit jedem Mausklick wird ein Ankerpunkt erstellt. Drücken Sie die Rücktaste auf der Tastatur, um Punkte nacheinander zu entfernen. Nachdem der Bereich gezeichnet ist, doppelklicken Sie mit der Maus, um das Polygon zu schließen.
  16. Überprüfen Sie das Signal, indem Sie den Laser auf einige Stellen im Gewebe abfeuern. Klicken Sie auf eine Stelle im Bild mit der Schaltfläche Probenträger positionieren , wie in Schritt 2.14, um die Lehre zu überprüfen. Das Spektrum wird von Matrix-Peaks um m/z 157 und 313 dominiert; Vergrößern Sie die m/z-Region unterhalb von 154 und 250-300, um viele kleinmolekulare Metaboliten- bzw. Fettsäurepeaks zu zeigen. Passen Sie die Laserfluenz nach Bedarf an, um ein optimales Signal zu erzielen.
  17. Speichern Sie die timsControl-Methode.
  18. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche AutoXecute Run starten klicken
    HINWEIS: Die Bildgebung im Negativ-Ionen-Modus mit DAN-Matrix führt zum Nachweis zahlreicher Metaboliten aus dem TCA-Zyklus, Aminosäuren und Fettsäuren, unter anderem.

3. Probenvorbereitung für die N-verknüpfte Glykan-Bildgebung

  1. Nachdem Sie die Probe aus dem Massenspektrometer entnommen haben, entfernen Sie die DAN-Matrix, indem Sie den Objektträger 1 Minute lang in 100 % Ethanol (200 Proof) tauchen.
  2. Rehydrieren Sie den Objektträger in Coplin-Gläsern: Frisches 100%iges Ethanol für 1 min; 95% Ethanol für 1 min; 70% Ethanol für 1 min; Wasser für 3 Minuten; Frisches Wasser für 3 Min.
  3. Lassen Sie die Folie ~15 min trocknen.
  4. Führen Sie eine Antigen-Entnahme durch, indem Sie den Objektträger in 100 mM Tris-Puffer (hergestellt durch Auflösen von 6,06 g Tris-Base in 500 mL Wasser und Einstellen des pH-Werts nach Bedarf) mit pH 9 in ein Coplin-Glas mit locker aufgesetztem Deckel tauchen und in eine Enttarnungskammer mit 500 mL Wasser in der Kammer stellen. 20 Min. auf 95 °C erhitzen.
  5. Nehmen Sie das Coplin-Glas aus der Enttarnungskammer und stellen Sie es zum Abkühlen für 20 Minuten auf die Arbeitsplatte.
  6. Tauschen Sie die Rutsche über fünf Mal gegen Wasser aus. Gießen Sie für die ersten drei die Hälfte der Lösung aus und ersetzen Sie sie durch Wasser. Gießen Sie für die letzten beiden die gesamte Lösung aus und ersetzen Sie sie durch Wasser.
  7. Lassen Sie die Folie vollständig trocknen.
  8. Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer für die Inkubation des Objektträgers nach der PNGaseF-Anwendung. Schneiden Sie einen Kreis mit einem saugfähigen Tuch aus, um den Boden einer Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm zu bedecken. Rollen Sie zwei Labortücher zu Kissen auf beiden Seiten der Petrischale (Abbildung 2). Fügen Sie 8 ml Wasser hinzu, um diese Tücher zu sättigen, und legen Sie den Deckel auf die Petrischale und stellen Sie sie für mindestens 30 Minuten zum Vorheizen bei 37 °C in den Ofen.
    HINWEIS: Das Innere der Schüssel sollte dampfend erscheinen.
  9. Bereiten Sie PNGaseF vor, indem Sie 100 μg lyophilisiertes Enzym in 200 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,8, rekonstituieren und zum Mischen vortexen. Übertragen Sie die Lösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie sie mit Wasser auf 1 mL.
  10. Besprühen Sie den Objektträger mit PNGaseF unter Verwendung des Reagenzienroboters mit den folgenden Parametern. Verwenden Sie die Spritzenpumpe für Anwendungen mit geringem Volumen und geringer Durchflussrate: Raupengeschwindigkeit - 1200 mm/s; Spurabstand - 3 mm; Temperatur der Düse - 45 °C; Düsenhöhe - 40 mm; Durchflussrate - 25 μL/min; Pässe - 15; N 2 Druck - 10 psi; Muster - CC
  11. Legen Sie den Objektträger mit dem Taschentuch nach oben in die vorgeheizte Petrischale, wobei je ein Ende auf einem der Labor-Wischkissen liegt. Setzen Sie den Schieber wieder auf und verschließen Sie die Petrischale mit selbstklebender Dichtungsfolie. In den 37 °C heißen Ofen stellen und ein auf 40 °C eingestelltes Reptilien-Heizkissen auf die Petrischale legen.
    HINWEIS: Dadurch bleibt der Deckel der wärmste Teil des Gerichts und es wird verhindert, dass sich Kondenswasser auf dem Deckel bildet und auf das Taschentuch tropft, was zu Artefakten auf den Bildern führt.
  12. Inkubieren Sie den Objektträger 2 Stunden lang, damit die Verdauung fortgesetzt werden kann.
  13. Den Objektträger aus der Petrischale nehmen und ~5 min trocknen lassen.
  14. Stellen Sie die MALDI-Matrix her, indem Sie 15 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in 1,5 ml 70 % ACN, 0,1 % TFA und 10 mM Ammoniumphosphat auflösen.
    HINWEIS: TFA ist ätzend und sollte in einer Haube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden.
  15. Beschallen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, ~5 min.
  16. Filtern Sie die Matrixlösung, bevor Sie sie in die Probenschleife laden.
  17. Besprühen Sie den Objektträger mit CHCA unter Verwendung des Roboter-Reagenziensprühers mit den folgenden Parametern: Bahngeschwindigkeit - 1.200 mm/s; Spurabstand - 3 mm; Temperatur der Düse - 75 °C; Düsenhöhe - 40 mm; Durchflussrate - 120 μL/min; Pässe - 3; N 2 Druck - 10 psi; Muster - HH
  18. Tragen Sie 0,5 μl roten Phosphor in Methanol suspendiert auf eine bekannte Stelle auf dem Objektträger auf.

4 . Datenerfassung zur N-verknüpften Glykan-Bildgebung

  1. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in das Slide Adapter-Target und laden Sie sie in das MALDI QTOF-Massenspektrometer.
  2. Laden Sie die entsprechende Methode für die Datenerfassung im positiven Ionenmodus in timsControl. Wenn sich das Gerät nicht bereits im positiven Ionenmodus befand, warten Sie nach dem Polaritätswechsel für die Äquilibrierung mindestens 25 Minuten, bevor Sie kalibrieren und Daten mit den folgenden Geräteparametern für Glykane sammeln: m/z-Bereich - 700-3500; Laserscan-Bereich - 16,0 μm sowohl in X als auch in Y; Resultierende Feldgröße - 20,0 μm sowohl in X als auch in Y; Laserschüsse - 200; Laser-Fluenz - ~25%; Trichter 1 RF - 450,0 Wps; Trichter 2 RF - 500,0 Vpp; Mehrpolig HF - 500,0 Vss; Kollisionsenergie - 10,0 eV; Kollision RF - 2.700,0 Vpp; Übertragungszeit - 140,0 μs; PrePulse-Speicher - 14,0 μs (Ergänzende Abbildung S2).
  3. Führen Sie ein Zielprofil (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt generieren ") und eine Fokusanpassung (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt anpassen ") auf der Registerkarte "Probenträger " durch. Passen Sie bei Bedarf die Laserposition in X und Y auf der Registerkarte "Laser" an, um sicherzustellen, dass der Laser mit dem Fadenkreuz ausgerichtet ist.
  4. Sammeln Sie ein Spektrum von rotem Phosphor, indem Sie mindestens fünf Sätze Laserschüsse von der Stelle auf dem Objektträger summieren.
  5. Führen Sie eine Kalibrierung durch, indem Sie auf der Registerkarte Kalibrierung auf die Schaltfläche Kalibrieren klicken. Entfernen Sie alle Peaks mit sehr geringer Intensität oder hohem ppm-Fehler.
    HINWEIS: Die Kalibrierungspunktzahl sollte 100 % betragen, bevor Sie auf Akzeptieren klicken. Wenn nicht, löschen Sie das summierte Spektrum und erwerben Sie ein neues.
  6. Öffnen Sie die .mis-Datei, die zuvor für die Metaboliten-Bildgebung in der Software verwendet wurde.
  7. Speichern Sie die Datei mit einem neuen Namen, der darauf hinweist, dass es sich um Glykandaten handelt.
  8. Unter Bearbeiten | Eigenschaften des Bildgebungslaufs, ändern Sie die Erfassungsmethode in die gewünschte Glykanmethode.
  9. Löschen Sie den vorherigen Unterricht mit Bearbeiten | Klare Teach-Punkte.
    HINWEIS: Die Rutsche befindet sich nicht in genau derselben Position, nachdem sie aus dem Schiebeadapter entnommen und wieder eingelegt wurde.
  10. Neuen Unterricht mit Bearbeiten | Festlegen von Teach-Punkten; Setzen Sie 3 Punkte , wie es im ursprünglichen Imaging Wizard (Schritt 2.12) gemacht wurde.
  11. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Teasens, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche Probenträger positionieren klicken. Vergrößern Sie die Ansicht und klicken Sie auf ein markantes Merkmal des vierten (unbenutzten) Passermarkenpunktes im Bild. Der Probenträger fährt innerhalb von timsControl an diese Position; Vergewissern Sie sich, dass das Fadenkreuz mit dem ausgewählten Feature ausgerichtet ist.
    HINWEIS: Wenn das Fadenkreuz nicht ausgerichtet ist, löschen Sie das Teachen und wiederholen Sie den Teach-Vorgang, um die Genauigkeit zu verbessern.
  12. Speichern Sie die Datei.
  13. Überprüfen Sie das Signal, indem Sie den Laser auf einige Stellen im Gewebe abfeuern. Klicken Sie auf eine Stelle im Bild mit der Schaltfläche Probenträger positionieren wie in Schritt 4.11, um die Lehre zu überprüfen. Vergewissern Sie sich, dass das Spektrum reichlich Glykanpeaks aufweist, wobei die dominanten Peaks typischerweise bei m/z 1.663 und 1.809 liegen. Passen Sie die Laserfluenz nach Bedarf an, um ein optimales Signal zu erzielen.
  14. Speichern Sie die timsControl-Methode.
  15. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche AutoXecute Run starten klicken.

5. Probenvorbereitung für die tryptische Peptidbildgebung

  1. Entfernen Sie die CHCA-Matrix, indem Sie den Objektträger für ~1 min in 100% Ethanol (200 Proof) tauchen
  2. Rehydrieren Sie den Objektträger in Coplin-Gläsern wie folgt: Frisches 100%iges Ethanol für 1 min; 95% Ethanol für 1 min; 70% Ethanol für 1 min; Wasser für 3 Minuten; Frisches Wasser für 3 Min.
  3. Lassen Sie die Folie ~15 min trocknen.
  4. Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie den Objektträger in 100 mM Tris-Puffer, pH 9, in ein Coplin-Glas mit locker aufgesetztem Deckel tauchen, das in eine Enttarnungskammer mit 500 mL Wasser in der Kammer gestellt wird. 20 Min. auf 95 °C erhitzen.
    HINWEIS: Diese zweite Antigengewinnung ist notwendig, um die Proteine zu denaturieren und einen effizienteren Zugang des Trypsins zu den Spaltstellen zu ermöglichen.
  5. Nehmen Sie das Coplin-Glas aus der Enttarnungskammer und stellen Sie es zum Abkühlen für 20 Minuten auf die Arbeitsplatte.
  6. Tauschen Sie die Rutsche über fünf Mal gegen Wasser aus. Gießen Sie für die ersten drei die Hälfte der Lösung aus und ersetzen Sie sie durch Wasser. Gießen Sie für die letzten beiden die gesamte Lösung aus und ersetzen Sie sie durch Wasser.
  7. Lassen Sie die Folie vollständig trocknen.
  8. Bereiten Sie Trypsin vor, indem Sie 100 μg lyophilisiertes Enzym in 200 μl 100 mM Essigsäure rekonstituieren und zum Mischen auf und ab pipettieren. Aliquotieren Sie in geeignete Größen für den Versuch (typischerweise 40 μl) und lagern Sie sie bei -20 °C.
  9. Bereiten Sie ein 40-μl-Aliquot von Trypsin vor, indem Sie 350 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,8 und 39 μl ACN hinzufügen. Gut mischen.
    HINWEIS: Acetonitril (10 % ACN) erhöht die Aktivität von Trypsin im Vergleich zu wässriger Lösung und verringert die Oberflächenspannung der Sprühlösung19.
  10. Besprühen Sie den Objektträger mit Trypsin unter Verwendung eines Roboter-Reagenziensprühers mit den folgenden Parametern. Verwenden Sie die Spritzenpumpe für Anwendungen mit geringem Volumen und geringer Durchflussrate: Spurgeschwindigkeit - 750 mm/s; Spurabstand - 3 mm; Temperatur der Düse - 30 °C; Düsenhöhe - 40 mm; Durchflussrate - 10 μL/min; Pässe - 12; N 2 Druck - 10 psi; Muster - HH
  11. Legen Sie ein Quadrat saugfähiges Tuch in den Boden einer Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm; Stellen Sie sicher, dass die Ecken nur den Rand der Schale berühren, und verteilen Sie 1 ml Wasser über das Tuch.
  12. Legen Sie den Objektträger mit dem Taschentuch nach oben auf das Tuch, legen Sie den Deckel auf die Petrischale und verschließen Sie die Petrischale.
  13. Der Objektträger wird 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, damit der Aufschluss fortgesetzt werden kann.
  14. Nehmen Sie den Objektträger aus der Petrischale und lassen Sie ihn ~5 Minuten trocknen.
  15. Stellen Sie die MALDI-Matrix her, indem Sie 15 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) in 1,5 ml 70% ACN, 0,1% TFA, 10 mM Ammoniumphosphat lösen.
  16. Beschallen, bis es sich vollständig aufgelöst hat, ~5 min.
  17. Filtern Sie die Matrixlösung, bevor Sie sie in die Probenschleife laden.
  18. Besprühen Sie den Objektträger mit CHCA mit einem Roboter-Reagenziensprühgerät mit den folgenden Parametern: Bahngeschwindigkeit - 1200 mm/s; Spurabstand - 3 mm; Temperatur der Düse - 75 °C; Düsenhöhe - 40 mm; Durchflussrate - 120 μL/min; Pässe - 4; N 2 Druck - 10 psi; Muster - HH
  19. Tragen Sie 0,5 μl roten Phosphor in Methanol suspendiert auf eine bekannte Stelle auf dem Objektträger auf.

6. Datenerfassung zur Bildgebung von tryptischen Peptiden

  1. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in einen Objektträgeradapter und laden Sie sie in ein timsTOF MALDI QTOF-Massenspektrometer.
  2. Laden Sie die entsprechende Methode für die Datenerfassung im positiven Ionenmodus in timsControl. Wenn sich das Gerät nicht bereits im positiven Ionenmodus befand, warten Sie nach dem Polaritätswechsel mindestens 25 Minuten für die Äquilibrierung, bevor Sie die Daten mit den folgenden Geräteparametern für Peptide kalibrieren: m/z-Bereich - 600-4500; Laserscan-Bereich - 16,0 μm sowohl in X als auch in Y; Resultierende Feldgröße - 20,0 μm sowohl in X als auch in Y; Laserschüsse - 200; Laser-Fluenz - ~25%; Trichter 1 RF - 450,0 Wps; Trichter 2 RF - 500,0 Vpp; Mehrpolige HF - 600,0 Vss; Kollisionsenergie - 10,0 eV; Kollision RF - 3400,0 Vpp; Übertragungszeit - 180,0 μs; PrePulse-Speicher - 18,0 μs (Ergänzende Abbildung S3).
  3. Führen Sie ein Zielprofil (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt generieren ") und eine Fokusanpassung (klicken Sie auf die Schaltfläche "Jetzt anpassen ") auf der Registerkarte "Probenträger" durch. Passen Sie bei Bedarf die Laserposition in X und Y auf der Laserlasche an, um sicherzustellen, dass der Laser mit dem Fadenkreuz ausgerichtet ist.
  4. Sammeln Sie ein Spektrum von rotem Phosphor, indem Sie mindestens fünf Sätze Laserschüsse von der Stelle auf dem Objektträger summieren.
  5. Führen Sie eine Kalibrierung durch, indem Sie auf der Registerkarte Kalibrierung auf die Schaltfläche Kalibrieren klicken. Entfernen Sie alle Peaks mit sehr geringer Intensität oder hohem ppm-Fehler. Vergewissern Sie sich, dass die Kalibrierungsbewertung 100 % beträgt, bevor Sie auf Akzeptieren klicken. Wenn nicht, löschen Sie das summierte Spektrum und erwerben Sie ein neues.
  6. Öffnen Sie die .mis-Datei, die zuvor für die Glykan-Bildgebung verwendet wurde.
  7. Speichern Sie die Datei unter einem neuen Namen, der darauf hinweist, dass es sich um Peptiddaten handelt.
  8. Unter Bearbeiten | Imaging Run Properties, ändern Sie die Erfassungsmethode in die gewünschte Peptidmethode.
  9. Löschen Sie den vorherigen Unterricht mit Bearbeiten | Klare Teach-Punkte.
    HINWEIS: Die Rutsche befindet sich nicht in genau derselben Position, nachdem sie aus dem Schiebeadapter entnommen und wieder eingelegt wurde.
  10. Neuen Unterricht mit Bearbeiten | Festlegen von Teach-Punkten; Setzen Sie drei Punkte, wie es im ursprünglichen Imaging-Assistenten (Schritt 2.12) der Fall war.
  11. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Teasens, indem Sie auf die Schaltfläche Probenträger positionieren klicken. Vergrößern Sie die Ansicht und klicken Sie auf ein markantes Merkmal des vierten (unbenutzten) Passermarkenpunktes im Bild. Der Probenträger fährt innerhalb von timsControl an diese Position; Vergewissern Sie sich, dass das Fadenkreuz mit dem ausgewählten Feature ausgerichtet ist.
    HINWEIS: Wenn das Fadenkreuz nicht ausgerichtet ist, löschen Sie das Teachen und wiederholen Sie den Teach-Vorgang, um die Genauigkeit zu verbessern.
  12. Speichern Sie die Datei.
  13. Überprüfen Sie das Signal, indem Sie den Laser auf einige Stellen im Gewebe abfeuern. Klicken Sie auf eine Stelle im Bild mit der Schaltfläche Probenträger positionieren wie in Schritt 6.11 zur Überprüfung des Unterrichts. Bestätigen Sie, dass das Spektrum reichlich Peptidpeaks aufweist, wobei dominante Peaks typischerweise bei m/z 944, 1,105 und 1,198 liegen. Passen Sie die Laserfluenz nach Bedarf an, um ein optimales Signal zu erzielen.
  14. Speichern Sie die timsControl-Methode.
  15. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche AutoXecute Run starten klicken.

7. Histologische Färbung

HINWEIS: Es gibt verschiedene Methoden für Hämatoxylin und Eosin. Hier wird eine modifizierte Carazzi-Methode vorgestellt, die in diesem Labor häufig verwendet wird.

  1. Entfernen Sie die CHCA-Matrix, indem Sie den Objektträger 1 Minute lang in 100 % Ethanol tauchen.
  2. Färben Sie die Folie wie folgt: 95% Ethanol für 30 s; 70% Ethanol für 30 s; Wasser für 30 s; Hämatoxylin für 2 Minuten; Wasser für 30 s; 70% Ethanol für 30 s; 95% Ethanol für 30 s; Eosin für 1 min; 95% Ethanol für 30 s; 100% Ethanol für 30 s; Xylol für 2,5 min; Deckglas mit Eindeckmedium.
  3. Lassen Sie den Objektträger >1 h trocknen und entfernen Sie eventuelle Blasen, indem Sie vorsichtig auf das Deckglas drücken.
  4. Digitalisieren Sie mit einem digitalen Diascanner.

8. Datenvisualisierung

HINWEIS: Es gibt umfangreiche Analysen, die mit SCiLS Lab durchgeführt werden können, die über den Rahmen dieses Protokolls hinausgehen. Hier beschreiben wir nur die grundlegende Dateierstellung, die Datenvisualisierung und die Suche von Peaks in Datenbanken zur vermeintlichen Identifizierung.

  1. Starten Sie SCiLS Lab 2025b und wählen Sie Neu.
  2. Wählen Sie die Datendatei(en) aus, die in die Software geladen werden sollen.
    HINWEIS: Mit SCiLS Lab Pro können mehrere Datendateien, die mit denselben Parametern erfasst wurden, zusammen geladen werden, um sie zueinander zu normalisieren und gleichzeitig zu visualisieren.
  3. Ordnen Sie die Beispiele im bevorzugten Layout an. Verschieben Sie die Samples, indem Sie mit der linken Maustaste klicken und ziehen. Drehen Sie die Samples, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und ziehen. Wählen Sie Weiter aus.
  4. Nehmen Sie im Fenster Einstellungen für die Massenachse die erforderlichen Anpassungen vor. Die Standardwerte eignen sich in der Regel gut für timsTOF-Daten. Klicken Sie auf Weiter.
  5. Legen Sie im Fenster Merkmalssuche die entsprechenden Werte für die automatische Spitzenauswahl während des Imports fest. Klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Dies funktioniert nicht gut für Metabolitendaten aus FFPE-Gewebe und sollte übersprungen werden.
  6. Die Importeinstellungen werden im Fenster Importzusammenfassung visualisiert. Klicken Sie auf Importieren.
  7. Geben Sie einen Dateinamen und einen Speicherort für die SCiLS-Datei an.
    HINWEIS: Je nach Größe der Datei kann der Import einige Minuten bis mehrere Stunden dauern.
  8. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, wird ein Zusammenfassungsfenster angezeigt. Klicken Sie auf Importiertes Dataset öffnen , um mit der SCiLS-Datei zu interagieren.
  9. Klicken Sie oben rechts in der Software auf das Dropdown-Menü neben Normalisierung und wählen Sie Root Mean Square aus.
    HINWEIS: Dies ist aufgrund der Seltenheit der importierten Schwerpunktdaten die am besten geeignete Methode für timsTOF-Daten und bietet die beste Visualisierung.
  10. Wählen Sie unter Datei | Dateieigenschaften: Legen Sie die Intervallbreite auf einen geeigneten Wert fest, in der Regel 10 - 15 ppm für timsTOF-Daten. Vergewissern Sie sich, dass der Wert angemessen ist, indem Sie bewerten, ob er die Breite eines Peaks im durchschnittlichen Spektrum umfasst.
  11. Vergrößern Sie das durchschnittliche Spektrum am unteren Rand der Software, entweder durch Klicken und Ziehen oder durch Vorwärtsdrehen des Mausrads.
  12. Wählen Sie einen zu visualisierenden Peak aus, indem Sie das Fadenkreuz an der Spitze positionieren und mit der linken Maustaste auf das Mausrad klicken.
  13. Fügen Sie der Liste der aktiven Ion Images interessante Ionen hinzu, indem Sie Strg + Leertaste drücken.
  14. Speichern Sie die kuratierte Feature-Liste, indem Sie auf die Schaltfläche Als Feature-Liste speichern am unteren Rand des Ionenbildfensters auf der rechten Seite der Software klicken.
  15. Öffnen Sie eine gespeicherte Feature-Liste, indem Sie auf Datei | Funktion Tabelle und Suche mit MetaboScape nach mutmaßlichen Metaboliten- oder Glykan-IDs, wenn MetaboScape im selben Netzwerk installiert und konfiguriert ist. Alternativ können Sie die SCiLS-Dateien in .imzML-Dateien konvertieren, um sie zur vermeintlichen Identifizierung in METASPACE (https://metaspace2020.org/) zu importieren.
    HINWEIS: Eine vollständige Beschreibung der Funktionen von SCiLS Lab finden Sie im Benutzerhandbuch unter dem Menüpunkt Hilfe .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fertigstellung dieses Protokolls sollte zu drei robusten MSI-Datensätzen aus demselben Gewebeabschnitt führen. Bei der Visualisierung des gesamten Spektrums der Metabolitendaten wird das Spektrum stark von Matrix-Peaks bei m/z 157 und 315 dominiert. Dies ist für FFPE-Gewebe normal. Viele Metaboliten- und Fettsäuresignale werden durch Heranzoomen in die m/z-Bereiche <155 und zwischen 250 und 300 beobachtet. Abbildung 3 zeigt Beispiele für das gesamte Spektrum und vergrößerte Bereiche, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Erfassung sequenzieller MSI-Daten aus einem einzigen Gewebeschnitt erfordert eine sorgfältige Detailgenauigkeit. Es gibt ein paar Schritte, die absolut entscheidend sind, um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Zunächst ist Vorsicht geboten, wenn mehr als ein Objektträger gleichzeitig erstellt wird. Achten Sie beim Einsetzen der Objektträger in oder beim Bewegen zwischen Coplin-Gläsern darauf, dass Sie nicht zwei Objektträger in die gleiche Position im Glas platzieren. Dies führ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS und die University of Texas at Austin Mass Spectrometry Imaging Facility werden durch einen Cancer Prevention and Research Institute of Texas Award (RP240559) unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise von der Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 und 891490), der Sie Foundation und dem Stephanie C. Stelter Endowment Fund finanziert. Diese Forschung wurde in Zusammenarbeit mit der Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility durchgeführt, die teilweise von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant P30 CA016672 von M. D. Anderson und den NCI's Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1 von Jared Burks unterstützt wird.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-DiaminonaphthalinFisher ScientificD010125GMALDI-Matrix für die Metaboliten-Bildgebung
AcetonitrilFisher ScientificNr. A955-4Lösungsmittel in LC-MS-Qualität, das für die Matrixvorbereitung verwendet wird
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäureSigma-AldrichArtikel-Nr.: 70990-1G-FMALDI-Matrix für die Glykan- und Peptidbildgebung
Ammonium-BikarbonatFisher ScientificNr. A643-500Puffer für Enzyme
AmmoniumphosphatSigma-AldrichArtikel-Nr.: 467782-50GAdditiv zur Reduzierung von Matrixclustern während der Bildgebung
Enttarnungskammer NxGenBiocare MedizinN/AWird zur Antigengewinnung von Gewebe verwendet
EthanolFisher Scientific04-355-223Lösungsmittel in LC-MS-Qualität, das für die Matrixvorbereitung und Färbung verwendet wird
M5 Roboter-ReagenziensprühgerätHTX-BildgebungN/AWird zum Auftragen von Enzymen und Matrices auf Gewebe verwendet
MethanolFisher ScientificNr. A456-4Lösungsmittel in LC-MS-Qualität zur Herstellung von roter Phosphorsuspension
Trypsin in MS-QualitätFisher ScientificPI90058Enzym für die Proteinverdauung
MTP Schiebeadapter IIBruker Daltonics8235380Adapter zum Einsetzen von Mikrscope-Objektträgern in das Massenspektrometer
NanoZoomer SQ Digitaler DiascannerHamamatsu CorpN/AWird zur Erstellung von digitalen Mikroskopiebildern von gefärbtem Gewebe verwendet
Perfection V600 FlachbettscannerEpson GmbHN/AWird zum Generieren eines optischen Bildes des Objektträgers für die MSI-Datenerfassung verwendet
Petri-SiegelFisher Scientific50-212-518Zum Verschließen der Petrischale während des enzymatischen Aufschlusses
PNGaseFBulldogge BiografieNZPP550LYEnzym zur Spaltung von N-verknüpften Glykanen aus Proteinen
Roter PhosphorSigma-Aldrich04004-250GMALDI-Kalibrant sowohl für den positiven als auch für den negativen Ionenmodus
SCiLS-Labor (2025b)Bruker DaltonicsN/ASoftware zur MSI-Datenvisualisierung
timsTOF fleX QTOF MassenspektrometerBruker DaltonicsN/AWird für die massenspektrometrische Datenerfassung verwendet
TrifluoressigsäureFisher Scientific85183Matrix-Additiv zur Senkung des pH-Werts für die Bildgebung im positiven Ionenmodus
Tris BasisFisher ScientificNr. BP152-500Puffer für die Antigengewinnung
WasserFisher ScientificW64Lösungsmittel in LC-MS-Qualität, das für Matrizen, Enzyme und Färbungen verwendet wird
WypAll X60Fisher Scientific19-413-113Saugfähiges Tuch für die befeuchtete Enzyminkubation
XylolFisher ScientificX3P-1GALLöschmittel zum Färben

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Dehoog, R. J., et al. Preoperative metabolic classification of thyroid nodules using mass spectrometry imaging of fine-needle aspiration biopsies. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21401-21408 (2019).
  3. Eberlin, L. S., et al. Pancreatic cancer surgical resection margins: Molecular assessment by mass spectrometry imaging. PLoS Med. 13 (8), e1002108(2016).
  4. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by UV-MALDI and IR-MALDESI mass spectrometry imaging coupled to FT-ICR-MS. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  5. Fletcher, J. S., Vickerman, J. C., Winograd, N. Label free biochemical 2D and 3D imaging using secondary ion mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 733-740 (2011).
  6. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  7. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  8. Ščupáková, K., et al. Spatial systems lipidomics reveals nonalcoholic fatty liver disease heterogeneity. Anal Chem. 90 (8), 5130-5138 (2018).
  9. Goncalves, J. P. L., et al. MALDI-MSI: A powerful approach to understand primary pancreatic ductal adenocarcinoma and metastases. Molecules. 27 (15), 4811(2022).
  10. Janssen, C., et al. Robust subtyping of non-small cell lung cancer whole sections through MALDI mass spectrometry imaging. Proteomics Clin Appl. 16 (4), e2100068(2022).
  11. Oezdemir, R. F., et al. Proteomic tissue profiling for the improvement of grading of noninvasive papillary urothelial neoplasia. Clin Biochem. 45 (1-2), 7-11 (2012).
  12. Bauer, J. A., et al. Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation. Clin Cancer Res. 16 (2), 681-690 (2010).
  13. Lazova, R., et al. Histopathology-guided mass spectrometry differentiates benign nevi from malignant melanoma. J Cutan Pathol. 47 (3), 226-240 (2020).
  14. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J Proteome Res. 9 (5), 2182-2190 (2010).
  15. Yagnik, G., Liu, Z., Rothschild, K. J., Lim, M. J. Highly multiplexed immunohistochemical MALDI-MS imaging of biomarkers in tissues. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 977-988 (2021).
  16. Clift, C. L., Drake, R. R., Mehta, A., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of the extracellular matrix using serial enzyme digests from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Anal Bioanal Chem. 413 (10), 2709-2719 (2021).
  17. Escobar, E. E., Seeley, E. H., Serrano-Negron, J. E., Vocadlo, D. J., Brodbelt, J. S. In situ imaging of O-linked beta-N-acetylglucosamine using on-tissue hydrolysis and MALDI mass spectrometry. Cancers (Basel). 15 (4), 1224(2023).
  18. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3d targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers. 16 (5), 846(2024).
  19. Wall, M. J., Crowell, A. M. J., Simms, G. A., Liu, F., Doucette, A. A. Implications of partial tryptic digestion in organic-aqueous solvent systems for bottom-up proteome analysis. Analytica Chimica Acta. 703 (2), 194-203 (2011).
  20. Goncalves, J. P. L., Bollwein, C., Schwamborn, K. Mass spectrometry imaging spatial tissue analysis toward personalized medicine. Life (Basel). 12 (7), 1037(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ImagingFormalin Fixed SamplesParaffin Embedded TissueSequential Biomolecule DetectionSpatial OmicsMetabolite ImagingGlycan ImagingTryptic Peptide ImagingTissue Section AnalysisMolecular Interactions

Related Articles