Skalierung für große Wirkung: Optimierte Produktion rekombinanter Adeno-assoziierter Viren mit hohem Durchsatz

Zusammenfassung

Obwohl rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren bei der Genübertragung weit verbreitet sind, stehen sie vor erheblichen Herausforderungen bei der Produktion. Dieses Protokoll beschreibt Produktionsmethoden im Mikro- und Minimaßstab, die sowohl Adhärent- als auch Suspensionszellen verwenden. Die Methoden rationalisieren die Vektorgenerierung, -reinigung und -optimierung, beschleunigen so die präklinische Forschung und erleichtern den Fortschritt innerhalb der Gentherapie-Pipeline.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren haben sich rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren zu einer führenden Plattform für Gentherapieanwendungen entwickelt. Die umständlichen Produktions- und Reinigungsprozesse stellen jedoch nach wie vor erhebliche Engpässe in der Arzneimittelentwicklung dar. Die Produktion von rAAV mit hohem Durchsatz in kleinem Maßstab ohne arbeitsintensive und zeitaufwändige Aufreinigungsverfahren bietet eine wertvolle alternative Strategie, um die präklinische Forschung und das therapeutische Screening in der Frühphase zu beschleunigen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Generierung diverser rAAV-Varianten oder therapeutischer Konstrukte mit ausreichender Qualität für die initiale in vitro und in vivo Evaluation. Dieses Protokoll führt zwei Methoden ein, die je nach Zelltyp und Produktionsmaßstab unterschieden werden: die mikroskalige und die miniskalige rAAV-Produktion. Die Produktion im Mikromaßstab erfolgt in einem 6-Well-Format unter Verwendung adhärenter humaner embryonaler Nierenzellen (HEK) 293T (Micro-6-Well), während bei der Produktion im Minimaßstab Suspensionszellen in 24-Well-Platten (mini-HT24) verwendet werden. Die mit diesen Methoden erzeugten Vektoren werden nachgelagerten Analysen unterzogen, um die Zellkulturbedingungen zu optimieren und/oder zur Beurteilung der biologischen Aktivität von Transgenen verwendet zu werden. Zu den wichtigsten analytischen Messwerten gehören die Vektorgenom-Titration (vg/ml), die Bestimmung des Kapsidtiters (vp/mL), die Western-Blot-Analyse und Zelltransduktionsassays. Zusätzlich werden Vektoren, die im Minimaßstab hergestellt und mit Affinitätsharzen halbgereinigt wurden, mit mittelgroßen Präparaten verglichen, die über Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt wurden. Die hier beschriebenen optimierten Methoden zeigen ein erhebliches Potenzial für die Verfeinerung von Zellkulturparametern, die Identifizierung von Leitkandidaten während des Screenings (d. h. optimierte Transgenkassetten oder überlegene AAV-Kapside) und die Verbesserung der Transgenexpression. Zusammengenommen unterstützen die vorgestellten Workflows die Etablierung einer robusten und effizienten Plattform für die iterative Entwicklung in der Gentherapie-Pipeline, die in jedem Forschungslabor problemlos implementiert werden kann.

Einleitung

Die Arzneimittelentwicklung ist ein komplexer und ressourcenintensiver Prozess, der die Integration hochwertiger Daten aus verschiedenen Phasen erfordert, einschließlich der Identifizierung von Zielmolekülen, der präklinischen Validierung und klinischer Studien¹. Als Reaktion auf die wachsende Nachfrage nach schnelleren Zeitplänen und reduzierten Kosten² hat die Pharmaindustrie zunehmend Assays mit hohem Durchsatz (HT) in kleinem Maßstab in Kombination mit fortschrittlicher künstlicher Intelligenz (KI) als Eckpfeiler moderner Entwicklungsstrategien eingesetzt ^3,4,5. HT-Assays ermöglichen das schnelle Screening und die Bewertung einer großen Anzahl von Wirkstoffkandidaten oder Assay-Variablen zu einem Bruchteil des Zeit- und Kostenaufwands im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ^5,6.

Bei Gentherapieanwendungen, insbesondere bei solchen, bei denen adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet werden, stellen die hohen Warenkosten und die langen Herstellungszeiten erhebliche Herausforderungen dar⁷. Der Entwicklungsprozess beginnt mit der Herstellung des für die Transfektion erforderlichen Plasmidmaterials, gefolgt von einem Zellwachstum auf hohe Dichten, die für die Produktion viraler Vektoren ausreichen. Nach der Transfektion ist eine Inkubationszeit von zwei bis fünf Tagen erforderlich, bevor die Ernte erfolgt, und der Prozess endet mit der Reinigung und Chargencharakterisierung ^8,9. Insgesamt kann dieser Arbeitsablauf bis zu einem Monat dauern und ist in der Regel auf eine begrenzte Anzahl von Präparaten beschränkt, die bei Verwendung von Affinitätssäulen oder Gradienten-Ultrazentrifugation 9,10,11,12 parallel ablaufen können.

In Anbetracht des Bedarfs an kleinen, Mini- oder Mikro-Produktionsprotokollen für AAV hat das Feld mehrere Ansätze angepasst, um rekombinantes AAV (rAAV) in kleinen Laboranlagen herzustellen. Diese Ansätze beinhalten typischerweise die Verwendung mehrerer 15-cm-Schalen für adhärente Zellen^{13, 14} oder 50-2000 mL¹⁵ Schüttelkolben für Suspensionskulturen. In der Vergangenheit wurden AAV-Reinigungsmethoden wie die Gradientenultrazentrifugation (z. B. Iodixanol¹⁶, Cäsiumchlorid (CsCl)¹⁷ oder Saccharosegradienten¹⁸) eingesetzt. Diese kostengünstige und serotypunabhängige Methode war sehr gut für die Herstellung von rAAV im Labormaßstab geeignet, aber aufgrund ihrer arbeitsintensiven Natur und ihrer begrenzten Ultrazentrifugenkapazität ist sie für Anwendungen mit hohem Durchsatz weniger geeignet^19,20.

Die anhaltende Nachfrage nach höherem Durchsatz führte zur Erforschung alternativer Ansätze zur Downscale-Produktion von rAAV. Unter Verwendung adhärenter Zellen wurden Formate wie 6-Well-Platten^{13, 21, 22}, 96-Well-Platten²³ und sogar 384-Well-Platten²⁴ untersucht. In jüngerer Zeit wurden Suspensionszellen aufgrund ihrer verbesserten Skalierbarkeit und der vergleichbaren oder sogar überlegenen Wirksamkeit von Vektorpräparaten eingesetzt⁸.

Die Hochdurchsatzproduktion von rAAV in Suspensionszellen mit einem Kulturvolumen von weniger als 15 mL bleibt jedoch ein Spezialgebiet mit begrenzten veröffentlichten Protokollen ^7,25,26. Die meisten Studien konzentrieren sich auf größere Volumina, um ausreichende Ausbeuten für nachgelagerte Anwendungen zu erzielen ^8,9,27, aber wie bei adhärenten Zellen bieten Miniscale-Formate eine signifikante Reduzierung des Ressourcenverbrauchs und der Verarbeitungszeit und erfüllen damit einen kritischen Bedarf im Feld. Wichtig ist, dass Protokolle im Mini- und Mikromaßstab häufig "rohe Lysate" oder ungereinigte Zellkulturernten mit Vektorpartikeln für die nachgelagerte Charakterisierung und Analyse verwenden.

In dieser Studie werden zwei Protokolle beschrieben, die sowohl adhärente als auch suspensionsbasierte Produzentenzellen verwenden (Abbildung 1). Rohe rAAV-Lysate, die aus adhärenten HEK293T Zellen hergestellt werden, werden direkt für nachfolgende Anwendungen, wie z. B. die Transduktion von Zielzellen, verwendet. Im Gegensatz dazu werden rAAVs, die in Suspensionszellen erzeugt werden, durch eine Hochdurchsatz-Affinitätsharzreinigung weiterverarbeitet. Diese Methoden wurden speziell entwickelt, um die Ausbeute zu verbessern, die Vektorqualität zu bewerten und die Transgenexpression zu überwachen und gleichzeitig den Verbrauch teurer Reagenzien und Materialien zu minimieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass je nach Anwendungsbereich sowohl Rohlysate (aus adhärenten Zellen) als auch affinitätsgereinigtes Material (aus Suspensionszellen) geeignet sind. Darüber hinaus wurde rAAV, das mit Affinitätsharzen gewonnen wurde, in Bezug auf Ausbeute, Reinheit und Transduktionseffizienz in humanen neuronalen Cokulturen direkt mit Gegenstücken verglichen, die mit herkömmlicher Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation gereinigt wurden.

Die Einführung von kleinen Assays mit hohem Durchsatz bei der Entwicklung von Gentherapeutika stellt einen unverzichtbaren Fortschritt dar, der die Innovation beschleunigt und die Lücke zwischen wissenschaftlicher Entdeckung und therapeutischer Realität schließt. Diese Methoden reduzieren nicht nur Kosten und Zeitpläne, sondern ermöglichen auch die parallele Erprobung zahlreicher Erkrankungen und tragen so letztlich zur effizienten Entwicklung transformativer Therapien bei.

Protokoll

1. Micro-6-Well-Produktion von rAAV-Vektoren in adhärenten Zellen

HINWEIS: Die Mikro-6-Well-Produktion von rAAV ist eine angepasste Version eines zuvor veröffentlichten Protokolls von Fakhiri et ^al.21.

1. Aussaat und Transfektion von HEK293T Zellen
   1. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit HEK293T Zellen²⁸ in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
   2. Die Zellen werden in 30 ml adhärente Zellkulturmedien in T175-Flaschen überführt und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10 % fötalem Kälberserum (FCS) bei 37 °C und 5 % CO₂ aufbewahrt.
   3. Teilen Sie HEK293T alle 2-3 Tage: Aspirieren Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie vorsichtig 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um die Zellen zu waschen.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden nur Zellpassagen unterhalb der Passage Nummer 15 verwendet, um die Integrität und Gesundheit der Zellen zu gewährleisten, was sich direkt auf die rAAV-Produktion auswirkt.
   4. Geben Sie 2 ml 0,025 % Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in die Zellen und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang bei 37 °C (oder bis sich die Zellen ablösen).
   5. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 20 ml frisches Medium hinzufügen und die Zellen mit einer 25-ml-Pipette im Medium suspendieren. Je nach Konfluenz können die Zellen 1:10 oder 1:20 in 24 ml DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt verdünnt werden. Um eine ausreichende Zelldichte für die Transfektion zu erhalten, werden 7 × 10⁶ HEK293T Zellen in einen T175-Kolben gesät.
   6. Nach 72 h bei 37 °C werden die Zellen durch Trypsinisierung (wie in Schritt 1.1.3-1.1.5 beschrieben) geerntet, in 20 ml Medium resuspendiert und die Zellen gezählt.
      HINWEIS: Zellen können mit verschiedenen Methoden gezählt werden, abhängig von der gewünschten Genauigkeit, dem Durchsatz und der verfügbaren Ausrüstung. Hauptsächlich werden zwei Ansätze verwendet: die manuelle Zählung (Neubauer-Kammer) und automatisierte Zellzähler. Dieses Protokoll verwendet einen vollautomatischen, bildbasierten Zellanalysator, um kritische Zellparameter wie Lebensfähigkeit, Zelldichte und Aggregationsrate zu messen.
   7. Samenzellen mit einer Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen/Well in einer 6-Well-Platte. Um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und legen Sie sie in den CO₂ -Inkubator.
   8. Nach 24 h erreichen die Zellen eine Konfluenz von 60-70% und können dreifach transfiziert werden.
   9. Mischen Sie für jede Vertiefung 90 μl serumfreies Medium mit insgesamt 2,6 μg Plasmid-DNA, einschließlich pTransgene, pRep/Cap und pHelper in einem molaren Verhältnis von 1:1:1.
   10. In einem zweiten Röhrchen geben Sie kurz vor der Transfektion 5 μl Polyethylenimin (PEI) zu 90 μl serumfreiem Medium.
   11. Nachdem Sie die beiden Lösungen kombiniert haben, die Mischung einreiben und 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   12. Geben Sie die Transfektionsmischung tropfenweise in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, bevor Sie sie wieder in den Inkubator legen.
       HINWEIS: Ein Mediumwechsel nach der Transfektion kann durchgeführt werden, wurde aber nicht als Standardpraxis angewendet, da die Zellen während des gesamten Experiments eine gute Lebensfähigkeit beibehielten.
2. Ernte und Lyse von Zellen
   1. 72 h nach der Transfektion das Zellmedium vorsichtig aus der/den Platte(n) aspirieren.
   2. Nehmen Sie die Zellen ab, indem Sie 500 μl PBS in jede Vertiefung geben und vorsichtig auf und ab pipettieren.
   3. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   4. Messen Sie die Lebensfähigkeit und Dichte der Zellen manuell oder automatisch, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
   5. 50 μl aus der Suspension in eine 96 U-Bodenplatte übertragen, um die Transfektionseffizienz durch Quantifizierung reporterpositiver Populationen mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen.
      HINWEIS: Es wird immer empfohlen, eine Transfektionskontrolle parallel durchzuführen, d. h. eine Transfektion von 1-2 Wells mit einem Transgen, das ein fluoreszierendes Protein trägt (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), mCherry usw.), um die Transfektionseffizienz auf der Platte zu überwachen. Wells mit nicht transduzierten Zellen dienen als Negativkontrolle.
   6. Die restliche Zellsuspension bei 800 × g für 10 min bei RT wird zu Pelletzellen zentrifugiert, die den Hauptteil der produzierten Vektoren enthalten.
   7. Überstand verwerfen und Zellen in 100 μl PBS resuspendieren. Die Zellsuspension kann bei -80 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Um ein rohes Lysat aus den geernteten Zellen zu erhalten, verwenden Sie einen der beiden unten beschriebenen Ansätze.
   8. Beim ersten Ansatz können die Zellen fünf Gefrier-Tau-Zyklen von jeweils 5 Minuten mit einem 37 °C vorgewärmten Wasserbad und flüssigem Stickstoff unterzogen werden. Die Proben zwischen den Zyklen kurz 2-3 s wirbeln.
   9. Die zweite und am häufigsten verwendete Option in diesem Protokoll ist die Beschallung. Hier wird die Zellsuspension auf dünnwandige Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Platten oder -Röhrchen umgefüllt und bei 4 °C in einen Wasserbad-Ultraschallator gegeben.
      1. Beschallung der Proben für insgesamt 3 Minuten mit 30 s Ein-Aus-Schritten bei 25 % Amplitude (Intensität).
   10. Nach der Beschallung werden die Zellen mit einer Tischzentrifuge (16.100 × g für 10 min bei 4 °C) pelletiert, um Zelltrümmer zu entfernen und eine zellfreie Vektorsuspension zu erhalten.
   11. Übertragen Sie Überstände auf 1,5-ml-Röhrchen und pipettieren Sie 10 μl jeder Probe in eine 96-Well-Platte mit geringer Bindung für die digitale Tröpfchen-PCR (dd)PCR oder digitale (d)PCR-Analyse.
   12. Lagern Sie die Röhrchen und 96-Well-Platten bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
3. Transduktion HEK293A Zellen mit Rohlysaten
   HINWEIS: HEK293A Zellen sind möglicherweise nicht für alle AAV-Serotypen geeignet. Um eine geeignete Zelllinie zu identifizieren, konsultieren Sie bitte Datenbanken wie SPIRIT²⁹ (siehe Materialtabelle für einen Link zur SPIRIT-Datenbank) oder einschlägige Originalforschungsartikel^30,31.
   1. Die Zellen werden einen Tag vor der Transduktion in drei 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1,5 × 10⁶ Zellen pro Platte HEK293A.
   2. Mischen Sie am nächsten Tag 10 μl der produzierten Vektoren mit unterschiedlichen PBS-Volumina, um Verdünnungen von 1:2, 1:10 und 1:100 zu erzeugen.
   3. Mit einer Mehrkanalpipette werden die Zellen in 96-Well-Platten in technischen Triplikaten transduziert.
   4. Inkubieren Sie die Zellen mit den rAAVs ohne Medienaustausch für 72 h. Danach führen Sie die nachgelagerten Experimente in Abhängigkeit vom exprimierten Transgen durch, wie z. B. Messungen des Proteinspiegels, Durchflusszytometrie-Analysen zur Fluoreszenzproteinexpression, Knockdown-/Knockout-Analysen usw.
   5. Bei der Standard-Durchflusszytometrie, wie sie in diesem Protokoll durchgeführt wird, aspirieren Sie das Medium und lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 25 μl 0,025 % Trypsin/EDTA ab.
   6. Bei 37 °C 3 Min. inkubieren.
   7. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 175 μl 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS in jede Vertiefung geben.
   8. Verwenden Sie 100 μl der Zellsuspension für die durchflusszytometrische Analyse.

2. Mini-HT24 Herstellung von rAAV-Vektoren in Suspensionszellen

HINWEIS: Im Gegensatz zur zuvor beschriebenen Mikro-6-Well-Produktion werden im mini-HT24-Aufbau gereinigte Präparate von rAAV-Vektoren mit Suspensionszellen erzeugt. Suspensionskulturen liefern höhere Mengen an rAAV aufgrund der höheren Zelldichten, die bei gleichem Kulturvolumen erreicht werden können. In diesem Protokoll wurde ein 24-Tiefen-Well-Format verwendet. Rohzelllysate werden im Hochdurchsatz mit AAVX-Affinitätsharzen gereinigt, mit dem Ziel, sauberere Produkte zu erzeugen, die für bestimmte Anwendungen benötigt werden, für die Rohlysate nicht geeignet sind (siehe Abschnitt Diskussion).

1. Kultivierung und dreifache Transfektion von Suspensionszellen in 24-Deep-Well-Platten
   1. Tauen Sie ein Fläschchen mit Suspensions-Virusproduktionszellen (VPC) in einem Wasserbad bei 37 °C auf. Passagezellen weniger als 30 Mal, um die gleichbleibende Qualität der produzierten Vektoren zu gewährleisten.
   2. Die Zellen werden in einen Schüttelkolben in 30 ml Suspensionskulturmedium überführt und 2-3 Tage lang unter Erhaltungskulturbedingungen kultiviert: 37 °C, 8 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit und 140 U/min (Radius der Schüttelplattform 25 mm).
   3. Bestimmung der Dichte lebensfähiger Zellen nach 2-3 Tagen (siehe HINWEIS in Schritt 1.1.6). Fahren Sie mit der Subkultivierung und Expansion fort, bis die gewünschte Anzahl lebensfähiger Zellen erreicht ist, die für die AAV-Produktion erforderlich ist.
      HINWEIS: Subkulturzellen mit einer lebensfähigen Dichte von > 4 × 10⁶ Zellen/ml und < 6 × 10⁶ Zellen/ml oder gemäß den Anweisungen des Herstellers auf der Grundlage der einzelnen verwendeten Zelllinie. Samen mit einer lebensfähigen Dichte von 6 × 10⁵ Zellen/ml für 3 Tage, gespalten oder 3 × 10⁵ Zellen/ml für 4 Tage. Nach Herstellerangaben aufteilen.
   4. 3 × 10⁶ Zellen/ml in 2,5 ml jeder Vertiefung der 24-fachen Vertiefungsplatte aussäen und die Platte mit einem sterilen Membrandeckel abdecken.
   5. Bereiten Sie die Dreifach-Transfektionsmischung für jedes rAAV-Konstrukt wie folgt vor:
      1. Herstellung eines DNA-Mixes der Produktionsplasmide (pHelper, pRep/Capsid, pTransgen) in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 bei einer Endmasse von 600 ng DNA pro 1 ×^{10 6} lebensfähigen Zellen.
      2. Bereiten Sie die Mischung in Suspensionskulturmedium mit einem endgültigen Volumen von 2,5 % des zu transfizierenden Kulturvolumens vor.
      3. Bereiten Sie den PEI-Mix in Suspensionskulturmedium mit einem endgültigen Volumen von 2,5 % des zu transfizierenden Kulturvolumens vor. Verwenden Sie eine Endmasse von 1 ng PEI pro 1 ng DNA.
      4. Kombinieren Sie sowohl DNA-Mix als auch PEI-Mix, indem Sie das gesamte Volumen des einzelnen PEI-Mixes auf den entsprechenden DNA-Mix übertragen, was zu einem Transfektionsmixvolumen von 5% des Kulturvolumens führt.
      5. Mischen, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
         HINWEIS: Die Transfektionsmischung darf nach der Inkubationszeit nicht vortexen, um eine Störung der PEI-DNA-Komplexe zu vermeiden, die während der Inkubation^{gebildet wurden 32}.
      6. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
   6. Geben Sie die Transfektionsmischungen tropfenweise in die entsprechenden Vertiefungen, während Sie die Vertiefungsplatte vorsichtig schütteln.
   7. Verschließen Sie die Platte mit einer sterilen, atmungsaktiven Viskosefolie und decken Sie sie zusätzlich mit dem entsprechenden Membrandeckel ab, um die Verdunstung zu minimieren.
   8. Stellen Sie sicher, dass die Platte auf eine geeignete Schüttelschale gestellt wird und befestigen Sie sie fest.
   9. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 8 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit und 225 U/min für 72 h.
      HINWEIS: Unterschiedliche Deep-Well-Plattenformate erfordern eine individuelle Beurteilung der Schüttelgeschwindigkeit, um einen effizienten Gasaustausch und eine Kultivierung der Zellen in einer homogenen Suspension zu ermöglichen, ohne dass sich die Zellen im Laufe der Zeit am Boden absetzen. Dies erfordert erste Tests, die von der individuellen Laborausstattung und dem Aufbau sowie den für die Produktion verwendeten Zelllinien abhängen. Berücksichtigen Sie insbesondere den Rüttelradius, das Plattenformat und die Form des Well-Bodens, um die Zellsuspension homogen zu halten und zu verhindern, dass sich die Zellen am Boden absetzen.
2. Ernte und Lyse
   1. Ernten Sie die Zellen, indem Sie das gesamte Kulturvolumen jeder Vertiefung in einzeln markierte 5-ml-Röhrchen überführen und 20 Minuten lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugieren.
   2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 550 μl Dulbecco's (D)PBS und übertragen Sie die Suspension in ein 1,8-2,0 mL Schraubverschlussröhrchen, um Aerosole und Tropfen beim Öffnen der Röhrchen zu vermeiden.
      HINWEIS: Pellets können an dieser Stelle auch gelagert werden, um später mit dem Reinigungsprozess fortzufahren. Lagern Sie die phosphatgepufferten Salzpellets (DPBS) von Dulbecco bei -80 °C und achten Sie darauf, dies während der Schritte des Gefrier-Tau-Zyklus zu berücksichtigen.
   3. Bereiten Sie die Lysate vor, indem Sie die Röhrchen ca. 2 Minuten lang in flüssigen Stickstoff legen und dann in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Wiederhole diesen Zyklus 3-5x.
   4. Zentrifugieren Sie die Lysate 5 min lang bei 1000 × g bei 4 °C. Decken Sie die Zentrifugeneimer mit aerosoldichten Deckeln ab.
   5. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.
      HINWEIS: Lysate müssen klar und frei von sichtbaren Ablagerungen oder Trübungen sein, um ein Verstopfen des im Reinigungsprozess verwendeten Harzes zu vermeiden. Vermeiden Sie es, die Pellets zu schütteln oder zu stören. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, falls die Überstände nicht klar sind. Ziehen Sie eine höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit oder eine längere Dauer in Betracht, wenn es sich um hochkonzentrierte Proben oder Proben mit großen Mengen an Schmutz handelt.
3. Hochdurchsatz-rAAV-Aufreinigung auf Affinitätsharzbasis
   1. Bereiten Sie den Elutionspuffer in einem Becherglas vor, indem Sie 720 mg Zitronensäure zu 50 mL Reinstwasser hinzufügen, um eine Endkonzentration von 75 mM Zitronensäure zu erreichen.
   2. Rühren Sie den Puffer, bis sich das Pulver vollständig aufgelöst hat.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Well-Volumen ausreichend ist, um die Puffervolumina und Pipettenspitzen aufzunehmen, ohne zu verschütten oder eine Kreuzkontamination benachbarter Wells zu riskieren.
   3. Stellen Sie den pH-Wert auf 3,0 ein, indem Sie tropfenweise 1 M Salzsäure (HCl) hinzufügen, während Sie den Puffer ständig umrühren und mit einer pH-Elektrode messen.
   4. Führen Sie eine Sterilfiltration auf dem Puffer mit einer Porengröße von 0,22 μm durch.
   5. Bereiten Sie Säulen einer 96-Deep-Well-Platte mit einem Well-Volumen von 2-2,2 mL für die Aufreinigung gemäß dem in Tabelle 1 beschriebenen Schema vor.
      HINWEIS: Die Proben wurden mit einer elektronischen Mehrkanalpipette aufgereinigt. Das Verfahren ist mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen kompatibel und kann für einen höheren Probendurchsatz skaliert werden.
   6. Führen Sie die Reinigung in einer Biosicherheitswerkbank auf RT unter Verwendung der im Reinigungsschema angegebenen Parameter durch (siehe Tabelle 1) oder optimieren Sie die Parameter entsprechend den individuellen Anforderungen, abhängig von Harz oder Probenvolumen, erwartetem Titer usw.
   7. Nach der Elution fügen Sie jeder Probe 1/4 des Elutionsvolumens Neutralisationspuffer hinzu.
   8. Mischen Sie, indem Sie 80 % des Volumens 10x nach oben und unten pipettieren.
   9. Bereiten Sie die Dialyseplatten vor, indem Sie die Membrankassetten entfernen und 1600 μl Dialysepuffer in jede Vertiefung geben.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Membranen vor der Durchführung der Dialyse nicht mit Flüssigkeit in Berührung kommen, da ein erneutes Trocknen die Integrität und Funktion der Membran beeinträchtigen kann.
   10. Übertragen Sie das gesamte Probenvolumen (maximal 300 μl) auf eine Dialysekassette mit einem geeigneten Volumenformat und einer geeigneten Membranporengröße (≥ 20.000 Molekulargewichts-Cutoff (MWCO)). Achten Sie darauf, dass die Membranen homogen beladen sind und keine Luftblasen vorhanden sind.
   11. Legen Sie die Kassetten in die bestückten Vertiefungen der Dialyseplatte und verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie.
   12. Übertragen Sie die Dialyseplatte auf eine Schüttelplattform und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 300 U/min, 4 °C.
   13. Ersetzen Sie den Dialysepuffer und wiederholen Sie die Inkubation bei 300 U/min, 4 °C für 30 Minuten.
   14. Wiederholen Sie den Pufferwechsel und die Inkubation insgesamt 3x.
   15. Das gesamte Volumen der dialysierten Proben wird in markierte Lagerröhrchen überführt und bei 4 °C gelagert, falls sie anschließend zur Charakterisierung oder für andere Experimente verwendet werden.
   16. Zur Langzeitlagerung bei -80 °C lagern. Vermeiden Sie Gefrier-Auftauzyklen, da dies die Wirksamkeit der AAVs beeinträchtigen kann, und bereiten Sie bei Bedarf Aliquote mit kleinen Volumina vor.
4. Titration des genomischen rAAV-Titers aus Rohlysaten und harzbasierter Aufreinigung mittels digitaler PCR (dPCR)
   1. Um den genomischen Titer der rohen Lysate, d.h. der viralen Genome pro ml (vg/mL), zu bestimmen, tauen Sie die geernteten Vektorproben bei RT auf und pipettieren Sie dann 10 μl in ein Röhrchen.
      HINWEIS: Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um den Titer des viralen Genoms (vg/ml) einer Vektorpräparation zu bestimmen, wobei die absolute Quantifizierung in der Regel auf zwei Hauptansätzen beruht: der tröpfchen- oder emulsionsbasierten Methode (ddPCR) und der Mikroplatten-basierten Methode, die durch die digitale PCR (dPCR) dargestellt ^wird33,34. Neben diesen digitalen Methoden kann eine absolute Quantifizierung auch mittels quantitativer PCR (qPCR) erreicht werden. Während die qPCR traditionell eine relative Quantifizierungsmethode ist, kann sie für die absolute Quantifizierung angepasst werden, indem eine Plasmid-Standardkurve verwendet wird. Dabei handelt es sich um ein Plasmid, das die Zielsequenz in einer bekannten Konzentration enthält, die als Referenz für die Extrapolation des viralen Genomtiters^21,33 dient. Obwohl die qPCR schneller und kostengünstiger ist als ddPCR oder dPCR, ist sie weniger präzise und hängt stark von der Genauigkeit des Plasmidstandards¹⁶ ab. Unabhängig von der Quantifizierungsmethode müssen die Proben vorbehandelt werden, um die viralen Genome aus den Partikeln freizusetzen. Dieses Protokoll folgt einer zuvor beschriebenen Methode von Dobnik, D. et al.³⁵.
   2. Behandeln Sie rAAV-Proben 30 Minuten lang mit einer Nuklease bei 37 °C, um freie Plasmid-DNA aus dem Transfektionsprozess abzubauen.
      HINWEIS: Optional, je nach verwendetem Enzym: Proben 15 Minuten lang auf 95 °C erhitzen, um das Enzym zu inaktivieren und das Kapsid des Vektors zu lysieren.
   3. Nach dem Abkühlen auf RT Proteinase K für 15 Minuten hinzufügen, um Kapsidfragmente zu verdauen.
   4. Zur Inaktivierung von Proteinase K die Proben erneut für 15 min auf 95 °C erhitzen.
   5. Bereiten Sie die ddPCR- oder dPCR-Mastermixe gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   6. Verwenden Sie markierte DNA-Sonden, da sie ein spezifischeres Signal liefern als interkalierende Farbstoffe. Entwerfen Sie Sonden so, dass sie "zentral" im viralen Genom, d. h. im Transgen (siehe ANMERKUNG), und nicht im Promotor oder PolyA-Schwanz binden, und wählen Sie ein Fluorophor wie Hexachlor-6-carboxyfluorescein (HEX) oder 6-Carboxyfluorescein (FAM) aus, das mit dem jeweiligen PCR-System kompatibel ist.
      HINWEIS : In jüngster Zeit wurde die Multiplex-ddPCR oder dPCR mit Primer-/Sondensätzen, die auf verschiedene Regionen des viralen Genoms abzielen, eingesetzt, um die Genauigkeit der Titerbestimmung zu verbessern^36,37. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung intakter Genome durch die Anwendung von Formeln, die in den referenzierten Studien skizziert wurden, oder durch den Einsatz integrierter Softwarelösungen.
   7. Führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der nachbearbeiteten Proben in ddH₂O mit 96-Well-Platten mit geringer DNA-Bindung durch. Übertragen Sie abschließend 5,5 μl (für ddPCR) oder 2 μl (für dPCR) des Templates (Verdünnungen 10,⁴- und 10,⁵) auf die ddPCR 96-Well-Platte, die bereits den ddPCR/dPCR-Mastermix einschließlich Primer/Sonden enthält. Passen Sie den Verdünnungsbereich basierend auf der Produktionseffizienz der einzelnen Konstrukte an, um sicherzustellen, dass die Messungen innerhalb des linearen Nachweisbereichs liegen.
      HINWEIS: Da es sich bei der dPCR/ddPCR-Quantifizierung um eine hochempfindliche Methode handelt, sind 10^{4- und} 10 5-Verdünnungen der Proben erforderlich.
   8. Befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte für ddPCR.
      1. Befolgen Sie für die PCR-Amplifikation die Anweisungen des Herstellers zur Optimierung der Assay-Bedingungen, einschließlich der Anpassung der Annealing- und Amplifikationszeiten auf der Grundlage der verwendeten Primer-/Sondensets. Das in dieser Studie verwendete Standardzyklusprotokoll sah wie folgt aus: anfängliche Denaturierung bei 9 °C für 10 min (Ramping °C/s); 35 Denaturierungszyklen bei 9 °C für 30 s und Verstärkung bei 6 °C für 60 s; gefolgt von einem abschließenden Dehnungsschritt bei 9 °C für 10 min (Ramping °C/s).
      2. Nach der PCR-Amplifikation der viralen rAAV-Genomziele übertragen Sie die Platte auf den Tröpfchen-Reader und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Fluoreszenzintensität in jedem Well zu messen. Der Tröpfchen-Reader ermöglicht die absolute Quantifizierung der Kopienzahlen des viralen Genoms pro μL-Reaktion.
   9. Befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte für dPCR.
      1. Befolgen Sie, wie für die ddPCR-basierte Quantifizierung beschrieben, die Anweisungen des Herstellers zur Optimierung der Assay-Bedingungen.
      2. Befolgen Sie als Ausgangspunkt das voreingestellte Wärmeprofil auf dem dPCR-Gerät, das einen ersten Denaturierungsschritt bei 9 °C für 2 Minuten umfasst, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 9 °C für 15 s und Glühen/Verlängern bei 5 °C für 30 s.
         HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen empfohlenen Rampengeschwindigkeiten und Reaktionsvolumina durchgeführt.
   10. Analysieren Sie ddPCR- und dPCR-Daten mit verschiedenen Softwarelösungen, die in der Regel vom Gerätehersteller bereitgestellt werden (z. B. QX Manager bzw. QIAcuity Software Suite 1.2). Für beide Methoden sind nur Probenverdünnungen mit einem angemessenen Verhältnis von positiven zu negativen Partitionen/Tröpfchen für die Quantifizierung auszuwählen.
       HINWEIS: Für die Bestimmung von rAAV-Partikeltitern (vp/mL; vp = virale Partikel) aus Rohlysaten und AAVX-Harz kann ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet werden., Es stehen verschiedene kommerziell erhältliche Standard-Sandwich-ELISA-Kits für die AAV-Quantifizierung zur Verfügung (die in dieser Arbeit verwendeten Kits sind in der Materialtabelle aufgeführt). Führen Sie den Assay gemäß dem/den Herstellerhandbuch(en) durch. Stellen Sie sicher, dass das verwendete ELISA-Kit mit dem zu produzierenden AAV-Serotyp kompatibel ist.
5. Analyse des VP-Verhältnisses aus gereinigten rAAVs
   HINWEIS: Um das Verhältnis des viralen Kapsidproteins (VP) jeder Probe aus den einzelnen Vertiefungen des 24-Deep-Well-Setups zu bestimmen, können entweder Standard-Western-Blot- oder automatisierte kapillarbasierte Protokolle durchgeführt werden.
   1. Zum Nachweis der AAV2-Kapsidproteine VP1, VP2 und VP3 verwenden Sie einen primären monoklonalen Anti-AAV-Antikörper VP1/VP2/VP3. Stellen Sie sicher, dass der Primärantikörper mit dem jeweiligen Serotyp oder der jeweiligen Kapsidvariante funktioniert.
   2. Verwenden Sie geeignete Positivkontrollen, wie z. B. rekombinante VP1, VP2 und VP3 oder einen AAV-Referenzstandard.
   3. Bereiten Sie die Positivkontrolle in einem molekularen Verhältnis von 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) vor, um das erwartete VP-Verhältnis nachzuahmen. Dies dient auch als Referenz für die Quantifizierung des VP-Verhältnisses mittels Signalbereichsintegration.
   4. Wählen Sie ein Kapillarkit mit einem geeigneten Bereich, der die zu detektierenden Kapsidproteine umfasst, einschließlich des kleinsten (VP3 mit ~ 60 kDa) und des größten (VP1 mit ~ 82 kDa). Dies kann je nach verwendetem Serotyp und Kapsidvariante variieren.
   5. Bereiten Sie die im Kit enthaltenen Reagenzien und biotinylierten Leiter gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   6. Bereiten Sie eine Verdünnungsserie der Proben (entweder basierend auf dem genomischen Titer beginnend mit 1 × 10¹² vg/ml bis 1 ×^{10 10} vg/ml oder 1:2 Verdünnungen beginnend mit der unverdünnten Probe bis 1:64) in dem mitgelieferten Verdünnungspuffer des Kits vor, um einen guten Nachweisbereich für jede Probe zu gewährleisten.
   7. Verdünnen Sie den Primärantikörper in dem bereitgestellten Antikörperverdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers oder in Abhängigkeit von vorherigen Tests. Beginnen Sie mit 1:100.
   8. Verwenden Sie ein entsprechendes Nachweiskit, abhängig von der Quelle des primären Antikörpers.
   9. Laden Sie die Platte gemäß dem mit dem Kit gelieferten Schema.
   10. Achten Sie darauf, leere Säulen auch mit Wasser oder Probenverdünnungspuffer zu füllen, um die Kapillaren des Instruments nicht durch Trockenlaufen zu beschädigen.
   11. Die Platte mit einer Siegelfolie abdecken und bei 1200 × g, 5 min, bei 4 °C zentrifugieren.
   12. Übertragen Sie Platte und Kapillaren auf das Instrument und verwenden Sie voreingestellte Standardbedingungen für den Lauf.
   13. Analysieren Sie den Lauf mit einer Datenanalysesoftware wie Compass (Version 6.3.0)³⁸.
       HINWEIS: Zur Analyse der Partikelintegrität, Monodispersität und Reinheit wird die Transmissionselektronenmikroskopie (ns-TEM) mit negativer Färbung empfohlen. Die TEM-Analyse kann wie von Steininger et. al²⁵. Andere Methoden, wie z. B. die Massenphotometrie³⁹, SEC-MALS⁴⁰ und die Splitterfärbung⁴¹ , können jedoch auch ergänzende Messwerte liefern, um die Qualität von rAAV-Präparaten zu beurteilen.
6. Transduktion mit gereinigten Viruspartikeln
   HINWEIS: Um Zellen mit gereinigten viralen Vektoren zu transduzieren, muss eine Multiplizität der Infektion (MOI) bestimmt werden. MOI ist definiert als die Anzahl der partikelhaltigen Genome, die pro Zelle hinzugefügt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass es sich hierbei um einen theoretischen Wert handelt. Die tatsächliche Anzahl der pro Zelle abgegebenen rAAV-Genome hängt von der Fähigkeit des Kapsids ab, die Zielzellen erfolgreich zu transduzieren. Daher muss das optimale MOI immer experimentell ermittelt werden. In diesem Abschnitt ging es darum, zwei virale Vektorstämme zu vergleichen, die mit unterschiedlichen Reinigungsmethoden (Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation und AAVX-Affinitätsharz) hergestellt wurden. Zu diesem Zweck wurden humane neuronale Co-Kulturen mit den beiden Präparaten transduziert und die Transduktionseffizienz mittels Fluoreszenzmikroskopie bewertet.
   1. Eine schwarze optische Bodenplatte mit 96 Wells über Nacht bei 4 °C mit 0,1 % (Poly-L-Ornithin) PLO beschichten oder 1 h bei 37 °≥C inkubieren.
   2. Am Tag der Aussaat das PLO-Beschichtungsreagenz aspirieren und mit der Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor beschichten und ≥1 h bei 37 °C inkubieren.
   3. Kultivieren Sie Motoneuronen mit Astrozyten im Verhältnis 1:6 oder nach Empfehlung des Lieferanten.
   4. Nach 2 Tagen in vitro (DIV) wird die Co-Kultur bei einem MOI von 50.000 transduziert.
   5. Virale Aliquots bei 4 °C auftauen.
   6. Bereiten Sie Transduktionsmedien vor (virale Vektoren mit gewünschtem MOI basierend auf viralen Genomen pro Zelle + Zellkulturmedien in geeigneten Volumina, um 50 % der Kulturmedien pro Vertiefung zu ersetzen).
   7. Führen Sie einen Medienaustausch von 50 % mit Transduktionsmedien durch.
   8. Führen Sie bei 5 DIV einen vollständigen Medienaustausch mit regulären Kulturmedien durch.
   9. Pflegen Sie die Zellen mit regelmäßigem Wechsel der Kulturmedien alle 2-3 Tage oder gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
   10. Überwachen Sie die Expressionsniveaus mit einem Live-Bildgebungsmikroskop, das mit der richtigen Anregung für das Reportertransgen ausgestattet ist. Bei humanen Neuronen wird die Plateauexpression zwischen 10 und 14 Tagen nach der Transduktion beobachtet (siehe Abbildung 4A).

Schritt	Puffer/Material	Well-Volumen [μL]	Arbeitsvolumen [μL]	Zyklen	Durchfluss [μL/min]
1. Äquilibrierung	Gleichgewicht/ Waschen I Puffer	1100	950	2	500
2.Laden/ Einfangend	Proben-Überstand	550	500	4
3. Waschen I	Gleichgewicht/ Waschen I Puffer	1100	950	2
4. Waschen II	Wash II Puffer	1100	950	2
5. Elution	Elutions-Puffer	70 μl (20 μl Harzspitzen) 250 μL (80 μl Harzspitzen)	60 μL (20 μL Harzspitzen) 240 μL (80 μl Harzspitzen)	4
6. Neutralisation	Neutralisations-Puffer	Geben Sie 1/4 des Elutionsvolumens direkt zu jeder Probe 70 μl eluierte Probe → 17,5 μl hinzufügen 250 μl eluierte Probe → 62,5 μl hinzufügen		-	-

Tabelle 1: Plattenlayout und Reinigungsparameter für die Affinitätsharzreinigung von rAAVs.

Ergebnisse

In den letzten Jahren ist die Nachfrage nach der Herstellung von AAV-Vektoren im Labormaßstab erheblich gestiegen, was zur Gründung zahlreicher Auftragsforschungseinrichtungen geführt hat, die dies als Dienstleistung anbieten⁴². Angesichts der hohen Kosten und der verzögerten Zeitpläne, die oft mit dem Outsourcing verbunden sind, bleibt die eigene rAAV-Produktion eine attraktive Option. Insbesondere Hochdurchsatzprotokolle, die den Materialverbrauch und die Arbeitsstunden minimieren und gleichzeitig Reinigungsschritte integrieren, sind in der Wirkstoffentwicklungspipeline von großem Nutzen.

Dieses Protokoll skizziert zwei Hochdurchsatz-Setups für die rAAV-Produktion: einen Micro-6-Well-Ansatz mit adhärenten Zellen und ein mini-HT24-Protokoll für Suspensionszellen (siehe Übersicht in Abbildung 1). Der Micro-6-Well-Aufbau verwendet adhärente HEK293T Zellen, um rAAV in einem 6-Well-Format zu produzieren. Dieses Material wurde verwendet, um die Auswirkungen von zwei kommerziell erhältlichen PEI-Transfektionsreagenzien und Natriumchlorid (NaCl) auf die rAAV2-Produktion zu bewerten (Abbildung 2A). Dabei wurden verschiedene Parameter gleichzeitig überwacht: (i) die Lebensfähigkeit der Produzentenzelle und die Transfektionseffizienz mit einem GFP-Transgen (Abbildung 2B und ergänzende Abbildung 1) und (iii) der Prozentsatz der GFP-positiven (GFP+) Zellen nach Transduktion mit Rohlysaten (Abbildung 2C). Das Transduktionsexperiment diente als kostengünstiges und schnelles indirektes Auslesen von Vektortitern und Funktionalitäten. Interessanterweise reichten niedrigere Verhältnisse von Transfektionsreagenz zu DNA aus, um eine effiziente Vektorproduktion zu fördern (Abbildung 2B) bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer guten Zellviabilität. Darüber hinaus erwies sich die Zugabe von 150 mM NaCl als vorteilhaft, insbesondere bei Verwendung des PEIpro-Reagenzes. Die Durchführung dieses Experiments im Mikromaßstab bot mehrere Vorteile: (i) einen schnellen Arbeitsablauf, bei dem die Zellaussaat, Transfektion und Vektorernte innerhalb einer Woche abgeschlossen waren; ii) Kompatibilität mit nachgelagerten analytischen Standardassays; und (iii) breite Anwendbarkeit auf alle AAV-Serotypen.

Für Anwendungen, die größere Mengen an rAAV-Vektoren erfordern, wie z. B. In-vivo-Experimente oder kinetische In-vitro-Studien (bei denen ein höherer oder breiterer Bereich von MOIs angewendet wird), ist ein Scale-up erforderlich. Um ein mini-HT24-Protokoll zu etablieren, das ausreichend Material für die Hochdurchsatzreinigung liefert, wurden Suspensionszellen verwendet. Im Vergleich zu adhärenten Zellen bieten Suspensionskulturen eine bessere Skalierbarkeit und sind platzsparender, da sie nicht durch die Oberfläche eingeschränkt sind. Da die Suspensionszellen frei im Medium wachsen, können sie das gesamte Kulturvolumen einnehmen, was das Scale-up in drei Dimensionen einfacher macht. Dadurch können höhere Zelldichten im Vergleich zu Schichtkulturen erreicht werden. Darüber hinaus sind die Aufhängungssysteme einfacher zu warten und zu verarbeiten, da während des Fahrens oder der Ernte keine Ablöseschritte erforderlich sind. Die Gleichmäßigkeit der rAAV-Produktion im 24-Well-Format wurde durch die Analyse von drei Schlüsselparametern auf der gesamten Platte bewertet (Abbildung 3): (A) Partikeltiter (vp/ml); (B) VP-Verhältnis im Kapsid; (C) Genomischer Titer (vg/ml) und (D) Leer-zu-voll-Verhältnis.

Obwohl bei diesen Parametern eine gewisse Variabilität beobachtet wurde, blieb sie weitgehend innerhalb eines zweifachen Bereichs, der innerhalb der Messfehlerspanne liegt. Die Expression des VP-Proteins wurde auch mittels automatisierter Western-Blot-Analyse untersucht (Abbildung 3E). Schließlich wird ein Vergleich der Gesamterträge aus der Produktion von Mikro-6-Wells, Mini-HT24 und mittleren Maßstäben (Schüttelkolben) vorgestellt, um die Auswahl des geeigneten Maßstabs auf der Grundlage der experimentellen Anforderungen und der nachgelagerten analytischen Anforderungen zu leiten (Abbildung 3F).

Ein kritischer Aspekt eines AAV-Aufreinigungsprotokolls ist die Bewertung der Reinheit und Wirksamkeit der Vektoren. Hier wurden die auf Harz gereinigten Vektoren Seite an Seite mit denen verglichen, die mit einer zweistufigen Cäsiumchlorid (CsCl)-basierten Ultrazentrifugation (UC) aufgereinigt wurden (Abbildung 4). Eine vergleichbare Wirksamkeit zwischen den beiden Präparaten wurde durch die Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, wie die erfolgreiche Transduktion von Motoneuronen und Astrozyten zeigte (Abbildung 4A). Die elektronenmikroskopische Analyse ergab keine signifikanten Unterschiede in der Partikelform oder im Aggregationszustand. Es gab jedoch einen leichten Trend, der darauf hindeutete, dass die CsCl-Reinigung konsistenter zu saubereren Präparaten führte (Abbildung 4B).

Abbildung 1: Überblick über die rAAV-Produktions- und Aufbereitungsansätze. Diese Abbildung veranschaulicht rAAV-Produktionsmethoden, die von Schüttelkolben im Midi-Maßstab über Mini-HT24-Suspensionskulturen bis hin zu Mikro-6-Well-Adhärentkulturen reichen. Diese Ansätze ermöglichen die Erzeugung von rAAV auf verschiedenen Skalen, wobei unterschiedliche Zelllyse- und Vektorreinigungsstrategien verwendet werden. Die abschließende Charakterisierung von rAAVs umfasst in der Regel qPCR/dPCR für die Quantifizierung des viralen Genoms (vg/mL), ELISA für die Bestimmung des Kapsidtiters (vp/mL) und Zelltransduktionsassays zur Beurteilung der biologischen Aktivität. Erstellt in BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Optimierung des Transfektionsprotokolls für die Mikro-6-Well-rAAV-Produktion. (A) Schematische Übersicht des Experiments mit getesteten Parametern und analytischen Messwerten. (B) HEK293T Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen/Well ausgesät. Es wurden verschiedene DNA-Mengen, PEI-Typen (Pro oder Max), Verhältnisse und NaCl-Konzentrationen getestet. (C) Prozentsatz der GFP-positiven (GFP+) HEK293A Zellen 72 h nach der Transduktion mit gleichen Volumina an Lysaten aus Panel A (jeweils 10 μl). Der Einfachheit halber wird nur der DNA-Zustand angezeigt, der zu den höchsten Vektorausbeuten (2650 ng) geführt hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analytische Charakterisierung von rAAV, das in einem mini-HT24-Setup hergestellt wurde, und Titervergleich über verschiedene Skalen. (A) ELISA-Analyse der gereinigten rAAV-Kapsidtiter in jeder Vertiefung. Die Werte werden als Schwankungen über dem durchschnittlichen Partikeltiter der Platte nach der Reinigung dargestellt. Die zu erwartenden Titer hängen vom verwendeten AAV-Kapsid und dem verpackten Transgen ab. Die Partikeltiter für verschiedene AAV-Vektoren reichten von niedrigen 10¹¹ bis hohen 10¹² VP/ml. (B) VP-Verhältnis-Analyse mittels WES von gereinigtem rAAV aus den angezeigten Vertiefungen. Rekombinante AAV2 VP1, VP2 und VP3 wurden als Positivkontrollen bei einem molaren Verhältnis von 1:1:10 verwendet. (C) dPCR-Analyse von gereinigtem rAAV aus jeder Vertiefung. Die Werte werden als Schwankungen über dem durchschnittlichen genomischen Titer der Platte nach der Reinigung angezeigt. Die zu erwartenden Titer hängen vom verwendeten AAV-Kapsid und dem verpackten Transgen ab. Die genomischen Titer für verschiedene AAV-Vektoren reichten von niedrig 10¹⁰ (rAAV2) bis hoch 10¹¹ vg/ml (rAAV9, hier nicht gezeigt). (D) Leer-zu-voll-Verhältnis (E/F) der angezeigten Wells, basierend auf genomischen und Partikeltiterergebnissen der Panels A und C. Die Werte werden auf den Plattendurchschnitt normiert. Der mittlere E/F-Wert im mini-HT24-Format für rAAV2 beträgt 10,6 % ± 3,0 % nach der Aufreinigung des AAVX-Affinitätsharzes. (E) Kapillar-Western-Blot-Analyse von VP-Proteinen in gereinigten rAAV2-Proben aus jeder Vertiefung. (F) Vergleich der Gesamtausbeute des viralen Genoms unter Berücksichtigung des endgültigen Probenvolumens und der Konzentration jeder Methode. Die Daten werden als mittlere Faltungsdifferenz über das kleinste Format (Micro-6-Well) dargestellt, wobei Fehlerbalken die Standardabweichung (SD) von biologischen Replikaten anzeigen. Für die Produktion von 24-Deep-Wells mit hohem Durchsatz und AAVX-Affinitätsharzaufreinigung, SD = ±0,176 (n = 24); für Micro-6-Well-Beschallung; SD = ±0,349 (n = 6); und für die Standardproduktion im mittleren Maßstab mit CsCl-Gradientenreinigung SD = ±134,70 (n = 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich der Potenz und Reinheit zwischen Hochdurchsatz (HT)-Harz gereinigtem rAAV und Standard-CsCl-gereinigten Proben. (A) Vom Menschen stammende Motoneuronen und Astrozyten wurden mit dem gleichen rAAV-Konstrukt transduziert, das den Fluoreszenzreporter mRuby3 unter dem humanen Synapsin-Promotor exprimierte, wie ein Reporter bei einem MOI von 50.000. Die Fluoreszenzmikroskopie-Bilder wurden sieben Tage nach der Transduktion (DPT) mit einem Live-Bildgebungsmikroskop aufgenommen. rAAVs wurden entweder mit der Standard-CsCl-Gradientenmethode (oben) oder mit dem HT AAVX-Affinitätsharzspitzen-basierten Ansatz (unten) aufgereinigt. CsCl-gereinigte Proben wurden vor der Transduktion einem zusätzlichen Gefrier-Auftau-Zyklus ausgesetzt und mit harzgereinigten rAAVs verglichen. (B) Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse von rAAV2-Serotyp-basierten Varianten, die mittels CsCl-Gradienten- (oben) und HT-Harzspitzenmethoden (unten) aufgereinigt wurden. Zwei Chargen von HT-Harz-gereinigten Proben von rAAV2 können ohne Dialyse (unten links) und mit Dialyse (unten rechts) verglichen werden. Das Leer-zu-Voll-Verhältnis (E/F) wurde unter Verwendung von TEM bestimmt, um > 90 % für CsCl-Gradienten-ultrazentrifugationsgereinigte Proben und < 40 % voll für AAX-Affinitätsharz-gereinigte Proben zu sein. Maßstabsleiste = 100 nm. Panel B zeigt repräsentative Bilder von gereinigten Chargen mit den angegebenen Methoden. Bitte beachten Sie, dass diese Bilder nicht zu den gleichen Präparaten gehören, die für Transduktionsexperimente in Panel A verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Transfektion von HEK293T Zellen für die rAAV2-GFP-Produktion unter Verwendung des Micro-6-Well-Aufbaus. Für die Transfektion wurden verschiedene DNA-Mengen, NaCl-Konzentrationen (in mM), PEI-Produkte und PEI-zu-DNA-Verhältnisse verwendet (wie in Abbildung 2 beschrieben). Die Bilder wurden 72 h nach der Transfektion mit der gleichen Belichtungszeit (320 ms) aufgenommen. In dieser Abbildung sind repräsentative Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen zu sehen. Vergrößerung: 10X. Maßstabsleiste nicht angezeigt; Das Bild dient nur zur Veranschaulichung und qualitativen Beurteilung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokollpapier skizziert effiziente Methoden zur Herstellung von rAAV in kleinen Durchsatzumgebungen mit hohem Durchsatz, wobei sowohl Adhärent- als auch Suspensionszellen verwendet werden. Diese Methoden adressieren die steigende Nachfrage nach skalierbaren und flexiblen rAAV-Produktionsprozessen, die die präklinische Forschung unterstützen und gleichzeitig Zeit-, Kosten- und Ressourcenverbrauch minimieren.

Sowohl Adhärent- als auch Suspensionszellensysteme bieten deutliche Vorteile und Herausforderungen für die Produktion von rAAV in kleinem Maßstab. Adhärente Zellsysteme, wie z. B. HEK293T Zellen²⁸ , die in Multi-Well-Plattenformaten gezüchtet wurden, eignen sich besonders gut für das Vektordesign im Frühstadium und vergleichende Studien. Ihre Kompatibilität mit etablierten Kultivierungs- und Transfektionsprotokollen ermöglicht eine unkomplizierte Implementierung in den meisten Laboren. Zum Beispiel Grosse et al. nutzte die Produktion in kleinem Maßstab in 6-Well-Platten, um die AAP-Funktionalität zu untersuchen, ein Protein, das für den Zusammenbau des viralen Kapsids²² entscheidend ist. Drittanti et al. stellten rAAV-Vektoren in 96-Well-Platten her, um die Kinetik der rAAV-Replikation zu bewerten und die Auswirkungen verschiedener Adenovirus-Helfer auf die rAAV-Produktion zu testen²³. Bemerkenswert ist, dass in der letztgenannten Studie ein Replikationsassay beschrieben wurde, bei dem spezialisierte HeLa-Zellen AAV Rep und Cap exprimieren, um das Signal weiter zu verstärken. In jüngerer Zeit wandten Quan et al. ein 384-Well-Hochdurchsatz-Produktionsprotokoll im Rahmen eines siRNA-Screenings an und berichteten über relative Titer²⁴. Angesichts der begrenzten Materialmenge bleibt jedoch immer noch ungewiss, wie viele Assays und Auslesungen durchgeführt werden können oder ob in Zelltransduktionsexperimenten über die Messung fluoreszierender Proteine hinaus ausreichende MOIs erreicht werden können, was sich möglicherweise auf die Reproduzierbarkeit auswirkt.

In dieser Arbeit wurde die Micro-6-Well-basierte Produktion in adhärenten HEK293T Zellen verwendet, um die Kulturbedingungen für rAAV2 zu optimieren (Abbildung 1 und Abbildung 2). In Übereinstimmung mit früheren Studien und technischen Berichten ^43,44 wirkten sich niedrigere PEI-zu-DNA-Verhältnisse und die Zugabe von NaCl während der Transfektion positiv auf die rAAV-Produktion aus. Dies spiegelte sich indirekt in den Transduktionseffizienzen der produzierten Vektoren in HEK293A Zellen wider. Die auffälligen Unterschiede, die bei den niedrigeren PEI:DNA-Verhältnissen beobachtet wurden, wurden hauptsächlich auf zellulären Stress zurückgeführt, was sich in einer geringen Zellviabilität, insbesondere bei PEIpro, zeigt. Obwohl die Effekte unter PEImax-Bedingungen weniger auffällig waren, zeigten Mikroskopiebilder zellfreie Bereiche in der Zellschicht, was auf Stress oder Zellablösung hindeutet (Ergänzende Abbildung 1).

Wichtig ist, dass diese Ergebnisse nicht direkt auf die Vektorproduktion in Suspensionskulturen anwendbar waren, was betont, dass experimentelle Bedingungen, die die rAAV-Produktion in adhärenten HEK293T-Zellen erhöhen, nicht immer auf Suspensionszellen übertragen werden können, selbst wenn der zugrunde liegende Zelltyp derselbe bleibt. Diese Diskrepanz könnte auf Unterschiede auf transkriptomischer und proteomischer Ebene zwischen diesen beiden Systemen zurückgeführt werden⁴⁵. Eine engere Ausrichtung an den klinischen Produktionsprozessen kann daher den Einsatz von Suspensionskulturen in den frühen Entwicklungsphasen erforderlich machen. Aufbauend auf diesen Beobachtungen und dem Vorteil, höhere Zelldichten in Suspension zu erreichen, wurde ein 24-Deep-Well-System zur Herstellung von rAAV in miniskaligen Suspensionskulturen (mini-HT24) eingesetzt. Dieses System wurde einer umfassenden Validierung unterzogen und zeigte konsistente vg/ml- und vp/ml-Titer über die gesamte Platte sowie einheitliche VP-Proteinexpression und -verhältnisse (Abbildung 3A-E). Tatsächlich führten die höheren Zelldichten, die im mini-HT24-Setup (3 × 10⁶ Zellen/ml) im Vergleich zum Micro-6-Well-Format (5 × 10⁵ Zellen pro Well) erreicht wurden, zu höheren rAAV-Titern, wie in Abbildung 3F gezeigt. Dies unterstreicht einen entscheidenden Vorteil von suspensionsbasierten Systemen, die nicht durch die Oberfläche des Kulturgefäßes begrenzt sind. Die Implementierung solcher Systeme erfordert jedoch spezielle Geräte, die möglicherweise nicht in allen Labors verfügbar sind. Schließlich wird empfohlen, identifizierte Leitmoleküle oder überlegene Kultivierungsbedingungen aus dem mini-HT24-System mit Minibioreaktorsystemen wie AMBR15 oder AMBR250 weiter zu validieren, da sich gezeigt hat, dass diese Systeme die Produktionsbedingungen in großen Bioreaktoren besser nachahmen ^46,47.

Die Wahl des Reinigungsgrades spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Eignung von rAAV-Präparaten für bestimmte Downstream-Anwendungen. Rohlysate, die sowohl aus adhärenten (Micro-6-Well) als auch aus Suspensionskulturen (mini-HT24) gewonnen werden, bieten eine schnelle und ressourceneffiziente Option für vorläufige Screening-Assays. Diese Lysate enthalten eine Mischung aus Viruspartikeln, zellulären Trümmern und Medienkomponenten, die für Anwendungen wie Vektorgenomik/Partikeltiter, Transduktionseffizienz-Screening und Western-Blot-Analyse akzeptabel ist. Besonders anwendbar in Studien, die sich mit grundlegenden biologischen Fragen befassen (wie oben bei der Untersuchung der AAP-Funktionalität beispielhaft), zur Optimierung des Zellkulturzustands sowie zum präklinischen Kandidatenscreening und zur präklinischen Kandidatenauswahl. Das Vorhandensein von Verunreinigungen kann jedoch höhere Verdünnungen erforderlich machen, was zu geringeren Assay-Sensitivitäten führt. Darüber hinaus können Verunreinigungen die Lebensfähigkeit empfindlicher Zelltypen, wie z. B. Primärzellen, negativ beeinflussen.

Im Gegensatz zu rohen Lysaten erreichen AAVX-affinitätsharzgereinigte Präparate, die ausschließlich im suspensionsbasierten Protokoll verwendet werden, einen höheren Reinheitsgrad, indem sie intakte Kapside selektiv isolieren. Dadurch werden die Einschränkungen von Rohzelllysaten überwunden, so dass diese Präparate besser für Anwendungen wie In-vivo-Studien sowie für detaillierte In-vitro-Analysen der Transgen-Expressionskinetik und präzise funktionelle Messwerte geeignet sind, die oft größere Materialmengen erfordern (siehe Ausbeutevergleich in Abbildung 3F). Für In-vitro-Anwendungen waren die Ausbeuten von rAAV-Vektoren, die in der mini-HT24-Einstellung hergestellt wurden, in der Regel für die meisten Auslesungen ausreichend, abhängig von der Anzahl der Zellen und den erforderlichen MOIs. Im Gegensatz dazu erfordern In-vivo-Anwendungen in der Regel eine Produktion im Midi-Shake-Kolbenmaßstab oder größer, abhängig von der Dosis, dem Verabreichungsweg und dem Tiermodell. Trotz der erhöhten Kosten und des Zeitaufwands für die Reinigung rechtfertigen die Konsistenz und Zuverlässigkeit des resultierenden Materials oft die Investition für kritische Anwendungsfälle. Insbesondere zeigen die in Abbildung 4 gezeigten Ergebnisse, dass rAAV-Vektoren, die mit Affinitätsharzmethoden gereinigt wurden, vergleichbar gut funktionieren wie solche, die mit herkömmlicher Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation gereinigt wurden. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, dass leere Kapside je nach vorhandener AAV-Spezies entweder keinen Einfluss auf die Transduktion haben oder diese sogar verstärken können⁴⁸. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass in diesem Experiment nur ein MOI und ein Zeitpunkt verwendet wurden und die optimalen Bedingungen für jeden Zelltyp individuell bestimmt werden müssen. Während die CsCl-Aufreinigung im Allgemeinen einen saubereren Hintergrund liefert, weisen HT-Harzspitzen-gereinigte AAVs eine größere Variabilität in der Reinheit auf (siehe TEM-Bilder in Abbildung 4). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Einführung von kleinen Workflows mit hohem Durchsatz.

Die Verwendung von kleinen, mit Affinitätsharz gefüllten Spitzen bei der Hochdurchsatzreinigung bietet eine praktische Lösung für ein schnelles rAAV-Screening, aber mehrere technische Aspekte erfordern Aufmerksamkeit, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Aufgrund des begrenzten Harzbettvolumens sind diese Spitzen besonders anfällig für Verstopfungen, insbesondere bei der Verarbeitung von Rohlysaten. Daher ist die Klärung von Lysaten durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation unerlässlich, um zelluläre Trümmer vor der Beladung zu entfernen, da eine unzureichende Klärung die Durchflussraten verringern und die Ausbeute beeinträchtigen kann. Für das Mini-HT24-Setup wird empfohlen, die Transfektionsprotokolle zu optimieren und ein maximales Arbeitsvolumen von 2,5 bis 3 ml pro Vertiefung beizubehalten. Bei der Arbeit mit verschiedenen Serotypen oder Kapsidbibliotheken ist es ratsam, verschiedene Affinitätsharztypen zu testen, da die Bindungseffizienz und -wiederherstellung je nach Kapsidstruktur variieren können⁴⁹. Das tragbare elektronische Mehrkanal-Pipettiersystem ermöglicht eine einfache Integration dieses Arbeitsablaufs in kleinen Laboren und bietet Flexibilität, ohne dass eine Automatisierung erforderlich ist. Die manuelle Handhabung kann jedoch zu Variabilität und Unterschieden zwischen den Chargen führen. Für eine größere Konsistenz können automatisierte Liquid-Handling-Plattformen von Vorteil sein. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, Kreuzkontaminationen während der Proben- und Pufferzugabe zu vermeiden, und die Verwendung geeigneter Plattenformate mit ausreichendem Well-Volumen ist unerlässlich, um einen Überlauf zu verhindern. Durch die Berücksichtigung dieser Überlegungen, einschließlich der Probenklärung, der Protokolloptimierung, der Harzauswahl und des sorgfältigen Pipettierens, können Forscher technische Probleme minimieren und die Robustheit und Reproduzierbarkeit von Arbeitsabläufen mit hohem Durchsatz und kleiner Affinitätsreinigung verbessern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von rAAV-Produktionsmethoden mit hohem Durchsatz und anwendungsspezifischen Aufreinigungsstrategien eine vielseitige Plattform für die Weiterentwicklung der Gentherapieforschung bietet. Diese Protokolle adressieren die wachsende Nachfrage nach kostengünstigen und effizienten Arbeitsabläufen und bieten gleichzeitig die Flexibilität, unterschiedliche experimentelle Anforderungen zu erfüllen. Durch das Ausbalancieren der Kompromisse zwischen Reinheit, Skalierbarkeit und Ressourcenverbrauch können Forscher die präklinische Entwicklung beschleunigen und den Übergang zu klinischen Anwendungen erleichtern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9 % ungepufferte Kochsalzlösung	B. Braun, Melsungen, Deutschland	7647-14-5	Wash II Puffer
1 M Hydrochlocirsäure	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA	1099700050	pH-Einstellung von Puffern
10x DNase I Puffer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	AM8170G	ddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9,0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Nr. J60707. AP	Neutralisations-Puffer
24-Deep-Well-Mikrotiterplatten	Enzyscreen, Heemstede, Niederlande	CR1424cl	Ausrüstung für Suspensionskulturen
250 mL Erlenmeyerkolben aus Polycarbonat mit Entlüftungskappe	Corning, New York, NY , Vereinigte Staaten von Amerika	431144	Ausrüstung für Suspensionskulturen
66 - 440 kDa Trennung 8x25 Kapillarpatronen	BioTechne, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten von Amerika	SM-W008	Automatisiertes Western-Blot-Kit
96 Vertiefung 2,2 mL Polypropylen DeepWell	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	AB0661	Probenaufbereitungs- und Lagerplatte
96 Well schwarz/klare Bodenplatte, TC-Oberfläche	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	165305	Transduktions-Assays
AAV2 VP1, rekombinantes Protein	PROGEN, Heidelberg Deutschland	640823	Wes Reagenz
AAV2 VP2, rekombinantes Protein	PROGEN, Heidelberg Deutschland	640824	Wes Reagenz
AAV2 VP3, rekombinantes Protein	PROGEN, Heidelberg Deutschland	640825	Wes Reagenz
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg Deutschland	PRAAV2XP	Wird für HT-Harz-gereinigte Proben verwendet.
Anti-Maus-Erkennungsmodul für Wes	BioTechne, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. DM-002	Automatisiertes Western-Blot-Kit
Assay-/Template-spezifischer Forward Primer	Gewohnheit	Gewohnheit	ddPCR/dPCR
Assay-/Template-spezifische Sonde	Gewohnheit	Gewohnheit	ddPCR/dPCR
Assay-/Template-spezifischer Reverse-Primer	Gewohnheit	Gewohnheit	ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - Flüssigkeit	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Vereinigte Staaten	NC1192689	Medium für die Suspensionszellkultur
Rinderserumalbumin	SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland	cRinderserumalbumin	Ergänzung für adhärentes Zellmedium
Atmungsaktive Viskosefolie, steril	VWR International LLC, Radnor, PA, USA	391-1262	Ausrüstung für Suspensionskulturen
C1000 Thermocycler	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA	1851096	ddPCR
CaptureSelec AAVX Liganden-Leckage-ELISA-Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	8113522000	ELISA
Cedex HiRes Analysator	Roche Holding AG, Basel, Schweiz	5650216001	Zähler für Zellen
CELL Kultur-Mikroplatte, 96 Well	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Österreich	655162	Adhärente Zellkulturgeräte
Zitronensäure	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten	5949-29-1	Reagenz zur Reinigung; VORSICHT
CMOS-basierte TEM-Kamera TVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, Deutschland	XF416	Video- und Bildverarbeitungssystem
Kompass-Software (Version 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten von Amerika		WES-Software
Costar 6-Well-Platten mit klarem TC-behandeltem Multiple-Well-Ton	Corning, New York, NY , Vereinigte Staaten von Amerika	3516	Adhärente Zellkulturgeräte
ddPCR Tröpfchengenerator Öl	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA	#1864110	ddPCR-Reagenz
ddPCR-Tröpfchen-Reader-Öl	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA	#1863004	ddPCR-Reagenz
ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP)	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA	#1863023	ddPCR-Reagenz
DMEM, hoher Glukosegehalt	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	11960044	Medium für adhärente Zellkulturen
DMEM, niedriger Glukosespiegel	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	11885084	Medium für adhärente Zellkulturen
96-Well-DNA-Platten mit geringer Bindung	Eppendorf, Hamburg, Deutschland	30129504	ddPCR/dPCR
DNA-Röhrchen mit geringer Bindung	Eppendorf, Hamburg, Deutschland	30108051	ddPCR/dPCR
DPBS (Englisch)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	14190094	Puffer waschen
EM-Gitter (T600H-Cu 698 l/Zoll, Hex. Maschenweite, dünner Stab; EMS)	Elektronenmikroskopie, Hatfield, PA, USA	FFTH600-Cu-UL	Elektronenmikroskopische Analyse
EVO M5000 Bildgebungssystem	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	AMF5000	Live-Imaging-Mikroskop für Transduktionsassays
EZ Standard Pack 3	BioTechne, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten von Amerika	PS-ST03EZ-8	Automatisiertes Western-Blot-Kit
Falcon 15 ml konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	11507411	Probenaufbereitung
Falcon 50 ml konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland	10203001	Probenaufbereitung
Geltrex LDEV-freie Basalmembran-Matrix mit reduziertem Wachstumsfaktor	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	A1413201	Beschichtung von Kulturplatten
GlutaMAX Ergänzung (L-Alanyl-L-Glutamin)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	35050061	Ergänzung für adhärentes Zellmedium
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Nr. R70507	Transduktionsassays (nur für Forschungszwecke)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virginia, Vereinigte Staaten von Amerika	CRL-3216	Adhärente Zellkultur, die zur Herstellung von rAAV verwendet wird (nur für Forschungszwecke)
HEPES-Lösung, 1M	Merck, Darmstadt, Deutschland	#H0887	Ergänzung für adhärentes Zellmedium
HL-Salz Aktive Nuklease, SAN (25 U/µ L)	ArcticZymes Technologies, Tromsø, Norwegen	70910-202	ddPCR/dPCR
HydroSpeed Mikrotiterplatten-Waschmaschine	Tecan, Mä nnedorf, Schweiz	30190101	ELISA
iCell Astrozyten Kit, 01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, USA	Nr. R1092	Transduktions-Assays
iCell Motoneuron Bausatz, 01279	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, USA	Nr. R1051	Transduktions-Assays
Unendlich 200 PRO	Tecan, Mä nnedorf, Schweiz	30213617	ELISA
JEM-1400Plus ist ein Transmissionselektronenmikroskop	JEOL Ltd., Akishima, Tokio, Japan	JEM-1400Plus	Transmissionselektronenmikroskop
Verdampfungsarme Sandwichabdeckung mit Stiften	Enzyscreen, Heemstede, Niederlande	CR1224c	Ausrüstung für Suspensionskulturen
Mikroplatten-Lesegerät  SpectraMax i3	Molecular Devices, San Jose, CA, USA	i3x	ELISA
Maus anit-AAV2 VP1/VP2/VP3 monoklonaler Antikörper	PROGEN, Heidelberg Deutschland	690058	Wes Reagenz
Nukleasefreies Wasser	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM, reduziertes Serummedium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	#31985070	Medium für die Bildung von PEI-DNA-Komplexen
PBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	#10010023	Puffer waschen
PEI-MAX, Polyethylenimin, 1mg/ml Vorrat	Polywissenschaften Europa  Hirschberg an der Bergstraßeß e, Deutschland	24765 oder 24765	Transfektionsreagenz
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, Frankreich	101000033/10 ml	Transfektionsreagenz
Pierce Mikrodialyseplatte, 96 Well, 0,3 mL, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	Nr. A50472	Geräte zur Reinigung
Poloxamer 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten	Nr. P5556-100 ml	Reagenz für Zellkulturen; VORSICHT
Poly-L-Ornithin-Lösung (0,01%)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Transduktions-Assays
Proteinase K Lösung (20 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	25530049	ddPCR/dPCR
ProteinEinfach " Wes"	BioTechne, Minneapolis, MN, Vereinigte Staaten von Amerika	004-600	Vorrichtung für autmatierten Western Blot
QIAcuity Acht-Plattform-System	Qiagen, Hilden, Deutschland	911052	dPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96-Well	Qiagen, Hilden, Deutschland	250021	ddPCR/dPCR
QIAcuity Sonde PCR-Kit	Qiagen, Hilden, Deutschland	250101, 250102 oder 250103	ddPCR/dPCR
QIAcuity Software-Suite 1.2	Qiagen, Hilden, Deutschland		dPCR-Software
QX-Manager	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA		ddPCR-Software
QX200 Tröpfchen-Lesegerät	Bio-Rad Laboratorien, Hercules, USA	1864003	ddPCR
Mikroröhrchen mit Schraubverschluss, 1,5 ml, PCR Performance Tested	Sarstedt, Nü mbrecht, Deutschland	72.703.416	Ausrüstung für Suspensionskulturen
Schraubverschluss, DNA LoBind, 5,0 mL	Eppendorf, Hamburg, Deutschland	30122348	Ausrüstung für Suspensionskulturen
Shaker-Inkubator	Infors AG, Bottmingen, Schweiz	Multitron	Ausrüstung für Suspensionskulturen
Natriumpyruvat (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	11360070	Medium für adhärente Zellkulturen
Ultraschallgerät Mikroplatten-Hornsystem	QSonica, Newtown, CT, Vereinigte Staaten von Amerika	Q700MPXC	Ultraschallgerät für die Erzeugung von Rohlysat
GEIST			Link zur SPIRIT-Datenbank: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP Sterile Zentrifugen-Filtereinheit mit Röhrchen	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA	SCGP00525	Ausrüstung zur Vorbereitung von Puffern
T-175, ZELLKULTURFLASCHE, 550 ML, 175 CM²	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Österreich	660175	Adhärente Zellkulturgeräte
Trypsin/EDTA 0,025 %	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	R001100	Reagenz für Zellkulturen
Virus-Produktionszellen 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA	A49784 oder A51218	rAAV-Produktion
		Nr. J63596. K2	1:10 für Arbeitslösung PBST verdünnen