Ein intelligentes strukturelles Farb-Hydrogel-Pflaster, das Diagnose und Behandlung für die Behandlung von chronischer Osteomyelitis integriert

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein intelligentes strukturelles Farbhydrogel-Pflaster (CPG) für die Diagnose und Behandlung von chronischer Osteomyelitis (COM) vorgestellt. Das Pflaster enthält ein temperaturempfindliches GelMA-Hydrogel, ein pH-empfindliches CSMA-PBA-Gerüst und Salicylsäure für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung, die Infektionsüberwachung und die Förderung der Geweberegeneration.

Zusammenfassung

Chronische Osteomyelitis (COM) ist eine hartnäckige Knocheninfektion, die mit herkömmlichen Antibiotika aufgrund von Problemen wie Arzneimittelresistenz und unerwünschten Nebenwirkungen nur schwer zu behandeln ist. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir ein neuartiges intelligentes strukturelles Farbhydrogelpflaster (CPG) sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung von COM entwickelt. Das Pflaster kombiniert methylacryliertes Chitosan, das mit Phenylboronsäure (CSMA-PBA) modifiziert wurde, als Gerüst, temperaturempfindliches GelMA-Hydrogel als Füllstoff und Salicylsäure (SA) für die Wirkstoffabgabe. Die Charakterisierung zeigte hervorragende mechanische Eigenschaften und Klebkraft. Experimente zur Wirkstofffreisetzung bestätigten, dass CPG effektiv auf pH-Änderungen reagiert und eine kontrollierte Wirkstofffreisetzung ermöglicht. CPG dient auch als diagnostisches Instrument, indem es pH- und Temperaturänderungen an der Infektionsstelle erkennt und so die postoperative Genesung unterstützt. Antimikrobielle Tests zeigten eine signifikante Hemmung des Bakterienwachstums, und In-vitro-Experimente zeigten die Fähigkeit von CPG, die Expression von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren zu fördern und gleichzeitig Entzündungsmarker zu reduzieren. Die Studie unterstreicht die multifunktionalen Fähigkeiten des Hydrogelpflasters, einschließlich antimikrobieller, entzündungshemmender und provaskulärer Wirkungen, und positioniert es als vielversprechende therapeutische Option bei chronischer Osteomyelitis.

Einleitung

Chronische Osteomyelitis ist aufgrund ihres herausfordernden und langwierigen Behandlungsprozesses, des hohen Risikos eines Behandlungsversagens und eines erneuten Auftretens zu einem großen Problem für Patienten geworden¹. Aktuelle Behandlungsstrategien für Osteomyelitis beinhalten das chirurgische Debridement von nekrotischem Gewebe und parenterale Antibiotika. Der Bedarf an hohen Dosen von Antibiotika, um therapeutische Niveaus am Wirkort bereitzustellen, bleibt jedoch bei der Behandlung der Krankheit unwirksam. Darüber hinaus ist der Einsatz von hochdosierten Antibiotika mit unerwünschten Komplikationen wie Nephrotoxizität, Ototoxizität, Antibiotikaresistenz und gastrointestinalen Nebenwirkungen verbunden. Die lokale Verabreichung von Antibiotika an Medikamente kann eine geeignetere Strategie sein, um diese Nachteile zu überwinden. Während die lokale Verabreichung von Antibiotika Knocheninfektionen mit minimalen Nebenwirkungen behandeln kann, ist die Induktion der Knochenregeneration entscheidend für eine erfolgreiche Behandlung². Daher scheint die gleichzeitige Gabe von Antibiotika und Knochenwachstumsfaktoren eine vielversprechende Behandlungsstrategie zu sein. In den letzten Jahrzehnten hat sich das nicht biologisch abbaubare Polymethylmethacrylat (PMMA) als Hauptstütze für die lokale Antibiotikatherapie bei Osteomyelitis erwiesen. Die Verwendung von PMMA als lokales Antibiotika-Verabreichungssystem ist jedoch mit Einschränkungen verbunden, wie z. B. der Notwendigkeit einer zweiten Operation zur Entfernung von Kügelchen, der Bildung eines bakteriellen Biofilms, der die Oberflächenbesiedlung begünstigt, der langfristigen Freisetzung von Antibiotika auf subtherapeutischem Niveau, die zu Antibiotikaresistenz führt, der systemischen Toxizität von Restmonomeren und dem Mangel an knocheninduktiven Eigenschaften³. Daher kann die Entwicklung biologisch abbaubarer lokaler Verabreichungssysteme unter Verwendung biokompatibler Polymere diese Nachteile überwinden. Die Literatur deutet darauf hin, dass Seidenfibroin-Nanopartikel (SFNPs), die in ein Seidengerüst zur lokalen Verabreichung von Vancomycin eingebaut werden, zur Behandlung schwerer Osteomyelitis verwendet werden können. Das Fehlen von knocheninduktiven bioaktiven Molekülen in dem Nanokompositmaterial führte jedoch dazu, dass die präparierten Konstrukte die Knochenregeneration nicht signifikant induzierten. Daher war die Entwicklung von Nanokomposit-Gerüstmaterialien, die für die Behandlung von chronischer Osteomyelitis geeignet sind, eine Herausforderung. Hydrogele auf Basis natürlicher Polymere haben aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit der extrazellulären Matrix (ECM) und ihrer Fähigkeit, die Wirkstofffreisetzung zu kontrollieren, große Aufmerksamkeit erregt⁴.

Ein herausragendes Merkmal von Hydrogelen ist ihre Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Faktoren wie Temperatur und pH-Wert. Chronische Infektionen können den pH-Wert aufgrund von mikrobieller Belastung, einer Dysregulation des Regenerations-Abbau-Gleichgewichts und verstärkten Stoffwechselreaktionen erhöhen. Darüber hinaus kann die chirurgische Exzision von debridiertem Material, wie nekrotischem Gewebe und Eiter, den Übergang des pH-Werts zu höheren Werten beschleunigen⁵. Daher ist die Verwendung von pH-empfindlichen Hydrogelen, die in der Lage sind, den pH-Wert einer chronischen Infektion zu erkennen, entscheidend für die Prognose der chronischen Osteomyelitis.

In dieser Studie schlagen wir einen integrierten Diagnose- und Behandlungsansatz vor, bei dem ein intelligentes strukturelles Farbhydrogelpflaster verwendet wird, das die erforderlichen Eigenschaften für die Behandlung von chronischer Osteomyelitis aufweist, wie in Abbildung 1 dargestellt. Supramolekulare Hydrogele, die aus dem Aufbau supramolekularer Polymernetzwerke gewonnen werden, sind attraktive Materialien, die der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) ähneln. Aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften, einschließlich angemessener mechanischer Festigkeit, selbstheilender, antibakterieller und entzündungshemmender Eigenschaften, haben supramolekulare Hydrogele viele Anwendungen im biomedizinischen Bereich gefunden⁶. Im Gegensatz dazu hat die Strukturfarbe als eine Art von Farbe, die durch einzigartige Wechselwirkungen von Licht mit intrinsischen periodischen Nanostrukturen erzeugt wird, in Bereichen wie optischen Displays, fälschungssicheren Etiketten und tragbaren elektronischen Geräten große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere wenn strukturelle Farbmaterialien aus responsiven Polymeren aufgebaut sind, kann ihre Farbe durch verschiedene Reize durch Ausdehnung oder Kontraktion dieser Polymere angepasst werden, was auf das Potenzial dieser Materialien als Sensoren hindeutet. Daher kann man sich vorstellen, dass die Kombination von supramolekularen Hydrogelen mit Strukturfarben eine einzigartige Strategie für die Konstruktion neuartiger Hydrogelpflaster zur Behandlung der chronischen Osteomyelitis bietet ^7,8,9.

In dieser Arbeit haben wir einen integrierten Diagnose- und Behandlungsansatz entwickelt, bei dem ein intelligentes strukturelles Farbhydrogelpflaster (CPG) verwendet wird, das aus gemischt modifiziertem Methylacrylat-Chitosan mit Phenylboronsäure (CSMA-PBA) als Anti-Protein-Steingerüst, temperaturempfindlichem GelMA-Hydrogel als Füllstoff und beladen mit Salicylsäure (SA)¹⁰ besteht. Aufgrund der Reversibilität von Wasserstoffbrückenbindungen und nicht-kovalenten Wechselwirkungen innerhalb des Netzwerks wies das resultierende Hydrogelpflaster nicht nur hervorragende mechanische Eigenschaften auf, sondern besaß auch Selbstheilungsfähigkeiten. Darüber hinaus wies dieses Hydrogelpflaster aufgrund des Vorhandenseins von CSMA auch eine starke antibakterielle Bioaktivität auf. Darüber hinaus könnte das Hydrogelpflaster unter Ausnutzung der thermischen Reaktionsfähigkeit des GelMA-Polymers Wirkstoffe freisetzen, wenn es an der relativ höheren Temperaturstelle der Entzündung platziert wird. Gleichzeitig reagierte das Hydrogel aufgrund des Vorhandenseins von Boronatesterbindungen in CSMA-PBA auf Veränderungen des Umwelt-pH-Werts^{von 11}. Basierend auf diesen Vorteilen konnten wir zeigen, dass das vorgeschlagene supramolekulare Hydrogelpflaster chronische Osteomyelitis behandeln kann, indem es die Expression von Entzündungsfaktoren und die antibakterielle Aktivität herunterreguliert und die Angiogenese fördert. Bemerkenswert ist, dass das Hydrogelpflaster von den einzigartigen optischen Eigenschaften des Anti-Protein-Steingerüsts profitiert und sogar die Fähigkeit aufweisen könnte, als Reaktion auf Temperaturreize die Farbe zu ändern, was ein erhebliches Potenzial bei der Überwachung und Behandlung chronischer Osteomyelitis und der Steuerung der klinischen Behandlung zeigt.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Medizinischen Ethikkommission genehmigt und gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23, überarbeitet 1978) durchgeführt. In den Experimenten wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen alt) verwendet.

Herstellung von kolloidalen Quarzkristall-Templates (SCCs)
Die SCCs wurden wie zuvor beschrieben erstellt 12,13,14. Gereinigte und plasmabehandelte Objektträger wurden in eine 5%ige Lösung aus monodispersen Siliziumdioxid-Nanopartikeln (12 nm Durchmesser) getaucht, die in deionisiertem Wasser dispergiert war. Die Lösung wurde 1 h lang kontinuierlich bei Raumtemperatur (25 °C) gerührt, um eine gleichmäßige Dispersion der Siliziumdioxid-Nanopartikel zu gewährleisten. Die Objektträger wurden aus der Lösung genommen und 1 h bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Der Trocknungsprozess war entscheidend, um die korrekte Haftung der Nanopartikel auf der Oberfläche der Objektträger zu gewährleisten. Nach der Lufttrocknung wurden die Objektträger 2 Tage lang bei 60 °C in einen belüfteten Ofen gestellt, um das restliche Lösungsmittel zu verdampfen und die Bildung von kolloidalen Kristallen zu erleichtern. Während dieser Verdampfung wurden die Objektträger in einem Winkel von 45° positioniert, um die Bildung geordneter kolloidaler Kristallarrays zu fördern. Die geordneten kolloidalen Kristallarrays zeichneten sich durch Selbstorganisation aus und wiesen je nach Partikelabstand unterschiedliche Strukturfarben auf. Diese Arrays wurden dann als Vorlagen für die anschließende Herstellung von Hydrogelpflastern verwendet.

Erstellung von integrierten Diagnose- und Behandlungsmodulen für intelligente strukturelle Farb-Hydrogel-Pflaster (CPG)
Anti-Protein-Steingerüste wurden aus den Hohlräumen von kolloidalen Siliziumdioxid-Kristall-Templates (SCCs) repliziert. Gereinigte Objektträger wurden zunächst in eine 5%ige Lösung aus monodispersen Siliziumdioxid-Nanopartikeln (12 nm Durchmesser) in deionisiertem Wasser getaucht und die Lösung 1 h lang bei Raumtemperatur (25 °C) gerührt, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel auf der Oberfläche zu gewährleisten. Der Rührprozess war entscheidend, um die Bildung von Aggregaten zu verhindern und eine homogene Verteilung der Nanopartikel zu gewährleisten. Nach dem Eintauchen wurden die Objektträger 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) an der Luft getrocknet, gefolgt von einer Trocknung im Ofen bei 60 °C für 2 Tage, um das Verdampfen des Lösungsmittels zu erleichtern und die Selbstorganisation der Siliziumdioxid-Nanopartikel zu gut geordneten kolloidalen Kristallarrays zu fördern. Während der Verdampfung wurden die Objektträger in einem Winkel von 45° positioniert, um die Ausrichtung der Nanopartikel zu erleichtern und die Bildung eines periodischen Arrays mit kontrollierten Abständen zwischen den Partikeln zu fördern. Dieses geordnete Array wies die Strukturfarbe auf, ein charakteristisches Merkmal der kolloidalen Kristalle, und diente als Vorlage für die nachfolgende Hydrogelstruktur.

Die vorbereiteten SCCs wurden dann in der CPG-Pre-Gel-Lösung getränkt, die aus GelMA in einer Konzentration von 10 % w/v bestand, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Proben wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) belassen, um eine gründliche Infiltration des GelMA in die Hohlräume zwischen den Siliziumdioxid-Nanopartikeln zu gewährleisten und eine gleichmäßige Verteilung innerhalb der Matrizenstruktur zu gewährleisten. Dieser Schritt war entscheidend, um sicherzustellen, dass die Hydrogelmatrix gleichmäßig in das Template eingebaut wurde und dass die endgültige Hydrogelstruktur die geordnete Nanopartikelanordnung der SCCs replizierte. Nach dem Einweichen wurde die Pre-Gel-Lösung unter UV-Licht (365 nm) bei einer Intensität von 3 mW/^cm2 für 5 min polymerisiert. Diese UV-Strahlung initiierte die Vernetzung von GelMA, wodurch sich die Hydrogelmatrix verfestigte. Die Belichtungszeit und -intensität wurden sorgfältig optimiert, um eine ausreichende Vernetzung zu erreichen, ohne das Hydrogel zu überbelichten, was zu einer übermäßigen Gelierung oder einem Verlust der Matrizenstruktur führen könnte.

Charakterisierung von CPG
Die Querschnittsmorphologie des Hydrogels wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV beobachtet, nachdem die Proben (1 mm x 1 mm) mit Gold¹⁵ beschichtet worden waren. Dies ermöglichte es uns, die nanoporöse Struktur sichtbar zu machen und die Gleichmäßigkeit des Hydrogel-Netzwerks zu bestätigen. Das Quellverhalten wurde durch Eintauchen von 10 mg Hydrogelproben in 10 mL PBS in verschiedenen Zeitintervallen (0, 30, 60, 120 und 180 min) untersucht. Die prozentuale Quellung wurde berechnet, indem die Zunahme des Hydrogelvolumens im Laufe der Zeit gemessen wurde, was einen Einblick in die Fähigkeit des Hydrogels gab, Wasser unter verschiedenen Bedingungen zu absorbieren. Die rheologische Analyse wurde mit einem Rheometer mit einer Dehnung von 1 % durchgeführt, wobei Winkelfrequenzen von 1 rad/s bis 100 rad/s angewendet wurden, um den Speichermodul (G') und den Verlustmodul (G'') zu messen. Dieser Schritt war wichtig, um die mechanischen Eigenschaften des Hydrogels zu verstehen, einschließlich seines viskoelastischen Verhaltens unter Belastung. Die Scherhafteigenschaften wurden mit einer universellen Zugprüfmaschine (Instron) gemäß ASTM F2255-05 (2015) bei einer Geschwindigkeit von 10 mm/min und einer Vorspannung von 0,01 N bewertet, um die Fähigkeit des Hydrogels zu beurteilen, an biologischem Gewebe zu haften. Die Wirkstofffreisetzung wurde mit einem UV-Spektralphotometer bewertet, indem die Absorption bei λ = 280 nm nach Eintauchen des Hydrogels in 5 mL PBS (pH 7,4) überwacht wurde. Die Freisetzung wurde unter Verwendung einer Standardkurve der Salicylsäurekonzentrationen quantifiziert, um die kontrollierte Freisetzungsfähigkeit des CPG-Hydrogels zu bestätigen. Schließlich wurden Hydrogele 30 Minuten lang in Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 4,5 und 7,2 getaucht, um die Reaktionsfähigkeit des pH-Werts zu beurteilen, wobei Veränderungen des Volumens und des Aussehens unter verschiedenen pH-Bedingungen beobachtet^{wurden 16}.

Temperatur- und pH-Reaktionsfähigkeit von CPG-Pflastern
CPG-Pflaster (ca. 2 mm Durchmesser) wurden in eine 5-ml-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 gelegt und 30 Minuten lang in einem temperaturgesteuerten Wasserbad bei 37 °C gehalten, um physiologische Bedingungen nachzuahmen. Die Reflexionsspektren wurden mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bei Wellenlängen von 400 nm bis 800 nm gemessen. Nach ersten Messungen wurden die Pflaster in Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten (z. B. pH 4,5, 7,2 und 9,0) überführt und 30 min lang bei 37 °C gehalten. Die Reaktion auf die Mikroumgebung, einschließlich etwaiger Farbveränderungen, wurde visuell beobachtet und Reflexionsspektren wurden erneut aufgezeichnet, um die Farbverschiebung zu analysieren. Diese Temperatur- und pH-Reaktionsfähigkeit liefert wertvolle Informationen darüber, wie das Hydrogel auf Veränderungen in der Wundumgebung reagiert.

Antibakterielle In-vitro-Tests
Antibakterielle Tests wurden mit Standardverfahren durchgeführt. Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 25923) und Escherichia coli (E. coli, ATCC 53868) wurden verwendet, um die antibakterielle Aktivität von CPG-Pflastern zu beurteilen. Diese Standard-Referenzstämme wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben und als Qualitätskontrollstämme (QC) verwendet, um die antimikrobiellen Testverfahren zu validieren. Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung wurde mit der Bouillon-Mikrodilutionsmethode gemäß den CLSI M100-Richtlinien durchgeführt. Die bakteriellen Suspensionen wurden in Mueller-Hinton-Brühe hergestellt, einem Standardmedium für antimikrobielle Tests. Die Trübung wurde auf einen McFarland-Standard von 0,5 eingestellt, was etwa 1,5 × 10,8 KBE/ml entspricht. Die Suspensionen wurden dann mit CPG-Pflastern (2 mm Durchmesser) beimpft, die entweder mit deionisiertem Wasser oder pH 6,0 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer (10 mM) hergestellt wurden. Die Pflaster wurden den bakteriellen Suspensionen in einem Verhältnis von einem Pflaster pro 1 ml Kultur zugesetzt. Die Suspensionen wurden bei 37 °C für 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Bakterienwachstum durch Plattieren von seriellen Verdünnungen der Kulturen auf Nähragar beurteilt, und koloniebildende Einheiten (KBE) wurden nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C gezählt. Dieses Verfahren lieferte ein quantitatives Maß für die antibakterielle Wirksamkeit.

Bewertung der Biokompatibilität
Die Experimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. CPG-Pflaster wurden durch Dialyse in PBS (pH 7,4) für 4 Stunden verarbeitet, gefolgt von einer Ethanolsterilisation (70 %) für 10 Minuten und einer UV-Desinfektion (365 nm) für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass alle biologischen Verunreinigungen entfernt wurden. L929-Zellen (ATCC CCL-1) wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO² ergänzt wurde, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden in 24-Well-Platten mit 2 × 10⁵ Zellen/ml, mit oder ohne CPG-Pflaster (2 mm Durchmesser), in dreifacher Ausfertigung ausgesät. Die Zellen wurden in drei experimentelle Gruppen eingeteilt: Blindkontrolle, CPG-Gruppe und CPG (MES)-Gruppe. Nach 24 Stunden wurde die Zellviabilität mit dem MTT-Assay bewertet, einer weithin akzeptierten Methode zur Beurteilung der Stoffwechselaktivität von Zellen. Für den MTT-Assay wurden 20 μl MTT (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 4 Stunden. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und 150 μl DMSO hinzugefügt, um die von den lebenden Zellen gebildeten Formazankristalle aufzulösen. Die Extinktion wurde bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu quantifizieren. Dieser Ansatz gewährleistete eine zuverlässige Beurteilung der Zytotoxizität und Biokompatibilität der Hydrogelpflaster.

Entzündungshemmende Wirkung
Die antioxidative Aktivität von CPG wurde mit einem ROS-Assay-Kit bewertet. L929-Zellen (ATCC CCL-1) wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurde, und 24 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, um die Zelladhäsion und die anfängliche Proliferation zu ermöglichen. Um oxidativen Stress zu induzieren, wurden die Zellen 12 h lang mit 3 μg/mL Wasserstoffperoxid (H2O2) behandelt. Nach der Induktion von oxidativem Stress wurde den Zellen Hydrogelextrakt (hergestellt durch Auflösen von 1 mg CPG-Hydrogel in 1 ml DMEM-Medium) zugesetzt. Die Zellen wurden für weitere 12 Stunden inkubiert, um die potenziellen antioxidativen Wirkungen des CPG-Hydrogels zu berücksichtigen. Anschließend wurden die Zellen mit 10 μM DCFH-DA-Lösung (verdünnt in DMEM-Medium) gefärbt und 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. DCFH-DA ist eine Fluoreszenzsonde, die zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Zellen verwendet wird. Nach der Färbung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm aufgenommen. Die Intensität der grünen Fluoreszenz korrelierte umgekehrt mit der antioxidativen Aktivität des Hydrogels, was eine visuelle Beurteilung der Fähigkeit des Hydrogels zur Minderung von oxidativem Stress in den Zellen ermöglichte.

Osteomyelitis-Tiermodell für Ratten
Es wurde ein chronisches Osteomyelitis-Modell etabliert: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen alt) wurden mit Isofluran (2-3% Sauerstoff) anästhesiert, um sicherzustellen, dass sie während der Operation unbeweglich und schmerzfrei blieben. Ein 2 cm langer Schnitt wurde an der lateralen Seite des linken Femurs vorgenommen, und eine sterile 27-G-Nadel wurde verwendet, um 1 10⁷ KBE S. aureus direkt in den trabekulären Bereich des Femurs zu injizieren. Die Injektion wurde in die Knochenmarkhöhle des Femurs durchgeführt, um eine Infektion im Markraum zu induzieren, dem primären Ort der Osteomyelitis. Die Bakterien wurden langsam abgegeben, um eine ordnungsgemäße Ablagerung im Knochenmark zu gewährleisten. Nach 10 Tagen wurden die Ratten durch CO₂ -Inhalation euthanasiert und die infizierten Oberschenkelknochen sorgfältig präpariert. Das Granulationsgewebe wurde aus der Infektionsstelle herausgeschnitten und sofort 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd getaucht, um die Integrität des Gewebes zu erhalten. Nach der Fixierung wurde das Knochengewebe je nach Größe des Knochens 48-72 h lang mit einem Entkalkungsmittel (z. B. EDTA) entkalkt, um eine korrekte Schnittung für die histologische und immunhistochemische Analyse zu ermöglichen. Die entkalkten Knochenproben wurden dann für die histologische Untersuchung, die Immunhistochemie (IHC) und die Immunfluoreszenzfärbung aufbereitet. Für die quantitative Real-Time-PCR (qPCR)-Analyse wurde das Granulationsgewebe für die anschließende RNA-Extraktion bei -80 °C gelagert, was die Analyse von Genexpressionsprofilen in Bezug auf Entzündungen, Knochenregeneration und Immunreaktionen ermöglichte

Bewertung der In-vivo-Behandlung von Osteomyelitis
Das Granulationsgewebe wurde in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom in einer Tiefe von 5 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit der Masson-Trichrom-Färbung (15 min mit Hämatoxylin, 1 h mit Anilinblau) gefärbt, um die Kollagenablagerung und den Gewebeumbau zu bewerten. Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung (5 min mit Hämatoxylin, 2 min mit Eosin) wurde verwendet, um die allgemeine Gewebemorphologie und Entzündung zu beobachten. Die Immunhistochemie (IHC) mit Anti-CD31 (1:100) und Anti-EGF (1:200) wurde für 1 h bei 37 °C durchgeführt, gefolgt von einer sekundären Antikörperinkubation bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten unter Verwendung von Anti-Maus-IgG oder Anti-Kaninchen-IgG (verdünnt 1:200), je nach verwendetem Primärantikörper, um die Angiogenese und die Expression von Wachstumsfaktoren zu bewerten. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde mit Anti-VEGF (1:100) und Anti-bFGF (1:200) für 1 h bei 37 °C durchgeführt, gefolgt von einer sekundären Antikörperinkubation für 30 min bei RT. Es wurden Schnitte für die CD31-, EGF-, VEGF- und bFGF-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Für die quantitative real-time PCR (qPCR)-Analyse wurde die mRNA-Expression von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-α, IL-1β und IL-6) nach RNA-Extraktion mit RNAiso Plus und cDNA-Synthese unter Verwendung des PrimeScript RT Reagenzienkits analysiert. Die PCR wurde mit dem SYBR Green PCR Master Mix durchgeführt, um die Entzündungsreaktion auf molekularer Ebene quantitativ zu beurteilen.

Maßnahmen zur Qualitätskontrolle
Um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse zu gewährleisten, wurden alle Verfahren nach standardisierten Protokollen durchgeführt. Jedes Experiment umfasste geeignete Kontrollgruppen, wie z. B. Blindkontrollen ( Ratten, die mit S. aureus infiziert waren, aber keine Behandlung erhielten), Kontrollgruppen (Ratten, die sich chirurgischen Eingriffen ohne bakterielle Infektion und ohne Behandlung unterzogen) und vergleichende Behandlungsgruppen (Ratten, die unterschiedliche Behandlungen für Osteomyelitis erhielten, wie z. B. Antibiotika oder ein experimentelles Medikament), um die Variabilität zu minimieren. Alle Assays wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um die Konsistenz zu gewährleisten und experimentelle Verzerrungen zu reduzieren. Jede Gruppe enthielt 6 Ratten, um die statistische Signifikanz zu gewährleisten. Die Instrumente, darunter ein UV-Vis-Spektralphotometer, ein Rheometer und ein Zugprüfgerät, wurden vor dem Einsatz routinemäßig gemäß den Herstellerspezifikationen kalibriert. Bakterien- und Zellkulturen wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen in einer Biosicherheitswerkbank hergestellt, und die Färbeverfahren wurden mit konsistenten Protokollen befolgt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Datenerfassung wurde mit einheitlichen Mikroskopeinstellungen durchgeführt, um die Variabilität zwischen den Proben zu minimieren und eine genaue Messung zu gewährleisten.

Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism (Version 8.0) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Für den Vergleich zwischen mehreren Gruppen wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, verwendet, um Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften, dem thermoresponsiven Verhalten, der antibakteriellen Aktivität und der Zellviabilität zu bewerten. Der Student's t-Test wurde für paarweise Vergleiche verwendet, wenn nur zwei Gruppen verglichen wurden, z. B. beim Vergleich der Reflexionspeaks von CPG-Pflastern bei unterschiedlichen pH-Werten oder Temperaturänderungen. p < 0,05 wurde für alle Analysen als statistisch signifikant angesehen. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

Ergebnisse

Herstellung und Charakterisierung von CPG-Pflastern (Abbildung 1)
In einem typischen Experiment wurden monodisperse Siliziumdioxid-Nanopartikel durch Lösungsmittelverdampfung selbst zusammengesetzt, um dicht gepackte Arrays zu bilden, was zu strukturellen Farbbeschichtungen (SCCs)17,18,19 führte, die anschließend zur Herstellung multifunktionaler struktureller Farbhydrogel-Patches verwendet wurden, wie in Abbildung 1 gezeigt. Dabei wurde eine Pre-Gel-Lösung über Kapillarwirkung in die nanoskaligen Lücken der SCCs infiltriert. Anschließend wurde die UV-Polymerisation eingesetzt, um den Hybridfilm aus SCCs und Hydrogel zu bilden. Nachdem die SCCs weggeätzt waren, erhielt man ein inverses Anti-Protein-Steingerüst mit einer periodischen porösen Struktur. Schließlich wurde das thermoresponsive GelMA-Hydrogel in die nanoskaligen Lücken des Anti-Protein-Steingerüsts gefüllt und anschließend ausgehärtet, um die unabhängigen CPG-Pflaster herzustellen.

Das starke Vernetzungsnetzwerk des Hydrogels verlieh den CPG-Pflastern hervorragende mechanische Eigenschaften. Es wurde beobachtet, dass die Flicken robust genug sind, um einer Dehnung standzuhalten, ohne Schäden zu verursachen, und bis zum 2,5-fachen ihrer ursprünglichen Länge gedehnt werden können. Wichtig ist, dass die CPG-Pflaster lebendige Strukturfarben aufwiesen und während des Dehnens dynamische Farbänderungen erfuhren, ein einzigartiges Merkmal, das sich aus der periodischen Anordnung von Nanostrukturen höherer Ordnung innerhalb der Pflaster ergibt. Diese Nanostrukturen erzeugen photonische Bandlücken (PBGs), bei denen Licht bei bestimmten Wellenlängen innerhalb des PBG selektiv reflektiert und nicht durchgelassen wird, wodurch die CPG-Patches mit ihren charakteristischen Strukturfarben und Reflexionsspitzen ausgestattet werden.

Die Peak-Reflexionsposition des CPG-Patches kann durch die Gleichung²⁰ geschätzt werden:

λ = 1,633dn_Durchschnitt

Dabei ist d der Abstand zwischen den Beugungsebenen und n_Average ist der durchschnittliche Brechungsindex des Materials, der als Mittelwert der Brechungsindizes der Komponenten berechnet wird, einschließlich GelMA-Hydrogel und anderer Materialien, die in dem Pflaster verwendet werden. Diese Gleichung legt nahe, dass die Reflexionswellenlänge abnimmt, wenn das Feld gedehnt wird und d abnimmt, was zu einer Blauverschiebung in der Strukturfarbe des Feldes führt. Die Zugfestigkeit der Pflaster wurde ebenfalls getestet, und es wurde festgestellt, dass die Dehnungskapazität der Pflaster aufgrund der Füllung des GelMA-Hydrogels in die nanoskaligen Lücken des Anti-Protein-Steingerüsts abnahm. Die Verformung der CPG-Patches beim Dehnen bietet ein hochempfindliches Mittel zur Dehnungserkennung, wodurch sie für Anwendungen geeignet sind, die eine mechanische Überwachung erfordern.

Thermoresponsives und pH-sensitives Verhalten von CPG-Pflastern (Abbildung 2)
Die CPG-Pflaster zeigten aufgrund des GelMA-Hydrogels bemerkenswerte thermoresponsive Eigenschaften. Beim Erhöhen der Umgebungstemperatur auf 37 °C schrumpfte das Hydrogel, wodurch Wassermoleküle und geladene Fracht freigesetzt wurden. Diese Schrumpfung führte zu einer Verringerung der Größe der Nanoporen in den CPG-Pflastern, wodurch sich ihr PBG veränderte und folglich das Reflexionsspektrum verschoben wurde. Abbildung 2 veranschaulicht dieses Verhalten und zeigt, wie sich die Strukturfarbe der Pflaster als Reaktion auf Schwankungen der Temperatur und des pH-Werts ändert.

Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurden die CPG-Pflaster in einer simulierten Wundumgebung mit chronischen Infektionen bei 37 °C und pH 7,2 platziert. Als der pH-Wert der Lösung anstieg, wurde eine blaue Verschiebung des Reflexionspeaks der CPG-Pflaster beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Größe der Nanoporen abnahm. Umgekehrt zeigten die Flecken bei sinkendem pH-Wert eine Rotverschiebung, was einer Ausdehnung der Nanoporen entsprach. Dieses pH-empfindliche Verhalten wurde auf die Hydrolyse von Boronatesterbrücken in der CSMA-PBA unter sauren Bedingungen zurückgeführt, die die Bindungen aufbrach und zu einer Rotverschiebung der Strukturfarbe führte. Wenn der pH-Wert jedoch alkalisch war, wurde keine signifikante Farbänderung beobachtet, was auf die Stabilität der Pflaster unter basischen Bedingungen hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CPG-Pflaster zur Überwachung von Temperatur- und pH-Änderungen in Wundumgebungen verwendet werden können, was für ein effektives Wundmanagement von entscheidender Bedeutung ist.

Antibakterielle Aktivität von CPG-Pflastern (Abbildung 3)
Die antibakteriellen Eigenschaften der CPG-Pflaster wurden durch Co-Kultivierung mit S. aureus und E. coli bewertet. Abbildung 3A,B zeigt, dass die CPG-Pflaster das Bakterienwachstum signifikant reduzierten, was ihre wirksamen antibakteriellen Eigenschaften zeigt. Diese antibakterielle Wirksamkeit wurde auf die elektrostatische Wechselwirkung zwischen der positiv geladenen CMCSMA-Oberfläche der Pflaster und den negativ geladenen bakteriellen Zellwänden zurückgeführt²¹. Diese Wechselwirkung störte die bakterielle Membranstruktur, was zum bakteriellen Tod führte. Die kationischen Gruppen von CMCSMA können an anionische Komponenten in der Bakterienmembran binden, was zu Membrandepolarisation und erhöhter Permeabilität führt²². Darüber hinaus kann CMCSMA aufgrund seiner relativ kleinen Molekülgröße und seiner flexiblen Polymerketten die Lipiddoppelschicht effektiver durchdringen, was zum Austreten intrazellulärer Substanzen und zur Beeinträchtigung der Stoffwechselaktivität führt. Die geringe Größe der CMCSMA-Moleküle erleichterte ihr Eindringen in die bakterielle Zellmembran zusätzlich, wo sie mit essentiellen Biomolekülen interagierten und den bakteriellen Stoffwechsel und die Enzymsysteme störten²³. Darüber hinaus ist es angesichts der robusten Fähigkeit von S. aureus, Biofilme zu bilden, erwähnenswert, dass Chitosan-basierte Materialien wie CMCSMA Berichten zufolge bakterielle Biofilme stören, indem sie in die Matrix der extrazellulären polymeren Substanz (EPS) eindringen und deren Integrität beeinträchtigen. Dies ermöglicht es den antibakteriellen Wirkstoffen, auf in Biofilmen eingebettete Bakterien zuzugreifen und diese abzutöten, die typischerweise gegen herkömmliche Antibiotika resistent sind^24,25. Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigt der visuelle Vergleich der Bakterienkolonien deutlich eine erhebliche Reduktion nach der Behandlung mit CPG-Pflastern, was ihre effektive bakterizide Wirkung und ihr vielversprechendes Potenzial für den Einsatz in infektionsanfälligen Wundumgebungen unterstreicht.

Biologische Funktionalität von CPG-Pflastern (Abbildung 4)
Die CPG-Pflaster zeigten neben ihren antibakteriellen Eigenschaften auch eine signifikante biologische Funktionalität. Abbildung 4C,D zeigt, dass die Pflaster reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in den Zellen effektiv abfangen, wie das verminderte grüne Fluoreszenzsignal in der CPG-Gruppe zeigt. Die ROS-Säuberung ist für die Wundheilung unerlässlich, da eine übermäßige ROS-Produktion die Geweberegeneration beeinträchtigen kann. Die Lebensfähigkeit von humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs), die mit den CPG-Pflastern kokultiviert wurden, wurde mittels Viabilitätsfärbung bewertet, wie in Abbildung 4A gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mehrheit der Zellen lebendig war, mit nur einem kleinen Teil toter Zellen, was darauf hindeutet, dass die CPG-Pflaster die Lebensfähigkeit der Zellen fördern und die Zellproliferation unterstützen.

Abbildung 4B zeigt die Ergebnisse eines MTT-Assays, der zeigte, dass die CPG-Pflaster die Zellproliferation signifikant förderten. Darüber hinaus zeigte Abbildung 4F,G, dass die CPG-Pflaster die Angiogenese verbesserten, indem sie die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) und des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) förderten, die für die Proliferation von Endothelzellen und die Bildung neuer Blutgefäße entscheidend sind. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der CPG-Pflaster, nicht nur Infektionen zu verhindern, sondern auch die Geweberegeneration zu verbessern und die Wundheilung zu beschleunigen.

In-vivo-Evaluierung von CPG-Pflastern (Abbildung 5)
In-vivo-Experimente , die mit einem chronischen Osteomyelitis-Modell durchgeführt wurden, zeigten, dass die CPG-Pflaster Infektionen und Entzündungen signifikant reduzierten. Abbildung 5A zeigt eine histologische Analyse (H&E-Färbung), bei der die Kontrollgruppe charakteristische Entzündungen, Knochenzerstörung, nekrotisches Gewebe und eine hohe Infiltration von Abwehrzellen aufwies, während die Behandlungsgruppe eine signifikante Verringerung der Infektion, Entzündung und Infiltration von Abwehrzellen zeigte. In der CPG-Gruppe wurden eine erhöhte Migration von Osteoblasten, die Umwandlung von Osteoblasten in Knochenzellen, die Gefäßbildung, die Knochenneubildung und eine verringerte Infektion beobachtet, was die Wirksamkeit der CPG-Pflaster bei der Förderung der Geweberegeneration weiter bestätigt.

Darüber hinaus zeigt Abbildung 5B eine Angiogenese-Färbung, die bestätigt, dass die CPG-Pflaster die Bildung neuer Blutgefäße förderten, was für die Gewebereparatur entscheidend ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CPG-Pflaster eine doppelte Rolle bei der Kontrolle von Infektionen und der Förderung der Geweberegeneration spielen, wodurch sie sich sehr gut für die chronische Wundheilung und die Knochenregeneration eignen.

Abbildung 1: Vorbereitung und Charakterisierung des strukturellen Farbhydrogel-Pflasters (CPG). (A): Reaktion zwischen CSMA und PBA; (B): Foto von CPG, das die Farbänderung beim Dehnen zeigt; (C): REM-Charakterisierung von CPG; (D): Quellverhalten von CPG; (E): Degradationsprofil von CPG; (F): Kinetik der Wirkstofffreisetzung aus CPG. Maßstab: 100 nm. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. In der Versuchsgruppe wurden sechs Ratten verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Intelligente Erfassung des CPG-Patches. (A): Variation der Strukturfarbe des CPG-Pflasters mit Änderungen der Umgebungstemperatur und des pH-Werts; (B): Spektralanalyse von CPG-Pflastern bei verschiedenen Temperaturen; (C): Spektralanalyse von CPG-Pflastern bei verschiedenen pH-Werten. Maßstab: 1 mm. Die Daten stellen die mittlere ± SD dar, die unter Verwendung einer unidirektionalen ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Antibakterielle Aktivität des CPG-Pflasters. (A): Repräsentative Bilder der Co-Kultur von S. aureus und E. coli mit CPG-Pflaster; (B): Analyse der Werte der optischen Dichte (OD). Maßstab: 5 mm. Die statistische Signifikanz wurde durch eine unidirektionale ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey bestimmt. Pro Gruppe wurden sechs Replikate verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Biologische Funktionsbewertung des CPG-Pflasters. (A): Viabilitätsfärbung von HUVEC-Zellen, die 48 h lang mit dem CPG-Pflaster kokultiviert wurden, mit lebenden Zellen (grün) und toten Zellen (rot); (B): Zellproliferation, gemessen mit MTT-Assay; (C): ROS-Färbung des CPG-Pflasters; (D): DPPH-Scavenging-Rate in der VEGF-Gruppe; (E): q-PCR-Analyse von Entzündungsfaktoren; (F): Förderung der Angiogenese durch CPG-Pflaster; (G): Western-Blot-Ergebnisse der VEGF- und bFGF-Expression; (H): Statistische Analyse der Graustufenwerte von VEGF und bFGF. Maßstab: 100 μm. Die Fehlerbalken stellen die SD dar. Die Daten wurden unter Verwendung einer unidirektionalen ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey analysiert. In jeder Gruppe wurden sechs Ratten verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: In vivo Experimente mit dem CPG-Pflaster. (A): HE-Färbung; (B): Angiogenese-Färbung. Maßstab: 100 μm. Die Daten stellen die mittlere ± SD dar, die durch eine unidirektionale ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey analysiert wurden. Jede Gruppe bestand aus 6 Tieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die Multifunktionalität von CPG-Hydrogelpflastern, insbesondere in Bezug auf ihre strukturellen Farbveränderungen, ihre Temperaturempfindlichkeit, ihre Reaktionsfähigkeit auf den pH-Wert und ihre antimikrobiellen Eigenschaften. Diese Hydrogel-Pflaster können sichtbare strukturelle Farbveränderungen erfahren, wenn sie mechanischer Verformung ausgesetzt werden, und bieten einen hochempfindlichen Mechanismus zur Überwachung der Dehnung. Dieses Merkmal stimmt mit früheren Studien überein, die die Strukturfarbe in Materialien für Sensoranwendungen untersucht haben, bei denen solche Farbverschiebungen als Indikatoren für Dehnung oder Druck verwendet werden^26,27. Unsere Studie erweitert diese Erkenntnisse, indem sie diese Farbveränderungen als nicht-invasives Mittel zur Überwachung von Wundstress nutzt, was für die Beurteilung der Wundheilung in Echtzeit unerlässlich ist. Die Möglichkeit, solche mechanischen Dehnungen zu überwachen, liefert wichtige Informationen für Ärzte und hilft möglicherweise dabei, frühe Anzeichen von Komplikationen, wie z. B. Nahtdehiszenz, zu erkennen und so gezieltere und rechtzeitigere Interventionen zu unterstützen. Wichtig ist, dass die optische Anzeige einen direkten und intuitiven Sensormechanismus bietet, ohne dass zusätzliche Stromversorgung oder Bildgebungsgeräte erforderlich sind, und bietet eine dezentrale Überwachungslösung, die sich ideal für die postoperative Versorgung am Point-of-Care oder zu Hause eignet.

Das thermoresponsive und pH-empfindliche Verhalten der CPG-Hydrogelpflaster erhöht ihr Potenzial für den klinischen Einsatz. Bei der Wundheilung sind Schwankungen der Temperatur und des pH-Werts häufig, insbesondere bei Vorliegen einer Infektion oder Entzündung²⁸. Es ist bekannt, dass erhöhte Temperaturen und veränderte pH-Werte an der Wundstelle mit diesen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. In dieser Studie zeigten die CPG-Pflaster eine Empfindlichkeit gegenüber solchen Veränderungen, was eine Echtzeitüberwachung des lokalen Wundzustands ermöglichte. Diese Eigenschaft ist besonders wertvoll im klinischen Umfeld, wo die Früherkennung von Infektionen oder Entzündungen für die Optimierung von Therapiestrategien unerlässlich ist. Die Überwachung von Temperatur- und pH-Schwankungen ist für das Wundmanagement besonders wichtig, da sie als frühe, nicht-invasive Biomarker für den Wundstatus dienen²⁹. Erhöhte Temperaturen können den Beginn einer Infektion signalisieren, bevor sich klinische Symptome manifestieren, während Verschiebungen in Richtung alkalischer pH-Werte oft auf Chronizität, mikrobielle Besiedlung und beeinträchtigte Heilung hinweisen. Im Gegensatz dazu wird saures Milieu mit akuten Wunden und einem besseren Heilungspotenzial in Verbindung gebracht²⁴. Die Integration von temperatur- und pH-empfindlichen Elementen in Wundauflagen ermöglicht somit rechtzeitige Interventionen und eine kontinuierliche Beurteilung des Heilungsfortschritts, wodurch eine Verschlechterung der Wunde oder das Fortschreiten zu einer systemischen Infektion verhindert werden kann. Die Fähigkeit des Hydrogels, sich dynamisch an diese Veränderungen anzupassen, bietet Ärzten auch ein neues Werkzeug, um den Wundstatus kontinuierlich zu überwachen, was eine höhere Genauigkeit bei der Verfolgung des Heilungsprozesses bietet. Darüber hinaus ermöglicht eine solche dynamische Reaktionsfähigkeit eine raumzeitliche Kontrolle über die therapeutische Freisetzung und stellt sicher, dass die Wirkstoffabgabe mit pathologischen Hinweisen synchronisiert wird, was ein Kernziel moderner intelligenter Biomaterialien ist.

Darüber hinaus sind die antimikrobiellen Eigenschaften der CPG-Hydrogelpflaster entscheidend für die Reduzierung der Bakterienbelastung an der Wundstelle. Chitosan, das in die Struktur des Hydrogels eingebaut wurde, ist seit langem für seine antimikrobiellen Eigenschaften bekannt, da es kationisch ist und elektrostatische Wechselwirkungen mit den negativ geladenen Bakterienzellwänden erleichtert²⁹. Der antibakterielle Mechanismus von Materialien auf Chitosanbasis beschränkt sich jedoch nicht nur auf die einfache Ladungsanziehung. Bei Kontakt mit bakteriellen Membranen kann Chitosan die Membranpermeabilität erhöhen, was zum Austreten von intrazellulären Inhalten wie Kaliumionen, Proteinen und Nukleinsäuren führt. Darüber hinaus kann Chitosan zweiwertige Metallionen (z. B. Ca²⁺ und Mg²⁺) chelatisieren, wodurch die Enzymaktivität und die Stoffwechselfunktionen gestört werden. Niedermolekulares Chitosan kann auch die bakterielle Zellwand durchdringen und an die DNA binden, wodurch die mRNA-Transkription und die Proteinsynthese gehemmt werden. Diese vielschichtigen Mechanismen sind umfassend dokumentiert. Die poröse Struktur des Hydrogel-Gerüsts verstärkt diese Effekte weiter, indem sie die Oberfläche und den Bakterienkontakt verbessert, was zu einer synergistischen antibakteriellen Wirksamkeit führt. Diese Eigenschaft ist besonders relevant bei der Behandlung chronischer Infektionen wie Osteomyelitis, bei denen die Bildung von Biofilmen den Heilungsprozess erschwert^25,30. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die CPG-Hydrogelpflaster das Bakterienwachstum wirksam hemmen, die bakterielle Belastung an der Wundstelle reduzieren und möglicherweise ein günstigeres Umfeld für die Geweberegeneration schaffen. Diese antimikrobielle Aktivität, kombiniert mit den anderen Eigenschaften des Hydrogels, positioniert die Pflaster als vielversprechenden Kandidaten für die Behandlung chronischer Wunden, die oft von bakterieller Kontamination und verzögerter Heilung geplagt sind. Darüber hinaus verhindert das Hydrogel durch die Hemmung der lokalen bakteriellen Besiedlung indirekt die Hochregulierung von entzündungsfördernden Zytokinen, die häufig in infizierten chronischen Wunden aufrechterhalten werden, und fördert so eine pro-regenerative Mikroumgebung.

Während ROS in der Regel mit oxidativem Stress und Gewebeschäden in Verbindung gebracht werden, ist es weithin anerkannt, dass die kontrollierte Erzeugung von ROS eine entscheidende Rolle bei der bakteriellen Ausrottung spielt. ROS, wie Hydroxylradikale und Superoxid-Anionen, können bakterielle Proteine, Lipide und DNA oxidieren, was letztendlich zum Membranbruch und Zelltod führt. Daher dient das Vorhandensein von ROS in moderaten Mengen als kritische Komponente der angeborenen antimikrobiellen Abwehrmechanismen. Im Rahmen der chronischen Osteomyelitis, bei der die bakterielle Besiedlung und Biofilmbildung bestehen bleibt, ist die Eliminierung von Krankheitserregern eine Voraussetzung für eine sinnvolle Geweberegeneration. Das CPG-Hydrogel bietet durch die Unterdrückung übermäßiger ROS bei gleichzeitiger Beibehaltung einer wirksamen antibakteriellen Aktivität durch CMCSMA-vermittelte Membranauflockerung und Biofilmpenetration einen ausgewogenen Ansatz. Diese Doppelfunktion stellt sicher, dass die Entzündung nicht durch anhaltende Bakterienpräsenz verlängert wird, was einen Übergang von der Immunaktivierung zu einer regenerativen Mikroumgebung ermöglicht. Anstatt also wahllos ROS zu entfernen, moduliert dieses System die oxidative Mikroumgebung, um sowohl die bakterielle Beseitigung als auch die Gewebeheilung zu unterstützen.

Neben der antimikrobiellen Aktivität wiesen die CPG-Hydrogel-Pflaster eine biologische Funktionalität auf, die für die Gewebereparatur und -regeneration entscheidend ist³¹. In-vitro-Assays zeigten, dass das Hydrogel die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen sowie die Angiogenese unterstützte. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die die Bedeutung der Angiogenese für die Wundheilung hervorgehoben^{haben 32}. Die Angiogenese ist entscheidend für die ausreichende Sauerstoff- und Nährstoffversorgung des verwundeten Gewebes und erleichtert die Geweberegeneration. Darüber hinaus sind die pro-angiogenen Wirkungen des Hydrogels besonders wichtig für die Behandlung chronischer Wunden, da diese Wunden oft unter einer schlechten Vaskularisation leiden, die den Heilungsprozess behindert^33,34. Durch die Förderung der Blutgefäßbildung trägt das CPG-Hydrogel nicht nur zur Geweberegeneration bei, sondern schafft auch ein günstigeres Umfeld für das langfristige Überleben von neu gebildetem Gewebe. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit des Hydrogels, die Migration und Differenzierung von Osteoblasten zu fördern, einen erheblichen Mehrwert im Rahmen der Knochenheilung, insbesondere für Patienten mit chronischen Knocheninfektionen oder Knochendefekten³⁵. Die Verbesserung der Osteogenese ist ein vielversprechender Weg zur Verbesserung der Ergebnisse bei Osteomyelitis und verwandten Knochenerkrankungen, bei denen die Heilung oft beeinträchtigt ist. Eine solche osteoinduktive Funktionalität, die in eine lokalisierte Infektionskontrolle integriert ist, adressiert eine zentrale Herausforderung im muskuloskelettalen Tissue Engineering: den Bedarf an konvergenten Lösungen, die sowohl die antimikrobielle Abwehr als auch die Geweberegeneration in einer einzigen Plattform fördern.

Die In-vivo-Ergebnisse bestätigen das therapeutische Potenzial der CPG-Hydrogel-Pflaster und zeigen ihre Fähigkeit, die Gewebereparatur zu unterstützen, Infektionen zu reduzieren und die Osteogenese zu fördern. In chronischen Wundmodellen erleichterten diese Hydrogele effektiv den Wundverschluss und die Geweberegeneration. In Knochenregenerationsmodellen förderte das CPG-Hydrogel die Migration und Differenzierung von Osteoblasten und verbesserte so die Knochenheilung. Diese Ergebnisse stimmen mit denen anderer Studien überein, die Hydrogel-basierte Wundheilungs- und Knochenregenerationsstrategien untersucht haben³⁶. Die Fähigkeit von CPG-Hydrogel-Pflastern, gleichzeitig Infektionen zu behandeln, die Angiogenese zu fördern und die Osteogenese zu unterstützen, bietet eine leistungsstarke Plattform für eine umfassende Wundversorgung, was sie zu einem vielversprechenden Kandidaten für den klinischen Einsatz macht.

Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse gibt es einige Einschränkungen der aktuellen Studie. Erstens: Während die In-vitro - und In-vivo-Modelle positive Ergebnisse zeigten, wurden die präklinischen Studien hauptsächlich in Mausmodellen durchgeführt. Obwohl Mäuse häufig für Wundheilungsstudien verwendet werden, können sie die Komplexität der menschlichen Wundheilung möglicherweise nicht vollständig replizieren. Daher ist eine weitere Validierung in größeren Tiermodellen sowie in klinischen Studien am Menschen erforderlich, um die Sicherheit und Wirksamkeit dieser Hydrogelpflaster in realen klinischen Umgebungen zu bestätigen. Zweitens zeigten die CPG-Hydrogele zwar kurzfristig gute mechanische Eigenschaften und biologische Funktionalität, ihre Langzeitstabilität und ihr Abbauverhalten in vivo sind jedoch unklar. Hydrogele können sich im Laufe der Zeit abbauen, und ihre Abbauprodukte können den Heilungsprozess beeinträchtigen oder sogar Nebenwirkungen hervorrufen. Zukünftige Studien sollten sich darauf konzentrieren, die Abbaurate dieser Hydrogele zu optimieren, um sicherzustellen, dass sie kontrolliert abgebaut werden, ohne schädliche Nebenprodukte freizusetzen. Darüber hinaus sollte die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Wirkstoffen, die in das Hydrogel eingebaut sind, weiter verfeinert werden, um eine nachhaltige therapeutische Wirkung über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten, insbesondere bei der Behandlung chronischer Wunden.

Während sich diese Studie auf ein hydrogelbasiertes supramolekulares Gerüst konzentriert, umfassen alternative Ansätze, um die gleiche therapeutische Hypothese zu adressieren, elektrochemische Biosensoren, mikrofluidische Wound-on-Chip-Systeme und intelligente Bandagen mit elektronischen Komponenten für die Umweltsensorik. Im Gegensatz zu Technologien, die oft Stromquellen und komplexe Schnittstellen erfordern, bietet das hier entwickelte Hydrogelpflaster jedoch eine in sich geschlossene, visuell interpretierbare Plattform ohne externe Instrumente, was es besonders attraktiv für Umgebungen mit begrenzten Ressourcen macht.

Die Bedeutung dieser Arbeit liegt in ihrem translationalen Potenzial. Über die Osteomyelitis hinaus kann die CPG-Plattform auch für andere entzündungsbedingte Erkrankungen wie diabetische Fußgeschwüre, Infektionen an der Operationsstelle und die Überwachung nach Tumorresektionen angepasst werden. Die Integration von diagnostischen und therapeutischen Funktionalitäten in einer einzigen Hydrogel-Matrix bietet eine einzigartige Gelegenheit für die Entwicklung intelligenter Wundauflagen der nächsten Generation. Darüber hinaus bietet das photonisch-kristallbasierte strukturelle Farbsystem Möglichkeiten für kolorimetrische Echtzeit-Biosensorik, die in der personalisierten Medizin anwendbar ist. Darüber hinaus ermöglicht die Modularität des CPG-Designs eine Anpassung an die zukünftige Integration mit Stammzellen, Exosomen oder Genverabreichungsvektoren, um seine regenerativen Fähigkeiten weiter zu erweitern und sich an den aktuellen Entwicklungen in der regenerativen Präzisionsmedizin anzupassen.

Mit Blick auf die Zukunft sollte sich die künftige Forschung auf mehrere Schlüsselbereiche konzentrieren. Erstens wird die Optimierung der Zusammensetzung und Struktur der CPG-Hydrogel-Pflaster entscheidend sein, um ihre Langzeitstabilität und Leistung zu verbessern. Die Modifikation der Vernetzungsdichte und die Einbeziehung anderer bioaktiver Wirkstoffe, wie Wachstumsfaktoren oder Zytokine, könnte das therapeutische Potenzial des Hydrogels für spezifische klinische Anwendungen verbessern. Zweitens könnte die Erweiterung des Anwendungsspektrums dieser Hydrogele über chronische Wunden hinaus auf andere Arten der Geweberegeneration, wie z. B. die Nerven- oder Knorpelreparatur, ihre Vielseitigkeit weiter demonstrieren. Es muss erforscht werden, wie CPG-Hydrogele auf bestimmte Wundtypen wie diabetische Geschwüre oder Druckgeschwüre zugeschnitten werden können, um ihre klinische Anwendbarkeit zu erweitern. Drittens kann die Integration neuartiger Therapien wie Stammzelltherapie oder Gentherapie mit Hydrogelpflastern deren regenerative Eigenschaften verbessern und umfassendere und effektivere Behandlungen ermöglichen. Schließlich werden groß angelegte, multizentrische klinische Studien und reale Anwendungsstudien erforderlich sein, um die Sicherheit, Herstellbarkeit, Benutzerkonformität und regulatorische Bereitschaft der CPG-Plattform zu bewerten und so ihre spätere klinische Umsetzung zu unterstützen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CPG-Hydrogelpflaster eine vielversprechende Plattform für eine fortschrittliche Wundversorgung und Geweberegeneration darstellen. Ihre Fähigkeit, Wundstress zu überwachen, auf Temperatur- und pH-Änderungen zu reagieren, antimikrobielle Eigenschaften zu zeigen und die Geweberegeneration zu fördern, bietet einen vielseitigen Ansatz für die Behandlung chronischer Wunden. Während die Ergebnisse aus präklinischen Studien ermutigend sind, sind weitere Optimierungen und klinische Validierungen erforderlich, um das Potenzial dieser Hydrogelpflaster im klinischen Umfeld voll auszuschöpfen. Zukünftige Forschungsrichtungen sollten Verbesserungen in der Materialzusammensetzung, breitere Anwendungen, die Integration mit fortschrittlichen therapeutischen Strategien und klinische Studien umfassen, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit beim Menschen zu etablieren.

In diesem Experiment verwendeten wir eine Kombination aus Methyl-CSMA-PBA als inverses Opalgerüst und temperaturempfindlichem GelMA-Hydrogel als Füllstoff und beluden es mit SA, um ein CPG-integriertes diagnostisches und therapeutisches intelligentes strukturelles Farbhydrogelpflaster zu erstellen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass dieses Hydrogelpflaster hervorragende mechanische Eigenschaften und Klebkraft aufweist. Es kann das Bakterienwachstum hemmen, die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors signifikant hochregulieren und die Spiegel von Entzündungsfaktoren herunterregulieren, wodurch es signifikante klinische Aussichten für die Behandlung von COM bietet. Darüber hinaus ist es wichtig, dass CPG aufgrund seiner Fähigkeit, Veränderungen der Temperatur und des pH-Werts am Ort der Infektion zu erkennen, eine Überwachungsfunktion bei der postoperativen Genesung von chronischer Osteomyelitis spielt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acrylamid (AM, 99%)	Sigma-Aldrich	Nr. A8887	Monomer für die Hydrogelpolymerisation
Acryloylchlorid (AC, 99%)	TCI Chemikalien	Nr. A0376	Wird in chemischen Modifikationsreaktionen verwendet
Alkalisches Aluminiumoxid (200-300 mesh)	Aladdin	A112336	Wird zur Reinigung von Methylmethacrylat verwendet
Anti-bFGF-Antikörper	Santa Cruz	SC-9084	Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von Wachstumsfaktoren
Anti-CD31-Antikörper	Abcam (Englisch)	AB28364	Immunhistochemie für den Nachweis von Gefäßmarkern
Anti-EGF-Antikörper	Sigma-Aldrich	Nr. E9644	Immunhistochemische Färbung
Anti-VEGF-Antikörper	Santa Cruz	SC-7269	Immunfluoreszenzfärbung für die Angiogenese
Bis-Acrylamid (BIS, 97%)	Sigma-Aldrich	Nr. M7279	Vernetzungsmittel im Hydrogel-Netzwerk
Zellzähl-Kit-8 (CCK-8)	Dojindo	CK04	Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen
Chitosan, Methylacrylat (CSMA-PBA)	Sigma-Aldrich	Nr. C3641	Gerüstbildung in Hydrogel-Patches
DCFH-DA Sonde	Beyotime	Nr. S0033	Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
Dimethylsulfoxid (DMSO)	China National Pharmaceutical Group Corporation	DMSO-AR	Lösungsmittel für Hydrogel-Formulierung
Escherichia coli (E. coli)	ATCC	-	Wird in antibakteriellen Tests verwendet
Fluoreszenzmikroskop	Olymp	BX53	Immunfluoreszenz und Zellbildgebung
Gelatinemethacrylat (GelMA)	Sigma-Aldrich	Nr. G1894	Temperaturempfindliche Hydrogel-Komponente
Salzsäure (HCl)	Chongqing Tianyun	HCl-AR	pH-Einstellung in der Synthese
Wasserstoffperoxid (H2O2)	Sigma-Aldrich	Nr. H1009	Induziert oxidativen Stress in den Zellen
Flusssäure (HF, 4%)	Sinopharm	H814912	Ätzen von kolloidalen Kristallen aus Siliziumdioxid
Instron Universal-Zugprüfmaschine	Instron	3345	Mechanische und Klebfestigkeitsprüfung
L929 Zellen	ATCC	CCL-1	Wird für Zytotoxizitäts- und Biokompatibilitätsassays verwendet
Leica Mikrotom	Leica	RM2235	Wird zum Paraffinschneiden von Geweben verwendet
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen)	Reagan Biotechnologie	-	In-vivo-Modell für chronische Osteomyelitis
Masson' s Trichrome Flecken-Set	Solarbio GmbH	Nr. G1340	Histologische Färbung bei Fibrose
Methylmethacrylat (MMA, 99%)	Sigma-Aldrich	Nr. M27805	Monomer für die Gerüstbildung
MTT-Assay-Kit	Beyotime	M5655	Bewertung der Zellproliferation und Zytotoxizität
Paraformaldehyd (4%)	Servicebiografie	Nr. G1101	Fixierung des Gewebes
Paraffin	Sigma-Aldrich	Nr. P1003	Einbettungsmedium für die Histologie
PBS-Puffer	Gibco	10010023	Wird in der Zell- und Hydrogelverarbeitung verwendet
Phenylalanin (99%)	Sigma-Aldrich	Nr. P5482	Wird in der chemischen Modifikation verwendet
Phenylboronsäure (PBA)	TCI Chemikalien	Nr. P0157	pH-empfindliche Komponente im Hydrogel
Kaliumpersulfat (KPS)	Peking Baolingwei	KPS-AR	Radikalischer Initiator in der Polymerisation
PrimeScript RT Reagenzien-Kit	Takara	RR047A	Wird für die cDNA-Synthese verwendet
Assay-Kit für reaktive Sauerstoffspezies (ROS)	KeyGen Biotech	KGAF019	Bewertung der antioxidativen Aktivität
Real-Time-PCR-System	Angewandte Biosysteme	StepOnePlus	Quantifizierung der Genexpression
RNAiso Plus	Takara	9108	Reagenz für RNA-Extraktion
Rheometer (HR-1)	TA Instrumente	HR-1	Rheologische Charakterisierung von Hydrogel
Salicylsäure (SA)	Sigma-Aldrich	Nr. S3254	Wirkstoffmolekül im Hydrogel
Rasterelektronenmikroskop (REM)	JEOL	JSM-7500F	Morphologische Analyse der Hydrogelstruktur
Siliziumdioxid-Nanopartikel (12 nm)	Sigma-Aldrich	637246	Bildung von kolloidalen Kristallmatrizen aus Siliziumdioxid
Natriumhydroxid (NaOH)	China National Pharmaceutical Group Corporation	NaOH-AR	pH-Einstellung
Staphylococcus aureus (S. aureus)	ATCC	-	Wird in antibakteriellen Tests verwendet
SYBR Grüner PCR-Mastermix	Angewandte Biosysteme	4367659	qPCR-Nachweis-Reagenz
UV-Lichtquelle (365 nm, 3 mW/cm²)	Herolab	UVT-28	Wird für die UV-Polymerisation verwendet
UV-Spektralphotometer	Shimadzu	UV-2600	Messung der Wirkstofffreisetzung