Subnanometer-Auflösung Strukturbestimmung von Hämagglutinin aus der Kryo-Elektronentomographie von Influenzaviren

Die Kryo-Elektronentomographie (KryoET) wurde in den letzten Jahrzehnten eingesetzt, um Schnappschüsse von Proteinkomplexen, Viren, Zellen und Organismen zu erfassen. KryoET ist eine Modalität der Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und eine strukturbiologische Methode, bei der eine biologische Probe schockgefroren und dann durch Kippen^{von 1,2,3} in einer Vielzahl von Ausrichtungen abgebildet wird. Bilder, die bei jeder Ausrichtung aufgenommen wurden, werden dann rechnerisch auf ihre gemeinsame Neigungsachse ausgerichtet und in ein Tomogramm rekonstruiert, um eine dreidimensionale Ansicht zu erhalten⁴.

Während bei der Röntgenkristallographie und der Einzelpartikel-KryoEM gereinigte, strukturell homogene Moleküle benötigt werden, kann die KryoET ein Molekül direkt in seinem nativen Kontext abbilden⁴. Daher ist ein Hauptvorteil der KryoET ihre Fähigkeit, pleomorphe Proben, wie z. B. membranöse Viren, einschließlich Influenza ^5,6,7, sichtbar zu machen. Ein weiteres Versprechen von cryoET ist seine Fähigkeit, skalenübergreifend abzubilden. Während Tomogramme typischerweise nicht über 5-10 nm hinaus aufgelöst werden⁸, kann die Integration der Subtomogramm-Mittelwertbildung, bei der Kopien desselben Partikels identifiziert, ausgerichtet und gemittelt werden, in einigen biologischen Molekülen, wie z. B. Ribosomen ^9,10, zu einer nahezu atomaren Auflösung führen. Allerdings können nur begrenzte Arten von Molekülen diese Auflösung erreichen; Subtomogramm-Mittelwerte überschreiten in der Regel nicht die Auflösung von 10-15 Å. Im Gegensatz dazu erreicht die Einzelpartikel-KryoEM nach der Auflösungsrevolution¹¹ routinemäßig Auflösungen von 3-4 Å. Jüngste Fortschritte sowohl bei der höheren Durchsatzleistung von KryoET-Datenerfassungs- als auch bei der Analysesoftware haben die Strukturbestimmung zusätzlicher biologischer Moleküle mit Subnanometerauflösung in ihrem nativen Kontext ermöglicht 12,13,14,15,16,17,18.

Eine häufige Anwendung für KryoET ist die Visualisierung der Morphologie, Organisation und Struktur von Viren. Trotz der geringeren Auflösung, die diese Technik im Vergleich zur Einzelpartikel-KryoEM oder Röntgenkristallographie bietet, kann die KryoET in Kombination mit der Subtomogramm-Mittelung Aufschluss darüber geben, wie sich virale Proteine in ihrer natürlichen Umgebung verhalten, und wichtige Details über ihre Organisation im Kontext des Virions liefern. Ein häufiges Ziel für die KryoET von Viren sind die Oberflächenglykoproteine, die üblicherweise für die Anheftung und Fusion von Wirtszellen verwendet werden, da sie oft die Hauptantigene und Ziele für Therapeutika oder Impfstoffe sind. Mit den jüngsten Fortschritten bei KryoET-Verarbeitungspaketen ist es zunehmend möglich geworden, eine durchschnittliche Auflösung von Subnanometern für diese Glykoproteine zu erreichen 19,20,21,22. Ein solches Beispiel ist Hämagglutinin (HA), das Hauptprotein auf der Oberfläche von Influenza-Virionen. Dieses Protein leitet nicht nur sowohl die Rezeptorbindung als auch die Membranfusion, sondern bedeckt das Virion auch auf unglaublich dichte Weise, mit Hunderten bis Tausenden von HAs auf einem einzigen Virion⁵. Das hier vorgestellte Protokoll (Abbildung 1) integriert mehrere häufig verwendete Pakete mit hauseigenen Skripten, um die Stadien von der Vorverarbeitung bis zur Modellverfeinerung für einen Subtomogramm-Durchschnitt von Influenza HA abzugrenzen.

HINWEIS: Beispieldatensätze, die für dieses Protokoll verwendet werden, können unter EMPIAR-12864 abgerufen werden, einschließlich der beiden Sätze von Neigungsreihen, die für dieses Protokoll verwendet werden. Die Tilt-Reihen werden aus manuell getauchten Gittern von gereinigten Influenza-A-Viren mit einer physikalischen Pixelgröße von 2,09 Å/Pixel gesammelt, um ein ausreichend großes Sichtfeld zu gewährleisten, so dass jede Tilt-Serie mehrere Virionen enthält, und um Rekonstruktionen mit der höchstmöglichen Auflösung zu ermöglichen. Für eigene Datasets empfiehlt es sich, den Workflow mit Raw-Tilt-Filmen zu starten. Diese Datensätze wurden mit Hilfe von Hochleistungs-Workstations verarbeitet und visualisiert. In der Materialtabelle sind die für dieses Protokoll verwendete Hard- und Software aufgeführt. Alle Softwarepakete, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind Open Source und stehen zum Download zur Verfügung. Installationslinks und -anweisungen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die empfohlene Workstation für die Verarbeitung von KryoET-Datensätzen sollte mit mindestens einem 8-Kern-Prozessor, einer dedizierten GPU-Karte mit 6 GB VRAM, 64 GB RAM und 2 TB lokalem Speicher ausgestattet sein.

1. Datenvorverarbeitung von Tilt-Filmen und Rekonstruktion von Kryo-Elektronen-Tomogrammen in Warp ²³ und IMOD ²⁴

1. Aktivieren Sie in einem Terminal eine Conda-Umgebung, in der Warp installiert ist, indem Sie den folgenden Befehl verwenden:
   conda activate warp_environment
2. Erstellen Sie eine Rahmenserien-Einstellungsdatei für die Verarbeitung von Rahmenserien. Hierbei handelt es sich um eine Konfigurationsdatei, die Metadaten über das Mikroskop, den Speicherort der zu verarbeitenden Daten und den Speicherort der Ausgabedateien enthält.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   HINWEIS: Diese Daten wurden im Superauflösungsmodus gesammelt.
3. Führen Sie eine Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) und eine Bewegungskorrektur durch.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   HINWEIS: m_grid Parameter sollte der Anzahl der Subframes innerhalb eines Tilt-Films entsprechen - unsere Datensätze bestanden aus 5 Subframes pro Tilt-Film.
4. Importieren Sie Metadaten von Tilt-Serien, damit WarpTools erkennen kann, welche Filme zu welcher Tilt-Serie gehören.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. Nachdem der Ordner tomostar gefüllt wurde, erstellen Sie eine Einstellungsdatei für die Neigungsserien für die Verarbeitung von Neigungsserien
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Schreiben Sie Tilt-Stacks aus und führen Sie eine automatisierte fiducial-basierte Ausrichtung von Tilt-Serien mit dem IMOD-Programm batchruntomo unter Verwendung der Etomo GUI²⁴ durch.
   1. Führen Sie den folgenden Befehl im Terminal aus:
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      HINWEIS: Die Neigungsserien wurden mit dem 4-fachen der physischen Pixelgröße exportiert, um die Ausrichtungszeit und den Rechenaufwand zu verringern.
   2. Wählen Sie ein Beispieldataset aus, um zuerst Ausrichtungsparameter festzulegen, bevor Sie sie als Vorlage für batchruntomo anwenden.
   3. Importieren Sie Ausrichtungsparameter aus IMOD, wenn batchruntomo verwendet wird.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      HINWEIS: Für diesen Datensatz führte die Verwendung der Etomo-GUI zu besseren Ergebnissen als die Wrapper in WarpTools.
   4. Alternativ können Sie auch eine automatische Ausrichtung der Tilt-Serien ohne Passerverlust mit dem AreTomo²⁵ Wrapper in WarpTools durchführen.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      HINWEIS: Der AreTomo-Wrapper wurde mit AreTomo1.3.4 getestet.
7. Führen Sie den folgenden Befehl im Terminal aus, um die CTF-Parameter für die Neigungsreihe zu schätzen:
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. Rekonstruieren Sie Tomogramme mit WarpTools.
   1. Umgebungsvariable setzen:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass Tomogramme mit nachfolgenden Phasen der Bildverarbeitung und Visualisierung in anderen Softwares kompatibel sind, die in diesem Protokoll verwendet werden.
   2. Um Tomogramme zu rekonstruieren, führen Sie in einem Terminal aus: WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.8.2 für alle Datensätze.

2. Tomogramm-Vorverarbeitung und Partikel-Picking

1. Aktivieren Sie in einem Terminal eine Conda-Umgebung, in der IsoNet²⁶ installiert ist.
   conda activate isonet_env
2. Bereiten Sie die Tomogrammverarbeitung vor, indem Sie zuerst einen Unterordner erstellen und alle Tomogramme in diesen Ordner verschieben.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. Generieren Sie eine Sterndatei im Projektordner.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. Öffnen Sie mit einem Texteditor die generierte Sterndatei und geben Sie den ungefähren Unschärfewert für die 0-Grad-Neigungsbilder in die vierte Spalte (_rlnDefocus) für jedes Tomogramm ein, die sich in der processed_items.json Datei im Ordner warp_tiltseries befindet.
   HINWEIS: Der Defokussierungswert sollte für IsoNet in Ångström angegeben werden. Warp schreibt Defokussierungswerte in μm aus, was einen Multiplikationsfaktor von 10.000 erfordert.
5. Führen Sie den Befehl CTF deconvolve im Terminal aus.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. Initiieren Sie nach der Dekonvolvierung EMAN2 GUI²⁷ , um mit der Vorverarbeitung von Tomogrammen für die Partikelauswahl zu beginnen.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. Klicken Sie unter Tomographie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben Rohdaten und wählen Sie Tomogramme importieren aus dem Dropdown-Menü.
8. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben Segmentierung und wählen Sie Tomogramme vorverarbeiten.
   HINWEIS: Die Standardparameter sind wahrscheinlich für viele Datensätze geeignet. Für diese Tomogramme wurde ein Tiefpassfilter bei 4 Å angewendet und Tilt-Bilder normalisiert. Nach der Vorverarbeitung wird von EMAN2 automatisch ein Info-Verzeichnis mit leeren .json Dateien (mit ähnlichen Basisnamen wie vorverarbeitete Dateien) erzeugt. Das Angpix muss vor der Partikelauswahl zu den JSON-Dateien hinzugefügt werden.
9. Trainieren Sie das Convolutional Neural Network (CNN), um HA-Glykoprotein zu erkennen.
   1. Ändern Sie das Arbeitsverzeichnis in den Speicherort der Tomogramme, die für das CNN-Training und die Partikelauswahl verwendet werden sollen:
      cd path/to/tomograms
   2. Verwenden Sie das Terminal, um das CNN-Trainingsfenster zu öffnen.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. Vergewissern Sie sich, dass vier Fenster geöffnet sind: eines mit den Informationen zu CNN-Parametern und Tomogrammen im Verzeichnis und die anderen drei Fenster mit Bildern von guten Referenzen (positiv), schlechten Referenzen (negativ) und von CNN ausgewählten Partikeln (Partikel).
   4. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Schaltfläche Neu in der CNN-GUI, um ein neues CNN zu initialisieren. Legen Sie die Standardlernrate auf 0,0001 und die Boxgröße auf 8 fest.
   5. Klicken Sie in der Spalte Dateiname mit der linken Maustaste auf ein repräsentatives Tomogramm, um es in einem neuen Fenster zu öffnen.
      HINWEIS: Es kann jeweils nur ein Tomogramm geöffnet sein.
      1. Um sich durch die z-Achse eines Tomogramms zu bewegen, platzieren Sie den Cursor über dem geöffneten Tomogramm und drücken Sie das Scrollrad der Computermaus, um ein neues Fenster zu öffnen. Der Schieberegler mit der Bezeichnung N# ändert die Z-Achse.
   6. Wählen Sie im geöffneten Tomogramm mit der linken Maustaste im positiven Bereich 10-20 Merkmale aus, die HA entsprechen.
      HINWEIS: Wählen Sie sowohl die Draufsicht als auch die Seitenansicht von HA aus, die entweder als Zylinder oder Dreiecke über der Membran angezeigt werden, als gute Referenz für ein robusteres Netzwerk.
      1. Bilder von positiven Referenzen werden im Fenster "Positiv" angezeigt. Um eine Referenz zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und klicken Sie mit der linken Maustaste auf ein Referenzbild.
   7. Wechseln Sie zum negativen Bereich, und wählen Sie 10-20 Referenzen aus, die Merkmalen wie leeren Membranfeldern, vRNP-Dichte, Passermarkenmarkern und Ablagerungen entsprechen.
      HINWEIS: Referenzen werden im Fenster Negativ angezeigt.
   8. Starten Sie das CNN-Training, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Schaltfläche Trainieren im Hauptfenster klicken.
      HINWEIS: Die Anzahl der Iterationen (Niter) im Hauptfenster ändert die Anzahl der Iterationen des Trainings, die das CNN durchläuft. Es wird empfohlen, den Parameter auf 50 zu setzen.
   9. Nachdem das CNN mit den ausgewählten Referenzen trainiert wurde, klicken Sie mit der linken Maustaste auf Anwenden , um das CNN zum Auswählen von Partikeln im geöffneten Tomogramm zu verwenden.
      HINWEIS: Bilder von ausgewählten Partikeln können im Fenster "Partikel" angezeigt werden. Ausgewählte Partikel werden auch auf dem Tomogramm in blauen Kreisen angezeigt.
   10. Wählen Sie weiterhin positive und negative Referenzen basierend auf dem angewendeten Netzwerk aus, und speichern Sie den Fortschritt regelmäßig über die Schaltfläche Speichern .
   11. Wenn die Zufriedenheit zufriedenstellend ist, wählen Sie Alle anwenden , damit das CNN Partikel in allen Tomogrammen im Verzeichnis auswählt und die Ergebnisse für mehrere Tomogramme auswertet. Führen Sie bei Bedarf zusätzliche Schulungen durch.
10. Speichern Sie die Koordinaten für jedes Tomogramm in einer Textdatei.
    1. Öffnen Sie die EMAN2-GUI mit dem e2projectmanager.py Befehl.
    2. Klicken Sie auf den Pfeil neben Subtomogramm-Durchschnitt und dann auf Manuelles Boxen.
    3. Geben Sie den Namen eines Tomogramms ein und klicken Sie auf Starten.
    4. Speichern Sie die Koordinaten in der Textdatei, indem Sie Datei auswählen > Box-Coord > tomogram_ha.txt speichern.
    5. Navigieren Sie zu den Unterordnern neuralnets und info, um nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf und boxes3dref.hdf zu sichern.
11. Um sicherzustellen, dass die Analyse nur an vollständig assemblierten Virionen durchgeführt wird, bei denen das Vorhandensein der Matrix-Proteinschicht (M1) und des viralen Ribonukleoprotein-Komplexes (vRNP) offensichtlich ist, trainieren Sie ein zweites konvolutionales neuronales Netzwerk, um das M1-Protein zu erkennen.
    1. Befolgen Sie das gleiche Protokoll wie in Schritt 2.9 beschrieben, und ändern Sie die Größe der Trainingsbox von 8 auf 14.

3. Kuration von Partikeln

1. Laden Sie Notizbücher von https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis herunter.
2. Öffnen Sie das Notebook CNN_Particle_Cleaning.ipynb , und laden Sie die erforderlichen Module.
   HINWEIS: Das Skript verwendet Open3D²⁸ als Paket, um Partikelkoordinaten als 3D-Punktwolken zu visualisieren.
3. Laden Sie Textdateien, die den HA- und M1-Koordinaten entsprechen, und betrachten Sie sie als 3D-Punktwolken mit dem Open3D-Paket.
4. Filtern Sie HA-Koordinatenausreißer heraus, indem Sie statistische Ausreißerentfernung verwenden, wie sie in Open3D implementiert ist.
   HINWEIS: Die empfohlenen Anfangswerte für HA sind nb_neighbors = 50 (Anzahl der benachbarten Koordinaten um eine Koordinate) und std_ratio = 0,5.
5. Berechnen Sie den Abstand zwischen den Punktwolken HA und M1. Alle HA-Koordinaten, die mehr als 20 Pixel von der M1-Punktwolke entfernt sind, werden dann als Ausreißer identifiziert. Alle Partikelkoordinaten, die nicht als Ausreißer identifiziert wurden, werden in einer Ausgabedatei .txt gespeichert.
   HINWEIS: 20 Pixel entsprechen einem ungefähren Abstand von 16 nm bei einer Pixelgröße von 8,35 Å/Pixel. Das Zentrum eines HA-Trimers zur M1-Schicht beträgt in unseren Tomogrammen etwa 15 nm.
6. Verketten Sie alle Partikel und speichern Sie sie als Sterndateien mit pts2starfile.ipynb.

4. Iterative Subtomogramm-Mittelung und -Klassifizierung

1. Extrahieren Sie mit WarpTools Partikel mit einem Binning-Faktor von 4 und führen Sie erste Runden der Subtomogramm-Mittelung in RELION4²⁹ durch.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   HINWEIS: Die empfohlene Boxgröße von 48 x 48 x 48 Pixeln, entspricht einer Box von ~360 ų, die groß genug wäre, um ein Array von 7-8 HA aufzunehmen.
   1. Konvertieren Sie Warp Starfile in RELION 4 kompatible Datei
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. Generieren Sie eine Anfangsreferenz mit relion_refine_mpi für eine Teilmenge von Partikeln.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. Verwenden Sie relion_refine_mpi, um die 3D-Autoverfeinerung für die Subtomogramme durchzuführen.
      1. Beispiel-Befehl: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         HINWEIS: Die anfängliche globale und lokale Abtastung wurde auf 7,5 und 1,8 Grad eingestellt, was einer Healpix-Ordnung von 4 und einer lokalen Healpix-Ordnung von 2 entspricht. Die ersten Verfeinerungen nutzen vor allem die starke Dichte der Membran, des M1-Proteins und des HA-Arrays. Der Translationsoffset-Bereich darf größer sein, um alle Verschiebungen zu berücksichtigen, die beim Ausrichten des Arrays auftreten können.
   4. Wiederholen Sie die Verfeinerung, nachdem der erste Verfeinerungslauf konvergiert ist, und ändern Sie die Translation in 8 und den Schritt in 2.
2. Nutzen Sie die 2D-Klassifizierung, um Junk-Partikel mithilfe von relion_refine zu entsorgen.
   1. Beispiel-Befehl: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      HINWEIS:Die 2D-Klassifizierung wurde anstelle der 3D-Klassifizierung verwendet, da sie recheneffizienter ist. Subtomogramme können ohne zusätzliche Bildverarbeitung direkt als Eingabe für den 2D-Klassifizierungsauftrag verwendet werden.
   2. Kombinieren Sie Klassen, die ein identifizierbares HA-Array mit zylindrischer HA-, Membran- und M1-Dichte enthalten, mithilfe von relion_star_handler.
   3. Erstellen Sie zunächst Sterndateien, die gute Klassen enthalten.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. Verwenden Sie dann den folgenden relion_star_handler Befehl, um die einzelnen Sterndateien zu kombinieren.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. Re-Extraktion bei bin2 und nicht binnierten Partikeln für eine iterative lokale Verfeinerung.
   1. Extrahieren Sie für die Bin2-Verfeinerung Partikel mit einer kleineren Boxgröße von 80 und führen Sie eine lokale Suche durch, bei der sowohl healpix als auch local healpix auf 4 eingestellt sind (1,8 Grad lokale Winkelprobe).
   2. Kombinieren Sie in dieser Phase Partikelsätze aus verschiedenen Datensätzen mithilfe von relion_star_handler.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. Erstellen Sie nach der ersten Verfeinerungsrunde eine zylindrische Maske mit e2filtertool.py innerhalb der EMAN2-Umgebung, die die zentrale HA-plus-Membran und die M1-Dichte umfasst.
      HINWEIS: Für die zylindrische Maske verwendete Parameter: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; Alle anderen Parameter sind deaktiviert.
   4. Führen Sie eine zusätzliche Verfeinerungsrunde mit der aufgetragenen Maske durch.
   5. Führen Sie eine weitere Runde der 2D-Klassifizierung durch, um Ausreißer zu eliminieren, die nicht mit der zentralen Hochverfügbarkeit und zusätzlichen Ablagerungen übereinstimmen.
   6. Wiederholen Sie den Vorgang mit nicht binnierten Partikeln mit einer Quadergröße von 120 und erstellen Sie eine weiche Maske, die die zentrale HA abdeckt, richten Sie die Referenz an der C3-Symmetrie aus und wenden Sie in dieser Verfeinerungsphase Symmetrie an.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      HINWEIS: Die endgültige Auflösung, die mit RELION erreicht wurde, betrug 6,1 Å.
4. Letzte Verfeinerung in MTools⁹
   1. Erstellen Sie eine Verfeinerungspopulation (nach Aktivierung der Warp-Conda-Umgebung).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. Fügen Sie Datenquellen für jedes Dataset hinzu.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit weiteren Datasets.
   3. Erstellen Sie die Verfeinerungsart.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. Multi-Partikel-Verfeinerung.
      1. Verfeinern Sie zunächst die Partikelposen mit dem Befehl: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. Verfeinern Sie anschließend sowohl die Partikelposen als auch die sphärische Aberration mit dem Befehl: MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         HINWEIS: Die Verfeinerung wurde hier gestoppt, da weitere Iterationen die Auflösung nicht verbesserten. Unterschiedliche Kombinationen von Parametern, die nicht erschöpfend getestet wurden, können jedoch die Ergebnisse weiter verbessern.

5. Verfeinerung des Modells

1. Laden Sie mit ChimeraX³⁰ die endgültige Karte und ein atomares Modell von HA ein.
2. Ordnen Sie alle Segmente zu, und kombinieren Sie sie, und verwenden Sie das Werkzeug An Segmente anpassen , um sie im HA-Modell anzudocken.
   1. Speichern Sie die transformierten Koordinaten des Modells.
3. Öffnen Sie die Phenix GUI³¹ und verwenden Sie das Real Space Refinement-Werkzeug .
   1. Wenn Sie aufgefordert werden, Dateien hinzuzufügen, fügen Sie das transformierte HA-Modell und die Karte hinzu, und geben Sie die Auflösung der endgültigen Rekonstruktion ein.
   2. Durchführung von fünf Runden der globalen Minimierung, der lokalen Rotamer-Anpassung, der Belegungsverfeinerung und der Gruppen-ADP-Verfeinerung.
4. Visualisieren Sie die endgültige Rekonstruktion und modellieren Sie mit ChimeraX.

Um die Verwendung dieses Verarbeitungsprotokolls zu demonstrieren (Abbildung 1), wurde der zuvor skizzierte Arbeitsablauf auf zwei Datensätze von 25 Tomogrammen angewendet, die von einem H1N1-Influenza-A-Virusstamm gewonnen wurden (A/Puerto Rico/8/1934). Die Parameter für die Datenerfassung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Tomogramm und vergrößerte Ansichten von pleomorphen Influenza-Virionen. In diesem Tomogramm werden unterschiedliche Morphologien erfasst, da die Virionen von kugelförmig bis oval/länglich reichen. Während die meisten Influenzapartikel gut organisierte M1- und vRNP-Anordnungen enthalten, scheinen einige Virionen unorganisierter zu sein und es fehlen wichtige Strukturkomponenten.

Aus diesem Datensatz wurde ein anfänglicher Satz von 40.995 Subtomogrammen für die Bin4-Rekonstruktion (8,35 Å/pix) nach Partikelauswahl und Kuration verwendet. Die beiden Datensätze wurden zunächst unabhängig voneinander in RELION4 mit C1-Symmetrie und einer breiten sphärischen Maske verarbeitet, die das gesamte HA-Array umfasste. Für diese Subtomogramme wurden drei Verfeinerungszyklen durchgeführt, gefolgt von einer 2D-Klassifizierung. Nach der Klassifizierung wurden schlecht aufgelöste Subtomogramme und Junk-Partikel verworfen; Die restlichen Subtomogramme wurden bei bin2 (4,17 Å/pix) extrahiert und die beiden Datensätze wurden kombiniert. Bin2-Subtomogramme wurden zunächst in einer Runde der Subtomogramm-Mittelung aneinander ausgerichtet, dann wurde eine zylindrische Maske um die zentrale HA angewendet, um die Fokusausrichtung zu gewährleisten. In diesem Stadium kann die trimere Symmetrie für die HA-Rekonstruktion deutlich sichtbar gemacht werden. Weitere Verfeinerungsrunden wurden bei bin2 und bei 2,8 Å/pix durchgeführt. Eine letzte Runde der 2D-Klassifizierung wurde mit einer kleinen Maske durchgeführt, die nur das zentrale HA-Trimer mit ausgerichteten Subtomogrammen bedeckte. Die Hauptklasse, bestehend aus ~94% der verbleibenden Subtomogramme, wurde in nicht binnierte Partikel extrahiert und einer 3D-Verfeinerung unter Anwendung der C3-Symmetrie unterzogen. Schließlich wurden diese Subtomogramme nach M exportiert, wo Partikelposen und Verfeinerungszyklen für sphärische Aberrationen durchgeführt wurden (ergänzende Abbildung 1).

Der endgültige Subtomogramm-Mittelwert (Abbildung 3A), bestehend aus 15.970 HA-Partikeln, erreichte eine globale Auflösung von 6,0 Å und einen lokalen Auflösungsbereich von 5-7 Å (Abbildung 4). Ein Modell von PR8 HA wurde flexibel in die Dichte veredelt; bei FSC=0,5 und FSC=0,143 betrug die Map-to-Model-Auflösung 8,1 Å bzw. 6,6 Å. Die Architektur der HA-Rekonstruktion ähnelte stark früheren KryoEM- und KryoET-Karten. Bei dieser Auflösung können Alpha-Helices und Beta-Faltblätter unterschieden werden (Abbildung 3B); Darüber hinaus können Glykane an vier Glykosylierungsstellen am HA-Kopf und -Stamm identifiziert werden (Abbildung 3C).

Unsere Ergebnisse zeigen die Eignung von cryoET bei der Rekonstruktion von HA aus nativen Influenza-Virionen. Im Rahmen des Protokolls wurde eine klare Dichte für das zylindrische Glykoprotein senkrecht zur Virusmembran beobachtet, und die Auflösung verbesserte sich mit jedem Schritt. Für die eigenen Daten wird vorgeschlagen, dass die Subtomogramm-Mittelung von einem binned Particle Stack ausgehen sollte, und die Ergebnisse sollten bei jedem Verfeinerungszyklus genau überwacht werden. Wenn die Glykoproteindichte in der Anfangsphase nicht sichtbar ist, wird empfohlen, die Subtomogramm-Positionen wieder auf das Tomogramm abzubilden, um die genaue Positionierung zu überprüfen. Andernfalls kann man die Ausrichtungsparameter optimieren oder zusätzliche Klassifizierungsstufen implementieren, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Abbildung 1: Gesamtpipeline für die Subtomogramm-Mittelwertbildung von HA aus KryoET von Influenzaviren. Der obere Bereich stellt einen zusammenfassenden Workflow für die beiden Datensätze dar, die zur Veranschaulichung des Protokolls verwendet werden. Das zweite Feld entspricht Abschnitt 1 des Protokolls, das dritte Feld entspricht den Abschnitten 2-3 und das vierte Feld entspricht den Abschnitten 4-5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentatives Tomogramm des PR8-Influenzavirus. (A) Schnitt durch rekonstruiertes Tomogramm. Die Maßstabsleiste beträgt 100 nm. (B-D) Vergrößert in Ansicht von (B) sphärisches, (C) zylindrisches, (D) M1-loses PR8-Virion. Alle Maßstabsbalken in B-D entsprechen 50 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Subtomogramm-Mittelwert von PR8 HA. (A) Draufsicht und Seitenansicht der HA-Rekonstruktion auf zwei Konturebenen, flexibel bestückt mit einer PR8 HA Einzelpartikel-KryoEM-Struktur. (B) Beschnittene Ansichten durch die HA-Rekonstruktion. Farbige Pfeile entsprechen farbigen Kästchen. (C) HA-Rekonstruktion an der unteren Kontur zur Darstellung der Glykandichte. Nahaufnahmen von Glykanen in der Stick-Darstellung in der KryoET-Karte sind ebenfalls zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schätzung der Auflösung des HA-Subtomogramm-Durchschnitts. (A) Schätzung der lokalen Auflösung des HA-Subtomogramm-Durchschnitts, abgebildet auf die Rekonstruktion. Der Farbbalken zeigt 5-7 Å auf der Blau-Weiß-Rot-Palette an. (B) FSC-Kurven von halben Karten und mit einer Karten-zu-Modell-Auflösung. Die blaue Kurve zeigt die unmaskierte Rekonstruktion und die rote die maskierte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Parameter der Datenerhebung für KryoET-Datensätze des PR8-Influenzavirus.

Ergänzende Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Subtomogramm-Mittelung für HA. Iteratives Alignment, Amitteling und Klassifizierung werden für HA-Subtomogramme durch schrittweises Unbinning durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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