Methodenartikel

Transientes optisches Clearing mit absorbierenden Molekülen für die ex vivo und in vivo Bildgebung

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DOI:

10.3791/68629

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11. Juli 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Optische Clearing-Techniken, wie z. B. die Absorption von Moleküllösungen, reduzieren vorübergehend die Lichtstreuung, um die biologische Bildgebung zu verbessern und biokompatible, reversible In-vivo-Bildgebungsstrategien für tief eingebettete Organe zu bieten. Dieses Protokoll stellt detaillierte experimentelle Verfahren sowie fortschrittliche Bildverarbeitung vor, um eine qualitativ hochwertige, dynamische Bildgebung für die Echtzeitdynamik bei lebenden Tieren zu erzielen.

Zusammenfassung

Die dynamische Bildgebung ist ein grundlegendes Werkzeug in der Biologie und Medizin, aber sie wird durch Lichtstreuung in lebenden Geweben eingeschränkt, die durch Brechungsindex-Fehlanpassungen verursacht wird, was die Eindringtiefe und Auflösung in biologischen Geweben verringert. Frühere Arbeiten führten einen neuartigen Ansatz ein, um optische Transparenz bei lebenden Tieren durch die Verwendung stark absorbierender Moleküle zu erreichen. Wenn sich diese absorbierenden Moleküle, wie z. B. Tartrazin, ein von der FDA zugelassener Farbstoff, der häufig in Lebensmitteln verwendet wird, in Wasser auflösen, verändern sie den Brechungsindex des wässrigen Mediums durch Kramers-Kronig-Beziehungen. Diese Modulation ermöglicht es, die Fehlanpassung des Brechungsindex zwischen einzelnen Komponenten im Gewebe mit unterschiedlichen Brechungsindizes zu reduzieren und so die Streuung zu mildern. In diesem Artikel wird über die detaillierte Methodik der Gewebereinigungstechnik unter Verwendung einer wässrigen Lösung auf Tartrazinbasis berichtet, die sowohl auf ex vivo - als auch auf in vivo-Proben angewendet wird. Dieser Ansatz macht lebende Mauskörper im sichtbaren Spektrum reversibel transparent und ermöglicht so eine klarere und tiefere Abbildung interner Prozesse und Strukturen. Ein fortschrittlicher Bildverarbeitungsalgorithmus wurde dann verwendet, um den Kontrast und die Segmentierung der interessierenden Organe zu verbessern. Darüber hinaus wird eine hohe Transparenz in ex vivo-Proben , wie z. B. Hähnchenbrust, die mit Tartrazin-basierter Lösung behandelt wurde, gezeigt. Diese Methode bietet einen vielseitigen und zugänglichen Ansatz zur Verbesserung der Bildgebungsmöglichkeiten über verschiedene Modalitäten hinweg und ebnet den Weg für Fortschritte im Verständnis komplexer biologischer Systeme.

Einleitung

Die biologische Bildgebung wurde lange Zeit durch die Streuung von Licht herausgefordert, die interessante Strukturen verdeckt1. Optische Clearing-Techniken zielen darauf ab, die Lichtstreuung zu reduzieren und die visuelle Klarheit zu verbessern, wodurch zuvor verborgene Strukturen sichtbar gemacht werdenkönnen 2. Die Entwicklung dieser Techniken hat zu einer Vielzahl von Methoden geführt, die entwickelt wurden, um die optische Bildgebung von biologischen Ex-vivo-Geweben, sogar von ganzen Tieren, ohne physische Dissektion der Proben zu verbessern3. Die Entwicklung ähnlicher Techniken für In-vivo-Anwendungen war jedoch eine Herausforderung. Techniken wie CLARITY Clear Lipid-ausgetauscht Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hY drogel) bieten eine hochauflösende Bildgebung, sind aber nicht reversibilität, so dass sie für Lebendtierstudien ungeeignetsind 4. Constantini et al. haben einen langsameren Fortschritt in der In-vivo-Bildgebung im Vergleich zur Klarheit der ex vivo-Bildgebung gezeigt, was auf die Komplexität der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit des Gewebes bei gleichzeitiger Vermeidung toxischer Wirkstoffkonzentrationen zurückzuführen ist, die für die Gewebetransparenz erforderlich sind5. Genina betont, dass die Zukunft der optischen Gewebereinigung auf nicht-invasiven und reversiblen Methoden beruht6. Jüngste Studien haben die Wirksamkeit von wasserlöslichen absorbierenden Farbstoffen für die optische In-vivo-Reinigung gezeigt. Zum Beispiel zeigten Miller et al., dass die topische Anwendung von Tartrazin die Bildgebungstiefe sowohl in der OCT als auch in der photoakustischen Mikroskopie (PAM) von lebender Maushaut signifikant erhöhte, indem die Streuung reduziert und der Brechungsindex der interstitiellen Gewebekomponenten erhöhtwurde 7. Jia et al. verwendeten eine 15%ige Tartrazin-Lösung, um die in vivo PAM-Bildgebung von Mausohr- und Bauchgewebe zu verbessern und feine mikrovaskuläre Strukturen mit subzellulärer Auflösung aufzudecken, die sonst verborgen blieben8. Zuo et al. zeigten außerdem die Bildgebung des Gehirns durch intakte Kopfhaut und Schädel bei lebenden Mäusen unter Verwendung von 0,6 M Tartrazin, die eine viermal höhere Signalintensität und eine 3,5-fach verbesserte Auflösung im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe erreichte9. In einer anderen Anwendung ermöglichten Narawane et al. durch die Anwendung von Tartrazin eine tiefe transsklerale OCT-Bildgebung in Schweineaugen, wodurch eine klare Visualisierung des suprachoroidalen Raums erreicht wurde, der zuvor aufgrund der starken Skleralstreuung unzugänglich war10. Obwohl ex vivo Tissue Clearing-Methoden wie CLARITY und iDISCO (Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) durch Lipidentfernung oder lösungsmittelbasiertes Clearing eine hohe optische Transparenz und subzelluläre Auflösung erreichen, sind sie für die in vivo Bildgebung mit lebenden Tieren oft ungeeignet 4,11,12. Diese Einschränkung betrifft die dynamische Bildgebung, die für die biomedizinische Bildgebung dynamischer Prozesse in lebenden Tieren, wie z. B. die Entwicklung von Krankheiten und Therapeutika, von entscheidender Bedeutung ist.

Absorbierende Moleküle mit hoher wässriger Löslichkeit und unterschiedlichen Absorptionsbandenformen, wie z. B. Tartrazin, ein Farbstoff in Lebensmittelqualität, bieten vielversprechende Vorteile, um optische Transparenz bei lebenden Tierenzu erreichen 13. Durch die gezielte Einführung von Tartrazin absorbiert das Gewebe aufgrund der einzigartigen spektralen Eigenschaften des Farbstoffs selektiv ultraviolette und blaue Wellenlängen, was zu einem modifizierten Brechungsindexprofil führt, das die Streuung bei längeren Wellenlängen reduziert. Diese kontraintuitive optische Gewebereinigungstechnik ist für die in vivo-Bildgebung optimiert, und die Kramers-Kronig-Beziehungen liefern eine wissenschaftliche Grundlage für die beobachtete Transparenz bei der Verwendung stark resorbierender Moleküle wie Tartrazin14,15. Für die In-vivo-Bildgebung wird Tartrazin mit erhitzten Agarosepartikeln und Wasser kombiniert, um eine kohäsive Lösung zu schaffen, die besser auf der Haut haftet. Die wasserlösliche Natur von Tartrazin erleichtert auch die einfache Entfernung der farbstoffbasierten Lösung von lebenden Tieren, wodurch mögliche Auswirkungen einer längeren Exposition gegenüber Farbstofflösungen reduziert werden. Darüber hinaus wurde die Methode für verschiedene biomedizinische Anwendungen angepasst, um die Bildgebungstiefe, die Auflösung sowie die Empfindlichkeit zu verbessern, einschließlich der optischen Kohärenztomographie 7,16 und der photoakustischen Bildgebung 7,9, was ihr Potenzial für die breitere biomedizinische Bildgebungsgemeinschaft demonstriert.

Mit dem wachsenden Interesse an der Anwendung absorbierender Moleküle in der biomedizinischen Bildgebung 17,18 stellt das Protokoll ein detailliertes Verfahren zur Verwendung von Lebensmittelfarbstoffen für ex vivo- und in vivo-Anwendungen vor, zusammen mit Bildverarbeitung und reversibler in vivo-Bildgebung. Dieses Protokoll wird auf Hühnerbrustgewebe angewendet, um ex vivo Transparenz zu demonstrieren, und wird dann für die in vivo Kopf- und Bauchbildgebung von Mäusen modifiziert, um Reversibilität zu zeigen. Eine Lösung, die in vivo auf die Haut von Mäusen aufgetragen wird, erzeugt eine vorübergehende, reversible Transparenz, ohne die Integrität der Haut oder des Gewebes zu beeinträchtigen. Diese Technik kann in eine Bildverarbeitungspipeline integriert werden, einschließlich Rauschunterdrückung, um ein optimiertes Bildgebungsprotokoll für die optische In-vivo-Bildgebung innerer Organe zu erstellen. In Kombination ermöglichen diese Techniken eine bessere nicht-invasive Längsschnittbildgebung für die Echtzeitbeobachtung biologischer Prozesse. Die Verwendung sichererer Mittel, die Reversibilität demonstrieren, überwindet bisherige Einschränkungen und bietet eine geeignetere Methode für die dynamische biologische Bildgebung.

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Protokoll

Alle durchgeführten Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Texas in Dallas in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. Bildverarbeitungscode ist auf Github verfügbar: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. Zubereitung der Tartrazin-Lösung

  1. Für ex vivo-Proben
    1. Um Farbstofflösungen herzustellen, berechnen Sie die erforderliche Masse des Farbstoffpulvers (Tartrazin), um das gewünschte Volumen der Lösung herzustellen. Verwenden Sie die Formel:
      Masse (g) = Molarität (M) × Molekulargewicht (g/mol) × Volumen (L)
      HINWEIS: Um die tatsächliche Molarität zu kalibrieren, messen Sie die Absorption von vorbereiteten Lösungen mit einem UV-VIS-Spektrometer und wenden Sie das Beer-Lambert-Gesetz19 an.
      ACHTUNG: Verwenden Sie eine Analysenwaage, um die genaue Menge des Pulvers abzuwiegen. Tragen Sie bei der Arbeit mit Farbpulvern geeignete PSA (persönliche Schutzausrüstung), einschließlich Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille. Vermeiden Sie Einatmen oder Hautkontakt.
    2. Füllen Sie das Farbstoffpulver in ein sauberes Glasfläschchen und fügen Sie mit einer volumetrischen Pipette das erforderliche Volumen an deionisiertem (DI) Wasser hinzu, um die volumetrische Präzision zu gewährleisten.
    3. Wenn sich das Pulver bei Raumtemperatur nicht vollständig auflöst, stellen Sie das Glasfläschchen in einen auf 40 °C vorgeheizten Laborofen oder Ofen und erhitzen Sie es 10 Minuten lang oder bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Lösungen mit niedriger Molarität sind bei Raumtemperatur vollständig löslich und verbleiben in flüssiger Form, während Lösungen mit hoher Konzentration (>0,37 M) erhitzt werden müssen.
      ACHTUNG: Übermäßige Erhitzung verdampft Wasser und verändert die tatsächliche Konzentration der Lösung.
    4. Rühren Sie den Wirbelmischer 30 s bis 1 min lang, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten.
    5. Zur Herstellung einer 0,65-M-Lösung werden 427,5 mg Tartrazinpulver in 1 ml DI-Wasser19 gelöst. Für andere Konzentrationen siehe Tabelle 1.
      HINWEIS: Entsorgen Sie unbenutzte Farbstofflösungen und kontaminierte Materialien gemäß den üblichen Entsorgungsverfahren für chemische Abfälle.
  2. Für in vivo Proben
    1. Berechnen Sie die erforderliche Masse von Agarose-Mikropartikeln mit niedriger Schmelztemperatur und Tartrazin, um eine Konzentration von 0,65 M mit 0,4 % (4 mg/ml) Agarose-Hydrogellösung herzustellen.
      HINWEIS: Befolgen Sie beim Umgang mit allen Reagenzien die in Schritt 1.1.1 beschriebenen Standard-Sicherheitsvorkehrungen.
    2. Übertragen Sie die gewichteten Pulver in ein sauberes Glasfläschchen. Fügen Sie DI-Wasser mit einer volumetrischen Pipette hinzu.
    3. Stellen Sie das Fläschchen für ca. 10-15 min in einen auf 75 °C vorgeheizten Laborofen oder Ofen, bis sich die Agarosepartikel vollständig aufgelöst haben.
    4. Gelegentlich während des Erhitzungsprozesses mit einem Wirbelmischer mischen, um eine gleichmäßige Auflösung zu erzielen.
    5. Lassen Sie die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen. Wenn es sich in Gelform verfestigt, verwenden Sie den Vortex-Mixer für 30 s, um es wieder zu verflüssigen.
    6. Zur Herstellung einer 0,65 M Hydrogellösung lösen Sie 427,5 mg Tartrazinpulver und 4 mg Agarose in 1 ml DI-Wasser. Zur Herstellung von Lösungen anderer Konzentrationen halten Sie die Agarosekonzentration bei 0,4 % (4 mg/ml) und beziehen Sie sich auf Tabelle 1 für die entsprechende Tartrazinmasse17.

2. Optisches Clearing von ex vivo Geweben

  1. Probenvorbereitung
    1. Um Ex-vivo-Gewebe herzustellen, schneiden Sie Hähnchenbrustgewebe parallel zu den Kollagenfasern auf die gewünschte Dicke.
    2. Reinigen Sie das geschnittene Taschentuch vorsichtig mit Wasser.
    3. Messen Sie die Dicke, indem Sie das Gewebe zwischen zwei sauberen Objektträgern platzieren. Drücken Sie die Objektträger vorsichtig zusammen und messen Sie mit einem Messschieber den Abstand zwischen den Objektträgern in der Mitte des Gewebes.
    4. Tränken Sie das Taschentuch in der Färbelösung.
      ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Lösung größer ist als das Probenvolumen und dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist.
    5. Stellen Sie den Behälter auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie ihn 10 Minuten lang mit 100 Umdrehungen pro Minute.
    6. Lassen Sie das Gewebe 60 Minuten lang bei Raumtemperatur für niedrige Konzentrationen ≤0,4 M und bei 40 °C für höhere Konzentrationen >0,4 M in der Lösung.
  2. Bildgebung
    1. Entferne das Gewebe mit einer sauberen Pinzette aus der Färbelösung.
    2. Platzieren Sie die Probe zwischen zwei transparenten Objektträgern und nehmen Sie die Bilder mit einer Digital- oder Wissenschaftskamera mit geeigneten Auflösungs- und Vergrößerungseinstellungen auf.
    3. Führen Sie den Bildgebungsprozess in einer Umgebung mit kontrolliertem Licht durch, um Störungen durch externes Licht zu minimieren.
    4. Wiederholen Sie den Bildgebungsprozess für Gewebeproben mit unterschiedlichen Dicken und Farbstofflösungskonzentrationen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Verwenden Sie eine LED-Lichtquelle für die Hintergrundbeleuchtung. Es funktioniert jedoch genauso wie bei einer Lichtquelle mit Top-Beleuchtung.
  3. Optische Transmissionsmessungen
    1. Um die optische Transmission zu messen, legen Sie das Hühnergewebe zwischen zwei transparente Glasobjektträger und messen Sie die Transmission mit einem UV-Visible-NIR-Spektrometer (Abbildung 2C).
    2. Stellen Sie sicher, dass das System richtig ausgelegt ist und der Lichtstrahl vor und nach der Behandlung mit Farbstofflösungen durch denselben Bereich des Gewebes dringt, um die Konsistenz zu erhalten.
      HINWEIS: Zeichnen Sie die Transmissionsspektren über einen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 2000 nm mit einer mittleren Scangeschwindigkeit und einem Datenintervall von 1,0 nm auf. Der vollständige Spektralscan dauert ca. 5 Minuten pro Probe.

3. Optische Transparenz bei lebenden Tieren

  1. Zubereitung von Tieren
    1. Messen Sie vor dem Versuch das Gewicht des Tieres und notieren Sie sich das allgemeine Aktivitätsniveau, um eine physiologische Ausgangsbasis zu schaffen.
    2. Verwenden Sie ein Heizkissen mit einer Temperatur von 37 °C, um die Körpertemperatur des Tieres während des Versuchs zu halten.
      ACHTUNG: Überwachen Sie das Tier kontinuierlich, um eine Überhitzung zu vermeiden.
    3. Verabreichen Sie eine Anästhesie (nach institutionell anerkannten Protokollen) für die optische Bildgebung lebender Tiere auf der Grundlage von Bildgebungsstellen. Verwenden Sie für die abdominale Bildgebung Inhalationsanästhetika für eine schnelle Genesung und injizierbare Anästhesie für die Bildgebung des Gehirns.
    4. Für die Inhalationsanästhesie mit Isofluran bei 1,5 %-3 % und einer Flussrate von 0,8 l/min für etwa 5 Minuten vor dem bildgebenden Experiment induzieren und während des gesamten Experiments bei 1 %-2 % halten.
      VORSICHT: Überwachen Sie kontinuierlich das Atemmuster und die Atemtiefe des Tieres. Verwenden Sie einen gut belüfteten Bereich, um die Anästhesiebelastung des Personals zu minimieren.
    5. Für die injizierbare Anästhesie bereiten Sie einen Cocktail vor, der Ketamin HCL (16 mg/ml) und Dexmedetomidin HCL 0,2 mg/ml enthält. Dosierung entsprechend dem Tiergewicht und den genehmigten institutionellen Protokollen.
    6. Schneiden Sie das Fell mit einer Kleintierschermaschine aus dem gewünschten Bildgebungsbereich ab.
    7. Tragen Sie die Enthaarungscreme weniger als 60 s lang auf die getrimmte Hautpartie auf, um Resthaare zu entfernen. Entfernen Sie sofort die Creme und reinigen Sie die Haut mit Alkoholtüchern, um Hautreizungen zu vermeiden.
    8. Verwenden Sie Atipamezol als Umkehrmedikament für die injizierbare Anästhesie nach dem Experiment. Überwachen Sie das Tier während der Genesung und stellen Sie sicher, dass es zu normaler Atmung und Mobilität zurückkehrt, bevor es in seinen Heimatkäfig zurückkehrt.
  2. Verfahren zur Transparenz von Gewebe
    1. Bereiten Sie die Bildgebung vor, indem Sie ein auf 37 °C eingestelltes Heizkissen unter das Tier legen, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Richten Sie die Lichtquelle und die Kamera aus, um die Bilder aufzunehmen.
    2. Verwenden Sie zum Auftragen eine 0,65 M Tartrazin-Hydrogel-Lösung, die mit 0,3 % bis 0,4 % Agarosegel gemischt ist (Schritt 1.2).
    3. Tragen Sie die Lösung mit einer Pipette auf die Haut (Bauch oder Kopf, je nach Art des Experiments) auf und lassen Sie sie einige Sekunden einwirken, um die Resorption zu initiieren (Abbildung 3A).
    4. Schrubben Sie den Bereich vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um die Färbelösung gleichmäßig zu verteilen und die Hautabsorption zu erleichtern.
    5. Massieren Sie den Bereich sanft mit einem sauberen Wattestäbchen und tragen Sie mehr Lösung auf, bis die Haut anfängt, Transparenz zu zeigen und die inneren Organe sichtbar sind. Während der Resorption zeigt die Haut zunächst das Aussehen von orange-roten Punkten, die nach und nach zu einer einheitlichen Farbe verschmelzen. Diese Farbänderung ist ein wichtiger visueller Indikator für eine ausreichende Farbdurchdringung und den Beginn der optischen Reinigung.
      ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass die Lösung nicht über dem Anwendungsbereich kristallisiert - Kristallisation kann die Hautpassagen blockieren und die Aufnahme der Farbstoffmoleküle in die Haut behindern, was für das Erreichen der Transparenz von entscheidender Bedeutung ist. Eine ausreichende Absorption von Farbstoffmolekülen färbt die Hautfarbe orangerot.
    6. Massieren Sie den Bereich sanft weiter, bis die Haut Transparenz zeigt und die inneren Organe sichtbar werden. Dieser Vorgang dauert in der Regel etwa 3-5 Minuten nach dem Massieren für eine kleine Fläche, aber die Dauer kann je nach Tiergröße und Hautdicke variieren.
    7. Nehmen Sie Bilder mit der ausgerichteten Kamera auf. Passen Sie Fokus, Belichtung und Weißabgleich an, um die Bildqualität zu optimieren.
    8. Legen Sie vorsichtig ein Objektträger oder einen Deckslip auf die Haut, um den Glanz zu minimieren und die Reflexion für eine bessere Bildqualität zu reduzieren.
      VORSICHT: Behandeln Sie alle chemischen Lösungen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) und entsorgen Sie gebrauchte Materialien gemäß den Entsorgungsprotokollen für chemische Abfälle der Einrichtung.

4. Erhöhung der Sichtbarkeit von Organen durch Bildverarbeitung

  1. Schritte der Bildverarbeitung
    1. Für die Bildverarbeitung wird Python mit OpenCV verwendet. Importieren Sie OpenCV, numpy, matplotlib und PyWavelets.
    2. Laden und normalisieren Sie das Originalbild. Laden Sie das ursprüngliche .tif-Bild mit hoher Bittiefe. Wenn ein Pixelwert 255 überschreitet, normalisieren Sie alle Pixel auf den Bereich [0, 255].
    3. Schneiden Sie den Interessenbereich (ROI) zu. Rufen Sie den ROI-Selektor von OpenCV auf, um einen Begrenzungsrahmen um den Organbereich zu zeichnen. Fahren Sie fort, indem Sie für alle nachfolgenden Schritte nur die zugeschnittene Version verwenden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Begrenzungsrahmen den Zielbereich fest umschließt, ohne relevante Strukturen abzuschneiden.
    4. Aufgeteilt in LAB-Kanäle. Konvertieren Sie das zugeschnittene Farbbild in den LAB-Farbraum und teilen Sie es in die Kanäle L (Helligkeit), A und B auf.
      HINWEIS: Bilder werden in Farbe verarbeitet, daher wurde der Lab-Farbraum verwendet, wobei Bildverarbeitungstechniken nur auf den L-Kanal angewendet wurden, in dem sich die Pixelintensitäten befinden.
    5. Analysieren Sie die Pixelintensitätsverteilung. Erstellen Sie ein Histogramm des L-Kanals, um die Kontrast- und Intensitätsverteilung zu bewerten.
      HINWEIS: Verwenden Sie das Histogramm, um zu überprüfen, ob eine Kontrastverstärkung erforderlich ist, und um die Parameterauswahl für die Kontrastverstärkung zu steuern. Sie möchten, dass Ihr Histogramm über [0, 255] verteilt wird.
    6. Wenden Sie CLAHE (Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization) an, um den lokalen Kontrast zu verbessern. Erstellen Sie ein CLAHE-Objekt mit clipLimit = 5.0 und tileGridSize = (16,16). Führen Sie CLAHE auf dem L-Kanal aus und führen Sie den CLAHE-erweiterten L-Kanal mit den ursprünglichen A- und B-Kanälen zusammen. Konvertieren Sie CLAHE bei Bedarf von LAB in RGB zur Visualisierung.
      HINWEIS: Wenn das Histogramm überverstärktes Rauschen (Spikes) anzeigt, passen Sie 'clipLimit' oder 'tileGridSize' an und wenden Sie es erneut an, um einen ausgewogenen lokalen Kontrast zu erzielen.
    7. Entrauschen Sie das kontrastverstärkte Bild. Führen Sie eine 2-stufige diskrete Wavelet-Zerlegung auf dem normalisierten CLAHE L-Kanal (skaliert [0, 1]) mit einem weichen Schwellenwert von 0,1 durch. Rekonstruieren Sie den entrauschten L-Kanal, skalieren Sie zurück auf [0, 255] und führen Sie den entrauschten L-Kanal mit den ursprünglichen A- und B-Kanälen zusammen. Zeigt das ursprüngliche zugeschnittene Farbbild im Vergleich zum Wavelet-entrauschten Ergebnis an.
      HINWEIS: Die Wavelet-Rauschunterdrückung reduziert kleine Fluktuationen, die in einheitlichen Bereichen als Vordergrund fehlinterpretiert werden könnten.
    8. Segmentieren Sie Interessenorgane über das Adaptive Thresholding von Otsu. Berechnen Sie den Schwellenwert von Otsu auf dem entrauschten L-Kanal. Subtrahieren Sie eine Verzerrung von 15 vom Schwellenwert, um Organregionen mit geringer Intensität einzubeziehen.
      1. Wenden Sie einen binären Schwellenwert mit dem Bias-Wert an, um eine Maske der Organpixel zu erhalten. Führen Sie die Maske mit den ursprünglichen A- und B-Kanälen zusammen und konvertieren Sie sie zur Anzeige in RGB.
        HINWEIS: Die Bias-Einstellung erzwingt die Einbeziehung von Organregionen unter den Gefäßen. Passen Sie die Verzerrung bei Bedarf für ein anderes Dataset erneut an.
    9. Fahren Sie wie gewünscht mit der Analyse fort.

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Ergebnisse

Demonstration der optischen Transparenz in ex vivo Hühnerbrustgewebe
Um die Lichtausbreitung durch ex vivo-Gewebe zu untersuchen, verwendeten wir in Scheiben geschnittene Stücke roher Hähnchenbrust ohne Knochen mit Dicken von 1,5 mm, 2,5 mm und 3,5 mm (Abbildung 2B). Das Gewebe wurde parallel zu den Kollagenfasern geschnitten, um eine gleichmäßige Ausrichtung der Muskelfasern zu gewährlei...

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Diskussion

Diese Arbeit stellt eine umfassende und reproduzierbare Protokollmethode vor, um optische Transparenz in biologischen Geweben unter Verwendung absorbierender Moleküle zu erreichen, insbesondere des von der FDA zugelassenen Lebensmittelfarbstoffs Tartrazin (zugelassen für die Verwendung in Lebensmitteln, nicht in medizinischen Anwendungen). Diese Methode minimiert effektiv die intrinsische Streuung im Gewebe, indem sie den Brechungsindex in der Mikroumgebung des Gewebes verändert, was die...

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

ZO dankt der University of Texas in Dallas für die Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Analytische WaageHZKFA220S
Anästhesiegerät für TiereRWD Life Science CoTAIJI-IEInhalations-Anästhetika
Atipamezol HCL Injektion 5 mg/mlCovertus82124Injizierbare Anästhesie
CMOS-KameraThor-LaboreCS165CU/M, Zelux
Dexmedetomidin HCL Injektion 5 mg/10 mLCovertus72960Injizierbare Anästhesie
Faser-Licht-IlluminatorRWD Life Science Co76301Lichtquelle für Top-Ausleuchtung
Objektträger aus GlasCravitySci0303-2122Mikroskopische Objektträger in Superqualität
Homötherme DeckeRWD Life Science Co69027Temperaturregler für Tiere
BildverarbeitungOffene CVPythonSoftware
Insulinspritze 0,5 mL 29 gKomfort-Punkt26028Injizierbare Anästhesie
IsofluranCovertusSKU-029405Inhalations-Anästhetika
Kemmin HCL Injektion 100 mg/mlDechra20042240Injizierbare Anästhesie
LED-LichtquelleGGE CorpTLB-01Lichtquelle für Top-Ausleuchtung
LinseThor-LaboreMVL4WA3,5 mm Brennweite und f/1,4 Blende
NairKirche & Kirche DwightL 1224Haarentfernung Creme
PBS ph 7,4 (1x)Gibco2902869Injizierbare Anästhesie
Q-TippPuritanisches Unternehmen für Medizinprodukte806-WC Krankenhaus
SeaPlaque AgaroseLonza50101Chemisch
TartrazinMilliporeSigmaCAS-Nummer: 1934-21-0Chemisch
Pipette übertragenFisherbrand13-711-9AMMD
UV-VIS-NIR-SpektrophotometerShimadzuSolidSpec-3700iInstrument
FläschchenQorpak242633
Volumetrische PipettenEppendorf research plus3123000063100-1000 & Mikro; L
WasseraufbereitungssystemAviditätswissenschaftSOLO SInstrument

Referenzen

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Schlagwörter

Ex vivo BildgebungGewebekl rungTartrazin FarbstoffLichtstreuungBrechungsindexbiomedizinische Bildgebungoptische Transmission

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