Method Article

Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonische (SLAM)-Mikroskopietechnik, einschließlich Details zur Erzeugung der Laserlichtquelle, zur Vorbereitung einer Gewebeprobe, zur Durchführung der Bildgebung und zur Analyse der Daten. SLAM entwickelt die nichtlineare Mikroskopie weiter, indem es vier komplementäre markierungsfreie Kontraste misst, um die Mikroumgebung des Gewebes zu untersuchen.

Abstract

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Die nichtlineare optische Mikroskopie bildet biologische Proben ab, indem sie Signale aus der nichtlinearen Wechselwirkung ultrakurzer Laserpulse mit endogenen Molekülen detektiert. Diese Methode ermöglicht eine schnelle chemische und strukturelle Identifizierung mit subzellulärer Auflösung, markierungs- oder markierungsfrei und zerstörungsfrei und ermöglicht damit einen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung von Zellen und Geweben. Zu diesen ausgeprägten nichtlinearen Kontrasten gehören die Multiphotonen-angeregte Autofluoreszenz und die Erzeugung von Oberschwingungen. Da jeder dieser Kontraste einzigartige Vorteile und Einschränkungen bietet, bieten ihre Kombination und ihre räumlich-zeitliche Co-Registrierung eine komplementäre Kontrastpalette, die die analytischen Fähigkeiten der nichtlinearen optischen Mikroskopie verbessert. Aus diesem Grund hat unsere Gruppe die simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonische (SLAM)-Mikroskopie entwickelt, eine bildgebende Technik, die vier oder mehr gleichzeitig erzeugte nichtlineare optische Signale misst, mit dem Ziel, unterschiedliche morphologische, metabolische und funktionelle Merkmale in biologischen Proben zu identifizieren. Hier stellen wir ein Protokoll für die SLAM-Bildgebung von Geweben vor, das sich auf wesentliche Komponenten der Technik konzentriert, einschließlich der Laserquelle, der Pulskompression und des Mikroskops. Darüber hinaus besprechen wir die Probenvorbereitung und skizzieren die Datenverarbeitungspipeline für SLAM-Daten. Der vorgestellte Arbeitsablauf eignet sich für die Untersuchung des Stoffwechselzustands, der Anordnung, der zellulären Reaktionen und der Zusammensetzung von menschlichem und tierischem Gewebe, ohne auf exogene Markierungen angewiesen zu sein.

Introduction

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Die nichtlineare optische Mikroskopie nutzt die Reaktion einer Probe auf intensive optische Strahlung (Licht mit elektrischen Feldern größer als 3 × 103 V/cm), um einen Bildkontrast abzuleiten, bei dem die induzierte Polarisation (und damit das erzeugte Signal) nichtlinear von der einfallenden Intensität 1,2,3 abhängt. Da diese multiplen Kontraste jeweils durch unterschiedliche Licht-Materie-Wechselwirkungen vermittelt werden, bietet die nichtlineare Mikroskopie gleichzeitigen Zugang zu einzigartigen Informationen sowohl über die Morphologie als auch über die chemische Landschaft einer Probe 1,2,3. Während traditionelle Mikroskopietechniken, die eine lineare Wechselwirkung mit dem Beleuchtungslicht beinhalten, auch eine quantitative Bildgebung ermöglichen, ermöglicht die nichtlineare Mikroskopie einen multimodaleren Ansatz, der oft eine verbesserte Abbildungstiefe und optische Schnitte aufweist und gleichzeitig weniger Lichtschäden an der Probe verursacht4. Im Rahmen biomedizinischer Anwendungen, wie z. B. der intraoperativen histologischen Bewertung von Gewebe 5,6, ermöglicht diese Technik die direkte Sondierung nativer Biomoleküle und ermöglicht so nahtlose Untersuchungen lebender Zellen, ohne dass externe Marker oder Modifikationen erforderlich sind. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung von Markierungen, Markierungen7, exogenen Molekülen, genetisch exprimierten fluoreszierenden Proteinen oder Nanopartikeln, die nicht nur einen hohen Arbeitsaufwand erfordern, sondern auch das Potenzial haben, die native Biochemie der Probe zu stören und sich negativ auf Zielzellen oder -gewebe auszuwirken 8,9,10. Somit dient das nichtlineare Mikroskop als leistungsstarkes und echtes Analysewerkzeug, das eine kontinuierliche Abbildung mikroskopischer Strukturen ermöglicht, ohne die chemische und strukturelle Integrität der Probe zu verändern. Diese Fähigkeit eröffnet eine breite Palette von Anwendungen, die von der Diagnose und Wirkstoffforschung bis hin zur Zellsignalisierung und Systembiologie reichen.

Multiphotonenkontraste wie Zwei-Photonen-Autofluoreszenz (2PAF), Drei-Photonen-Autofluoreszenz (3PAF), Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) und Erzeugung der dritten Harmonischen (THG) bieten jeweils analytische Vorteile bei der Charakterisierung von Proben. 2PAF wird von endogenen Flavinen erzeugt, wobei Flavin-Adenosindinukleotid (FAD) in biologischen Systemen am häufigsten vorkommt11. 3PAF nutzt die Nahinfrarotanregung, um intrinsische Chromophore wie NAD(P)H sichtbar zu machen, und ermöglicht die metabolische Bildgebung bei gleichzeitiger Umgehung von UV-bedingten Phototoxizitäts- und Dämpfungsproblemen12. SHG zeigt spezifisch nicht-zentrosymmetrische molekulare Strukturen wie fibrilläres Kollagen (Typen I, II und III) und Proteinarrays 13,14,15,16,17 auf, was strukturelle Einblicke ermöglicht 1. Schließlich eignet sich THG, das empfindlich auf Grenzflächen und kleine strukturelle Merkmale reagiert, hervorragend für die Abbildung von Lipidverteilungen und extrazellulären Vesikeln 18,19,20,21,22.

Jedes dieser Kontrastsignale wurde unabhängig voneinander von Forschungsgruppen untersucht, wodurch sich die Nische für die nichtlineare Multiphotonenmikroskopie als zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug für biologische Anwendungen etablierthat 23,24,25,26. Diese Bemühungen wurden von den Erfindern des 2PAF-Mikroskops angeführt, die ihre innovative Technologie nutzten, um neue Einblicke in die Gewebemorphologie, den Zellstoffwechsel und sogar die morphofunktionellen Merkmale von Krankheiten wie Alzheimer und Krebs zu gewinnen23. Ihre Arbeit hat letztlich zu bahnbrechenden Anwendungen in den Neurowissenschaften geführt27,28. In den folgenden Jahren hoben mehrere Forscher die Empfindlichkeit des SHG gegenüber Veränderungen in der extrazellulären Matrix hervor, dem Gerüst, das den Zellen strukturelle Unterstützung bietet und das während der Krebspathogenese erhebliche Veränderungen erfährt29. Campagnola et al.14,24,30,31 zeigten, dass die SHG-Mikroskopie die Visualisierung makromolekularer und supramolekularer Anordnungen ermöglicht und Details wie die Anordnung, Konzentration und Art des Kollagens enthüllt, die mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Techniken nicht nachweisbar sind. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der SHG-Mikroskopie als praktikables Diagnoseinstrument im klinischen Umfeld. Schließlich wurde die THG-Mikroskopie erfolgreich eingesetzt, um Netzhautschichten bei Nagetieren mit subzellulärer Auflösung25 zu visualisieren, Gehirnstrukturen32 zu kartieren und die Multigrenzflächentopographie der Melanomzellinvasionzu erfassen 33.

Diese historischen Implementierungen der nichtlinearen Mikroskopie beinhalteten im Allgemeinen einen modengekoppelten Femtosekundenlaser (fs), der an ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) gekoppelt war, um die nichtlinearen Signale zu erzeugen und zu sammeln, die dann mit einem dichroitischen Spiegel zu einem Bandpassfilter geleitet und mit einer Photomultiplier-Röhre (PMT) gesammelt wurden34. Trotz ähnlicher Implementierungen konzentrierten sich die meisten Anwendungen darauf, nur einen oder höchstens zwei Kontraste zu erfassen, während die anderen übersehen wurden. Um das Potenzial des Multiphotonenmikroskops voll auszuschöpfen, implementierten Boppart et al. zunächst die sequentielle Erfassung mehrerer nichtlinearer Kontraste 21,35,36,37, gefolgt von deren gleichzeitiger Detektion 4,22,38,39,40,41 . Die daraus resultierende Technik, die als Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM)-Mikroskopie bekannt ist, registriert die nichtlinearen 2PAF-, 3PAF-, SHG- und THG-Signale räumlich und zeitlich durch Single-Shot-Anregung und Multiplex-Detektion und erreicht so eine überlegene analytische Leistung. Die raumzeitliche Co-Lokalisierung dieser vier Kanäle liefert hochrangige und funktionsreiche Daten42, die Vorteile gegenüber sequentiell erfassten Daten bieten, indem sie Bewegungsartefakte eliminieren und eine verbesserte Bildregistrierung gewährleisten. Folglich ermöglicht SLAM die Erzeugung von zusammengesetzten Merkmalen, wie z. B. optischen Reduktions-Oxidations-Verhältnissen, die die metabolischen Eigenschaften effektiv charakterisieren 43,44,45. Darüber hinaus erleichtert die kombinierte Analyse von Signalen über Modalitäten hinweg die Entwicklung zusätzlicher Funktionen auf der Grundlage der Korrelation und Kolokalisierung von Kanälen. Shi et al. zeigten beispielsweise, wie wichtig die Kolokalisationsmerkmale der SLAM-Mikroskopie für die genaue Klassifizierung von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) sind, die in der pharmazeutischen Produktion verwendet werden42. Auf diese Weise legt SLAM den Grundstein für das, was heute als Stand der Technik in der Multiphotonenmikroskopie gilt, und ebnet den Weg für zukünftige Fortschritte auf diesem Gebiet46.

In diesem Protokoll skizzieren wir die Schlüsselkomponenten eines SLAM-Mikroskops (Abbildung 1) und beschreiben eine Schritt-für-Schritt-Methodik für seine Implementierung. Dazu gehören die Erzeugung und Formgebung der Anregungsimpulse, die repräsentative Gewebeprobenvorbereitung, bildgebende Verfahren und die Verarbeitung sowie die Darstellung der resultierenden Daten. Durch die Verwendung von Standardtechnologie und etablierten Techniken ist dieses Protokoll universell, übertragbar und kann mit ähnlichen optischen Systemen in verschiedenen Labors leicht reproduziert werden.

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Abbildung 1: Das optische Design eines simultanen markierungsfreien Autofluoreszenz-Multiharmonischen (SLAM) Mikroskops. Der Femtosekundenlaser gibt 1040 nm Licht in 370 fs Pulsen bei einer Wiederholrate von 10 MHz aus. Intensität und Polarisation des Lasers werden sorgfältig kontrolliert, bevor ein photonischer Kristall gepumpt wird, um ein Superkontinuum zu erzeugen. Die Pulse werden dann von einem Pulsformer komprimiert und in ein kundenspezifisches Laser-Scanning-Mikroskop geleitet (gestrichelte Box). Dichroitische Spiegel und Bandpassfilter isolieren die von der Probe erzeugten nichtlinearen Signale, bevor sie von hochempfindlichen Photonendetektoren wie Photomultiplier-Röhren (PMTs) oder Hybrid-Photodetektoren (HPDs) detektiert werden. Das optische Design basiert auf einem zuvor beschriebenen System41. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

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Alle Tierversuche wurden gemäß dem Protokoll UIUC#23031 durchgeführt, das vom University of Illinois Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde, und hielten sich strikt an alle relevanten Richtlinien und Vorschriften.

1. Spalten und Ausrichten photonischer Kristallfasern (PCF)

  1. Schneiden Sie mit einem Faserschneider oder Drahtschneider ein Stück photonische Kristallfaser (PCF, Table of Materials) auf eine Länge von etwas mehr als 15 cm ab.
    HINWEIS: Von jedem Ende des PCF werden Längen von mindestens 1,5 cm gespalten, da diese Länge erforderlich ist, um das PCF während des Spaltens sicher zu klemmen. Die endgültige Länge der in dieser Studie verwendeten PCF (12 cm) wurde auf der Grundlage einer vorangegangenen Simulation unter Verwendung der verallgemeinerten nichtlinearen Schrödinger-Gleichung47 und empirischer Tests bestimmt. Im Allgemeinen kann die beste PCF-Länge je nach PCF-Typ, Pumpenlasereingang und gewünschtem Superkontinuum variieren.
    ACHTUNG: Tragen Sie beim Schneiden von PCF persönliche Schutzausrüstung (PSA), um die Augen und die Haut des Experimentators zu schützen. Entsorgen Sie Faserreste sofort in den Entsorgungsbehälter für scharfe Gegenstände.
  2. Entfernen Sie mit einem Faserabisolierer (Materialtabelle) oder einer Rasierklinge etwa 3 cm der Kunststoffbeschichtung von jedem Ende des PCF und reinigen Sie alle Kunststoffreste mit Seidenpapier (Materialtabelle) und 100 % Methanol.
  3. Setzen Sie ein Ende des PCF in die Halterung auf einem Präzisions-Glasfaserspalt (Table of Materials) ein und richten Sie die Klinge 1,5 cm vom Ende des PCF entfernt aus. Schließen Sie die Klemmen vorsichtig und drücken Sie die Spaltentaste .
    HINWEIS: Befolgen Sie sorgfältig die Bedienungsanleitung des Fasermessers, einschließlich spezifischer Richtlinien zum Spalten von PCFs. Die Einstellungen, wie z. B. die Faserspannung, erfordern möglicherweise eine Feinabstimmung, um konsistente und qualitativ hochwertige Spaltungen für jeden PCF-Typ zu erzielen.
  4. Untersuchen Sie die gespaltene Fläche und die Seite des PCF mit dem integrierten Mikroskop (10× Vergrößerung) an einer Glasfaserverarbeitungsarbeitsstation (Materialtabelle) und stellen Sie sicher, dass die Spaltung von guter Qualität ist (Abbildungen 2A, C). Spalten Sie erneut, wenn Schmutz (Abbildung 2D) oder Kratzer (Abbildung 2E) vorhanden sind oder die gespaltene Oberfläche nicht flach und senkrecht zur Länge des PCF ist (Abbildung 2B).
    HINWEIS: In diesem Schritt und den nachfolgenden Schritten ist äußerste Vorsicht geboten, um zu vermeiden, dass die gespaltenen Enden des PCF mit einer Oberfläche in Berührung kommen, um Schäden zu vermeiden.
  5. Spalten Sie das zweite Ende des PCF und stellen Sie die gewünschte Endlänge sicher.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete PCF ist auf 12 cm gekürzt.
  6. Wie bei den vorherigen Schritten ist das neu gespaltene Ende des PCF zu prüfen (siehe Schritt 1.4). Wenn die Spaltung fehlerhaft oder inkonsistent erscheint, verwerfen Sie die aktuelle PCF und wiederholen Sie den Vorgang mit einer neuen.
  7. Klemmen Sie das Eingangsende des PCF auf einen 3-Achsen-Tisch (Materialtabelle) in etwa der Brennweite der Faserkopplungslinse, gemessen mit einem Lineal. Stützen Sie das andere Ende des PCF mit einem temporären Pfosten oder einer Halterung sicher ab.
    HINWEIS: Klemmen Sie den Ausgang noch nicht fest, um ein Brechen des PCF während der Bruttoeinstellung zu vermeiden.
    ACHTUNG: Es ist notwendig, das Ausgangsende abzustützen und mit ausreichend Strahlblöcken zu umgeben, um das Risiko einer Laserbelichtung zu verringern.
  8. Platzieren Sie ein optisches Leistungsmessgerät (Materialtabelle) im Strahlengang direkt vor dem PCF, um die Eingangsleistung zu messen. Stellen Sie sicher, dass der Femtosekundenlaser (Materialtabelle) durch Verschluss 1 blockiert ist, bevor Sie den Laser einschalten.
    HINWEIS: Absolvieren Sie immer alle erforderlichen Lasersicherheitsschulungen, um die mit der Verwendung von Lasern verbundenen Risiken zu verstehen.
    ACHTUNG: Tragen Sie beim Betrieb des Lasers eine geeignete Laserschutzbrille, die speziell für die Wellenlänge und Leistung des verwendeten Lasers ausgelegt ist. Entfernen Sie vor dem Betrieb des Lasers alle Schmuckstücke, Uhren und andere reflektierende Gegenstände, die gefährliche Streureflexionen verursachen können.
  9. Schalten Sie den Laser ein und lassen Sie ihn für die vom Laser angegebene "Kaltaufwärmzeit" aufwärmen. Öffnen Sie den Verschluss 1 und stellen Sie die Leistung mit der Halbwellenplatte (HWP1) direkt vor dem Polarisationsteiler ein, bis der Leistungsmesser 260 mW oder weniger anzeigt.
    HINWEIS: Die Verwendung von 260 mW für die Ausrichtung wurde empirisch als niedrig genug eingestuft, um eine Beschädigung des PCF zu vermeiden (selbst wenn es falsch ausgerichtet ist), während immer noch ein heller Strahl für die Visualisierung auf einem IR-Viewer oder einem fluoreszierenden Ziel bereitgestellt wird.
  10. Blockieren Sie den Laser mit Verschluss 1 und bewegen Sie den Leistungsmesser an das Ausgangsende des PCF.
  11. Lösen Sie die Blockierung des Lasers und stellen Sie die optische Achse der PCF-Eingangsfläche mithilfe des 3-Achsen-Tisches ein, bis ein Signal auf dem Leistungsmesser erscheint, das darauf hinweist, dass etwas Licht in den Kern, die Verkleidung oder die Kunststoffbeschichtung des PCF eingekoppelt ist. Wenn die Positionierung des PCF-Eingangs im Fokus des Strahls außerhalb des Bereichs des 3-Achsen-Tisches liegt, blockieren Sie den Laser, stellen Sie den PCF ein und spannen Sie ihn wieder ein.
    HINWEIS: Ein Infrarot-Betrachter (IR) oder ein fluoreszierendes Ziel kann verwendet werden, um zu visualisieren, wo der Strahl fokussiert ist.
  12. Passen Sie mit dem 3-Achsen-Tisch eine Dimension der optischen Achse des PCF an, um den Bereich zu ermitteln, über den das Licht gekoppelt ist, berechnen Sie die Mitte dieses Bereichs und verschieben Sie den Tisch dorthin. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Dimension, um den Balken ungefähr auf dem Kern des PCF zu zentrieren.
    HINWEIS: Die μm-Teilstriche auf dem 3-Achsen-Tisch können helfen, Entfernungen zu messen und die Mitte des PCF zu finden.
  13. Passen Sie die drei Dimensionen des 3-Achsen-Tisches in einer sich wiederholenden Sequenz iterativ an und optimieren Sie gleichzeitig die Kopplungseffizienz, um den Strahl präzise zu zentrieren und in den Kern des PCF zu fokussieren.
    HINWEIS: Wenn der vom Leistungsmesser gemessene maximale Kopplungswirkungsgrad deutlich unter 80 % der Eingangsleistung liegt, schließen Sie den Verschluss 1, klemmen Sie den PCF ab und untersuchen Sie ihn auf Beschädigungen. Wenn beschädigt, starten Sie mit Schritt 1.1 neu, andernfalls blockieren Sie den Laser, klemmen Sie das PCF wieder ein und starten Sie die Ausrichtung von Schritt 1.11 neu.
  14. Blockieren Sie den Strahl mit Shutter 1 und erhöhen Sie die Laserleistung auf 1,6 W.
    HINWEIS: Die Verwendung von 1,6 W wurde durch Simulation und empirische Tests bestimmt, um ein ausreichend breites Superkontinuum zu erzeugen, das unter der Zerstörschwelle der PCF bleibt.
  15. Öffnen Sie den Verschluss 1 und stellen Sie den 3-Achsen-Tisch erneut iterativ ein, um die PCF-Eingangsposition anzupassen und die Kopplungseffizienz zu optimieren.
    HINWEIS: Empirisch liegt der maximale Wirkungsgrad in der Regel bei etwa 80 %.
  16. Schließen Sie den Verschluss 1 und klemmen Sie den Ausgang des PCF ungefähr auf die Brennweite des Parabolspiegels. Platzieren Sie einen Strahlblock am Ausgang des Parabolspiegels.
  17. Reduzieren Sie die Laserleistung erneut auf 260 mW oder weniger.
  18. Öffnen Sie den Verschluss 1 und verwenden Sie den 3-Achsen-Tisch des Parabolspiegels, um die optische Achse des Parabolspiegels auszurichten und so die Verzerrung des Strahls zu minimieren. Stellen Sie als Nächstes den Fokus ein und kollimieren Sie den Strahl im Fernfeld.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen IR-Betrachter oder ein fluoreszierendes Ziel, um den Ausgangsstrahl zu betrachten.
  19. Stellen Sie die Spiegel nach dem Parabolspiegel ein, um sicherzustellen, dass der Strahl auf den Rest des optischen Systems ausgerichtet ist.
    HINWEIS: Installieren Sie permanente Flip-Alignment-Ziele oder Iris, um diesen Schritt reproduzierbar zu machen.
  20. Schließen Sie den Verschluss 1 und erhöhen Sie die Laserleistung auf 1,6 W. Öffnen Sie den Verschluss 1 und vergewissern Sie sich, dass der Strahlengang unverändert ist.
  21. Messen Sie die Ausgangsleistung des Pulsformers (Materialtabelle) mit einem Leistungsmesser. Drehen Sie die Halbwellenplatte vor dem Pulsformer (HWP3), um die Übertragungseffizienz des Pulsformers zu optimieren.

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Abbildung 2: Gespaltene Enden der photonischen Kristallfaser (PCF). (A, B) Bilder von der Seite des Spalts. (C-F) Bilder der Stirnseite der Spaltung. (A) Ein gut gespaltenes PCF hat eine flache und senkrechte Fläche. (B) Ein schlecht gespaltenes PCF mit einer abgewinkelten und abgebrochenen Oberfläche. (C) Ein gut gespaltenes PCF mit einem sauberen Gesicht. (D) Ein falsch behandeltes PCF, das Schmutz auf seiner Oberfläche hat. (E) Ein schlecht gespaltenes PCF mit Kratzern auf der Oberfläche. (F) Ein altes PCF, das ersetzt wurde. Es gibt eine sichtbare Schädigung des Kerns des PCF, wie der dunkle Fleck in der Mitte des PCF zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Charakterisierung und Optimierung von Impulsen

  1. Messen Sie mit einem Spektrometer oder optischen Spektrumanalysator (OSA, Table of Materials) den Laser nach dem Parabolspiegel, um die Superkontinuumserzeugung des PCF zu überprüfen.
  2. Drehen Sie die Halbwellenplatte hinter dem Polarisationsstrahlteiler (HWP2), um die Breite des Superkontinuums zu optimieren.
  3. Schalten Sie den Mikroskopie-Autokorrelator (Materialtabelle) ein. Stellen Sie den Detektor mit der Software auf den internen Detektor ein und stellen Sie den Scanbereich auf 5 ps ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Breite der Impulsautokorrelation erfasst wird.
    HINWEIS: Bei Setups mit längeren Pulsbreiten (z. B. aufgrund von Dispersion in einem langen PCF) sollte der Scanbereich entsprechend erhöht werden. Beachten Sie, dass die von einem Intensitäts-Autokorrelator gemessene Pulsbreite nicht die wahre Pulsdauer ist, aber dennoch als nützliche Referenz für die Pulskompression dienen kann. Für eine genaue und vollständige Charakterisierung sowohl der Pulsamplitude als auch der Phase sollten spektral aufgelöste Techniken wie das frequenzaufgelöste optische Gating (FROG)48 verwendet werden.
  4. Lösen Sie die Blockade des Lasers und richten Sie den Autokorrelator auf den Strahl aus, der den Pulsformer verlässt, bis ein Signal erscheint.
    HINWEIS: Die Platzierung von temporären Spiegeln (zwei am Eingang und zwei am Ausgang des Autokorrelators) ermöglicht die Ausrichtung des Strahls auf den Autokorrelator, ohne den Rest des optischen Systems zu beeinträchtigen.
  5. Stellen Sie sicher, dass Verschluss 2 geschlossen ist, und tragen Sie das entsprechende Immersionsmedium (z. B. Wasser oder Öl) auf die Objektivlinse auf (Materialtabelle). Platzieren Sie den externen Detektor des Autokorrelators auf dem Mikroskoptisch (Materialtabelle) und stellen Sie den Tisch so ein, dass der Detektor direkt über dem Objektiv positioniert ist.
    HINWEIS: Im Gegensatz zu typischen Mikroskopobjektiven sind die empfohlenen Objektive für die SLAM-Mikroskopie ultraviolett durchlässig, um die Detektion von THG38 zu verbessern.
  6. Schalten Sie die scannenden Galvanometerspiegel (Materialtabelle) ein, um deren Spannung auf Null zu setzen. Öffnen Sie den Verschluss und verwenden Sie einen IR-Betrachter oder ein Fluoreszenzziel, um zu überprüfen, ob der Strahl den externen Detektor erreicht.
  7. Legen Sie den Autokorrelator-Detektor auf den externen Detektor fest. Passen Sie die Position der Bühne an, bis das Signal angezeigt wird.
    HINWEIS: Wenn der Detektor gesättigt ist, verringern Sie die Leistung mit dem Neutraldichtefilter.
  8. Passen Sie die Polynomkoeffizienten (Dispersionsordnungen) des Pulsformers an, um die vom Autokorrelator gemessene Pulsbreite iterativ zu minimieren. Reduzieren Sie den Scanbereich des Autokorrelators entsprechend, wenn die Impulsbreite abnimmt, um die Genauigkeit und Visualisierung der Autokorrelationsfunktion zu verbessern.
    HINWEIS: Die optimale Pulsbreite, gemessen mit einer Gaußschen Passung, sollte einige Dutzend Femtosekunden (fs) betragen.

3. Vorbereitung der Probe

HINWEIS: Der Einfachheit halber beschreibt dieses Protokoll die Ex-vivo-Gewebebildgebung . Aufgrund der markierungsfreien Natur von SLAM lassen sich In-vivo-Bildgebungsverfahren jedoch leicht anpassen38.

  1. Euthanasthan des Tieres durch CO2 -Erstickung oder eine andere von der IACUC zugelassene Methode der Euthanasie.
  2. Das/die Organ(e) von Interesse wird mit dem Standard-Nekropsieverfahren49 innerhalb von 10 Minuten post mortem entnommen und mit vorgekühlter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, um Blut zu entfernen.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden Leber und Lunge entnommen.
  3. Präparieren Sie das Organ vertikal oder horizontal mit einer Klinge, je nachdem, welche Ausrichtung für die Analyse erforderlich ist. Stellen Sie sicher, dass die Dissektion mit Präzision durchgeführt wird, um die Integrität der Gewebestruktur zu erhalten.
  4. Legen Sie das Gewebestück in eine sterile Gewebekulturschale, die mit phenolrotfreiem vollständigem Zellkulturmedium gefüllt ist. Kühlen Sie das Gewebe bei 4 °C, wenn Sie nicht sofort Bilder aufnehmen.
    HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Zellkulturmedium war HEPES-gepuffertes Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 4 mM Glutamin und Endothelzellwachstumsmedium (Materialtabelle). Dieses Medium wurde sorgfältig ausgewählt, um die physiologische Lebensfähigkeit der in der Nierengewebeprobe befindlichen Epithel- und Endothelzellen während der Bildgebungsdauer50 zu erhalten.
  5. Zur Herstellung von Fluoreszenz-Kalibrierstandards stellen Sie eine Präzisionswaage auf das Gewicht eines antistatischen Wägeschiffchens auf Null und messen Sie ca. 5 mg Flavinadenin-Dinukleotid-Dinatriumsalz (FAD, Table of Materials) oder 5 mg reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dinatriumsalz (NADH, Table of Materials).
  6. Verwenden Sie eine Einkanalpipette, um ein geeignetes Volumen von 1 M HEPES-Puffer in die Wägeschiffchen zu dosieren, die vorgewogene FAD- oder NADH-Pulver enthalten, um 5 mM Stammlösungen herzustellen. Pipettieren Sie wiederholt auf und ab, um das Pulver aufzulösen.
  7. Bereiten Sie 1 mM Arbeitslösungen aus den Stammlösungen durch 1:5-Verdünnung in den HEPES-Puffer vor.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Arbeitskonzentration von 1 mM wurde empirisch bestimmt, um ein hohes Signal zu erzeugen und gleichzeitig eine Detektorsättigung zu vermeiden.
  8. Lagern Sie die vorrätigen FAD- und NADH-Lösungen in Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C.
    HINWEIS: Lösungsstandards können mehrere Tage im Kühlschrank gelagert werden, es wird jedoch empfohlen, für jeden Versuch frische Lösungen zuzubereiten.
  9. Legen Sie die Gewebeproben kurz vor der Entnahme von SLAM-Mikroskopiebildern in 35-mm-Bildgebungsschalen mit Glasboden (Table of Materials). Alternativ können Sie auch ein Deckglas verwenden. Aliquotieren Sie die FAD- und NADH-Lösungen in identische Schalen oder Deckgläser.
    HINWEIS: Unbeschichtetes Glas oder Poly-D-Lysin-beschichtetes Glas wird aufgrund des reduzierten Hintergrundsignals dringend empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Glasdicke für das verwendete Mikroskopobjektiv geeignet ist (in dieser Studie wurde #0 verwendet).

4. SLAM-Einrichtung und -Betrieb

  1. Vergewissern Sie sich, dass der Lasereingang zum PCF durch Verschluss 1 blockiert ist, und schalten Sie den Laser ein. Lassen Sie den Laser für die angegebene "Kaltaufwärmzeit" des Lasers aufwärmen.
    HINWEIS: In dieser Studie wird für den Laser eine Kaltaufwärmzeit von 30 Minuten verwendet.
  2. Vergewissern Sie sich, dass der Strahlengang frei von Hindernissen ist, und platzieren Sie einen optischen Leistungsmesser im Strahlengang direkt vor dem PCF. Öffnen Sie den Verschluss 1 und messen Sie die Eingangsleistung.
  3. Schließen Sie den Verschluss 1 und stellen Sie den Leistungsmesser an den Ausgang des PCF nach dem Parabolspiegel. Öffnen Sie den Verschluss 1 und maximieren Sie die PCF-Ausgabe mit dem 3-Achsen-Eingangstisch.
  4. Lassen Sie den PCF 10 Minuten lang aufwärmen und maximieren Sie dann die Ausgangsleistung wieder. Zeichnen Sie die Übertragung des PCF auf. Wenn das Getriebe unter 50 % fällt, ersetzen Sie das PCF.
    HINWEIS: Während des gesamten Betriebs des SLAM-Mikroskops (in den folgenden Schritten) wird empfohlen, die Ausgangsleistung des PCF stündlich zu messen, um konsistente Daten zu gewährleisten.
  5. Bewegen Sie das Leistungsmessgerät hinter den ND-Filter (Neutral Density) und drehen Sie den Filter, um die Laserleistung zu steuern, die die Probe erreicht.
    HINWEIS: Multiplizieren Sie die gemessene Leistung mit dem Transmissionsgrad der restlichen optischen Komponenten. Der Transmissionsgrad wird gemessen, indem der Leistungsmesser hinter der Objektivlinse platziert wird. Für diese Studie wurde eine durchschnittliche Laserleistung von 20 mW an der Probe verwendet. Die Laserleistung wurde empirisch für die gegebene Probe, die Abbildungstiefe und das Mikroskopsystem bestimmt, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen und gleichzeitig Probenschäden oder Nichtlinearität des Detektors zu vermeiden. Es gibt zwar keinen endgültigen Standard, aber die typische markierungsfreie Multiphotonen-Bildgebung ist auf mehrere Dutzend bis Hunderte von Milliwatt 7,32,33,51,52 beschränkt.
  6. Schalten Sie die Galvanometer und den Tisch ein. Öffnen Sie die Erfassungssoftware und geben Sie die gewünschten Parameter für die Bildgebung ein.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden 512 × 512 Pixel und eine Pixelverweilzeit von 13,65 μs verwendet, um ein Sichtfeld von 360 × 360μm 2 abzubilden. Fünf Bilder, die mit 0,333 Hz aufgenommen wurden, wurden zu einem einzigen Bild mit hoher Qualität gemittelt.
  7. Die Probe unter Verwendung des für das Objektiv geeigneten Immersionsmediums, wie es zuvor in Schritt 2.5 verwendet wurde, auf den Tisch legen.
  8. Schalten Sie das Licht im Zimmer aus und schließen Sie die Vorhänge.
    HINWEIS: Um eine Beschädigung der Melder zu vermeiden, schalten Sie die Raumbeleuchtung niemals ein, während die Melder eingeschaltet sind oder die Melderklappen geöffnet sind.
  9. Schalten Sie die Netzteile und Verstärker des Detektors ein.
  10. Schließen Sie den Leuchtkasten, der die Bühne umgibt.
  11. Mit den elektronischen Steuerschaltern können Sie die Melderklappen (S3, S4, S5, S6) manuell öffnen.
  12. Klicken Sie in der Mikroskopaufnahmesoftware auf Klicken, um die Aufnahme zu starten , um mit der Erfassung von SLAM-Bildern zu beginnen. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, indem Sie den Knopf am Mikroskoptischregler (Materialtabelle) drehen, bis die Probe scharf gestellt wird.
    HINWEIS: Das Glasdeckglas erzeugt ein starkes THG-Signal, mit dem die Bildtiefe anhand der auf dem Mikroskoptisch-Controller angezeigten Tischposition genau bestimmt werden kann. Zum Beispiel wurden alle Bilder von Lösungsstandards, die in dieser Studie aufgenommen wurden, in einer Fokusebene 20 μm über dem Deckglas aufgenommen.
  13. Verwenden Sie den Joystick am Controller des Mikroskoptisches, um das gewünschte Sichtfeld in der Probe zu lokalisieren, und klicken Sie dann auf Stopp und Zurücksetzen.
    HINWEIS: Wenn das Bild gesättigt ist, kehren Sie zu Schritt 4.5 zurück und verringern Sie die Leistung. Wenn das Bild ein Signal-Rausch-Verhältnis unter 10 aufweist, kann die Leistung stattdessen vorsichtig erhöht werden.
  14. Klicken Sie auf der Registerkarte Speichern auf Daten speichern , um sie auf Ja zu setzen, und klicken Sie dann auf Klicken, um die Erfassung zu starten. Warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.
  15. Um die Probe während der Bildgebung zu wechseln oder zu manipulieren, schließen Sie die Verschlussverschlüsse des Detektors und verwenden Sie eine Taschenlampe oder Stirnlampe für das Licht. Sobald das Beispiel geändert wurde, kehren Sie zu Schritt 4.10 zurück.
    HINWEIS: Um Wiederholbarkeit und quantitative Analyse zu ermöglichen, sammeln Sie SLAM-Bilder von FAD- und NADH-Lösungsstandards. Stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld, die Bildgröße und die Anregungsleistung mit dem übereinstimmen, was für die biologischen Proben verwendet wurde.
  16. Um die SLAM-Bildaufnahme zu beenden, schließen Sie die Melderverschlüsse und schalten Sie die Melder aus, bevor Sie die Raumbeleuchtung einschalten.
  17. Blockieren Sie den Laser mit Verschluss 1 und schalten Sie ihn dann aus.
  18. Schalten Sie die Galvanometer und den Tisch aus. Schließen Sie die Mikroskopaufnahmesoftware.
  19. Entsorgen Sie das Taschentuch ordnungsgemäß und reinigen Sie den Arbeitsplatz.

5. Datenvisualisierung

HINWEIS: Die folgende Bildanalyse kann in einer Bildanalysesoftware wie ImageJ53 (Table of Materials) oder einer Programmiersprache mit Bildanalysefunktionen wie Python oder MATLAB durchgeführt werden. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie Sie die Datenvisualisierung mit ImageJ durchführen.

  1. Stellen Sie sicher, dass die Bilder aus jedem Kanal in einem verlustfreien Bildformat (z. B. TIFF oder PNG) vorliegen.
    HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete benutzerdefinierte Mikroskopsteuerungssoftware speicherte Bilder automatisch als TIFFs. Um ein Bild als TIFF zu speichern, öffnen Sie es in ImageJ und wählen Sie Datei > Speichern als > Tiff.
  2. Um Standardbilder für die Beleuchtung zu generieren, öffnen Sie die FAD- und NAD(P)H-Kanalbilder von FAD- bzw. NADH-Lösungen in ImageJ. Wählen Sie für jedes Bild die Option "Prozess > Filter > Gaußscher Weichzeichner...", stellen Sie "Sigma (Radius)" auf 41 ein und klicken Sie dann auf "OK".
    HINWEIS: Passen Sie das Sigma (Radius) des Gaußschen Filters nach Bedarf an, um das Bild ausreichend zu glätten.
  3. Um gleichzeitig eine ungleichmäßige Beleuchtung zu korrigieren und die Fluoreszenzintensität zu normalisieren, öffnen Sie die FAD- und NAD(P)H-Kanalbilder der Probe. Wählen Sie für jedes Bild Prozess > Bildrechner..., wählen Sie für Bild1 das Beispielbild aus, wählen Sie für Operation die Option Teilen aus, und wählen Sie für Bild2 das Beleuchtungsstandardbild aus, das dem Kanal des Beispielbildes entspricht, und klicken Sie dann auf OK.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Korrektur der Systemvariabilität und die Aufrechterhaltung der Konsistenz bei quantitativen Bewertungen der Autofluoreszenz, wie z. B. des optischen Redoxverhältnisses (ORR).
  4. Wenn mehrere Bilder aufgenommen werden, um ein größeres Sichtfeld zu bilden oder einen Z-Stapel zu bilden, fügen Sie die Bilder zusammen oder kombinieren Sie sie zu einem einzigen Bild oder einem Stapel von Bildern.
  5. Um ein ORR-Bild zu generieren, summieren Sie zunächst die FAD- und NAD(P)H-Bilder. Wählen Sie Prozess > Image Calculator..., wählen Sie für Image1 und Image2 die FAD- bzw. NAD(P)H-Kanalbilder aus, wählen Sie für Operation die Option Hinzufügen aus, und klicken Sie dann auf OK. Um das ORR-Image zu berechnen, wählen Sie Process > Image Calculator..., wählen Sie für Image1 das FAD-Kanalbild aus, wählen Sie für Operation die Option Dividieren aus, und wählen Sie für Image2 das Ergebnis der Summe von FAD und NAD(P)H aus, und klicken Sie dann auf OK.
  6. Um eine Colormap auf das ORR-Bild anzuwenden, wählen Sie Bild > Farbe > LUT bearbeiten..., klicken Sie auf Öffnen, wählen Sie die gewünschte Look-up-Table-Datei (.lut) aus und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Bild > > Helligkeit/Kontrast anpassen und passen Sie den Kontrast wie gewünscht an.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine isoluminante Farbkarte zu verwenden, wie z. B. die in dieser Studie verwendete (invertierte) CET-I2 54,55-Farbkarte. Um eine Colormap in ImageJ zu invertieren, nachdem Sie sie auf ein Bild angewendet haben, wählen Sie Bild > Farbe > LUTs umkehren.
  7. Um die Klarheit der Merkmale im ORR-Bild zu verbessern, skalieren Sie die Helligkeit um die Intensität der Fluoreszenzkanäle. Wählen Sie zunächst das Ergebnis der Summe von FAD und NAD(P)H aus und wählen Sie Prozess > Kontrast verbessern..., stellen Sie sicher, dass Normalisieren aktiviert ist, und klicken Sie dann auf OK. Wählen Sie Bearbeiten > Kopieren , um dieses Ergebnis in die Zwischenablage zu kopieren. Wählen Sie als Nächstes das ORR-Bild aus und wählen Sie Bild > Typ > RGB-Farbe" und dann Bild > Typ > HSB (32-Bit). Bewegen Sie den Schieberegler am unteren Rand des Bildes ganz nach rechts, um den Helligkeitskanal anzuzeigen, wählen Sie Bearbeiten > Einfügen und dann Bild > Typ > RGB-Farbe aus.
  8. Um das SLAM-Bild als Composite zu visualisieren, öffnen Sie die vier SLAM-Kanäle in ImageJ und wählen Sie: Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen... Wählen Sie für C2 (grün) das SHG-Kanalbild aus, für C5 (cyan) das NAD(P)H-Kanalbild, für C6 (magenta) das THG-Kanalbild und für C7 (gelb) das FAD-Kanalbild. Vergewissern Sie sich, dass Composite erstellen aktiviert ist, und klicken Sie auf OK.

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Results

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Der komplexe, mehrkanalige, multimodale Ansatz des SLAM-Mikroskops (Abbildung 1) kann es für neue Benutzer schwierig machen, Probleme zu beheben und die Ergebnisse zu verstehen. Erstens weist ein gut gespaltenes PCF eine saubere Oberfläche auf (Abbildung 2C) mit einer flachen Oberfläche, die senkrecht zur Länge des PCF verläuft (Abbildung 2A). Eine abgewinkelte, abgebrochene Spaltfläche (Abbildung 2B) u...

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Discussion

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Die Generierung eines geeigneten Superkontinuums ist entscheidend für ein erfolgreiches SLAM-Imaging, kann aber aufgrund der Komplexität der Einrichtung des PCF eine Herausforderung darstellen. Die Gewährleistung eines präzisen Spaltens und einer sorgfältigen Handhabung des PCF ist unerlässlich, um saubere Oberflächen frei von Ablagerungen, Schmutz oder Kratzern zu halten, die alle eine effektive Kopplung und Superkontinuumsgenerierung beeinträchtigen und sogar die Lebensdauer des PCF ve...

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgements

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Die Finanzierung der in dieser Studie verwendeten Geräte wurde zum Teil von GSK über das Center for Optical Molecular Imaging am Beckman Institute for Advanced Science and Technology bereitgestellt. Diese Arbeit wurde auch teilweise vom NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) und dem NSF Science and Technology Center for Quantitative Cell Biology unterstützt. K.K.D.T. wurde durch das NIEHS Research Training Program in Toxicology and Environmental Health (5T32ES007326-25) unterstützt, A.D.C. wurde durch das Postdoctoral Fellows-Programm des Beckman Institute for Advanced Science and Technology unterstützt und A.H. wurde durch das NIBIB Tissue Microenvironment Training Program (T32EB019944) unterstützt. Die Autoren danken Darold Spillman für sein Management von Laborräumen, Ausrüstung und Technologie und danken Dr. Janet E. Sorrells und Dr. Rishyashring R. Iyer für ihre früheren Beiträge zum SLAM-Mikroskopsystem, das in dieser Studie verwendet wurde.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Achsen-TischThorLabs (Englisch)MAX316Unterbrochen.
35 mm Bildschale mit GlasbodenMatTekP35G-0-14-CUnbeschichtetes #0 Deckglas.
DMEMGibco21063029Hoher Glukosegehalt, HEPES, kein Phenolrot.
Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von EndothelzellenPromoCellNr. C-39210Fötales Kälberserum weglassen.
FemtoTrain FemtosekundenlaserSpektren-Physik1040-5Durchschnittliche Leistung: >5,0 W, Pulsenergie: >500 nJ, Wellenlänge: 1040 nm ± 8 nm, Wiederholrate: 10 MHz, Pulsbreite (FWHM): < 220 fs.
Fötales RinderserumCytivaSH30071.03HyClone charakterisiert.
Abisolierer für FasernThorLabs (Englisch)T10S13
Flavinadenin-Dinukleotid-DinatriumsalzhydratSigma-AldrichNr. F6625
Galvanometer-SpiegelCambridge Technologie6215HUnterbrochen.
Arbeitsplatz für die GlasbearbeitungVytranGPX3800
BildJEliceiri Labor an der University of Wisconsin MadisonVersion 2.16.0Fidschi Vertrieb.
Kimwipe SeidenpapierKimberly-Clark Professional34120
L-GlutaminCytivaSH30034.01
MikroskoptischAngewandte wissenschaftliche InstrumenteFTP-2050
Tischregler für MikroskopeAngewandte wissenschaftliche InstrumenteMS-2000-500-UDSW
Autokorrelator für MikroskopieAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
ObjektivOlympXLPLN25XWMP2Eintauchen in Wasser, 25-fache Vergrößerung, 1,05 NA.
Optischer LeistungsmesserNewportArtikel-Nr.: 919P-003-10600 - 1700 nm.
Optischer SpektrumanalysatorThorLabs (Englisch)OSA202C
Photonische KristallfaserNKT PhotonikLMA-PM-15 NKTGroßer Modenbereich, Polarisation beibehaltend. Kerndurchmesser: 15 &μm.
Präzisions-Spaltgerät für optische FasernFujikuraCT-101
ImpulsformerBiophotonik-Lösungen Inc.FemtoJock-DUnterbrochen.
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes DinatriumsalzhydratSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

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