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Zugang zum subduralen Raum des Rückenmarks von Nagetieren für die Behandlung

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DOI:

10.3791/68620

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8. August 2025

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1School of Pharmacy, University of Auckland, 2Neurosurgical Department, Auckland City Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses chirurgische Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Einführen eines intrathekalen Katheters in den spinalen Subduralraum eines Nagetiers, um eine gezielte Behandlung durchzuführen.

Zusammenfassung

Die Behandlung von Rückenmarkserkrankungen oder -verletzungen ist eine Herausforderung, was zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass es schwierig ist, wirksame Behandlungen zu entwickeln, die direkt auf das Rückenmark angewendet werden können. Die derzeitigen Behandlungen für Rückenmarksverletzungen (SCI) sind beispielsweise in erster Linie epidural. Epidurale Therapien erlauben jedoch keine direkte Interaktion mit dem Rückenmark, wodurch der potenzielle Behandlungseffekt verringert wird. Hier wird eine Methode für den Zugang zum subduralen Raum in einem Nagetiermodell vorgeschlagen, um eine direktere Wirkung einer gegebenen Behandlung zu erzielen. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde eine erfolgreiche subdurale Implantation eines bioelektronischen Geräts zur Aufzeichnung/Stimulation des Rückenmarks sowie die sichere Einführung eines Neurotrophin-3-geladenen Hydrogels durchgeführt. Tiere, die in beiden Anwendungen diesem Protokoll ausgesetzt waren, zeigten nach dem Eingriff keine Veränderung der Funktion der Hinter- oder Vordergliedmaßen, und bis zu 12 Wochen nach dem Eingriff entwickelte sich keine Funktionsstörung. Obwohl die hier vorgestellten Beispiele sehr spezifisch sind, kann das vorgeschlagene Protokoll in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, um eine effektivere lokalisierte Behandlung von neurologischen Erkrankungen des Rückenmarks zu ermöglichen.

Einleitung

Erkrankungen und Verletzungen des Rückenmarks können verheerende Auswirkungen auf Millionen von Menschen weltweit haben und zu erheblichen sozialen, wirtschaftlichen und gesundheitlichen Belastungen führen 1,2. Verletzungen des Rückenmarks und neurodegenerative Erkrankungen können zu chronischen motorischen, sensorischen und autonomen Funktionsstörungen führen, die die Lebensqualität und Selbstständigkeit der Betroffenen beeinträchtigen. Aktuelle Behandlungen, wie z. B. chirurgische Eingriffe und Pharmakotherapie, konzentrieren sich auf die Linderung des Anfangstraumas und die Behandlung von Sekundärkomplikationen3. Diese Ansätze erreichen jedoch selten eine substanzielle neuronale Regeneration oder funktionelle Wiederherstellung, so dass ein dringender Bedarf an effektiveren Interventionen besteht, die auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzielen.

Ein Hauptanliegen aktueller Behandlungsstrategien ist der Ort und die Durchführung einer gewünschten Behandlung. Behandlungen wie Neuromodulation oder pharmazeutische Interventionen haben die Fähigkeit, die neuronale Aktivität zu beeinflussen, die funktionelle Wiederherstellung zu erleichtern und möglicherweise Verbindungen in geschädigten Schaltkreisen der Wirbelsäule wiederherzustellen4. Die Stimulation des Rückenmarks kann zu einer Verbesserung der motorischen Kontrolle und einer Verringerung der Schmerzen führen5. Diese Strategien beschränken sich jedoch derzeit auf die indirekte Abgabe an das verletzte Gewebe, die sich auf den Epiduralraum konzentriert, ohne Berücksichtigung der Dura mater-Barriere des Rückenmarks 6,7,8. Während epidurale Behandlungen klinische Vorteile gezeigt haben, sind sie aufgrund des indirekten Zugangs zu neuronalen Zielpopulationen begrenzt, was zu einer potenziell reduzierten Wirkung von Therapeutika führt.

Unsere Gruppe hat daran gearbeitet, diese Einschränkungen zu überwinden, die mit epiduralen Strategien verbunden sind, und das Potenzial für eine direkte subdurale Behandlung in Modellen für Rückenmarksverletzungen (SCI) zu erforschen. Das Einführen von Kathetern in den subduralen Raum ermöglicht es, die Behandlung direkt auf das Rückenmark aufzutragen, was zu einer verbesserten Interaktion mit dem betroffenen Nervengewebe führt 9,10. Die subdurale Verabreichung reduziert auch die Barrierewirkung der Dura mater, wodurch die Wirksamkeit der elektrischen Stimulation und der gezielten Wirkstoffabgabesysteme verbessertwird 11,12. Diese Methode könnte die Präzision und Wirksamkeit der Behandlung verbessern, was möglicherweise zu besseren Ergebnissen bei der funktionellen Wiederherstellung führt.

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den sicheren Zugang zum subduralen Raum des Rückenmarks von Nagetieren. Dieses Verfahren konzentriert sich auf den Brustbereich der Wirbelsäule (T10-T12), kann jedoch bei Bedarf an verschiedenen Stellen des Rückenmarks durchgeführt werden. Anatomische Orientierungspunkte werden spezifiziert, die eine Identifizierung der Region ermöglichen, und es werden detaillierte Anweisungen zur Laminektomie, Durotomie und Dura mater-Penetration gegeben. Zwei Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls vorgestellt, darunter die Implantation eines elektrischen Stimulationsgeräts sowie die Verabreichung eines Hydrogel-Wirkstoffverabreichungssystems (Abbildung 1). Die skizzierten Schritte sind für Forscher mit Erfahrung in der Nagetierchirurgie leicht reproduzierbar. Dieses Protokoll wurde im Rahmen eines Kontusionsmodells der Querschnittlähmung geschrieben; Das spezifische Modell der Verletzung kann jedoch in Abhängigkeit von den gewünschten experimentellen Ergebnissen modifiziert werden. Die hier beschriebene Technik ist nicht nur vielversprechend für die Weiterentwicklung der SCI-Behandlung, sondern kann auch eine Plattform für zukünftige Forschungen zur Reparatur und Regeneration des Rückenmarks durch präzise, lokalisierte Interventionen bieten.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien der University of Auckland durchgeführt und von der Tierethikkommission (AEC) der Institution und den Tierschutzbeauftragten der Universität (AWO) genehmigt. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 240-260 g wurden verwendet und in Gruppen untergebracht (21 °C; 12 h:12 h, Hell: Dunkelzyklus) und vor und nach der Operation ad libitum Zugang zur Standarddiät von Nagetieren erhalten. Es wird empfohlen, dieses Protokoll zuerst auszuprobieren, wenn kein Verletzungsmodell vorhanden ist, da es darum geht, einen sicheren Zugang zum subduralen Raum des Rückenmarks von Nagetieren zu ermöglichen. Dies ist ein wichtiger erster Schritt, um zu zeigen, dass das Protokoll ohne Verletzungen angewendet werden kann, was eine genauere Untersuchung eines gewünschten Verletzungsmodells ermöglicht. Das Protokoll eignet sich für die Kombination mit den vielen verschiedenen Verletzungsmodellen, die von Forschungsgruppen verwendet werden. Daher beschreibt das Protokoll keine spezifischen Schritte zur Verabreichung von Verletzungen, da diese je nach Anwendung variieren. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Sterilisieren Sie alle Instrumente (ergänzende Abbildung 1) und die entsprechenden Verbrauchsmaterialien.
  2. Wiegen Sie die Ratte(n), die am nächsten Tag operiert werden sollen.
  3. Berechnen Sie die geeigneten Dosen der zu verabreichenden Medikamente; Bupivacain (Analgetikum) @ 2 mg/kg, Dosis - 0,08 mL/100 g; Meloxicam (Analgetikum) @ 2 mg/kg, Dosis - 0,04 mL/100 g; Buprenorphin (Analgetikum) @ 0,03 mg/kg, Dosis - 0,1 ml/100 g; Enrofloxacin (Antibiotikum) @ 10 mg/kg, Dosis - 0,08 mL/100 g12,13.
    HINWEIS: Bupivacain wurde vor dem ersten Schnitt an 3-4 Stellen entlang der Operationsstelle subkutan verabreicht.

2. Chirurgische Vorbereitung

  1. Stellen Sie sicher, dass das Anästhesiesystem richtig eingerichtet ist (überprüfen Sie, ob alle Schläuche, die mit dem Sauerstoff- und Anästhesiesystem verbunden sind, richtig eingerichtet sind).
  2. Bereiten Sie die erforderlichen Injektionen basierend auf dem Gewicht der Ratten sowie eine 3-ml-Injektion mit Kochsalzlösung vor, die vor dem Start verabreicht wird.
  3. Stellen Sie sicher, dass das Wärmekissen (Erhaltungstemperatur 37 °C), die Lampe, das Mikroskop und der Rasierer eingerichtet und funktionsfähig sind.
    HINWEIS: Es ist keine spezielle Vergrößerung für das Präpariermikroskop erforderlich, da die Vergrößerung je nach Vorliebe des Benutzers und Sichtbarkeit während des Eingriffs variiert.
    ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Tieres während des Eingriffs nicht unter 35 °C sinkt oder 40 °C überschreitet

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche, die mit dem Anästhesiesystem und dem Sauerstofftank verbunden sind, angeschlossen sind. Wenn Sie das in dieser Studie verwendete Anästhesiesystem verwenden (siehe Materialtabelle), stellen Sie die Isofluran-Induktion auf 3 % ein und geben Sie das Gewicht des Tieres in das Anästhesiesystem ein, um die Sauerstoffflussrate für die Erhaltungsanästhesie einzustellen (Ergänzende Abbildung 1A).
    HINWEIS: Halten Sie die Anästhesie auf einem Erhaltungsniveau, das für jedes einzelne Tier geeignet ist. Diese kann je nach Tier zwischen 1,3 % und 2 % variieren.
  2. Setzen Sie die Ratte in die Induktionskammer, bis sie sich nicht mehr aufrichten kann, wechseln Sie auf die gewünschte Isofluran-Erhaltungsstufe und bewegen Sie die Ratte zum Nasenkonus.
  3. Verabreichen Sie vor der Rasur 3 ml Kochsalzlösung und die erforderlichen Medikamenteninjektionen subkutan.
    HINWEIS: Injizieren Sie nach der Injektion und Rasur mit Kochsalzlösung das Bupivacain an mehreren Stellen entlang der vorgesehenen Inzisionsstelle
  4. Während Sie den Narkosegrad des Tieres überwachen, bereiten Sie alle Instrumente (Mikroskop, Werkzeuge, sterile Abdeckungen) im Operationsbereich vor. Platzieren Sie ein steriles Abdecktuch für die Werkzeuge im gewünschten Bereich und ordnen Sie die Werkzeuge auf dem Abdecktuch an, wobei das sterile Feld beibehalten wird.
  5. Rasieren Sie das Fell entlang des Rückens des Tieres, vom Halsansatz bis zur Oberseite der Hüften.
  6. Desinfizieren Sie den Bereich mit einem Chlorhex-Peeling, gefolgt von einer Chlorhex-Tinktur, indem Sie sich in kreisenden Bewegungen von der Mitte des rasierten Bereichs (3x) nach außen bewegen, und tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  7. Bringen Sie die Ratte unter das Mikroskop auf das Heizkissen, legen Sie ein Press- und Siegeltuch über den rasierten Bereich und schneiden Sie ein Loch, das groß genug ist, um das Operationsfeld freizulegen, aber nicht so groß, dass unrasiertes Fell freigelegt wird.
  8. Platzieren Sie einen rektalen Temperaturfühler, um die Temperatur des Tieres zu überwachen und ~37 °C mit dem Heizkissen zu halten. Führen Sie alle 5-10 Minuten Tierschutzchecks durch.
  9. Verabreichen Sie den Pedalreflex, um die chirurgische Ebene der Anästhesie zu bestätigen und den Eingriff zu beginnen.

4. Gewebedissektion der Wirbelsäule

  1. Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen linearen Schnitt (~6-8 cm) in rostraler bis kaudaler Richtung (Abbildung 2A), der unterhalb der Halsbasis beginnt und sich über den thorakalen Buckel erstreckt und die T9-T13-Wirbel freilegt.
  2. Koppeln Sie das Bindegewebe vorsichtig unter der Inzisionsstelle mit einer Graefe-Pinzette oder einer Mikrofederschere, um das Muskelgewebe an der Wirbelsäule direkt freizulegen.
  3. Identifizieren Sie den T13-Prozess, indem Sie die beiden weißen V-förmigen Sehnen in der Nähe der kaudalen Hälfte des Schnitts lokalisieren. Der Dornfortsatz direkt rostral des V auf der Schwanzseite des Tieres ist T13 (Abbildung 2B).
  4. Beginnend bei T13 und bis T9 machen Sie zwischen den einzelnen Prozessen kleine Schnitte im Bindegewebe, um sie zu trennen, bevor der Muskel freigelegt wird, um die Position im Verlauf des Eingriffs beizubehalten (Abbildung 2C). Schneiden Sie dann mit Mikroskopen Kanäle in den Muskel, die parallel zu beiden Seiten der Dornfortsätze verlaufen. Tun Sie dies auf beiden Seiten der Wirbelsäule, um die Lamina jedes Wirbelsäulensegments freizulegen (Abbildung 2D).
  5. Befestigen Sie serrefine Klemmen an beiden Seiten der Muskelwände, um ein offenes Sichtfeld zur Wirbelsäule zu erhalten. Befestigen Sie ein Paar an den Seiten von T13, ein weiteres am Rand von T11/T12 und ein weiteres an T11/T10 (Abbildung 2E).
  6. Sobald sich klare Kanäle gebildet haben, schneiden Sie das Bindegewebe zwischen den einzelnen Prozessen entweder mit einer Mikroschere oder einem Rongeur ab (Abbildung 2F).
  7. Reinigen Sie die Kanäle, bis das Bindegewebe und die Muskeln sauber aus jeder Lamina präpariert sind, vom rostralen Teil von T13 bis zum kaudalen Teil von T9, und legen Sie die T10-12-Segmente für die Laminektomie frei. Der erfolgreiche Abschluss wird durch deutlich sichtbare Lamina auf beiden Seiten der Prozesse angezeigt.
    HINWEIS: Für Schritt 4 ist kein Mikroskop erforderlich, wird aber dringend empfohlen.

5. Laminektomie

  1. Lokalisieren Sie den kaudalen Teil der T12-Lamina, der den rostralen Teil von T13 überlappt, positionieren Sie die Spitze der Rongeure darunter und beginnen Sie vorsichtig mit der Entfernung von Laminastücken, wie in den StandardprotokollenJoVE empfohlen 14,15 (Abbildung 2G).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um den Dornfortsatz jeder Lamina zu greifen, um die Stabilität zu erhalten und die Platten bei jedem Schnitt mit den Rongeuren sanft "anzuheben" (Abbildung 2G). Wenn Sie die Spitze der Rongeure unter die Lamina schieben, halten Sie den Druck nach außen vom Rückenmark weg aufrecht, um mögliche Schäden zu minimieren.
    ACHTUNG: Achten Sie darauf, die Rongeure beim Schneiden nicht zu weit nach unten zu schieben, da dies die Dura mater und/oder das Rückenmark selbst beschädigen kann.
  2. Bewegen Sie sich von einer Seite zur anderen und schneiden Sie weiterhin Knochenstücke aus der T12-Lamina ab, bis genügend Platz vorhanden ist, um den Schnitt in die Mittellinie des Prozesses zu verlängern und das Rückenmark mit einem Loch von etwa 5 mm Durchmesser freizulegen (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Die Entfernung von Knochen aus der Wirbelsäule kann zu Blutungen führen, die die Sicht während des Eingriffs beeinträchtigen können. Verwenden Sie Wattestäbchen oder gerollte, fusselfreie Tücher (Ergänzende Abbildung 1B), um dies während der Durchführung der Laminektomie zu bewältigen.
  3. Die Rongeure unterhalb der Lamina auf beiden Seiten häkeln und dann einen ebenen Kanal zum kranialen Teil von T12 freimachen (Abbildung 2I).
    HINWEIS: Das Rückenmark wird sichtbar, wenn Teile der Laminarplatte für jedes Wirbelsäulensegment entfernt werden.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.3, um sowohl T11 als auch T10 zu entfernen.
  5. Setzen Sie die Laminektomie fort, wobei Sie auf beiden Seiten gleichmäßige Schnitte beibehielten und rostral bis T9 bewegten (Abbildung 2J).
    HINWEIS: Bei einer Rückenmarksverletzung (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse") muss die Lamina oberhalb des gewünschten Rückenmarkssegments/der gewünschten Rückenmarkssegmente weit genug entfernt werden, um die Verwendung eines Prellungsverletzungsgeräts zu ermöglichen (siehe erweiterter Bereich in der Mitte von Abbildung 2K). Für die Verabreichung von Medikamenten kann die Laminektomie gerade breit genug sein, um die Anwendung der gewünschten Verbindung zu visualisieren.
  6. Spülen Sie den Thekalsack vorsichtig mit Kochsalzlösung und bereiten Sie den gewünschten Bereich für die Durotomie vor, sobald die Laminektomie abgeschlossen ist und ein ausreichender Bereich von T10-T12 entfernt wurde (Abbildung 2K).
    HINWEIS: Dieses Verfahren ist spezifisch für den Zugang zu den Wirbelsäulensegmenten (T10-T12), diese Methoden können jedoch verwendet werden, um Laminektomien an verschiedenen Segmenten entlang der Wirbelsäule durchzuführen.

6. Durotomie für die Behandlungsanwendung

  1. Führen Sie die Durotomie (Inzision der Dura mater) mit dem Dissektionsendoskop durch, um Zugang zum subduralen Raum des Rückenmarks zu erhalten (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Passen Sie die Vergrößerung des Zielfernrohrs an die Präferenz des Chirurgen für die Sichtbarkeit der Dura mater an.
  2. Biegen Sie eine 27-G-Nadel in einem 90-Grad-Winkel, wobei die Fase nach oben zeigt (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Paar Nadeltreiber oder Hämostatika, um die Nadel beim Biegen zu greifen.
  3. Stechen Sie die Dura mater vorsichtig mit der Nadelspitze an der gewünschten Eintrittsstelle am Rückenmark ein (Abbildung 3B).
    ACHTUNG: Achten Sie darauf, das darunter liegende Rückenmark oder das mediane Blutgefäß nicht zu beschädigen.
  4. Sobald die Dura mater punktiert ist, heben Sie die Nadel vorsichtig nach dorsal an, um ein kreisförmiges Loch von nicht mehr als 2 mm in die Dura mater auf beiden Seiten des Mittellinienblutgefäßes zu reißen. Eine erfolgreiche Durotomie wird durch einen kleinen Austritt von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus einem der Löcher angezeigt.
    HINWEIS: Halten Sie einen Abstand von mindestens einigen mm zum Ende der Laminektomie ein, um einen leichteren Zugang zum Subduralraum zu ermöglichen. Führen Sie die Nadelspitze bei Bedarf vorsichtig wieder in das ursprüngliche Loch ein, um sie zu vergrößern.
  5. Stellen Sie sicher, dass die für den Durotomieschnitt gewählte Position und die Position unmittelbar davor frei von verzweigten Blutgefäßen aus dem Mittellinienblutgefäß sind.
    ACHTUNG: Beschädigen Sie NICHT das Blutgefäß in der Mittellinie, da dies zu übermäßigen Blutungen führt und den Abschluss des Eingriffs verhindert.
  6. Führen Sie mit den in die Dura gemachten Löchern die gewünschte Behandlung durch oder implantieren Sie ein Gerät in den Subduralraum. Für dieses Protokoll werden intrathekale Katheter für die Behandlungsabgabe verwendet, um entweder das Stimulationsgerät in Position zu bringen oder das Hydrogel zu injizieren (Abbildung 3C).
    HINWEIS: Halten Sie ein klares Sichtfeld aufrecht, indem Sie nach Durotomien kontinuierlich Blut und/oder Liquor entfernen.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Katheter unter der Dura sichtbar sind, bevor Sie in das Rückenmark gelangen. Eine erfolgreiche Anwendung wird durch Katheter angezeigt, die sich sanft über die kleinen Blutgefäße der Wirbelsäule bewegen, während sie unter der Duralmembran verlaufen.
  8. Nachdem die gewünschte Behandlung durchgeführt wurde (Abbildung 3D, E), legen Sie ein Stück sterilen chirurgischen Gelschaum in den durch die Laminektomie geschaffenen Raum, um die Blutstillung, die Wundheilung und den Erhalt der Struktur der Wirbelsäule zu unterstützen.
  9. Verwenden Sie nach dem Platzieren des Gelschaums ein resorbierbares 4-0-Polydioxanon-Nahtmaterial, um die Muskel- und Hautschicht über der Wirbelsäule zu schließen.

7. Nachsorge

  1. Kontrollieren Sie die Tiere täglich und verabreichen Sie die erforderlichen postoperativen Medikamente (Buprenorphin für 2 Tage; Enrofloxacin und Meloxicam für bis zu 5 Tage). Verabreichen Sie bei Bedarf 1-3 ml Kochsalzlösung subkutan (wenn <10% des Körpergewichts Wasser über 24 Stunden während der postoperativen Phase konsumiert werden).
  2. Überwachen Sie je nach Eingriff die Blasenfunktion, die Motorik, die Grimassenschuppe und alle anderen Anzeichen des Tierschutzes.
  3. Entfernen Sie die Hautnähte etwa 10-14 Tage nach der Operation.

Ergebnisse

Das vorgeschlagene Protokoll wurde in zwei verschiedenen Versuchsanordnungen angewendet. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für nicht-verletzte Gruppen, da gezeigt werden sollte, dass die im Verfahren beschriebenen subduralen Manipulationen (in Ermangelung eines Verletzungsmodells) die Funktion nicht beeinträchtigen. Ein bioelektronisches Gerät wurde implantiert (Abbildung 1A) oder ein Hydrogel verabreicht (Abbildung 1B) bei 6-8 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten. Die motorische Funktion dieser Tiere wurde mit der von Kontrolltieren, die sich einer Scheinoperation ohne subdurales Verfahren unterzogen hatten, mit der BHS-Motorikskala verglichen. Hier sind mehrere Gruppen von Tieren vertreten, die die Durchführbarkeit und Sicherheit jedes Verfahrens zeigen. Nach jedem Eingriff behielten alle Tiere 7 Tage nach dem Eingriff eine normale motorische Funktion bei, ohne dass sich der BHS-Wert zwischen den Gruppen unterschied, was auf die sichere Durchführung des beschriebenen Protokolls hinweist. Darüber hinaus wird eine Gruppe von Tieren (Abbildung 4C), die eine beeinträchtigte motorische Funktion der Hintergliedmaßen aufweisen, zum Vergleich mit den subduralen Verfahrensgruppen dargestellt, um weiter zu zeigen, dass in den Versuchsgruppen keine nachteiligen Wirkungen festgestellt wurden. Diese Gruppe erhielt ein SCI-Verfahren mit einer Kraft von 175 kdyn, wie in der früheren Literaturbeschrieben 12,13.

Bioelektronisches Implantat
Für die Geräteimplantation umfasst das Protokoll die Schaffung von zwei Durotomiestellen - eine für den Kathetereintritt und eine für den Ausgang -, um die Bewegung der Führungskatheter unter der Dura und die kontrollierte Platzierung des Geräts zu erleichtern. Das bioelektronische Bauelement bestand aus zwei gegabelten Armen, die an einer PCB-Schnittstelle befestigt waren, die von einem biokompatiblen Gehäuse umschlossen war. Die Arme werden vorübergehend über eine 7-0-Seidennaht mit kleinen intrathekalen Kathetern verbunden, um die Positionierung des Implantats zu erleichtern. Die Katheter werden langsam durch die rostralen Durotomielöcher gezogen, unter die Dura geschoben und durch die Austrittsdurotomielöcher kaudal zur Behandlungsstelle. Die befestigten Implantatarme wurden dann durchgezogen und auf jedem Halbabschnitt des Rückenmarks positioniert. Das hintere Ende des Implantats wird mit dem Muskel vernäht, der am T13-Prozess befestigt ist. Das Gehäuse wird mit dem Musculus trapezius/latissimus rostral zur Laminektomie vernäht. Die Haut wird dann um den Boden der Gehäuseeinheit geschlossen, um den Zugang von außen zu ermöglichen.

Hydrogel-Behandlung
Für die Hydrogel-Abgabe ist nur ein Eintrittspunkt erforderlich. Das Hydrogel wurde über ähnliche intrathekale Katheter verabreicht, die an der gleichen Stelle wie das Stimulationsgerät positioniert waren. Die Katheter wurden mit 10 μl eines Poloxamer-Hydrogels12 beladen und auf die gleiche Weise wie die Implantationsschritte des Geräts in den subduralen Raum eingeführt. Sobald sie an Ort und Stelle waren, wurden die Katheter langsam zurückgezogen, während das Hydrogel kontinuierlich unter der Dura (Abbildung1B) auf jede Hemistranglänge abgegeben wurde. Nach jedem Eingriff wurden die Tiere 7 Tage lang überwacht, um eine angemessene Erholung zu gewährleisten.

Die 21-Punkte-Basso-Beattie-Bresnahan-Skala (BHS) wurde für die Beurteilung der motorischen Funktion verwendet16. Die Tiere in beiden Gruppen wurden vor dem Eingriff (Baseline) und 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage nach der Operation untersucht. Das Verhalten im Gelände wurde direkt und über verblindete Videoaufzeichnungen erfasst. Die motorischen Funktionswerte sowohl für die linke als auch für die rechte Hintergliedmaße für jede Gruppe wurden mit nicht operierten Kontrolltieren und einer separaten Querschnittgelähmtengruppe verglichen, um das Ausmaß der nachteiligen Auswirkungen der Operation zu bestimmen. Tiere in der Implantat- oder Hydrogelgruppe zeigten nach beiden Verfahren im Vergleich zu nicht operierten Kontrollen oder verletzten Querschnittgelähmten kein Defizit in der motorischen Funktion. Zu beachten ist, dass die histologische Analyse, die das Fehlen einer Rückenmarksschädigung bestätigt, bereits in unserer früheren Arbeit veröffentlicht wurde. Diese Studie zeigte, dass die Verwendung dieser Methode zur Implantation eines Geräts bis zu 7 Tage nach dem Eingriff kein zusätzliches Rückenmarkstrauma verursacht11. Minimale Veränderungen sowohl der Astrozyten- (GFAP) als auch der Mikroglia-/Makrophagenaktivität (Iba1) wurden nach der Implantation eines Geräts im Vergleich zu Kontrolltieren beobachtet. Die Oberfläche und Rundheit der koronalen Rückenmarksschnitte direkt unter dem Implantat wurden ebenfalls untersucht, wobei keine Veränderung der Morphologie zu erkennen war.

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Abbildung 1: Subdurale Behandlungsstrategien. (A) Beispiel für das Implantat und (B) Katheter/Spritze, der zur Injektion des Hydrogels verwendet wurde. (C) Repräsentative Modelle sowohl des Implantats als auch des Hydrogels in das Rückenmark einer Ratte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Bilder der Laminektomie, die das Operationsfeld darstellen. (A) Orientierung des Tieres für chirurgische Bilder in Abbildung 2 und Abbildung 3. (B) Orientierungspunkte der Muskelsehnen für die Lokalisation des Prozesses T13, um den Beginn der Muskeldissektion zu leiten. (C) Senkrechte Schnitte zur Identifizierung jedes Prozesses, der durch Laminektomie entfernt werden soll. (D) Muskelkanäle, die parallel zu den Wirbelsäulenfortsätzen geschnitten sind, um den Zugang zu den Knochenplatten für die Entnahme zu ermöglichen. (E) Bulldog-Serrefine-Clips, die verwendet werden, um den Muskel/die Haut auf beiden Seiten der Wirbelsäule zurückzuhalten, um ausreichend chirurgischen Raum zu schaffen. (F) Entfernung der weißen Sehnen, die jeden Prozess vor Beginn der Laminektomie miteinander verbinden. (G) Operationsfeld zu Beginn der Laminektomie, wenn Rongeure unter die T12-Platte geschoben werden, um mit dem Wegschneiden des Knochens zu beginnen. (H) Die erste Hälfte des T12-Prozesses wurde entfernt, um das Rückenmark freizulegen und dem Chirurgen ausreichend Platz zu geben, sich rostral zu bewegen und mit der Entfernung der restlichen Fortsätze zu beginnen (T11/T10). (I) Entfernung des kranialen Teils von T12 mit vollständiger Entfernung des Segments. (J) Laminektomie zur Hälfte abgeschlossen bei T11 mit breiteren Schnitten zur Anwendung einer Beispiel-Rückenmarksverletzung. (K) Vollständige Laminektomie nach Entfernung der T10-T12-Segmente, bei der die dorsale Oberfläche des Rückenmarks vollständig freigelegt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schritte zur Durchführung der Durotomie und zur gezielten Behandlung. (A) Schematische Darstellung der Lage der Löcher in der Dura mater des Rückenmarks. (B) Operationsfeld, das eine 27-G-Nadel zeigt, die in die Dura eindringt, um die Durotomie zu erzeugen; Dies geschieht auf beiden Seiten des zentralen Blutgefäßes, wie in (A) zu sehen. (C) Ersteinführung eines Katheters, der für die Behandlungsanwendung verwendet wird. (D) Elektrostimulationsgerät, das am Rückenmark angebracht wird. (E) Katheter, die mit Hydrogel zur Injektion auf die Rückenmarksoberfläche beladen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Postoperativer Zustand und motorische Funktion. (A) Repräsentative Bilder von Tieren nach der Implantation des Geräts und der Hydrogel-Verabreichung. (B) Repräsentative BHS-Werte von Tieren mit einer Wirbelsäulenprellung im Vergleich zu Tieren, die sich entweder einem subduralen Verfahren (Implantat oder Hydrogel) unterzogen haben, oder Kontrolltieren, die nicht manipuliert wurden. Die Stichprobengrößen der Kontrollgruppe (nicht operiert), der Querschnittlähmung und der Implantatgruppe betrugen n = 5 und die Stichprobengröße der Hydrogel-Gruppe n = 3. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Werkzeuge für die Chirurgie. Foto der verwendeten chirurgischen Instrumente. (1) #10 Klingenskalpell. (2) Vannas Mikroschere. (3) Graefe-Zange. (4) Serrefine Bulldoggen-Clips. (5) Rongeure. (6) 27 G Nadel für die Durotomie. (7) Feine Pinzette. (8) 1 ml-Spritze für die Anwendung von Kochsalzlösung nach Bedarf. (9) Sezierschere. (10) Hämostatika zum Nähen. (11) Spitze Wattestäbchen. (12) Sterilisierte Wattebäusche. (13) Ausgerollte, fusselfreie Tücher. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Subduraler vs. epiduraler Raum. Schematische Darstellung der Wirbelsäule und des Rückenmarks, die die epidurale vs. subduraler Raum. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Die hier vorgestellte Methodik bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Zugang zum spinalen Subduralraum und demonstriert ihre Sicherheit und Durchführbarkeit anhand von zwei Beispielen für die Verabreichung von Behandlungen in die thorakale Region des Rückenmarks11,12. Zahlreiche Forschungsgruppen haben Ansätze entwickelt, um eine Rückenmarksverletzung (SCI) durch elektrische oder chemische Eingriffe zu behandeln. Derzeitige Strategien, einschließlich implantierbarer Geräte für die Optogenetik17 oder elektrische Stimulation18 sowie pharmazeutische Therapien unter Verwendung von Hydrogelen19,20, haben bei der Erleichterung der Genesung und Rehabilitation einen unterschiedlichen Erfolg gezeigt. Die präzise Zielerfassung bleibt jedoch eine kritische Herausforderung, da die meisten aktuellen Behandlungen außerhalb des subduralen Raums durchgeführt werden. Die hier beschriebene Technik bietet einen vielversprechenden Ansatz für die direkte Durchführung von Interventionen am Rückenmark, einschließlich eines langfristigen Zugangs zum subduralen Raum (Ergänzende Abbildung 2), der eine nachhaltige und gezielte Verabreichung von Therapeutika für Rückenmarksverletzung und neurodegenerative Erkrankungen unterstützt. Dies hat wichtige Auswirkungen auf die Umgehung der Blut-Rückenmarks-Schranke, eine große Herausforderung bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Rückenmarkserkrankungen.

Laminektomie
Während Laminektomieverfahren bei Nagetieren weit verbreitet sind 17,21,22, gibt es mehrere kritische Aspekte des Protokolls, die beachtet werden müssen. Die anatomischen Orientierungspunkte, die im obigen Protokoll (Schritt 4.3; Abbildung 2A) ermöglichen den Zugang zum unteren Thoraxbereich des Rückenmarks und sind spezifisch für die Arbeit unserer Gruppe. Wenn das Verfahren auf eine andere Wirbelsäulenregion angewendet werden soll, kann man Segmente entweder rostral oder kaudal zu den ursprünglichen Wirbeln zählen, um die Lage zu bestimmen. Ein weiterer entscheidender Aspekt ist das Ausmaß der Entfernung der Lamina. Um das Risiko einer unerwünschten Verletzung des Rückenmarks während des Eingriffs zu minimieren, sollten mindestens zwei zusammenhängende Ebenen entfernt werden. Auf diese Weise wird ausreichend Platz für die Durotomie geschaffen und eine korrekte Visualisierung gewährleistet. Diese Vorsichtsmaßnahme verringert das Risiko, kleine Blutgefäße beim Einführen des Katheters zu verletzen. Auch eine übermäßige Knochenentfernung an der Seitenwand der Wirbelsäule sollte vermieden werden, um unnötige Blutungen oder Instabilitäten der Wirbelsäule nach der Operation zu vermeiden. Durch die Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts zwischen angemessenem Zugang und minimaler Unterbrechung gewährleistet das Verfahren eine sicherere und präzisere Behandlung.

Durotomie und Kathetereinführung
Die Durchführung der Durotomie erfordert Präzision, um ein Eindringen in das Rückenmark zu vermeiden. Ein unsachgemäßes Einsetzen kann zu Blutergüssen oder Schnittwunden am Rückenmark oder an den subduralen Blutgefäßen führen. Die in der Dura geschaffenen Öffnungen sollten gerade groß genug sein, um die gewünschte Behandlungsstrategie, in diesem Fall den Durchmesser der intrathekalen Katheter, aufzunehmen, ohne die Integrität der Membran zu beeinträchtigen. Bei der Durchführung der Durotomie kann Liquor cerebrospinalis austreten, wenn die Dura mater punktiert wird; Die Menge ist jedoch minimal. Während große Risse in der Dura zu Komplikationen führen können, deutet die bisherige Literatur darauf hin, dass kleine Einstiche, wie sie im beschriebenen Protokoll (Schritt 6.4) verwendet werden, in der Lage sind, sich durch Kollagenablagerung/Vaskularisation selbst zu heilen23, was zu keinen messbaren nachteiligen Auswirkungen nach dem Eingriff führt. Bei der Platzierung der Katheter müssen diese so parallel wie möglich zum Rückenmark eingeführt werden, um die Verletzungsgefahr durch direkte Gewalteinwirkung zu minimieren. Eine sorgfältige Handhabung ist notwendig, um ein Verbiegen oder Crimpen zu verhindern und ein reibungsloses Einführen und eine korrekte Positionierung zu gewährleisten.

Nachsorge
Die postoperative Betreuung nach dem Eingriff ist ein wichtiger Aspekt, da Nagetiere in der Regel unter Standardbedingungen in Gruppen untergebracht werden. Aggressives Verhalten oder soziale Interaktionen nach diesem Eingriff können je nach Art der angewandten Behandlung die Versuchsergebnisse beeinflussen. Dieses Protokoll führt zu einer 6-8 cm langen Linie von Hautnähten entlang des Rückens des Tieres. Es wird empfohlen, Einzeltiere 7-10 Tage nach der Operation zu halten, um die Wundheilung zu ermöglichen und eine mögliche Entfernung der Nähte durch einen Käfiggenossen zu verhindern. Im Falle einer Medikamentenverabreichungsanwendung können sie, sobald der Schnitt verheilt ist, wieder in frühere Gruppen eingeteilt werden, ohne dass es zu offenkundig aggressivem Verhalten oder Komplikationen im Zusammenhang mit dem Eingriff kommt. Bei implantierbaren Geräten sollten Tiere nur in Gruppen von 2 Personen untergebracht werden. Wir haben festgestellt, dass die Haltung von Tieren in Gruppen von 3 oder mehr Personen zu aggressionsbedingten Komplikationen bei den Behandlungsergebnissen führen kann.

Anwendungen der Behandlung
Obwohl sich das hier beschriebene Verfahren auf das thorakale Rückenmark und zwei spezifische Behandlungsstrategien konzentriert, ist es für andere Regionen der Wirbelsäule und zusätzliche therapeutische Anwendungen adaptierbar. Ähnliche Laminektomie-Verfahren wurden erfolgreich auf verschiedenen Ebenen der Wirbelsäule in Nagetiermodellen durchgeführt. Der kleine subdurale Raum bei Nagetieren stellt jedoch eine Herausforderung dar, da er während der Behandlung nur minimalen Spielraum für Fehler lässt. Während die Schritte der Laminektomie und Durotomie von Personen mit Erfahrung in Nagetieroperationen problemlos durchgeführt werden können, kann die präzise Platzierung eines Geräts oder Medikaments unter der Dura ohne Verletzungen zusätzliche Schulungszeit erfordern. Neben der chirurgischen Ausbildung gibt es mehrere Faktoren, die bei der Anwendung der Behandlung hilfreich sein können. Die Aufrechterhaltung eines klaren Sichtfelds während der Behandlung ist von entscheidender Bedeutung. Stellen Sie bei der Verwendung von intrathekalen Kathetern, wie in dieser Studie beschrieben, sicher, dass sich keine gezackten oder rauen Stellen auf den Kathetern befinden, bevor Sie sie unter die Dura einführen. Wie oben erwähnt, ist die Lokalisation der Durotomie äußerst wichtig. Je weiter der Kathetereintritt von der verbleibenden rostralen Lamina entfernt ist, desto einfacher lassen sich die Katheter ausrichten und bleiben während des Einführens parallel zum Rückenmark. Der Zeitpunkt der Behandlungsstrategien in Bezug auf eine Verletzung sollte ebenfalls berücksichtigt werden. Zukünftige Arbeiten werden darin bestehen, diese Verfahren bei Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung zu etablieren, um anschließend eine Bewertung von Behandlungen zur Behandlung chronischer Verletzungen zu ermöglichen. Dieses Protokoll stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Behandlungsanwendung für neurologische Erkrankungen des Rückenmarks dar und bietet einen vielseitigen und präzisen Ansatz für die direkte Verabreichung von Therapien an das Rückenmarksgewebe.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird vom CatWalk Spinal Cord Injury Trust und einem HRC Sir Charles Hercus Research Fellowship (BH) finanziert. Diese Arbeit wurde auch vom stellvertretenden Verteidigungsminister für Gesundheitsangelegenheiten unterstützt, der vom Verteidigungsministerium in Höhe von 534.258 US-Dollar durch das Forschungsprogramm für Rückenmarksverletzungen unter der Auszeichnung Nr. HT9425-23-1-0492. Die Schaltpläne in Abbildung 2A und Abbildung 3A wurden mit Biorender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL und 3 mL SpritzenAmtech
1ml TuberkulinspritzenBD302100
2 x Graefe-ZangeFST11051-10
25G-Nadeln zur MedikamentenverabreichungNiproSH811
27G-Nadeln für DuralschnittNiproSH816
6 x Tissue Bulldog-KlemmenFST18051-28
70 % Ethanol
Baytril 5 mg/kgElancoKV04UHU
Biogel-Chirurgen-LatexhandschuheMolnlycke822775-01
Bupivicain 2 mg/kgAspen, Neuseeland,2023-02
Buprenorphin 0,05 mg/kgCeva (Tiermedizin)9000320
Chlorhex- und Ehtanol-TinkturPerrigoK076A
Chlorhex-SchrubberSchulkeLBL11258
Gebogene RongeursFST16021-14
Dumont #4 ZangeFST11294-00
Gelfoam, steriler, resorbierbarer GelatineschwammGELFOAM09-0342-04-015
Hamilton-SpritzeHamilton80314
Heizkisse (37 oC)Kent ScientificSF-01
HemostatFST13004-14
Infinite Horizon Impaktor und SoftwarePräzisionssysteme und Instrumentierung (PSI)IH-0400
IsofluraneMedsourceUnbekannt
Metacam 2 mg/kgBoehringer IngelheimD02818
Nicht absorbierbare Nähte (Ethilon 4-0, P-3)Ethicon1603G
O2 Tank
Omax Chirurgisches MikroskopJacobs DigitalW43DPT
Press and Seal Frischhaltefolie zum DrapierenGutN/A
SkalpellgriffFeinwissenschaftliche Werkzeuge (FST)10004-13
Skalpellklingen Größe 10Amtech MedicalSH070
Somnoflow-InduktionssuiteKent ScientificSF-01Niedrigdurchfluss-Anästhesiesystem
Sterile absorbierende Pads und WatteSwisspersN/A
Sterile Wattestäbchen (Standard + spitz)help@handN/A
Sterile Kochsalzlösung 0,9 %hergestellt und im Labor autoklaviertN/A
Sterile Abschnitte des zusammengerollten Kim-WipesKimtech-Wissenschaft34155
TemperatursondeKent ScientificSF-01
Vannas FrühlingsschereFST15903-08
Wasserbasiertes Schmiermittel
WaageJeglicheN/A

Referenzen

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Schlagwörter

R ckenmarksverletzungNagetiermodellintrathekaler KatheterDurotomie VerfahrenLaminektomie TechnikImplantation bioelektronischer Ger teHydrogel InjektionBewertung der motorischen Funktion
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