Mikrobioreaktor-basierte Produktion von ankerabhängigen mesenchymalen Stromzellen, die auf das akute Atemnotsyndrom vorbereitet sind

Summary

Ein Protokoll wird für die Produktion von ankerabhängigen Zellen durch Mikroträger-Mikrobioreaktoren als potenzielle zellbasierte Therapien beschrieben. Bei der Zielsetzung eines Anwendungsfalls des akuten Atemnotsyndroms werden vergleichbare Zellausbeute und günstige Genexpression im Vergleich zu kolbenbasierten Prozessbedingungen illustriert. Dieses Protokoll lässt sich auf andere ankerabhängige Zellen und Zielindikationen erweitern.

Abstract

Die zellbasierte Therapie ist ein aufkommender therapeutischer Ansatz für eine Vielzahl von Gesundheitszuständen. Die Herstellung ausreichender Qualitätszellen bleibt jedoch eine aktive wissenschaftliche und technische Herausforderung. Das Endprodukt der Zelle kann nicht sterilisiert werden; daher sind Sterilität und Qualität nach Design von größter Bedeutung. Für Zellen, die von Ankerpunkten abhängig sind, wird die auf Flaschen basierende Expansion weiterhin im Entwicklungs- und Industriemaßstab eingesetzt, was große physische Flächenflächen erfordert, die Kontrolle der biochemischen Umgebung (pH-, CO-2_{und O2}, Diffusionsgradienten von Nährstoffen und Metaboliten) begrenzt und physikalische Hinweise liefert, die die endgültige Zellqualität beeinflussen können. Diese Herausforderungen haben die Einführung bioreaktorbasierter Fertigungsansätze motiviert, doch solche Ansätze erfolgen typischerweise in volumetrischen Maßstäben, die Herausforderungen mit sich bringen und für explorative Laborforschung oder Prozessentwicklung kostengünstig sein können. Es wurde berichtet, dass die Produktion von Mikrobioreaktor-Mikroträgerzelltherapien während der Kultur eine biochemische Kontrolle für einen Testfall des Zellquellentyps – mesenchymale stromale Zellen – ermöglicht. Für die erste Bewertung der Zellqualität in vitro wurde das akute Atemnotsyndrom als möglicher Anwendungsfall in Betracht gezogen. Der hier illustrierte Ansatz ermöglicht eine schnelle Prozessentwicklung im Tischmaßstab aufgrund des kleinen (2 ml) Volumens und der engen biochemischen Steuerung im Mikroreaktor. Um dies bei einem ankerabhängigen Zelltyp wie mesenchymalen Stromalzellen zu erreichen, war eine erhebliche Modifikation des Mikrobioreaktorprozesses erforderlich und eine Gelatine-Mikroträgerplattform genutzt, die intern durch einen mikrofluidischen Prozess hergestellt wurde. Hier werden zusätzliche Details zu den Methoden und Prozessparametern illustriert, die zur Kultivierung solcher ankerabhängigen Zellen im Mikroreaktor verwendet werden, mit dem Ziel, anderen Forschern zu ermöglichen, diese Praktiken an ihre eigenen Anwendungsfälle und Zellquellentypen anzupassen.

Introduction

Die Verwendung lebender Zellen als therapeutisches Produkt hat sich kürzlich als vielversprechende neue Behandlungsoption für mehrere Gesundheitsprobleme etabliert. Zum Beispiel haben die T-Zellen des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) eine dauerhafte Remission bei sogenannten flüssigen Krebsarten – Leukämie, Lymphom und multiplem Myelom – gebracht, die gegen alle zuvor verfügbaren^Behandlungen refraktär waren. Kürzlich wurde ein mesenchymales Stamm-/Stromalzellprodukt (MSC) (Ryoncil) zur Behandlung von Kindern zugelassen, die an steroidrefraktärer akuter Graft-versus-Host-Erkrankung (SR-aGvHD) leiden, einer Erkrankung mit > 50 % Mortalität². Doch die Erweiterung auf andere unerfüllte klinische Bedürfnisse erfordert eine intensive Entwicklung sowohl der Therapie als auch der Mittel zur Entwicklung und Herstellung dieses Produkts.

Ein solcher unerfüllter klinischer Bedarf findet sich bei Personen mit akutem Atemnotsyndrom (ARDS). ARDS wird hier diskutiert, um einen spezifischen Anwendungsfall zu bieten, der die Methode, Ergebnisse und die Diskussion möglicher Erweiterungen auf andere Krankheitsziele darstellt. Als kritische (Verlauf von Stunden bis Tagen), verbreitet (> 200.000 jährliche Fälle in den USA) und tödliche Indikation (27%–46% Sterblichkeit, abhängig von der Schwere der Erscheinung), erregte ARDS während der COVID-19-Pandemie erneut und breite Aufmerksamkeit als typischer Todesmechanismus für Patienten, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind ^3,4. ARDS ist gekennzeichnet durch eine erhöhte pulmonale Gefäßdurchlässigkeit, was zu interstitiellen Ödemen, alveolärer Überflutung und Infiltration von Zellkomponenten, einschließlich Neutrophilen und roten Blutkörperchen, in das alveoläre Kompartiment⁵ führt. In der anfänglichen exsudativen Phase von ARDS treibt die angeborene, immunzellvermittelte Entzündung diese pathogenen Folgen voran, indem sie die Integrität der Endothel- und Epithelbarriere schädigt und die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine fördert; Eine erfolgreiche Lösung der Entzündungsreaktion, die Reparatur der Barrierenintegrität und die Vermeidung übermäßiger Fibrose sind entscheidend für das Überleben³. Während antivirale Therapien wie Remdesivir vielversprechende Leistungen im Kampf gegen SARS-CoV-2-vermitteltes ARDS gezeigt haben, gibt es für andere Ursachen derzeit keine zugelassenen pharmakologischen Interventionen, die die Sterblichkeit⁵ senken.

MSCs könnten einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von ARDS bieten, angesichts ihres lungenspezifischen Tropismus bei systemischer Injektion und ihrer Fähigkeit, immunmodulatorische Parakrinsignale in ihr umgebendes Mikroumfeld^{abzugeben 6,7}. Mechanistische Studien haben die Expression solcher parakrinen Faktoren wie Interleukin-10 (IL-10)⁸, Indoleamin 2,3-Dioxygenase 1 (IDO1)⁹, Prostaglandin E2 (PGE2)¹⁰ und andere als Faktor für die mögliche MSC-Wirksamkeit für mehrere Indikationen, einschließlich akuter Lungenverletzung (ALI)/ARDS¹¹, in Verbindung gebracht; daher stellen die Expressionsniveaus dieser Genprodukte potenziell kritische Qualitätsmerkmale (pCQAs) dar, die die klinische Wirksamkeit voraussagen können und während der Herstellung ein handhabbares Freisetzungskriterium für das Endprodukt liefern. Es ist jedoch eine Herausforderung, genügend Zellen zu produzieren, um eine wirksame therapeutische Dosis zu erreichen; Ryoncil zum Beispiel ist für die Dosierung von 2 x 10^{6 Zellen}/kg Patientenmasse empfohlen, zweimal wöchentlich für 4 Wochen^{und 12} Wochen verabreicht. Für einen 80-kg-Patienten entspricht dies > 1,2 Milliarden MSCs für eine einzige Behandlung, was einen großen physischen Fußabdruck erfordert, um eine ausreichende Oberfläche für diese 2D-Wachstumsbedingung aufzunehmen. Da dieses lebende Zellprodukt vor der Verabreichung durch Patienten nicht sterilisiert werden kann, ohne das therapeutische Potenzial der Zellen zu beeinträchtigen, ist die Anwendung der aktuellen Good Manufacturing Practices Richtlinien für eine sterile Produktion von größter Bedeutung, was die logistische Komplexität der Zellherstellung und damit die Kosten^{der Waren erhöht}.

Darüber hinaus haben frühere Studien Hinweise darauf gezeigt, dass die typische MSC-Produktion in Gewebekultur-Polystyrol (TCPS)-Kolben zum Beginn der intrapopulationsspezifischen phänotypischen Heterogenität beiträgt. Für einige Endanwendungen macht dies die Qualitätskontrollmaßnahmen zwischen Chargen in der Forschung und in der klinischen Übersetzung^{herausfordernd} 14,15,16,17. Es wird spekuliert, dass die begrenzte biochemische Kontrolle in TCPS-Kolben, einschließlich diffusionaler Gradienten von Gasen, Nährstoffen und metabolischen Abfallprodukten, schlechter pH-Regulierung usw., zu diesen Herausforderungen beiträgt.

Diese Probleme motivieren die Einführung einer bioreaktorbasierten Kultur, um die überlegene biochemische Regulation und Zelldichte in einem kontrollierten dreidimensionalen Wachstumsformat mit dynamischem Mixing¹⁸ zu nutzen. Bioreaktorbasierte Verarbeitung oder -fertigung bringt jedoch eigene Herausforderungen mit sich: Als ankerabhängiger Zelltyp benötigen MSCs eine Form von Substrat, auf dem sie in einem Bioreaktor wachsen können, was die Zugabe von Mikroträgern erforderlich macht. Darüber hinaus arbeiten viele kommerziell verfügbare Bioreaktoren auf Mengen, die ressourcenintensiv sind (> 3 Liter Wachstumsmedium) für die Art von explorativer Laborforschung, die notwendig ist, um unbekannte Prozessparameter zu identifizieren und zu verfeinern, die die Expression messbarer Indikatoren der Zellqualität beeinflussen. Diese Merkmale werden als potenziell kritische Qualitätsmerkmale oder pCQAs¹⁹ beschrieben.

Krupczak et al. berichteten zuvor von einem Mikroträger-Mikro-Mikro-Bioreaktor-Ansatz, der MSCs mit verbesserter pCQA-Expression für ARDS erzeugte, beschränkt auf In-vitro-Bewertungen ²⁰. Dieser Ansatz kombinierte den Einsatz einer im Haus hergestellten lösbaren Gelatine-Mikroträgerplattform mit einer kommerziell verfügbaren Mikrobioreaktorplattform, dem Mobius Breez Mikrobioreaktor²¹. Dieser Mikrobioreaktor verwendet 2-mL Einweg-Einwegreaktorkammern und integriert viele wünschenswerte Merkmale für eine verbesserte biochemische Steuerung, darunter die Regulierung von Temperatur, pH,_CO2 und_O2 in einem dynamisch gemischten, geschlossenen Kreislauf-Perfusionssystem, wurde jedoch nicht mit ankerabhängigen Zellen wie MSCs im Sinn entwickelt. Tatsächlich sind die standardmäßigen mikrofluidischen Kanäle zur Injektion von Reaktorinhalten zu klein, um den Durchgang von Mikroträgern zu ermöglichen, was eine erhebliche Anpassung für eine erfolgreiche Produktion von MSCs auf dieser Plattform erforderlich macht.

Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben und illustriert, um diesen Mikrobioreaktor an die ankerabhängige Kultur von MSCs anzupassen. Die hier aufgeführten Prozessparameter wurden mit dem Ziel identifiziert, die Prozessentwicklung und Herstellung von MSCs für die präklinische, in vitro Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit bei ARDS zu unterstützen. Grundsätzlich kann dieses Protokoll jedoch für andere Endanwendungen, andere entzündliche oder immunmodulatorisch bedingte Erkrankungen sowie andere ankerabhängige Zelltypen angepasst werden, die von einer verbesserten biochemischen Kontrolle im Laborbereich profitieren könnten. Abbildung 1 zeichnet das im beiliegenden Video beschriebene Protokoll schematisiert, und Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4 illustrieren die wichtigsten Ergebnisse.

Protocol

1. Aufbau und Vorbereitung des Mikrobioreaktors

1. Herstellung der erforderlichen Anzahl an Mikrobioreaktorverbrauchsmaterialien
   1. Stellen Sie sicher, dass der Biosicherheitsschrank (BSC) eingeschaltet und steril ist. Entfernen Sie den Folienbeutel, der das neue Verbrauchsgut abdeckt, indem Sie die Oberseite des Beutels durchstoßen und den Folienbeutel bis zum Abschluss dieses Experiments behalten (um Details von Los# im Falle eines Defekts zu dokumentieren). Öffnen Sie die äußere Blasenverpackung und werfen Sie das darin enthaltene Hydrationspäckchen weg. Entsorge die äußere Blasenverpackung.
   2. Sprühe die Innenblistenverpackung mit 70 % Ethanol auf und bring es in den BSC. Öffnen Sie die Innenverpackung der Blase und werfen Sie sie weg.
   3. Mit einer sterilen Spritze wird der Kolben entfernt und die Düse an einen 0,22 μm sterilen Filter angeschlossen. Gieße 50 ml unsterilisiertes ultrareines Wasser in den Behälter der Spritze. Während Sie die Spritze über ein wartendes, steriles 50-ml-Rohr halten, setzen Sie den Kolben wieder in die Spritze ein und injizieren Sie das sterile gefilterte Wasser in das wartende Sammelrohr.
   4. Entfernen Sie den durchsichtigen Kunststoffdeckel, der mit Flasche LL im Flaschenregal verbunden ist. Mit einer neuen sterilen 50-ml-Spritze entfern Sie den Kolben und verbinden Sie die Düse mit Flasche LL. Gießen Sie das sterile gefilterte Wasser in den Spritzenbehälter und injizieren Sie es in Flasche LL.
      HINWEIS: Die nadellosen Anschlussanschlüsse können während des Sterilisationsvorgangs des Herstellers klemmen, daher müssen Sie die Spritze möglicherweise mehrmals an- und abkoppeln, um die Versiegelung der Flasche zu lösen und den Inhalt erfolgreich einzuspritzen. Alternativ können Sie einen Rohrschweißer verwenden, um eine Quellflasche steril mit dem schweißbaren Rohr für die passende Flasche zu verbinden.
   5. Mit demselben Verfahren füllen Sie Flasche L mit 25 ml nicht-FBS-supplementiertem niedrigglukosearmem DMEM, Flasche R mit 25 ml sterilem PBS und Flasche RR mit 8 ml Anti-Haftungsspüllösung. Verwenden Sie für jede Flüssigkeit eine neue sterile Spritze.
   6. Wiederholen Sie dieses Verfahren für so viele Verbrauchsmaterialien, wie im Experiment benötigt werden.
2. Führen Sie in jedem für dieses Experiment verwendeten POD einen POD-Selbsttest durch.
   HINWEIS: Der Selbsttest sollte problemlos abgeschlossen werden; Wenn eine Komponente des Selbsttests fehlschlägt, beheben Sie den Fehler, bevor Sie fortfahren.
3. Nehmen Sie die Selbsttestkassetten in ihre lichtgeschützten Aufbewahrungstaschen.
4. Installieren Sie das Verbrauchsgut wie unten beschrieben am Bioreaktor.
   1. Entferne das grüne Klebeband von den Ventilen des Verbrauchsmaterials und montiere es in Position im POD. Setze die Klemmen wieder ein und stelle sicher, dass kein Gas oder Luft beim Entweichen zu hören ist.
   2. Verbinden Sie die weiße Drucksensorleitung des Flaschenhalters, die rote Luftdruckleitung und die blaue Vakuumleitung zwischen den Verbrauchsgütern und der Basisstation/POD. Stellen Sie sicher, dass der seitliche Einspritzeinwurf mit einer weißen Tropfenklemme verschlossen ist.
   3. Folgen Sie den Softwareschritten, um ein neues Experiment zu starten. Diese gipfeln in der Autoprime- und Kalibrierungsfunktion, die ~4–5 Stunden dauert und über Nacht laufen kann.
5. Beschriften Sie jedes Flaschenregal mit seiner POD-Position, damit man leicht erkennen kann, zu welchem POD das Verbrauchsgut zurückgegeben werden soll, nachdem es aus dem Bioreaktor entfernt wurde. Verwenden Sie farbiges Klebeband, um die Position anzuzeigen: Pod0 = rot, Pod1 = orange, Pod2 = gelb, Pod3 = grün. Schreibe den Namen des Experiments und das Datum auf das Band.
6. Lass die Verbrauchsmaterialien über Nacht kalibrieren. Stellen Sie sicher, dass das Medium in den Reaktor gelangen und in die Abfallleitung gelangen kann.
7. Wenn Sie planen, Zellen zu verwenden, die in flüssigem Stickstoff gelagert sind, tauen Sie sie auf und plattieren Sie sie so, dass sie > 24 Stunden Zeit haben, sich vor der Injektion von der Kryolagerung zu erholen.

2. Rekalibrierung und Mikroträgervorbereitung

1. Stellen Sie sicher, dass die Autopriming- und Kalibrierungsschritte erfolgreich abgeschlossen wurden.
   1. Wenn die Kalibrierung nicht erfolgreich abgeschlossen wurde, identifizieren und beheben Sie etwaige Ursachenprobleme und versuchen Sie dann eine Neukalibrierung. Häufige Probleme sind das Versäumnis, die weiße Flaschenhalterklemme zu entfernen, das grüne Klebeband vor dem Einlegen in den POD nicht vom Verbrauchsartikel zu entfernen, und zu wenig Medienvolumen in der Flasche.
2. Stellen Sie sicher, dass die Sensoren für gelösten Sauerstoff stabil sind.
   1. Fast 10 % der Verbrauchsmaterialien zeigen nach der Kalibrierung Sensordrift im DO-Sensor. Führen Sie die bevorzugte Korrekturmaßnahme aus, nämlich die vollständige Kalibrierung erneut durchzuführen. Falls erforderlich, führen Sie eines der folgenden Dinge durch.
      1. Stelle sicher, dass keine Luft in der Kassette ist, deaktiviere dann das Kontrollkästchen für Anzeigediagramme, um die Steuerung anzuzeigen, und klicke dann auf Autokalibrieren DO und pH.
         1. Wenn Luft im Reaktor vorhanden war, wenn eine Neukalibrierung erforderlich ist, kehren Sie auf die erste Seite des MBS-Dashboards zurück, indem Sie auf den blauen linken Pfeil oben links im Fenster klicken, um den jeweiligen POD anzuzeigen. Klicken Sie auf den Button , um manuelle Operationen zu aktivieren. Prüfen Sie das Feld "Abwasserrohrbereitschaft" und geben Sie W in das Texteingabefeld ein, um die Abfallflasche auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Auswerfen-Waschen" und klicken Sie dann im Pop-up-Fenster auf Ja. Dies entleert die Reaktorkammern und füllt sie mit dem Medium aus der Medienquellenflasche nach.
3. Bereiten Sie die korrekte Anzahl von Mikroträgern in 15-mL konischen Röhren vor, jeweils eines für jede Bedingung.
   HINWEIS: Mikroträgeranzahl, Gesamtfläche und Zell-Seeding-Dichte hängen von deiner Anwendung ab. Für dieses Protokoll wird empfohlen, eine absolute Anzahl von Mikroträgern zu injizieren, was zu 75 cm^² der verfügbaren Mikroträgerwachstumsfläche führt, zum Vergleich zu einer T75-Flasche.
4. Lassen Sie Mikroträger im Röhrchen absetzen; Aspiriere so viel Supernatant wie möglich, ohne Mikroträger zu entfernen, um Platz für Zellen und frische Medien zu schaffen.

3. Zell- und Mikroträgerinjektion

1. Stellen Sie sicher, dass die Autoprime- und Kalibrierungsfunktionen erfolgreich ausgeführt wurden.
2. Klicken Sie durch das Softwarefenster, als würde der Reaktor gemäß dem Standard-Suspensionszellen-Workflow geimpft.
3. Geben Sie eine Notiz im Pop-up-Fenster ein, um anzuzeigen, dass zu diesem Zeitpunkt keine Zellinjektion stattgefunden hat.
4. Manuelle Operationen aktivieren, um das Mischen des Reaktors zu pausieren, und eine weiße C-Klemme an die Flaschenrackleitungen anbringen.
5. Entfernen Sie jedes Verbrauchsgut und übertragen Sie es in die BSC. Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus Abfällen und Perfusionsflaschen und entsorgen Sie es.
   1. Entfernen Sie alle Abfälle aus der großen Perfusionsflasche sowie aus dem kleineren 1,5-ml-Rohr darin, wenn Sie zu einem Zeitpunkt der Studie konditioniertes Material entnehmen möchten.
6. Entferne das nicht serumhaltige Wachstumsmedium aus Flasche L und entsorge es. Spüle Flasche L mit ~20 ml sterilem PBS aus und entsorge es. Fügen Sie 25 ml serumhaltiges Wachstumsmedium in Flasche L hinzu.
7. Bringt die Verbrauchsgüter an ihre jeweiligen PODs zurück. Stellen Sie Medienquellenflaschen für die restliche Dauer des Experiments auf Eis. Erfrischen Sie das Eis täglich.
   HINWEIS: Nasses Eis kann mit Gefrierpacks ergänzt werden, um die Dauer der Temperaturkontrolle zu verlängern.
8. Waschen Sie die Reaktoren mit PBS aus und spülen Sie die Leitungen.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Spülflaschen ", aktivieren Sie die Funkfunktion für Flasche L, wählen Sie "Ausgabe in den Abfall" und klicken Sie dann auf "MSCserum starten".
      HINWEIS: Dadurch wird das neu hinzugefügte hMSC-Medium durch die Leitung geleitet, um sicherzustellen, dass kein weiteres nicht mit FBS ergänztes Medium in den Reaktor gelangt.
   2. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche "Spülflaschen ", wählen Sie die Radio-Taste für Flasche RR und beginnen Sie mit dem Spülen. Dadurch wird die Anti-Adhärenz-Spüllösung durch die Leitung gespült und sichergestellt, dass sie für den Eintritt in den Reaktor vorbereitet ist.
   3. Im Fenster "Flascheninhalt" geben Sie in der Software an, dass sich MSCserum in Flasche R befindet, die tatsächlich PBS enthält.
   4. Geh in den manuellen Betrieb und führe drei Auswurf-Waschzyklen an der Abfallflasche durch.
9. Gib dem Reaktor eine Anti-Adhärenz-Spüllösung zu.
   1. Gehen Sie zurück zum Fenster "Flaschenhalt" und geben Sie an, dass sich MSCserum in Flasche RR befindet, die tatsächlich eine Anti-Adhärenz-Spüllösung enthält.
   2. Geh zur manuellen Operation und führe einen Auswurf-Wasch-Zyklus an der Abfallflasche durch.
      HINWEIS: Die frühere PBS-Waschung diente dazu, zu verhindern, dass Komponenten im DMEM die Anti-Adhärenz-Waschung stören; Jetzt sollte der Reaktor mit Anti-Adhärenz-Spüllösung mit Spur von PBS gefüllt sein.
10. Nach 30 Minuten mit vorhandener Anti-Adhärenzlösung spülen Sie das Verbrauchsmaterial mit PBS aus.
    1. Im Fenster "Flascheninhalt" geben Sie in der Software an, dass sich MSCserum in Flasche R befindet, die tatsächlich PBS enthält.
    2. Geh in den manuellen Betrieb und führe drei Auswurf-Waschzyklen an der Abfallflasche durch.
    3. Gehen Sie zurück zum Fenster Flascheninhalt und geben Sie in der Software an, dass sich MSCserum in Flasche L befindet, die hMSC-Medien enthält.
11. Entleeren Sie den Reaktor, um auf die Zell- und Mikroträgerinjektion zu warten. Im manuellen Betriebspanel klicken Sie auf Reinoculieren und lassen Sie das System in der Phase, in der das Armaturenbrett anzeigt, dass der Reaktor impfen soll.
    HINWEIS: Hier bezeichnet der Begriff Inokulieren einfach die Injektion der Zellen, die zur Expansion im Mikrobioreaktor bestimmt sind.
12. Fügen Sie die zusätzlichen Widerstände hinzu, um die Mischgeschwindigkeit im Einklang mit dem Standardwiderstand R0 zu modulieren.
13. Nehmen Sie Zellen aus ihrem Kolben und zählen Sie sie auf einem Hämozytometer. Führen Sie alle offenen Operationen in einem BSC durch, um die Sterilität zu gewährleisten.
    1. Aspiratiere das Medium und wasche dann mit 5–10 ml vorgewärmtem PBS. Aspiriere das PBS und gib 5 ml Trypsin + EDTA in die Kolben.
    2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten oder bis alle Zellen sichtbar von der Kolbenoberfläche abgehoben sind.
    3. Fügen Sie 10 ml vorgewärmtes hMSC-Medium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Entnehmen Sie den Flüssigkeitsinhalt und geben Sie ihn in ein 15-mL-Zentrifugenrohr ein.
    4. Zentrifugiere die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen hMSC-Medium zum Zählen wieder aufhängen. Für einen vollständig konfluenten T75-Kolben beträgt ein geeignetes Volumen typischerweise 2–4 mL, was eine Zellkonzentration von ~1–2E6 Zellen pro ml ergibt.
    5. Mischen Sie eine Probe der resuspendierten Zellen mit einem gleichen Anteil Trypan-Blau-Wirksamkeitsfarbstoff und laden Sie die Mischung in ein Hämozytometer zum Zählen. Zählen Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
14. Berechnen Sie das Volumen der Zelllösung, das benötigt wird, um 150.000 Zellen zu erreichen, und pipettieren Sie diese Menge in das wartende 15-mL konische Rohr mit Mikroträgern für jede Bedingung. Fülle das Volumen im Rohr auf zwischen 2,2 und 2,5 mL mit frischem, warmem hMSC-Medium auf.
    HINWEIS: Das Volumen in jedem 15 mL konischen Volumen sollte etwas größer als 2 ml sein, sodass die Injektion zu einem leicht überfüllten Reaktorzustand führt, um Blasen zu vermeiden, die in einem späteren Schritt ausgeglichen werden.
15. Füge das entsprechende Volumen an Zellen zur T75-Kolbensteuerung hinzu.
16. Arbeiten Sie mit ein bis zwei Verbrauchsmaterialien gleichzeitig und entfernen Sie die Verbrauchsmaterialien aus dem POD und bringen Sie sie in die BSC.
17. Entnehmen Sie Zellen und Mikroträger in einer 5-ml-Spritze mit grünen 4-Zoll-stumpfen Nadeln. Injizieren Sie die Zellen und Mikroträger in den Reaktor.
18. Bringen Sie das Verbrauchsgut in die Basisstation zurück und wiederholen Sie das, bis alle Verbrauchsmaterialien injiziert wurden.
19. Klicken Sie durch das Software-Fenster , um anzuzeigen, dass die Impfung stattgefunden hat. Wenn die Software zur normalen Startseite zurückkehrt, entferne die weiße Klemme von den verbrauchbaren Ausgabezeilen.
20. Gehen Sie in manuelle Operationen ein und führen Sie eine Funktion "Eject Excess aus" mit auf P eingestelltem Ausgangsport für die Perfusion aus. Aktiviere den statischen Mischmodus, benutze 1680 s an und 120 s aus. Halte die Mischfrequenz beim statischen Mischen bei 5 Hz.
21. Schalten Sie die optische Dichte-Referenzmessung aus.
    1. Öffnen Sie den MBS-Client und klicken Sie auf Verbinden. Geben Sie den folgenden Befehl in den Anführungszeichen ein: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Klicken Sie auf Senden, warten Sie auf die Bestätigung, dass der Befehl erfolgreich gesendet wurde, und schließen Sie den MBS-Client.
22. Nach 24 Stunden deaktivieren Sie den statischen Mischmodus und aktivieren Sie das normale Mischen erneut. Reduziere die Mischfrequenz auf 1,5 Hz.

4. Betrieb des Mikrobioreaktors

1. Überwachen Sie den Mikrobioreaktor täglich, um sicherzustellen, dass keine Probleme das Experiment stören. Stellen Sie sicher, dass die Medienquellenflaschen >5 ml Medium halten, um den Reaktor problemlos durchsickern zu können.
2. Wechseln Sie die Eiskübel bei Bedarf aus, um die Temperaturkontrolle der Medienflasche aufrechtzuerhalten. Behalten Sie den lichtschützenden Vorhang über der Vorderseite des Mikrobioreaktors, um eine lichtbasierte Zersetzung flüchtiger Medienkomponenten zu verhindern.
3. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in den Reaktor eingeführt werden. Vergessen Sie nicht, das Medium in der TCPS-Kolbensteuerung regelmäßig zu wechseln.

5. Mikrobioreaktor-Ernte

1. Stellen Sie sicher, dass der BSC steril und betriebsbereit ist.
   1. Erwärmen Sie die folgenden benötigten Reagenzien in einem Perlen- oder Wasserbad auf 37 °C: ~25 mL warmes hMSC-Medien, 10 mL warmes PBS und 1,5 mL 10 mg/mL Pronase, das für die Ernte benötigt wird.
2. Bereiten Sie das Flaschenregal für die Ernte vor.
   1. Aktivieren Sie den manuellen Betriebsmodus für jeden POD in der Software.
   2. Klemmen Sie die verbrauchbaren Eingangsleitungen mit einer weißen C-Klemme entlang des freien Teils der Leitung.
   3. Entferne die Verbrauchsmaterialien in den BSC. Entferne den Inhalt der Abfallflasche und entsorge es.
   4. Die Abfallflasche mit ~20 ml PBS spülen und entsorgen. Untersuchen Sie das verbleibende Volumen in der Medienflasche und füllen Sie bei Bedarf frisches (kaltes) hMSC-Medium auf.
      HINWEIS: Hier sind > 4 ml Medium erforderlich, um die drei notwendigen Auswurf-Waschzyklen für die Ernte abzuschließen.
   5. Auslegen Sie die Abfallflasche mit ~5 ml kaltem hMSC-Medium, um die entnommene Flüssigkeit abzufedern.
3. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Mikrobioreaktor.
   1. Mit einer 1-mL-Spritze werden 200 μL 10 mg/mL Pronase in die Spritze und ~300–400 μL Luft aufgenommen.
   2. Schrauben Sie die Seitenöffnung der Einspritzleitungskappe ab und sprühen Sie den nadellosen Ventilanschluss mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie das Klebeband, das die verknotete Einspritzleitung an der Seitenöffnung hält, und lösen Sie den Knoten. Entspanne die weiße Tropfenklemme.
   3. Schließen Sie die 1-mL-Spritze an und injizieren Sie das Pronase vorsichtig in den Reaktor. Jagen Sie die Flüssigkeit mit Luft durch die Einspritzleitung, um sicherzustellen, dass alle Flüssigkeitsinhalte in den Reaktor gelangen.
   4. Ziehen Sie die Tropfenklemme wieder ein und schließen Sie die Seitenöffnungs-Einspritzleitung wieder ein. Das Verbrauchsmaterial zurück in den POD, alle Leitungen wieder verbinden, die weiße C-Klemme entfernen und das Mischen fortsetzen.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Abfallflasche und die Flasche mit der Medienquelle auf Eis gehalten werden. Starte einen 5-minütigen Timer und lass das Pronase die Mikroträger im Reaktor verdauen.
   6. Nach 5 Minuten überprüfen Sie, ob die Mikroträger verschlechtert sind, indem Sie überprüfen, ob sie nicht mehr sichtbar im Reaktor vorhanden sind. Wenn Mikroträger noch sichtbar sind, sollten Sie eine zusätzliche Minute für die Verdauung einplanen. Wenn keine Mikroträger sichtbar sind, fahren Sie fort.
   7. Entnehmen Sie die Zellen. Schalte den manuellen Operationsmodus ein, stelle die # der Zyklen auf 3 und den Ausgangsanschluss auf W für Abfall und klicke auf Auswerfen Wasch.
   8. Nach Abschluss der Auswurfwaschzyklen wird das Verbrauchsmaterial zurück in den BSC entnommen und der Inhalt der Abfallflasche mit einer 10- oder 20-ml-Spritze entnommen.
   9. Geben Sie den Inhalt der Abfallflasche in ein 15 mL konisches Zentrifugenrohr ab. Zentrifugiere die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, aspiriere das Supernatant und bewerte die Größe des Zellpellets.
   10. Setzen Sie das Zellpellet in 1–5 ml Wachstumsmedium (PBS) wieder auf und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Verbrauchsmaterialien.
4. Ernte die Flaschenbedingung(en) mit deinen normalen Zellkulturprotokollen. Ein typisches Protokoll für MSCs wird in 3.13 beschrieben.

6. Analyse der Zellen aus den Bedingungen des Mikrobioreaktors und des Kolbens für die nachgelagerte Anwendung

HINWEIS: Die analytischen Methoden, die zur Erzeugung der vorgestellten Ergebnisse verwendet werden, sind unten kurz dargestellt und ausführlicher in Krupczak, Farruggio und Van Vliet (2024)²⁰ beschrieben.

1. Umweltkontrolle: Verwenden Sie die grafische Benutzeroberfläche, die vom Mikrobioreaktor bereitgestellt wird, um Daten von jedem der integrierten Sensoren eines Verbrauchsprodukts während der Dauer einer Kulturperiode abzurufen und diese anzuzeigen. Diese Daten werden in der Breez Explorer Software bereitgestellt, die im Laptop des Mikrobioreaktors installiert ist.
2. Zellerträge: Entnehmen Sie MSCs wie oben beschrieben und pelletieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Überstandsmittel und suspendieren Sie das Zellpellet gründlich in einem geeigneten Volumen PBS- oder hMSC-Medium (1–2 ml). Nehmen Sie eine Probe der resuspendierten Zellmischung und mischen Sie sie mit einem gleichen Volumen Trypan Blue-Farbstoff. Mikropipettieren Sie die gefärbte Probemischung in einen Hämozytometerchip und messen Sie Zellanzahl sowie -viabilität mit einem automatisierten oder manuellen Hämozytometer.
3. Überprüfen Sie die Genexpression durch eine zweistufige Reverse-Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion, wie unten beschrieben.
   1. RNA-Reinigung: Verwenden Sie ein RNeasy Mini Kit, um RNA aus jeder Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren und zu reinigen. Kurz gesagt: Lysieren Sie die Zellen, übertragen die Zellinhalte in ein Reinigungs-Spin-Rohr und reinigen Sie die Proben mit jedem Puffer, um unnötige zelluläre Komponenten, Nukleinsäuren und Proteine zu entfernen, die die anschließende PCR beeinträchtigen könnten.
   2. cDNA-Umwandlung: Verwenden Sie ein High-Capacity Reverse Transcription Kit und einen thermischen Cycler, um die gereinigte RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers in komplementäre DNA (cDNA) umzuwandeln. Kurz gesagt: Taue die Kit-Komponenten auf und erstelle einen Master-Mix, indem du die Komponenten in den passenden Volumina für deine Anzahl an Samples zusammensetzt. Gleiche Teile gereinigte RNA und präparierte Mastermischung (je 10 μL) in jede Öffnung einer PCR-Platte einladen und dabei sorgfältig die Standorte jeder Probenidentität zu verfolgen. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers im thermischen Cycler, um die Reverse-Transkriptionsreaktion abzuschließen.
   3. qPCR: Mit exonaufspannenden, sequenzspezifischen Primern, die validiert sind, um Primer-Dimer zu vermeiden, wird eine 384-Well-qPCR-Platte mit Forward Primer, Reverse Primer, Template cDNA, nukleasefreiem Wasser und Mastermischung in geeigneten Volumen (typischerweise 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL) verwendet, wobei mehrere technische Replikationsbrunnen für jedes Gen und jede Probe verwendet werden. Teilen Sie den Inhalt bei Bedarf auf mehrere Platten auf, um alle Genziele zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass alle Proben für ein bestimmtes Genziel auf dieselbe Platte geladen werden, um Platten-zu-Platten-Variabilität der Ergebnisse zu vermeiden, und dass jede Platte ein geeignetes Haushaltsgen und keine Vorlagenkontrollen besitzt. Messen Sie die Fluoreszenzintensität auf einer geeigneten qPCR-Maschine und verwenden Sie die ΔΔCt-Methode zur relativen Quantitation zur Berechnung der Genexpression.

Results

Der Mikrobioreaktor ermöglichte die Überwachung und Regulierung von Umweltfaktoren über etwa 10 Tage in der Kultur. Umweltfaktoren, darunter pH-Wert (Abbildung 2A), Temperatur (Abbildung 2B), gelöster Sauerstoff (Abbildung 2C) und Kohlendioxid (Abbildung 2D), wurden während der Kulturperiode präzise gemessen und in den Mikrobioreaktorbed...

Discussion

In diesem Protokoll wird eine Methode beschrieben, um Zellen mit einem Mikroträger-Mikro-Mikroreaktor-Ansatz zu erweitern, zu primieren und zu ernten. Dieses Verfahren ermöglicht es ankerabhängigen Zellen wie MSCs, die Zellzahl unter der überlegenen biochemischen Steuerung einer Bioreaktorplattform (im Vergleich zu herkömmlichen TCPS-Kolben) im Tischmaßstab zu erhöhen, was sich für eine schnelle Prozessentwicklung eignet. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Produktion von MSCs du...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Haftungsspülung	Stemcell-Technologien	7010
Biosicherheitsschrank
Breez-Mikrobioreaktor	MilliporeSigma
Zentrifuge
Konische Röhre, 15 mL
Konische Röhre, 50 mL
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium, niedriger Blutzucker	Gibco	11885084
Ethanol
Fetales Rinderserum	Gibco	A5670701
Hämozytometer
Laborband
Mikroträger
Mikrozentrifugenrohr, 1,5 mL
Mikroskop
Nadel, stumpf, 4", 18 Gauge	Amazonas	B0D663ZR6D
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-040-CM
Pronase, aus Streptomyces griseus	MilliporeSigma	10165921001
Serologische Pipette, 10 ml	VWR	75816-100
Steriles, deionisiertes Wasser
Spritzenfilter, 0,22 ähm, steril	Celltreat Wissenschaftliche Produkte	229762
Spritze, 1 ml	BD	309628
Spritze, 20 ml	BD	302830
Spritze, 5 mL	BD	309646
Spritze, 50 ml	BD	309653
Gewebekultur-Polystyrolkolben, T75	Thermo Fisher Scientific	130190
Trypan Blau	SigmaAldrich	T8154-100ML