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Methodenartikel

Umfassendes räumliches Profiling von spezies-agnostischen Transkriptomen mittels Stereo-Seq

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DOI:

10.3791/68619

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31. Oktober 2025

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, mit dem ein umfassendes räumliches Transkriptom-Profiling von Wirts-, Virus-, Pilz- und Mikrobiom-RNA aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten mittels Stereo-seq durchgeführt werden kann, das eine hochauflösende Kartierung verschiedener Transkriptome unter Beibehaltung der Gewebearchitektur ermöglicht.

Zusammenfassung

Die räumliche Zusammensetzung der Zellen im Wirt sowie die Bakterien- oder Viruslast im Gewebe können das Zusammenspiel von Zelltypen und Analyten beeinflussen, die die Zelle durch zelltypspezifische Prozesse treiben. Stereo-Seq für FFPE-Gewebe verwendet zufälliges Priming für räumliche Barcodes, was sich von standardmäßigen räumlichen Transkriptomik-Methoden unterscheidet, die A'tailing verwenden, um Boten-RNA (mRNA) zu erfassen, oder sondenbasiert, um speziesspezifische Transkripte zu erfassen. Diese Methoden berücksichtigen nicht das aktuellere Wissen über die Auswirkungen und die Bedeutung anderer Arten von RNA aus langer nicht-kodierender RNA, mitochondrialer RNA, microRNA oder anderen Spezies, RNA, wie z. B. mikrobielle, virale und pilzliche. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren von der Gewebeschnittung über die Bibliotheksvorbereitung für die räumliche speziesunabhängige Stereo-Seq-Anwendung mit RNA-Nachweis unter Verwendung einer Randomer-Sondenmethode skizziert, die mit formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Geweben kompatibel ist. Diese Stereo-Seq-Methode weist eine zufällige Einfangperle von 0,22 μm Größe auf, die alle 0,5 μm in einem Array wiederkehrt, was eine subzelluläre Auflösung durch eine sequenzierungsbasierte Technologie ermöglicht. Da diese Methode sowohl Wirts- als auch Nicht-Wirts-RNA nachweist, erfordert das Protokoll spezifische Überlegungen, um zu bestimmen, was sich im Gewebe befindet und was sich während des Entnahme-, Konservierungs-, Schnitt- und Nachweisprozesses auf dem Gewebe abgelagert hat (d. h. Umwelt- und Handhabungskontaminanten). Schließlich ermöglicht dieses Protokoll eine hohe (einzelzellliche) Auflösung von Multi-RNA-Spezies in einem räumlichen Kontext und bietet einen Einblick in das Intra- und Interaktom von Zelltypen und pathologischen Spezies.

Einleitung

Spatial-Omics-Technologien haben die Untersuchung der zellulären Heterogenität von Geweben revolutioniert, indem sie die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Ziele, DNA (Genomik), RNA (Transkriptomik), Metaboliten (Metabolomik) oder Proteine (Proteomik)1, ermöglichen. Die Auflösung dieser verschiedenen Assays variiert oft, was zu unterschiedlichen Einschränkungen bei der Messung von Analyten führt, entweder mit erhöhter Seltenheit bei der Messung einzelner Zellen 2,3 oder des nativen räumlichen Kontexts4. Im Gegensatz dazu liefern Massenmethoden wie die RNA-Sequenzierung nur eine durchschnittliche Genexpression über ganze Proben und verschleiern die zelluläre Heterogenität2, oder die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)2,3, die eine Gewebedissoziation für die Einzelzellsequenzierung erfordert, erfordert oft eine Filterung. Daher schließen diese Methoden große Zellen und Aggregate aus, während bioinformatische Methoden versuchen, Fragmente und Dubletten zu entfernen, die alle Verzerrungen induzieren 5,6,7. Die räumliche Transkriptomik behält die Gewebearchitektur bei und bietet wichtige Einblicke in die zelluläre Organisation und Interaktionen. Die meisten der nicht-zielgerichteten räumlichen Sequenzierungsmethoden haben keine Einzelzellauflösung, so dass eine Dekonvolution von räumlichen Erfassungsbereichen mit 10 bis 100 Zellen erforderlichist 8,9,10. In den letzten zehn Jahren hat die räumliche Transkriptomik jedoch den Bedarf an diesen Methoden übertroffen, da es Fortschritte bei der Auflösung, bei größeren Erfassungsbereichen und bei der Integration von Multi-Omics-Ansätzen gegeben hat, entweder unter Verwendung experimenteller Strategien oder neuartiger Techniken 1,11,12.

Die Omics-Sequenzierung (Stereo-seq) bietet eine nanoskalige Auflösung (500 nm) und einen Erfassungsbereich im Zentimeterbereich, wobei die speziesunabhängige vollständige transkriptomische Erfassung die Erfassung von kodierender, nicht-kodierender und nicht-wirtsbezogener RNA ermöglicht13. Diese Methode hat derzeit die höchste Auflösung für die räumliche Transkriptomik und bietet Optionen, um die größten Sichtfelder bereitzustellen. Diese Methode weist jedoch einige bemerkenswerte Einschränkungen auf, darunter einen Zeit- und Arbeitsaufwand von etwa 15 Stunden Hands-on-Zeit, die sich über 4 Tage erstreckt, um die sequenzierungsbereiten Bibliotheken zu vervollständigen. Im Vergleich dazu erfordern andere sequenzierungsbasierte räumliche Transkriptomik-Technologien, wie z. B. sondenbasierte räumliche Transkriptomik, polyA-Capture-Array-basierte räumliche Transkriptomik, Slide-seq und deterministisches Barcoding in tissue for spatial omics sequencing (DBiT-seq), in der Regel 5 bis 8 Stunden Hands-on-Zeit über 2 bis 3 Tage (Tabelle 1). Für viele Forscher überwiegen diese Fortschritte die technischen Herausforderungen und sind ideal für die Erstellung vollständiger Transkriptomik-Raumatlanten zur Untersuchung des Krankheitsverlaufs auf zellulärer und subzellulärer Ebene, insbesondere wenn sie mit anderen Technologien überlagert werden1.

Das Stereo-seq-Protokoll bietet Möglichkeiten, die über die traditionelle mRNA-Transkriptomik hinausgehen, die auf Poly-T-Sonden zur Erfassung polyadenylierter mRNA-Transkripte beruht. Diese Verfahren können modifiziert werden, indem Polyadenylierung zu frischem Gewebe14 oder speziesspezifische Sonden für vordefinierte Zielgensätze15 für die räumliche Expressionsanalyse hinzugefügt werden. Stattdessen verwendet Stereo-seq zufällige Nukleotidsonden, um verschiedene RNAs unabhängig von der Spezies auszuwählen, einschließlich mikrobieller RNAs, Pilz-RNAs, viraler RNAs und nicht-polyadenylierter RNAs wie Enhancer-RNAs, zirkulärer RNAs und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs)16. Theoretisch ist es möglich, kleinere RNAs oder reparative Elemente wie kleine interferierende RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs) und Transposons zu erfassen17. Derzeit sind die Bioinformatik und die Kartierung dieser RNA jedoch nach wie vor eine Herausforderung und werden oft während des initialen Alignments herausgefiltert, bei dem typischerweise ein Cutoff von 30 bp verwendet wird.

Im Folgenden finden Sie ein detailliertes Protokoll mit unseren Modifikationen für die zufällige Nukleotiderfassung auf DNA-Nanoballs (DNB)-Chips des Herstellers, um ein besseres Verständnis und eine bessere Handhabung eines in Abbildung 1 dargestellten Stereo-seq-Protokolls zu gewährleisten. Dieses Protokoll enthält Strategien für Molekularbiologen zum Testen neuer FFPE-Gewebe auf Stereo-seq mit zufälliger Nukleotiderfassung, um konsistentere, höhere Ausbeuten aus archivierten Proben und Fettgeweben von geringerer Qualität zu erzielen. Das skizzierte Protokoll ist für FFPE-Proben aus den meisten Organen optimiert, unabhängig von der Herkunft der Art. Dieses Protokoll enthält jedoch nicht die aktuellen Modifikationen, die für den Umgang mit schwierigen Geweben wie Knochenmark erforderlich sind, die eine Entkalkung erfordern.

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Protokoll

In diesem Methodenpapier werden keine klinischen Daten für die nicht behandlungsnaive, hochgradige Patientin des serösen Ovarialkarzinoms bereitgestellt. Die damit verbundenen klinischen Daten wurden jedoch nach Protokollen gesammelt, die vom Institutional Review Board (IRB) des MD Anderson Cancer Center der University of Texas, Abteilung für gynäkologische Onkologie und Reproduktionsmedizin, von Teilnehmern genehmigt wurden, die eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben hatten.

HINWEIS: Es wird empfohlen, während des gesamten Protokolls eine chirurgische Maske und Handschuhe zu tragen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden. Forschern mit langen Haaren wird empfohlen, diese nach hinten zu ziehen oder sogar ein Haarnetz zu tragen. Verwenden Sie immer steriles nukleasefreies Wasser (NFW) und nukleasefreie, niedrig bindende DNA/RNA-Röhrchen, um die Ausbeute zu maximieren. Nicht-Säugetiergewebe, wie z. B. Pflanzengewebe, erfordern möglicherweise eine Adhärenzoptimierung, die Poly-L-Lysin (PLL) und verlängerte Permeabilisierungszeiten aufgrund der Zellwände umfasst. Während die molekulare Erfassung theoretisch machbar bleibt, ist eine experimentelle Validierung erforderlich, da Pflanzengewebe in unserem derzeitigen Arbeitsablauf noch nicht getestet wird.

1. Bewerten Sie die RNA-Qualität und den Verteilungswert der RNA-Fragmente 200 Punkte

  1. Beurteilen Sie die RNA-Qualität mit dem RNA-Fragmentverteilungswert 200 (DV200), der den Prozentsatz der RNA misst, der größer als 200 bp ist.
  2. Verwenden Sie zwei 10-μm-Schnitte aus demselben Gewebeblock, die für die Stereo-Seq-Verarbeitung vorgesehen sind.
    HINWEIS: Die sofortige Verarbeitung ist optimal, aber die Proben können bis zu 1 Woche bei 4 °C, 4 Wochen lang bei -20 °C oder 6 Monate lang bei -80 °C gelagert werden.
  3. Extrahieren Sie RNA unter Verwendung eines nicht-größenselektiven RNA-Extraktionsprotokolls, wie von Patel et al.18 beschrieben, um eine genaue Bewertung der Verteilung der RNA-Fragmentgrößen zu ermöglichen.
  4. Bewerten Sie die RNA-Qualität mit einer der folgenden Methoden, indem Sie einen Fragmentanalysator verwenden, um den DV200-Score zu bestimmen, d. h. den Prozentsatz der Fläche unter der Kurve, der RNA-Fragmente darstellt, die länger als 200 bp sind. Idealerweise sollte das Gewebe einen DV200-Score (> 50%) und eine Konzentration (> 10 ng/μl) aufweisen.

2. Reinigung des Arbeitsbereichs

  1. Reinigen Sie alle Oberflächen mit 30% Bleichmittel. Lassen Sie die Oberflächen mindestens 30 Minuten trocknen, um die Bildung von Chloroform durch die Kombination von Bleiche und Ethanol zu verhindern.
  2. Wischen Sie Oberflächen mit DNA-Dekontaminationstüchern (DDW) ab. Sprühen Sie alle Oberflächen mit RNase-Dekontaminationslösung (RDS) und dann 70 % Ethanol ein, das mit NFW hergestellt wurde.
    HINWEIS: Mischen Sie niemals Bleichmittel oder anderen Alkohol. Diese Kombination erzeugte Chloroform, das hochgiftig ist und selbst bei geringer Exposition zu Bewusstlosigkeit, Organschäden oder zum Tod führen kann.

3. Vorbereitung des Stereo-Seq-Random-Oligonukleotid-Capture-Chips (N-Chip)

  1. Bereinigen Sie den Arbeitsbereich wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben, einschließlich aller in diesem Schritt verwendeten Systeme.
  2. Nehmen Sie den Stereo-seq N-Chip aus der Verpackung, notieren Sie die Chip-ID und reinigen Sie die Kanten des Stereo-seq N-Chips und des Glasobjektträgers mit 100 % Ethanol, ohne den Chip zu berühren. Vollständig an der Luft trocknen lassen.
  3. Harzauftrag, um den Chip auf dem Objektträger zu befestigen (optional für Benutzer, die Xylole verwenden).
    HINWEIS: Obwohl Nicht-Xylol-Klärmittel häufig von kommerziellen Anbietern empfohlen werden, wurde beobachtet, dass Nicht-Xylol-Klärmittel je nach Paraffinmischung weniger wirksam sein können. Sie sind oft nicht verträglich mit bestimmten Kunststoffen, Kunstharzen oder in Bienenwachs eingebetteten Geweben und reinigen stark vernetzte oder hochschmelzende Paraffine nicht effizient. Wenn Sie sich nicht sicher sind, welche Paraffinzusammensetzung für die Einbettung der Probe verwendet wird, wird empfohlen, Xylole für eine optimale Reinigung zu verwenden. Darüber hinaus sind Xylole besser in der Lage, Fettgewebe wie Brust-, Eierstock-, Ei- oder Hirngewebe zu reinigen.
    1. Schütteln oder mischen Sie das Harz gut, um sicherzustellen, dass es homogen weiß ist. Tragen Sie mit einer Mikropipette vorsichtig 10 μl UV-härtendes Keramikharz um den Rand des Stereo-seq N-Chips auf (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Harz kann Haut- und Augenreizungen verursachen und bei wiederholter Exposition zu allergischen Hautreaktionen führen. Tragen Sie beim Pipettieren oder Hantieren mit diesem Harz immer Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich und tragen Sie eine Maske, wenn Sie große Mengen verwenden oder wenn Sie eine Heizlösung verwenden, und vermeiden Sie den direkten Kontakt mit Haut oder Augen.
    2. Verwenden Sie einen versiegelten Schaumstofftupfer, entfernen Sie überschüssiges Harz und lassen Sie nur eine dünne Linie um die Chipkante herum. Legen Sie den Objektträger in das UV-Härtungsgerät und achten Sie darauf, dass die Chipoberfläche nicht berührt wird.
    3. Legen Sie den mit dem Harz aufgetragenen Chip auf eine undurchsichtige Maske auf der 405 nm UV-Lichtquelle, um die Rückseite des Objektträgers zu beleuchten, und härten Sie ihn 5 Minuten lang aus. Dies ist in Abbildung 2B dargestellt.
      HINWEIS: Belichten Sie den Stereo-seq N-Chip nicht zu stark mit UV-Licht und berühren Sie kein Harz auf der Chipoberfläche, da dies schädliche Auswirkungen auf die Nanokugeln haben kann.
    4. Verwenden Sie nach dem Aushärten versiegelte Schaumtupfer, die in jedem der folgenden Inhaltsstoffe getränkt sind: 100 % Ethanol in molekularer Qualität; 70 % Ethanol; und schließlich NFW, um die Kante zu reinigen, an der das Harz platziert wurde. Wenn sich weiße Flecken lösen, reinigen Sie den Rand erneut. Berühren Sie niemals die Chipoberfläche (Abbildung 2C).
    5. Lassen Sie die Folie vollständig an der Luft trocknen. Nach der Inspektion die Chips über Nacht bei 4 °C mit einem Trockenmittel lagern, falls erforderlich. Es wird jedoch empfohlen, mit der Spanvorbereitung und dem Schneiden nach Möglichkeit sofort fortzufahren.
      HINWEIS: Tragen Sie bei der Arbeit mit UV-Licht immer geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich einer UV-Schutzbrille. Behandeln Sie Ethanol und Harz in einem gut belüfteten Bereich, vorzugsweise in einem Abzug. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien.
  4. Chipvorbereitung mit Poly-L-Lysin (Optional für Fettgewebe oder Gewebe mit Adhärenzproblemen.)
    1. Bereinigen Sie den Arbeitsbereich wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben, einschließlich aller in diesem Schritt verwendeten Systeme.
      HINWEIS: Sprühen Sie keine Chemikalien direkt in das PCR-Gerät. Arbeiten Sie bei allen Prä-PCR-Schritten nach Möglichkeit in einer PCR-Haube, um eine Kontamination zu verhindern, einschließlich einer vorherigen Amplifikation der cDNA.
    2. Tauchen Sie den Chip dreimal mit einem konischen 50-ml-Röhrchen in frisches NFW.
    3. Trocknen Sie den Span mit Druckluft mit der vollen Druckluftkraft in einem Winkel von ca. 60° bis 80° diagonal (45°) über die Oberfläche des Späns aus einem Abstand von etwa 5 cm von der Oberfläche des Span (Abbildung 2E). Wenn die Oberfläche trüb erscheint, wiederholen Sie die Wäsche mit frischem NFW und trocknen Sie erneut (die Wolkenoberfläche bedeutet normalerweise, dass die Keramik in den vorherigen Schritten nicht ausreichend abgewaschen oder ausgehärtet wurde).
    4. Tragen Sie 150 μl PLL-Lösung auf, um die gesamte Chipoberfläche zu bedecken. 10 min bei Raumtemperatur (22 °C bis 25 °C) inkubieren. Dies ist in Abbildung 2D dargestellt.
    5. Entfernen Sie die PLL-Lösung und waschen Sie den Chip zweimal mit nukleasefreiem Wasser für 10-15 s.
    6. Trocknen Sie die Ränder des Objektträgers nach dem zweiten Waschen vorsichtig ab (ohne den Chip zu berühren).
    7. Trocknen Sie den Span fest mit Druckluft und nutzen Sie die volle Druckluftkraft in einem Winkel von ca. 60° bis 45°, indem Sie diagonal über die Oberfläche des Späns aus einem Abstand von etwa 5 cm von der Oberfläche des Späns verlaufen (Abbildung 2E).
      HINWEIS: Der Span muss innerhalb von 30 s oder weniger vollständig trocken sein. Dauert es länger, wird die DNB gestört, was zu Artefakten bei der Erfassung führt.
    8. Fahren Sie innerhalb von 1 h mit der Montage fort und halten Sie den Chip trocken.
      HINWEIS: Wenn die Chipoberfläche nach dem Trocknen trüb erscheint, waschen Sie sie mit frischem NFW und wiederholen Sie den Trocknungsvorgang. Wenn sich nach dem Trocknen Artefakte auf der Oberfläche des Chips befinden, kann dies in diesen Bereichen zu Erfassungsproblemen führen. Vermeiden Sie die Verwendung von PLL zum Kleben, wenn das Gewebe dies nicht erfordert. Das Berühren des Chips kann zu Kratzern und zum Verlust von Erfassungsbereichen vor der cDNA-Freisetzung oder zu einer ungleichmäßigen Erfassung nach der Freisetzung führen. Harz auf der Chipoberfläche führt zu fleckigen Verlusten von Erfassungsbereichen. Wenn der Chip zu nahe an der Druckluftdüse platziert wird, können Kristalle und ein Sprühnebel beschädigter DBN-Markierungen auf der Chipoberfläche entstehen. Dies ist jedoch selten und tritt in der Regel nur auf, wenn die Düse den Chip fast berührt und die Druckluftflasche zu kalt ist. Es empfiehlt sich, dieses Vorgehen mehrmals mit Assessment-Chips zu üben, da dieser Schritt technisch anspruchsvoll ist.

4. Gewebeschnitt und -befestigung

  1. Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich sauber ist, wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass neue Klingen und NFW für alle Wasserbäder und Eis während des Gewebeschnitts und der Gewebemontage verwendet werden. Berühren Sie den Chip nicht direkt und bedecken Sie den Chip nur zu 80 % mit Taschentuch.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Dicke von 5 μm für Standardgewebe oder 4 μm für fettreiches Gewebe zu verwenden. Verwenden Sie ggf. ein Band mit seriellen Abschnitten, um die Modalitäten über die Proben hinweg abzugleichen.
  2. Trocknen Sie Objektträger bei 42 °C für 3 Stunden entweder im Ofen oder auf einer PCR-Maschine bei geöffnetem Deckel. Dann die Objektträger übertragen oder die Temperatur im Ofen oder PCR-Gerät auf 37 °C ändern und über Nacht 12-48 h backen. Es wird empfohlen, ca. 18 h zu verwenden.
  3. Optionaler Haltepunkt: Nach dem Trocknen die Objektträger in Aluminiumbeuteln mit Trockenmittel bei 4 °C bis zu 1 Woche verschließen, bevor Sie fortfahren.
    HINWEIS: Längere Trocknungszeiten können die RNA-Integrität verringern. Eine zu kurze Trocknung führt zu einer geringeren Gewebehaftung am Objektträger. Das Backen bei einer höheren Temperatur kann die RNA-Integrität verringern. Objektträger können zur externen Verarbeitung (z. B. Host-Analyse) versendet werden. Für die Mikrobiomanalyse wird der Versand jedoch nicht empfohlen, da die potenzielle Kontamination während des Transports erhöht ist.

5. Objektträger entparaffinieren

  1. Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich sauber ist, wie in den Schritten 2.1 und 2.2 beschrieben.
  2. Bereiten Sie Reagenzien für die Entparaffinisierung und das Stereo-Seq-Protokoll vor.
    1. Aliquotieren Sie die erforderlichen Reagenzien: Zwei 30 mL Xylole in konischen 50 mL Röhrchen, zwei 30 mL 100% Ethanol in 50 mL konischen Röhrchen.
    2. Bereiten Sie die folgenden verdünnten Reagenzien mit NFW vor: 96 % Ethanol pro Chip (2 konisch oder 1 ml erforderlich), 90 % Ethanol pro Chip, 80 % Ethanol pro Chip, 70 % Ethanol pro Chip, 50 % Ethanol pro Chip, 30 % Ethanol pro Chip, 2,5 ml 5x Kochsalz-Natriumcitrat (SSC) aus einer 20-fachen Lösung, 5 ml 0,01 N HCl (0,1 N HCl mit NFW auf pH 2 verdünnen). Für Ethanolverdünnungen bereiten Sie entweder eine 30-ml-Lösung in konischen 50-ml-Röhrchen oder eine 500-μl-Lösung in einem 1,5-ml-Röhrchen vor, wenn Silikondichtungen verwendet werden.
    3. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor und bewahren Sie sie auf Eis auf: i) 32,5 mL 0,1x SSC aus einer 5x Lösung (bewahren Sie 30 mL der Lösung in einem konischen Röhrchen auf und geben Sie die anderen 2,5 mL in ein 5 mL Röhrchen für die zukünftige Verwendung), ii) 400 μL 0,1x SSC mit 5% RI, auf Eis aufbewahren.
    4. Bereiten Sie die folgenden verdünnten Reagenzien mit 0,1 N HCl vor.
      1. Bereiten Sie eine 10-fache Permeabilisierungsreagenzlösung (PR) her, indem Sie 1 ml 0,1 N HCl zu dem kommerziell erhältlichen lyophilisierten Reagenz hinzufügen.
        HINWEIS: Nur 1 h auf Eis lagern, für die zukünftige Verwendung aliquotieren und bei -20 °C einfrieren.
      2. 500 μl 1x PR-Lösung herstellen (eine 10x PR-Lösung aliquot mit 0,01 N HCl verdünnen, bis zu 6 h auf Eis halten).
        HINWEIS: Es ist wichtig, dass der pH-Wert von 0,01 N HCl innerhalb von 10 % von pH 2,0 liegt, da Pepsin-basierte Enzyme bei pH 2 optimal funktionieren.
  3. Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie die Objektträger in Xylolen (empfohlen) für 2 Runden à 20 Minuten einweichen.
  4. Rehydrieren Sie die Probe sofort mit Ethanol (100 %, 96 % für 2 Runden à 5 Minuten, gefolgt von 90 %, 70 %, 50 % und 30 % für 1 Runde, 2 Minuten). Zum Schluss rehydrieren Sie 1 Minute lang mit NFW. Verwenden Sie für Ethanolverdünnungen 30 ml Lösung in einem konischen 50-ml-Röhrchen für jeden Objektträger, wenn Sie Proben für Mikrobiomstudien vorbereiten, oder verwenden Sie 30 ml für jeweils zwei Objektträger, wenn Sie Nicht-Mikrobiom-Proben vorbereiten. Für alle nachfolgenden Verdünnungen 30 ml Lösung in einem konischen 50-ml-Röhrchen vorbereiten oder, wenn Silikondichtungen verwendet werden, 500 μl Lösung pro 1 cm2 Chip verwenden, um den Chipbereich vollständig abzudecken.
    OPTIONAL: Es wird empfohlen, eine Silikonkammer aus einem 3-Kammer-Entnahmeschieber um den Chip zu platzieren, um nach dem 100%igen Ethanolschritt eine Versiegelung zu schaffen, wie in Abbildung 2F-H dargestellt. Dies ermöglicht die Verwendung kleinerer Reagenzienmengen und verringert das Risiko, den Chip zu beschädigen. Alternativ können konische 50-ml-Röhrchen verwendet werden, um den Stereo-Seq-Objektträger während des gesamten Eingriffs vollständig einzutauchen.

6. (Optional) Nukleare Bildgebung und ssDNA-Färbung

ANMERKUNG: Lassen Sie das FFPE-Entkopplungsreagenz vor der Verwendung in 6.1 Raumtemperatur (~25 °C) erreichen. Andere Färbelösungen sind möglich, aber die Fluoreszenzkernfärbung ist derzeit für die Einzelzellsegmentierung und das Cell-Binning von Transkriptomdaten erforderlich.

  1. Fluoreszenzfärbung mit einzelsträngigem DNA-Farbstoff (ssDNA)
    1. Bereiten Sie 2 μl ssDNA-Färbelösung in SSC-Puffer vor, indem Sie das Qubit ssDNA-Reagenz mit 5x SSC-Puffer in einer Verdünnung von 1:1 pro 1 bis 2 Chips verdünnen.
      HINWEIS: Die ssDNA-Verdünnung kann sich je nach dem bei der Bildgebung verwendeten Mikroskop ändern.  Daher sollten neue Mikroskope mit einem ssDNA-Farbstoffverdünnungsset getestet werden, das unter Verwendung eines Bewertungschips und eines Testgewebes eingestellt wird, um den besten Dynamikbereich zu bestimmen.
    2. Erstellen Sie einen Mastermix der Färbelösung (200 μl pro Chip) mit einer 1:20-Verdünnung des RNase-Inhibitors (RI), einer 1:200-Verdünnung der ssDNA-Verdünnung und dem restlichen 5x SSC.
    3. Färbelösung (150 μl pro Chip) hinzufügen und 5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Färbelösung vorsichtig mit einer Pipette aus der Ecke des Chips.
      HINWEIS: Wenn Sie die abnehmbare Silikonkammer verwenden, entfernen Sie sie, bevor Sie den Chip mit einer ssDNA-Farbstoffmischung färben.
    4. Waschen Sie den Chip zweimal mit 0,1x SSC (jeweils 150 μL pro Chip) für 10-15 s. Trocknen Sie die Ränder des Objektträgers nach dem zweiten Waschen vorsichtig mit Linsenpapier ab (ohne den Chip zu berühren).
    5. Fügen Sie ~3-5 μl Glycerin hinzu (verwenden Sie weniger für ein inverses Mikroskop), um den Kleeschlitten zu montieren (achten Sie auf Blasen).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das richtige Volumen an Glycerin auf den Objektträgerbereich aufgetragen wird, typischerweise etwa 4 μl für einen 1 cm2 Chip. Die Verwendung von zu viel Glycerin kann dazu führen, dass sich das Deckglas verschiebt, wenn der Objektträger vertikal gehalten wird. Die Verwendung von zu wenig Glycerin erhöht das Risiko von Gewebeschäden beim Entfernen des Deckglases und kann Blasen bilden, die sich negativ auf die Bildgebung und die Segmentierungsergebnisse einzelner Zellen auswirken können.
    6. Lassen Sie das Deckglas aus ca. 1 cm Höhe auf den Chip fallen. Wenn Sie ein eingreifendes Mikroskop verwenden, achten Sie darauf, dass das Deckglas nicht abrutscht, wenn es senkrecht gehalten wird. Wenn dies der Fall ist, wird es ohne Zugabe von mehr Glycerin wieder montiert.
    7. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder von ssDNA-gefärbtem Gewebe mit einem Weitfeldmikroskop mit einer Überlappung von 10 % zwischen den Bildkacheln.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine manuelle Fokuskarte von 9-13 Punkten mit einem Weitfeldmikroskop unter Verwendung eines 10-fach-Objektivs durchzuführen. Ein konfokales Mikroskop kann verwendet werden, aber es reagiert viel empfindlicher auf Fokusveränderungen im gesamten Gewebe und Chip.
    8. Fügen Sie in Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ zusammen, indem Sie die theoretische Überlappung nutzen, um die ungefähre Positionierung jeder Kachel zu generieren, und führen Sie anschließend eine pixelgleiche Rechenüberlappung durch, um die Bildkachelung fein abzustimmen.
    9. Verarbeiten Sie Bilder in der StereoMap-Software und stellen Sie sicher, dass die Bild-QC erfolgreich ist, bevor Sie fortfahren.
    10. Tauchen Sie den Stereo-Seq-Objektträger in 30 mL 0,1x SSC ein, bis sich der Deckglas löst.

7. Entkopplungsprozess

HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Chip während dieses Schritts zu berühren oder zu kippen, und pipettieren Sie vorsichtig.

  1. Stellen Sie sicher, dass das FFPE-Entkopplungsreagenz eine warme Raumtemperatur (~25 °C) hat, und überprüfen Sie, ob keine Partikel vorhanden sind, die die Lösung trüb machen. Wenn Partikel sichtbar sind, vor Gebrauch auf 55 °C erhitzen und auf 30 °C abkühlen.
  2. Schalten Sie den Thermocycler mit den folgenden Einstellungen ein: 30 °C für die Äquilibrierung (ein beheizter Deckel von 85 °C); 95 °C für eine 30-minütige Inkubation; 4 °C unendliche Haltezeit.
  3. Montieren Sie die Kassettendichtung und setzen Sie dann den Stereo-seq-Chipschieber in die Kassette ein.
  4. Geben Sie das FFPE-Entkopplungsreagenz (400 μl pro Chip) in die Vertiefung der Kassette, die den Chip enthält. Bringen Sie Dichtungsband auf die Kassette an und vergewissern Sie sich, dass sie fest verschlossen ist.
  5. Starten Sie die 30-minütige Inkubation bei 95 °C ab Schritt 7.2. Sobald 10 Minuten vergangen sind, geben Sie 10 ml Methanol in einen 15-ml-Behälter (ca. 1 ml pro Objektträger wird benötigt) in einen -20 °C-Gefrierschrank.
  6. Entfernen Sie vorsichtig den Chip vom Thermocycler, legen Sie die Kassette auf die Werkbank und ziehen Sie das Dichtungsband ab.
  7. Entfernen und entsorgen Sie das FFPE-Entkopplungsreagenz mit einer Pipette. Nachdem alle Entnetzungsreagenzien entfernt wurden, lösen Sie die Kassette und die Dichtung und entsorgen Sie sie.
  8. Äquilibrieren Sie den Stereo-Seq-Objektträger auf Raumtemperatur ~23 °C. Trocknen Sie den Rand des Objektträgers unter einem sterilen Abzug ab und tragen Sie eine neue Silikonkammer auf (falls zutreffend). Fügen Sie 500 μl gekühltes Methanol aus dem -20 °C Gefrierschrank hinzu und stellen Sie sicher, dass der gesamte Abschnitt 20 Minuten lang vollständig untergetaucht ist.
    HINWEIS: Alternativ kann der gesamte Stereo-seq-Objektträger in ein konisches 50-ml-Röhrchen getaucht werden, das mit 30 mL gekühltem Methanol gefüllt ist.
  9. Die 1x PR-Lösung auf einem 37 °C trockenen Block vor Gebrauch 10 min vorwärmen, ca. 5 min vor Ende der Methanolfixierung (Schritt 7.8).
  10. Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, bringen Sie den Objektträger in einen sterilen Abzug. Wischen Sie überschüssiges Methanol auf dem Objektträger ab und warten Sie, bis das restliche Methanol auf dem Chip verdampft ist (~5 min). Montieren Sie eine neue Kassette und Dichtung. Sobald das Methanol vollständig verdampft ist, setzen Sie den Stereo-seq-Chipschieber in die Kassette ein.

8. Permeabilisierung und reverse Transkription

HINWEIS: Pipettieren Sie in den Schritten 8.1 bis 8.11 langsam und berühren Sie den Chip nicht. Übermäßiger Druck führt zu Diffusion oder Markierungen in den DNBs.

  1. Geben Sie 200 μl Permeabilisierungsreagenz in den Chip. Bringen Sie Dichtungsband auf die Stereo-seq-Diakassette an und stellen Sie sicher, dass sie dicht verschlossen ist.
  2. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
  3. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 380 μl 0,1x SSC und 20 μl RI (RNA-Inhibitor) für jeden Objektträger hinzufügen. Stellen Sie 400 μl pro Objektträger her und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf.
  4. Ziehen Sie die Reagenzien für die reverse Transkription (FFPE RT) heraus, schleudern Sie dann alle folgenden Elemente herunter und halten Sie die Enzymmischung, die Oligos und die Dimere auf Eis. Erwärmen Sie den FFPE RT-Puffer auf Raumtemperatur (~23 °C).
  5. 5 min vor dem Ende der Permeabilisierung 200 μl pro Chip FFPE RT Mix vorbereiten. Fügen Sie FFPE RT-Puffer (158 μL), FFPE RT-Enzymmix (30 μL), FFPE RT-Oligo (10 μl) und FFPE-Dimer (2 μl) hinzu. Mischen Sie dies vorsichtig und halten Sie es auf Eis.
  6. Lassen Sie den Chip auf dem Thermocycler und ändern Sie die Inkubationstemperatur auf Raumtemperatur (~23 °C). Entfernen Sie die Versiegelung und entsorgen Sie vorsichtig die 1x PR-Lösung.
  7. Waschen Sie den Chip sehr schonend mit 200 μL 0,1x SSC (mit 5% RI) pro 1 cm2 Chip.
  8. Entfernen Sie 0,1x SSC (mit 5% RI) Wash aus der Ecke des Chips.
  9. Geben Sie 200 μl FFPE-RT-Lösung in die Ecke des Chips.
  10. Bringen Sie Dichtungsband auf die Stereo-seq-Schiebekassette an und stellen Sie sicher, dass sie dicht verschlossen ist. Andernfalls verringert die Verdunstung die Ausbeute.
  11. Starten Sie das Protokoll FFPE RT Inkubation isotherme Reaktion bei 42 °C mit 45 °C beheiztem Deckel für (5 bis 24 h).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 12 bis 16 Stunden zu inkubieren und über alle Experimente hinweg konsistent zu sein.

9. cDNA-Freisetzung und -Reinigung

HINWEIS: Pipettieren Sie in den Schritten 9.6-9.7 langsam und berühren Sie den Chip nicht. Übermäßiger Druck führt zu Diffusion oder Markierungen in den DNBs.

  1. Bereiten Sie 400 μl cDNA-Freisetzungspuffer vor, indem Sie den cDNA-Freisetzungspuffer auf 55 °C erwärmen, um eventuell gebildeten Niederschlag aufzulösen.
  2. Äquilibrieren Sie den cDNA-Freisetzungspuffer auf eine warme Raumtemperatur (25 °C). Nicht auf Eis legen.
  3. Schleudern Sie den cDNA-Freisetzungspuffer und das cDNA-Freisetzungsenzym bei 100 x g in einer Tischzentrifuge herunter, bevor Sie es verwenden.
  4. Bereiten Sie den cDNA-Puffer vor, indem Sie 20 μl Freisetzungsenzym zu 380 μl cDNA-Freisetzungspuffer hinzufügen.
  5. Lassen Sie den Chip auf dem Thermocycler und ändern Sie die Inkubationstemperatur auf Raumtemperatur (~23 °C). Entfernen Sie die Versiegelung und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig die FFPE RT-Lösung.
  6. Waschen Sie den Chip einmal, unglaublich schonend, mit 0,1x SSC pro Chip (200 μL).
  7. Entfernen Sie 0,1x SSC aus der Ecke des Chips, indem Sie sehr vorsichtig pipettieren.
  8. Geben Sie 400 μl der vorbereiteten cDNA-Freisetzungslösung in jeden Chip.
  9. Versiegeln Sie die Stereo-seqs-Slide-Kassette, indem Sie Dichtungsband (oder PCR-Abdeckung) auf die Kassette aufbringen. Stellen Sie sicher, dass die Kassette dicht verschlossen ist, um Verdunstung, Auslaufen oder Kontamination zu verhindern.
  10. Bei 55 °C ≥ 5 h (mindestens 5 h bis 24 h) mit auf 60 °C erhitztem Deckel inkubieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 5 bis 7 Stunden zu inkubieren oder bei Experimenten mit 2 Stunden konsistent zu sein.

10. Sammeln Sie die cDNA-Freisetzungsmischung

  1. NFW auf 37 °C vorheizen (mindestens 500 μL pro Chip von 1 cm2).
  2. Entfernen Sie die Dichtung und pipettieren Sie kräftig in jede Ecke und Mitte des Chips über dem Gewebe, aber kratzen oder berühren Sie das Gewebe nicht. Sammeln Sie die gesamte cDNA-Freisetzungsmischung vom Chip und geben Sie sie in ein 1,5- oder 2,0-ml-Zentrifugenröhrchen. Notieren Sie die Chip-Identifikationsnummern (Chip-ID) auf jedem Röhrchen.
  3. Geben Sie 350 μl vorgewärmtes NFW direkt auf die Chipoberfläche. Pipettieren Sie erneut kräftig mit einer kleineren Pipette (P100 oder P200) und kippen Sie die Spitze, um mehr Scherkraft auszuüben, aber berühren Sie nicht das Gewebe und kratzen Sie den Chip nicht.
  4. Kombinieren Sie die Wäsche aus Schritt 10.3 (350 μl) mit dem cDNA Release Mix aus Schritt 10.2 (400 μl). Achten Sie darauf, nur die Proben von einem einzigen Chip zu kombinieren.
  5. Geben Sie 100 μl NFW auf den Chip, verschließen Sie den Stereo-seq-Chipschieber in der Kassette und bewahren Sie ihn bis zum Ende des Protokolls im Kühlschrank auf.
    HINWEIS: Bei geringer Ausbeute ist eine erneute Freisetzung der cDNA in Betracht zu ziehen. Das Vorhandensein von DNA auf dem Chip kann mit einem ssDNA-Farbstoff und einer erneuten Bildgebung mit oder ohne Deckglas beurteilt werden.

11. Sammeln Sie die Reinigung der cDNA-Kügelchen

  1. Resuspendieren Sie die cDNA aus Schritt 10.4 mit einem gleichen Volumen an Festphasen-Reversiblen Immobilisierungskügelchen (SPRI). Mischen, bis die Kügelchen gleichmäßig in der Lösung verteilt sind, um DNA-Fragmente über ~100 bp auszuwählen.
  2. 10 Minuten bei einer Temperatur von 27 °C bis 37 °C (30 °C empfohlen) inkubieren.
    1. Während der Inkubation. Bereiten Sie 5 ml 80% frisches Ethanol in NFW für jeweils 2 verarbeitete Chips vor.
  3. Nehmen Sie die Röhrchen mit der inkubierten Kügelchenmischung und schleudern Sie sie kurz bei 100 x g auf einer Tischzentrifuge.
  4. Legen Sie die Röhrchen auf ein magnetisches Trenngestell und inkubieren Sie sie mindestens 5 Minuten lang (bis die Flüssigkeit klar wird).
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Kügelchen zu beschädigen, und bewahren Sie ihn in einer sauberen, beschrifteten Tube auf. Markieren Sie die cDNA-Freisetzung mit Chip-ID und Datum.
  6. Geben Sie 1,5 ml 80%iges Ethanol in die Röhrchen, ohne die Kügelchen zu stören, und inkubieren Sie 30 s lang, bevor Sie das Ethanol entfernen.
  7. Wiederholen Sie Schritt 11.6 noch ein weiteres Mal, wobei Sie dieses Mal so viel Ethanol wie möglich mit einer kleinen Pipettenspitze entfernen, ohne die Kügelchen zu stören.
  8. Trocknen Sie die Kügelchen in den Tuben an der Luft, bis sie nicht mehr reflektieren. Die Zeit kann variieren, also regelmäßig überprüfen, um ein Austrocknen (Risse) zu vermeiden, das zu einer geringen Ausbeute führt.
    HINWEIS: Messen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur des Raumes. Bei hohen Temperaturen (27 °C) und niedriger Luftfeuchtigkeit (weniger als 20 %) trocknen die Kügelchen sehr schnell (3 bis 5 Minuten). Bei niedrigen Temperaturen (23 °C) und hoher Luftfeuchtigkeit (mehr als 40 %) trocknen die Kügelchen viel langsamer (7 bis 15 Minuten).
  9. Nehmen Sie die Bead-Röhrchen aus dem Magnetgestell, fügen Sie 22 μl NFW hinzu und mischen Sie durch Vortexen.
  10. Inkubieren Sie in einem Trockenbad oder einer PCR-Maschine bei 27 °C für 5 bis 15 Minuten.
  11. Kurz zentrifugieren und das Röhrchen wieder auf das magnetische Trenngestell legen, bis die Flüssigkeit klar wird (2 bis 5 min).
  12. Übertragen Sie 21 μl cDNA-haltigen Überstand in das probenmarkierte 0,2-ml-PCR-Röhrchen, ohne die Kügelchen zu beschädigen.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 11.9 bis 11.12 für jedes Röhrchen und sammeln Sie insgesamt 42 μl cDNA. Fahren Sie direkt mit der Amplifikation der cDNA fort (Schritte 12.1 bis 12.8).
    HINWEIS: Eine Verzögerung beim Start der Amplifikation führt zu einer verringerten Ausbeute, mehr kurzen Lesevorgängen und einer Degradation des einzelsträngigen DNA-Templates.

12. cDNA-Amplifikation

  1. Nehmen Sie die cDNA-Amplifikationsmischung und die FFPE-cDNA-Primer aus dem Gefrierschrank und legen Sie sie zum Auftauen auf nasses Eis.
  2. Schleudern Sie die cDNA-Amplifikationsmischung und die FFPE-cDNA-Primer auf einer Tischzentrifuge bei ~100 x g herunter.
  3. 50 μl cDNA-Amplifikationslösung und 8 μl FFPE-cDNA-Primer aus 42 μl aus (Schritt 11.13) in jedes cDNA-Röhrchen geben und mit dem Flatcap-Adapter in einen Thermocycler geben, um eine Verformung des Röhrchens zu verhindern.
  4. Führen Sie das Thermocycler-Programm für die cDNA-Amplifikation durch: Erstdenaturierung: 95 °C für 5 Minuten; Zyklen: [98 °C für 20 s, 58 °C für 20 s, 72 °C für 3 min] × 15 Zyklen; Endausdehnung: 72 °C für 5 min; Haltetemperatur: 12 °C (bei sofortiger Verarbeitung) / 4 °C (bei Lagerung über Nacht).
  5. Messen Sie die DNA-Konzentration von 1 μl cDNA vor und nach der Beulenreinigung.
    HINWEIS: Die Menge des cDNA-Produkts vor der Reinigung sollte so berechnet werden, dass sie 1 μg pro 1 cm² Chip übersteigt. Die Konzentration nach der Aufreinigung sollte mindestens 10 ng/μl betragen. Niedrigere Ausbeuten sind in der Regel mit einer geringeren Bibliotheksvielfalt verbunden. Ein signifikanter Probenverlust in dieser Phase korreliert mit den DV200-Werten. Der DV200 ist jedoch kein perfekter Prädiktor für Ergebnisse.
  6. Wiederholen Sie die Reinigung der cDNA-Beads aus Schritt 11 (Reinigung der Beads) mit dem PCR-Produkt aus Schritt 12.4 mit drei Modifikationen: Verwenden Sie ein kleineres PCR-Magnetrack, fügen Sie in Schritt 11.6 nur 200 μl 80 % Ethanol hinzu und resuspendieren Sie in Schritt 11.9 22 μl Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH 8).
  7. Lagern Sie die Kügelchen in einem Röhrchen mit 20 μl NFW, das mit Probennamen, Barcode, Datum und Chip-ID gekennzeichnet ist.
  8. Messen Sie die cDNA-Fragmentverteilung mit einem Fragmentanalysator. Der Fragmentgrößenbereich sollte zwischen 250 und 400 bp liegen. Wenn die Fragmente zu klein sind, wiederholen Sie die Raupenreinigung, aber verwenden Sie Raumtemperatur (~25 °C) anstelle von 27 °C.
    OPTIONALER STOPPPUNKT: Nach der Messung der cDNA kann sie bis zu 1 Monat bei -20 °C und bis zu 1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Perlen können 1 Woche bei 4 °C in NFW gelagert werden. Frieren Sie die Perlen nicht ein.

13. Vorbereitung der Bibliothek (Tag 4)

  1. Vorbereitung der Amplifikationsreaktionsmischung
    1. Entfernen Sie die PCR-Amplifikationslösung der Bibliothek, die Barcode-Sätze der Bibliothek, das cDNA-Produkt und das NFW. Tauen Sie die cDNA und die Reagenzien auf Eis und Wasser bei Raumtemperatur auf und schleudern Sie sie 10 s lang bei 100 x g herunter.
  2. Bestimmen Sie die Bibliotheks-Barcode-Strategie für jeweils 25 μl PCR-Barcode-Primer-Mix.
    HINWEIS: Bei diesem Sequenzer müssen alle Basen an jeder Position in einem Barcode-Satz gleich dargestellt werden. Die meisten kommerziellen Kits, die damit kompatibel sind, sind daher mit vordefinierten Barcode-Tetraden (Vierer-Sets) ausgestattet. Diese Tetraden können auf einzelne Proben angewendet werden, wenn sie über eine Sequenzierspur aufgeteilt werden, oder sie können für eine einzelne Probe zusammengefasst werden, wenn eine Probe pro Spur sequenziert wird. Die Beibehaltung ausgewogener Barcodes ist unerlässlich, da unsymmetrische Barcodes die Menge der vom Sequenzer erzeugten nutzbaren Daten reduzieren.
  3. Bestimmen Sie das Volumen der cDNA für 20 ng (z. B. würden 10 ng/μl 2 μl benötigen). Stellen Sie damit eine NFW-Lösung (25 μl) aus verdünnter cDNA her (verdünnt auf ~1 ng/μl).
  4. Kombinieren Sie die Bibliotheksamplifikationsmischung (50 μl) mit verdünnter cDNA in NFW (25 μl) und der PCR-Barcode-Primermischung (25 μl) in das 0,2-ml-PCR-Röhrchen.
  5. Mischen Sie die Vertiefung durch Pipettieren und schleudern Sie sie 10 s lang bei 100 x g herunter. (Nicht vortexen)
  6. Legen Sie die 0,2 mL PCR-Röhrchen in den Thermocycler und stellen Sie sicher, dass Sie einen Einsatz haben, um ein Zerquetschen der Röhrchen zu verhindern.
  7. Führen Sie das Thermocycler-Programm für die cDNA-Amplifikation durch: Erstdenaturierung: 95 °C für 5 Minuten; Zyklen: [98 °C für 20 s, 58 °C für 20 s, 72 °C für 3 min] × 8 Zyklen; Endausdehnung: 72 °C für 5 min; Haltetemperatur: 12 °C (bei sofortiger Verarbeitung) / 4 °C bei Lagerung über Nacht.
    HINWEIS: Es ist möglich, unterschiedliche Mengen an Eingangs-cDNA zu verwenden, um die Bibliothek vorzubereiten. Die verwendete Menge wirkt sich jedoch auf die Anzahl der PCR-Zyklen aus, die für die Amplifikation erforderlich sind. Zum Beispiel empfiehlt der Anbieter 20 ng Eingangs-DNA und die Verwendung von 8 Zyklen. Es ist auch möglich, 40 ng mit 7 Zyklen oder 80 ng mit 6 Zyklen zu verwenden. Die Verwendung von weniger als 20 ng oder mehr als 80 ng Eingangs-cDNA wird nicht empfohlen.

14. Reinigung der Bibliotheksverstärkungsperlen

  1. Quantifizieren Sie das Rohbibliotheksprodukt wie in Schritt 12.5 beschrieben.
  2. Wiederholen Sie die Bead-Reinigung aus Schritt 11 (Bead-Reinigung) unter Verwendung des Rohbibliotheksprodukts aus Schritt 13.7 mit drei Modifikationen: Verwenden Sie ein Verhältnis von Bead zu Produkt von 0,8:1, verwenden Sie ein kleineres PCR-Magnetrack, verwenden Sie nur 200 μl 80%iges Ethanol im Vergleich zu Schritt 11.7 und resuspendieren Sie in 22 μl TE-Puffer (pH 8) in Schritt 11.9. Bereiten Sie etwa 1 ml frisches 80%iges Ethanol frisch pro zwei 1 cm2 Chips vor.
  3. OPTIONALER STOPPPUNKT: Nach der Messung der Bibliothek kann sie bis zu 1 Monat bei -20 °C und bis zu 1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Die Perlen können bei NFW 1 Woche bei 4 °C gelagert werden. Frieren Sie die Kügelchen nicht ein.

15. DNBSEQ-T7RS-System zur Sequenzierung von Stereo-Seq Random Oligonucleotid Primed DNBs

  1. Ordnen Sie die Zyklen mit einem PE75-Kit auf dem DNBSEQ-T7RS-System als 25 für Read 1 und 62 für Read 2 (PE25+62) zu, gefolgt von einem Index von 10 bp:
    1. Beim ersten Lesen (Lesen von 1 von 25 Zyklen) werden die räumliche Chip-ID (CID) oder standortspezifische Informationen aus den chipbasierten Barcodes erfasst.
    2. Der zweite Read (Read 2 von 62 Zyklen) erfasst den Molecular Identifier (MID), eine zufällige 6-bp-Sequenz, die direkt an die Geninserts angehängt ist, mit 3 zusätzlichen Dark Cycles, die für die Phasenkorrektur und die Barcode-Offset-Kalibrierung verwendet werden. Es folgt ein Gen-Insert von 30-59 bp aus Read 2, das durch Mapping auf bekannte Genome oder Transkriptome identifiziert wird.
      HINWEIS: Längere Geninsertionen sind möglich, erfordern jedoch unterschiedliche gepaarte Endkits und eine Änderung des Mapping-Workflows.
    3. Der Indexzyklus für das Demultiplexing umfasst 10 Basispunkte auf der Grundlage der in Schritt 13.2 gepoolten Sequenzierungs-Barcodes.
      HINWEIS: Typische Sequenzierungszeit von ca. 10-12 Stunden für eine 75 PE-Durchflusszelle. Die Sequenzierung wird meist in einem Sequenzierungszentrum oder einer kommerziellen Einrichtung durchgeführt und ist für die meisten Labore kein interner Prozess, da dafür ein DNBSEQ-T7RS oder ein ähnliches Sequenziergerät erforderlich ist.

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Ergebnisse

Die folgenden Daten zeigen die Möglichkeit, eine Einzelzellsegmentierung mit der SAW-Pipeline durchzuführen und auf nicht-polyadenylierte RNAs wie tRNA (TRDMT1) aus einer FFPE-Sektion zu kartieren. Die unverzerrten Daten von Stereo-seq ermöglichen es, die Bedeutung nicht nur von mRNAs, sondern auch von tRNAs, rRNAs und Nicht-Wirt-RNAs (falls relevant) zu untersuchen. Unter Verwendung der direkten Ausgabe aus der SAW-Pipeline16 und ...

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Diskussion

Das Stereo-seq-Protokoll ist sehr detailliert und umfasst mehrere kritische Schritte, die Präzision, Timing und eine saubere Umgebung erfordern, um den Erfolg zu gewährleisten, insbesondere bei der Erstellung von Mikrobiom- oder Nicht-Wirts-Profilen, die möglicherweise besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordern.

Bei allen Schritten muss nukleasefreies Wasser verwendet werden, und der Capture-Chip darf nur mit der Probe und den Reagenzien berührt werden. Seien Sie ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass diese Arbeit nicht von Complete Genomics finanziert wurde. Complete Genomics übernimmt jedoch die Kosten für die Veröffentlichung dieses Artikels.  Sie erhielten weder eine Vorabkopie noch Eingaben zum Inhalt.

Danksagungen

Diese Forschung wurde teilweise von der Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 und 891490), der Sie Foundation und dem Stephanie C. Stelter Endowment Fund finanziert. Diese Forschung wurde in Zusammenarbeit mit der Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, der Abteilung für Veterinärmedizin und Chirurgie und dem Advanced Genomics Technology Core durchgeführt, die teilweise von den National Institutes of Health durch den Cancer Center Support Grant P30 CA016672 von M. D. Anderson und den NCI-Forschungsspezialisten 1 R50 CA243707-01A1 von Jared Burks unterstützt werden.

Wir möchten uns auch bei Compete Genomics bedanken, insbesondere bei Brandon Vanderbush und Tanzeen Yusuff für die technische Schulung und Fehlerbehebung sowie bei Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong und Erin Petrilli. Der/die Autor(en) erhielten ein Set von FFPE OMNI und Sequenzierungsreagenzien sowie Zugang zum T7 Early Access Program von Complete Genomics zu einem reduzierten Preis. Darüber hinaus wurden einige Reagenzien für die Verwendung in dieser Studie kostenlos zur Verfügung gestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Zentrifugenröhren mit normalem DNAse/RNAseThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen3456Um Reagenzien einzumischen (andere Bands sind in Ordnung) 
100 % EthanolSigma-AldrichE7023Molekularqualität
15-mL konische, sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrenThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen339650Verwendet für aliquots 
20x Konzentrat  Kochsalz-Natriumcitrat (SSC) PufferSigma-AldrichS6639-1LFrüher wurden 5x SSC zum Flecken und 1x SSC für Waschschritte und Deckrutschentfernung hergestellt.
2100 Bioanalysator-InstrumentAgilentReduziertInstrument: Bioanalysator
3. Brunnenkammer, abnehmbarIbidi80381Silikonkammer zur Reduzierung der Volumina während der Rehydration und der Methanolfixierung.
405nm UV-LichtquelleVerschiedeneN/AZum Aushärten von UV-Harz
50 ml konische, sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrenThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen339652Verwendet für Aliquots und Deparaffinisierung 
70 % steriler IsopropanolalkoholTexwipe TX3270Für Oberflächendekontamination  
Agilent Hochsensitivitäts-DNA-KitAgilent5067-4626Für die Charakterisierung von cDNA und Bibliotheken durch Bioanalysatoren
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513Zur Charakterisierung von RNA durch Bioanalysatoren
AlufolieVerschiedeneN/AUm den Objektträger während der ssDNA-Färbung zu bedecken.
Beckman Coulter SPRIselectBeckman Coulter Life Sciences B23317/B23318/B23319SPRI Beads cDNA und Bibliotheksreinigung
BleichmittelVerschiedeneN/AReinigung der Arbeitsstation zur Entfernung der Mikrobiomkontamination
CONSTIX versiegelte SchaumstoffabstöckerContec19161023Für präzise Harzreinigung
CoverslipSigma-AldrichBR470045-2000EA
TrockenmittelpackungenVerschiedeneN/ARNase-freie, staubfreie Trockenmittelpackungen.
Einweg-GesichtsmaskeThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen12-888-001Schutz, RNAse-Kontamination und & Sterilität 
DNA-LöschtücherSigma-AldrichL9060-250EADekontamination durch Abwischen von Oberflächen (feuchte Feuchttücher)
DNA-LoBind-Röhren 1,5 mLEppendorf 22431021Verwendet zur Sammlung von cDNA und Bibliotheks-Post-Amplifikationen.
DNA-LoBind-Röhren 2 mlEppendorf 22431048Wird zur Sammlung von cDNA vor der Amplifikation verwendet.
DNBSEQ OneStep DNB Make Reagenz-KitVollständige Genomik940-001891-00Reagenzien für die Herstellung und Amplifikation von DNA-Nanoball (DNB)
DNBSEQ-T7RS Reinigungs-Reagenz-KitVollständige Genomik940-001903-00Kartusche zum Waschen nach Abschluss der Sequenzierung
DNBSEQ-T7RS DNB Load Reagenz-KitVollständige Genomik940-001894-00Reagenzien und Platten zum Laden von DNBs an die Durchflusszelle
DNBSEQ-T7RS SequenzierungsstromzelleVollständige Genomik940-001902-001 Spur/Durchflusszelle
DNBSEQ-T7RS Stereo-seq Visualisierungsreagenz-KitVollständige Genomik940-001893-00Die Patrone und Reagenzien für die Sequenzierung.
DNBSEQ-T7RS-SystemVollständige GenomikDieses Stereo-Seq-Visualisierungsset nutzt DNBSEQ-Technologie. Ein Sequenzierungslauf beginnt mit der Hybridisierung eines DNA-Ankers, dann wird eine fluoreszierende Sonde mittels kombinatorischer Probe-Anker-Sequenzierung (cPAS) an den DNA-Nanoball (DNB) angeschlossen. Schließlich erfasst das hochauflösende Bildgebungssystem das fluoreszierende Signal. Nach der digitalen Verarbeitung des optischen Signals erzeugt der Sequenzer hochwertige und genaue Sequenzierungsinformationen.
StaubabdruckluftMatinM-6318Es ist wichtig, diese Marke oder eine mit ähnlichem Treibmittel zu verwenden;
Edge-Rite Mikrotom-KlingenThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen4280LHistologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
Explosionssicherer GefrierschrankVerschiedeneN/AUm Methanol vor und während der Methanolfixierung zu kühlen.
Histologie-PinselVerschiedeneN/AHistologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
SalzsäureSigma-Aldrich2104-50MLZur Verdünnung des Premuliablisationsenzyms in 0,01 N HCl (pH 2). Die Standardkonzentration für HCl-Lösung beträgt 0,1 N.
BildbildsystemVerschiedeneN/AGC Stomics Imager, Lecia, Evo Revolution
Invitrogen RNaseZap RNase-DekontaminationslösungThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenAM9780Reinigungsarbeitsstation zur Entfernung von RNAse-Kontamination
Kimtech Delicate Task Wipers Kimtech34155Um Bänke, Geräte, Pipetten usw. zu trocknen.
LabkittelVerschiedeneN/APersönliche Schutzausrüstung (PSA)
LinsenpapierThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen11-997Verschiedene Arbeiten zum Trocknen von Objektträgern ohne Sheading
Lookout DNA-LöschtücherSigma-AldrichL9060Reinigungsarbeitsstation zur Entfernung von PCR-Verunreinigungen
Magentic Separation Rack 5 μL - 0,2 ml & lbs;Permagen LabwareMSRLV08Zur Perlentrennung in PCR-Röhrchen
Magjet-Rack 12x1,5 mLThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenMR02Für die Perlentrennung in 1,5-mL-Röhren
Manuelles Rotierendes MikrotomLeicaRM2235Histologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
Methonal ≥ 99,9 %, geeignet für Immunfluoreszenz, HPLCSigma-Aldrich34860Zur Fixierung (Muss HPLC-Grad sein)
Mikro-Sezierende ZangeSigma-AldrichF4142-1EAHistologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
MikropipetteVerschiedeneN/A
Molekulares nukleasefreies Wasser, nicht DPEC-behandeltes WasserVerschiedeneN/AVerdünnungen und Eluation von Perlen
NitrilhandschuheVerschiedeneN/APSA
OfenVerschiedeneN/AUm Pommes zu backen
PCR 0,2 mL Röhren mit angebrachten KondensatorenVerschiedeneN/AFür PCR-Anwendungen
PCR-Abdeckungen VerschiedeneN/AErsatz, wenn der Klebstoff auf der mitgelieferten Abdeckung schwach ist
PCR-Haube & ArbeitsstationMystaireMY-PCR24-010Für Pre-PCR-Schritte (RNA zu cDNA)
pH-MeterVerschiedeneN/ApH-Meter zur Bestätigung des HCl-pH-Werts.
Poly-L-Lysin-LösungSigma-AldrichA005-COptional, um die Gewebeadhäsion zum Chip zu erhöhen
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenQ33226Insuterment; DNA-Quantienmessung
Qubit dsDNA-Quantifizierungs-Assay-KitsThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenQ32851Zur Messung von cDNA und Bibliotheksquantifizierungen
Qubit ssDNA Assay KitThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenQ10212ssDNA-Färbung (Nur verwendeter Farbstoff)
RNAse-freier EisblockVerschiedeneN/AHistologie – Wird beim Schneiden von Proben verwendet, um Blöcke vor dem Schneiden zu hydratisieren
RNaseZap RNase-DekontaminationslösungThermo Fisher Wissenschaftlich / InvitrogenAM9782Eine Oberflächendekontaminationslösung, die RNAses zerstört
RNeasy FFPE-KitQiagen73504 & 19093Für RNA-Extraktion & DV200-Messung 
Sculpt Ultra White ResinSiraya TechN/AHochtemperaturbeständiges, UV-härtendes Harz
Stereo-seq 16 Barcode-BibliotheksvorbereitungssetSTOmics / Vollständige Genomik111KL160Zum Aufbau einer Stereo-seq OMNI FFPE-Bibliothek
Stereo-seq FFPE-ZubehörsetSTOmics / Vollständige Genomik310AK002Räumliche OMNI-Zubehörteile des 211SN114-Kits
Stereo-seq N-Chip-Schlitten (1 cm x 1 cm)STOmics / Vollständige Genomik210CN114Räumlicher OMNI-Chip Teil des 211SN114-Kits
Stereo-seq PCR-Adapter STOmics / Vollständige Genomik301AUX001Für PCR-Hybridisierungsschritte, die auf drei angepasst wurden, ähnlich wie der PCRmax Situ Hybridization Adapter
Stereo-seq Transkriptomik N KitSTOmics / Vollständige Genomik211KN114Räumlicher OMNI-Regent-Teil des 211SN114-Kits
Chirurgisches Design Allzweck-IndustrierasierklingeThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen13-812-236Histologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
TE-Pufferlösung pH 8,0Sigma-Aldrich8890Zum Eluieren von cDNA und Bibliotheken
Thermische ZyklerBioRad / verschiedene1861096 /12015392 / verschiedenePCR-Maschine mit manuellem Deckel oder Tiefbrunnenoptionen (T100 Thermal Cycler / PTC Tempo, Deepwell Thermal Cycler usw.)
Thermo Scientific Orion All-in-One-pH-Puffer-KitsThermo Fisher Wissenschaftlich / Invitrogen13-624-500
Gewebeflotationsbad – Digital XH-1003UraufführungNC0779538Histologie – Verwendet beim Schneiden von Proben
UV-schützende BrillenVerschiedeneN/AZur Sicherheit während der UV-Aushärtung
XylenesSigma-Aldrich247642Für die Deparaffinisierung

Referenzen

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  2. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  3. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 1-12 (2025).
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