Methodenartikel

Eine minimalinvasive Methode zur Generierung eines syngenen orthotopen Mausmodells für Lungenkrebs

DOI:

10.3791/68676

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19. August 2025

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1Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa Health Care, 2Department of Neuroscience and Pharmacology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Department of Radiation Oncology, Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 4Free Radical Radiation Biology Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Geminii, Inc., 6Interdisciplinary Graduate Program in Molecular Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa Health Care

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine große Herausforderung bei der Entwicklung neuer Therapien für Lungenkrebs besteht darin, die Mikroumgebung des Tumors zu modellieren, wenn die regionale Erkrankung zu einer metastasierenden Erkrankung fortschreitet. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Etablierung eines orthotopen syngenen Modells von Lungenkrebs, das eine In-vivo-Verfolgung der Krankheit im Zeitverlauf ermöglicht.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist nach wie vor die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen und Männern weltweit. Es müssen mehr Informationen gesammelt werden, um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen, dem Immunsystem, der Mikroumgebung in jedem Tumor und dem Wirtsgewebe zu verstehen und effektivere Behandlungsmethoden zu entwickeln. Hier wird über eine einfache, wiederholbare Methode zur Induktion von Krebs in der Lunge von Mäusen berichtet, die die Überwachung des Tumorwachstums vom Früh- bis zum Spätstadium der Erkrankung ermöglicht. Der chirurgische Eingriff besteht aus einem kleinen oberflächlichen Schnitt in der Haut und einer Injektion von Krebszellen durch die Interkostalmuskulatur in die Lunge. In-vivo-Bildgebungssysteme (IVIS) in Kombination mit Zellen, die so verändert wurden, dass sie Luciferase exprimieren, bieten eine bequeme Möglichkeit, das Tumorwachstum und das Fortschreiten der Krankheit im Verlauf einer Studie zu bewerten. Diese Technik ist leicht auf verschiedene Modelle von Lungenkrebs übertragbar und kann verwendet werden, um die Machbarkeit und Wirksamkeit neuartiger Therapeutika in einem präklinischen Modell von Lungenkrebs zu testen, das die natürliche Tumormikroumgebung nachahmt. Dies erweitert die Relevanz sowohl von Wirksamkeits- als auch von Sicherheits-/Toxizitätsstudien mit Standardbehandlungen, einschließlich chirurgischer Resektion, Bestrahlung und Immuntherapien in Verbindung mit experimentellen Therapeutika.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lungenkrebs ist nach wie vor eine der am häufigsten diagnostizierten Krebsarten und die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Männern und Frauen weltweit 1,2,3. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht fast 90 % aller Lungenkrebsfälle in den Vereinigten Staaten aus, und obwohl sich die Behandlungslandschaft in den letzten Jahren stark verbessert hat, besteht weiterhin ein großes Interesse an der Entwicklung neuer Therapien, die die Ergebnisse verbessern4. Obwohl es viele Fortschritte bei der Entwicklung zielgerichteter Therapien für spezifische Treibermutationen und Immuntherapien für ansprechende NSCLC-Subtypen gegeben hat, ist die Fünf-Jahres-Überlebensrate insgesamt nach wie vor niedrig und liegt bei etwa 20 % für alle Stadien von Lungenkrebs 2,5,6,7. Obwohl die Immuntherapie große Fortschritte bei der Verbesserung des Überlebens bei fortgeschrittener Erkrankung gemacht hat, haben diese Verbesserungen die Nadel nur von einem Fünf-Jahres-Gesamtüberleben von 6,8 % auf 10,7 % gebracht und die Überlebenszeit von 7 Monaten auf 8 Monate verlängert8. Es besteht nach wie vor ein großer Bedarf, die Wirkmechanismen der Krankheit zu verstehen und neue Therapien zu entwickeln, die mit den aktuellen Standardtherapien zusammenwirken. Um die Mechanismen des natürlichen Verlaufs von NSCLC und des Ansprechens auf neue Therapien zu verstehen, sind präklinische Modelle erforderlich, die zuverlässig reproduzierbar und leicht zu induzieren sind und die Mikroumgebung des Tumors, in der sich der Krebs entwickelt, einkapseln.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene Verfahren entwickelt, um orthotope Modelle von Lungenkrebs bei Nagetieren zu beurteilen. Die Verfahren reichen von sehr invasiv und erfordern ein hohes Maß an Fachwissen, wie z. B. intrapulmonale Implantationen oder Transplantationsverfahren, bei denen die Brusthöhle geöffnetwird 9,10,11,12,13; mäßig invasiv wie intratracheale und orotracheale Eingriffe 14,15,16,17; bis hin zu minimalinvasiven Eingriffen, wie z. B. perkutanen Injektionen, Schwanzvenen oder intranasaler Induktion 18,19,20,21. Alle Verfahren bieten unterschiedliche Risiken und Vorteile – mit invasiveren Techniken, die eine höhere Präzision, aber potenziell höhere Abriebraten ermöglichen, und weniger invasiven Techniken, die zu einem besseren Überleben, aber einer größeren Variabilität der Tumorimplantationsstellen führen. Von diesen verschiedenen Protokollen entscheiden sich einige dafür, das Tumorwachstum nicht in vivo zu verfolgen und nur die Tumoren ex vivo zu bewerten 9,11,12,16. Von den Protokollen, die das Tumorwachstum im Laufe der Zeit verfolgen, stützen sich frühere Protokolle mehr auf Systeme wie Computertomographie (CT)14,19, Positionsemissionstomographie (PET)18 und Magnetresonanztomographie (MRT)17, während spätere Protokolle, nachdem Biolumineszenzbildgebungssysteme (BLI) und genetisch veränderte Zellen leichter verfügbar wurden, sich für die Verfolgung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit mit BLI20 entscheiden. 21. Urheberrecht

Der Zweck der Entwicklung dieses Protokolls bestand darin, die Erkenntnisse aus diesen anderen Verfahren zu nutzen und eine einfache, aber zuverlässige Methode zur Induktion eines solitären Lungentumors zu entwickeln, um das Fortschreiten des NSCLC ab dem frühen Krankheitsstadium zu untersuchen, bei dem der Tumor auf die Lunge beschränkt ist. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Methoden zur Generierung eines zuverlässigen und minimal-invasiven syngenen orthotopen Mausmodells für Lungenkrebs zu beschreiben, das mit Hilfe von In-vivo-Bildgebung überwacht werden kann und es Forschern ermöglicht, Lungenkrebs in dem Organ zu untersuchen, aus dem die Krankheit entsteht. Diese Methode ist effektiv für die Generierung sowohl orthotoper Xenotransplantat-Mausmodelle unter Verwendung menschlicher Lungenkrebszelllinien als auch syngener orthotoper Mausmodelle unter Verwendung von Lungenkrebszelllinien der Maus in Mäusen mit intaktem Immunsystem, was der Methode Vielseitigkeit verleiht, um sowohl menschliche Krebsarten als auch das komplexe Zusammenspiel von Immunsystem und NSCLC zu untersuchen.

Wir konzentrierten uns auf die Optimierung dieses Protokolls im immunkompetenten NSCLC-Mausmodell, dem Lewis Lung Carcinoma (LLC), da dieses Modell es den Forschern ermöglicht, die Reaktion des Immunsystems mit und ohne aktuelle Therapien wie Chemotherapie, Strahlentherapie, Immuntherapie und andere zielgerichtete Therapien besser zu verstehen 22,23,24,25. Das Protokoll generiert ein Modell, das repräsentativ für das Frühstadium der Erkrankung bei der Inokulation (Tumor im Lungenparenchym) und der Metastasierung gegen Ende der Studien ist, da der Tumor oft aus dem Lungenparenchym herauswächst und andere Gewebe besiedelt.

Ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung orthotoper Modelle ist die Möglichkeit, das Tumorwachstum wiederholt, mit minimalem Stress für das Tier und schnell zu verfolgen, so dass jedes Tier in einer Studie zu einem einzigen Zeitpunkt beurteilt werden kann. Während bildgebende Verfahren wie MRT oder CT eine verbesserte Auflösung des Tumors ermöglichen, sind diese Bildgebungsmodalitäten teuer, zeitaufwändig und haben Schwierigkeiten, das frühe Tumorwachstum in Kleintiermodellen wie Mäusen zu verfolgen 26,27,28,29,30,31. Daher haben wir uns entschieden, das Tumorwachstum durch Biolumineszenz mit Hilfe von Krebszellen zu überwachen, die mit Luciferase hergestellt wurden. In diesem Protokoll injizierten wir 25.000 bis 50.000 LLC-Zellen, die mit Glühwürmchen-Luziferase (LLC-luc) hergestellt wurden, und entdeckten Tumore bereits am nächsten Tag durch BLI. Die Luciferin-Luciferase-Reaktion ist ein nützliches Werkzeug, um das Tumorwachstum in vivo mit Hilfe von spektralen Bildgebungsinstrumenten zu verfolgen. Aufgrund der Empfindlichkeit dieser bildgebenden Systeme zur Verfolgung von Lichtphotonen können Krebszellen, die Luciferase exprimieren, frühzeitig in vivo verfolgt werden, oft bevor Tumore in einem Mausmodell durch MRT oder CT nachgewiesen werden können, und häufig26,32,33,34.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren mit Tieren werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Iowa überprüft und genehmigt. C57BL6/N-Mäuse (Alter 4-6 Wochen) werden gekauft und mindestens 1 Woche vor der Operation akklimatisiert. Alle Tiere befinden sich in einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus. Die Tiere sind in 4 Käfigen untergebracht und haben bis zum Zeitpunkt der Narkose vollen Zugang zu Futter und Wasser.

1. Auswahl und Wachstum von Zellen für die Injektion

  1. Führen Sie einen Luciferase-Assay durch, um eine Zelllinie auszuwählen, wie in35 beschrieben.
    1. Züchten Sie LLC-luc-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C und hoher Luftfeuchtigkeit. Führen Sie den Assay durch, wenn die Zellen zu 50 % bis 100 % konfluent sind.
    2. Waschen Sie die Zellen vor der Durchführung des Assays mit 1x PBS.
    3. Geben Sie 200 μl Lysepuffer/Vertiefung (25 mM Tris/Phosphat, 4 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 10 % Glycerin) in eine 6-Well-Platte. Kratzen Sie die Zellen aus der Vertiefung ab und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zellen bei 16.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur drehen. Vergewissern Sie sich, dass sich am Boden des Röhrchens ein kompaktes Zellpellet bildet, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.
    4. Übertragen Sie die Hälfte des Zellextrakts in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und sparen Sie es für die Proteinquantifizierung. 2 mM Dithiothreitol zur restlichen Hälfte geben und gut vermischen.
    5. Kombinieren Sie 8 μl Zellextrakt mit 2 mM Dithiothreitol mit 42 μl Assay-Puffer (25 mM Tris/Phosphat, 20 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM Dithiothreitol). Fügen Sie 50 μl 0,5-1 mM Luciferin hinzu.
    6. Messen Sie die maximale Lumineszenz, die als relative Lichteinheiten (RLU) angegeben wird, und bewerten Sie den Proteingehalt mit einer bevorzugten Proteinquantifizierungsmethode, um die Lumineszenz als RLU pro mg Protein (RLU/mg) anzugeben.
  2. Wählen Sie eine Zelllinie mit einer Lumineszenz zwischen 8.000 und 15.000 RLU/mg.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Auswahl einer höheren Luziferase-Expression (>15.000 RLU/mg), da dies das BLI-Gerät sättigen kann.

2. Vorbereitung der Zellen

  1. Züchten Sie LLC-luc-Zellen in DMEM, die mit 10 % FBS, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin ergänzt sind, in einem 5 % CO2 - Inkubator bei 37 °C und hoher Luftfeuchtigkeit für mindestens 1 Woche vor der Verwendung.
    HINWEIS: Überwachen Sie das Wachstum, um die Konfluenz auf 70 % bis 80 % zu begrenzen, und teilen Sie es bei Bedarf mit 0,25 % Trypsin-EDTA auf, um die gewünschte Menge für Injektionen zu erreichen, wie zuvorbeschrieben 36.

3. Präoperative Vorbereitung

  1. Bei Mäusen mit Fell 1 Tag vor der Operation rasieren.
  2. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer, um sie mit Isofluran zu betäuben. Stellen Sie den Sauerstoffdurchfluss auf 2,0 l/min und den Verdampfer auf 2 % Isofluran ein. Passen Sie dies basierend auf der Größe der Maus an, die induziert wird.
  3. Überwachen Sie die Atmung der Mäuse und setzen Sie einen Pedal-Entzugsreflex ein, um eine angemessene Anästhesie zu bestätigen.
  4. Platzieren Sie die Maus in einem Nasenkonus in Bauchlage auf einem von der IACUC zugelassenen Erwärmungsgerät. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit dem Pedalzurücknahmereflex richtig betäubt ist, bevor Sie fortfahren.
  5. Tragen Sie die Augensalbe auf beide Augen auf.
  6. Wenn die Maus ordnungsgemäß betäubt ist, verwenden Sie eine elektrische Haarschneidemaschine, um eine große rechteckige Fläche (2 cm x 3 cm) im linken dorsalen Teil der Maus zu entfernen. Rasieren Sie sich medial bis zur Wirbelsäule, den Tisch seitlich, bis kein Fell mehr sichtbar ist, die letzte Rippe (13.) nach unten und den oberen Rand des Schulterblatts zum Kopf hin.
  7. Setzen Sie die Maus in einen leeren Käfig auf einem von der IACUC zugelassenen Wärmegerät und beobachten Sie die Atmung der Maus, bis die Maus wach und wach ist. Bringen Sie die Maus zu diesem Zeitpunkt bis zur Operation in ihren Heimatkäfig zurück.

4. Vorbereitung der Zellsuspension für die Injektion

  1. Am Tag der Zellernte (Schritt 2.2) 3-4 h vor der Entnahme frisches Medium mit 50 mg/ml Gentamycin zugeben, um abgestorbene und abgelöste Zellen zu entfernen.
  2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Trypsin-EDTA zugeben und 1-2 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Dispergieren Sie die Zellen und fügen Sie Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
  4. Bei 1.200 × g 3 min bei Raumtemperatur schleudern. Bestätigen Sie, dass sich am Boden des Röhrchens ein kompaktes Zellpellet bildet, saugen Sie den Überstand an und waschen Sie das Pellet mit 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
  5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1x PBS bei ca. 1-2 Millionen Zellen/ml zur Zählung. Vor der Zählung durch ein 40-μm-Zellsieb filtrieren.
  6. Kombinieren Sie 10 μl Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie mit einem Hämozytometer. Machen Sie eine Zellsuspension 2x und zählen Sie beide, um die Zellzahl zu überprüfen. Berechnen Sie die Gesamtzellzahl und Viabilität.
  7. Die Zellen werden 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.200 × g heruntergeschleudert, um sie im endgültigen Injektionsvolumen zu resuspendieren. Aspirieren Sie das PBS.
  8. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 mg/ml Matrigel in 1x PBS auf die gewünschte Zellzahl pro Injektion in einem Volumen von 50 μl. Halten Sie die endgültige Zellsuspension während des gesamten Eingriffs auf Eis, um eine Verfestigung zu verhindern.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet LLC-luc-Zellen. Injizieren Sie mit 25.000 bis 50.000 Zellen in einem Volumen von 50 μl pro Maus.

5. Chirurgische Vorbereitung

  1. Führen Sie den Eingriff in einem von der IACUC zugelassenen Operationssaal für aseptische Eingriffe durch. Reinigen Sie den Operationstisch mit einem tierärztlich zugelassenen Desinfektionsmittel.
  2. Legen Sie ein desinfiziertes, von der IACUC zugelassenes Heizkissen in den Operationsbereich. Legen Sie ein steriles OP-Tuch über das Heizkissen.

6. Chirurgische Anästhesie

  1. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer, um sie mit Isofluran zu betäuben. Stellen Sie den Sauerstoffdurchfluss auf 2,0 l/min und den Verdampfer auf 2 % Isofluran ein.
    HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann je nach Größe der Maus angepasst werden.
  2. Überwachen Sie die Atmung der Maus und setzen Sie einen Pedal-Rückzugsreflex ein, um eine angemessene Anästhesie zu bestätigen.
  3. Platzieren Sie die Maus in einem Nasenkonus in der richtigen seitlichen Liegeposition auf dem sterilen OP-Tuch. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit dem Pedalzurücknahmereflex richtig betäubt ist, bevor Sie fortfahren.
  4. Präoperativ Analgetikum, Meloxicam (2 mg/kg Gewicht) subkutan und Augensalbe auf beide Augen geben.

7. Orthotope Lungeninjektion

  1. Reinigen Sie das Operationsfeld 3x, indem Sie zwischen 70%igem Ethanol und Betadin mit steriler Gaze wechseln. Platzieren Sie ein sterilisiertes gefenstertes OP-Abdecktuch mit einer 3 cm x 4 cm großen Öffnung auf der Maus. Legen Sie autoklavierte, sterilisierte Instrumente auf das OP-Tuch.
  2. Bestimmen Sie, wo der Schnitt vorgenommen werden soll, indem Sie den Schädelrand des Schulterblatts und den Schwanzrand des Brustkorbs mit einer Pinzette lokalisieren. Stellen Sie sicher, dass die Haut mit Daumen und Zeigefinger des Chirurgen straff ist, und machen Sie mit einer Klinge der Größe 10 einen oberflächlichen Schnitt von 5 mm nur durch die Haut direkt unter dem Schulterblatt.
    HINWEIS: Der Chirurg muss sterile Handschuhe tragen.
  3. Verwenden Sie eine gerade 115-mm-Schere, um das Unterhautfett von den Rippen und der Interkostalmuskulatur abzustumpfen. Schneiden Sie nicht durch die Interkostalmuskulatur.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Arteria thorakodorsale und den tiefen Ast der Arteria cervicalis transversal, die sich in der Nähe des Schulterblatts befinden, nicht zu beschädigen. Leichte Blutungen können durch das Schneiden von Kapillaren in der Haut und im Unterhautfettgewebe auftreten. Stoppen Sie die Blutung, indem Sie leichten Druck mit einem sterilisierten Applikator mit Wattespitze ausüben.
  4. Verwenden Sie eine Micro-Adson-Pinzette, um den Schnitt offen zu halten. Beginnend mit der siebten echten Rippe zählen Sie mit einer gebogenen Zange mit mittlerer Spitze nach oben, um die Rippen vier und fünf zu identifizieren. Notieren Sie sich diesen Bereich für die Injektion.
  5. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie vorsichtig 3-4x invertieren. Unmittelbar vor der Injektion verwenden Sie eine sterile 300 μl 31 G 8 mm Insulinspritze, um 50 μl der Zellsuspension aufzuziehen und sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind.
  6. Tragen Sie einen Streifen sterilisiertes, 4 mm dickes Metallband auf die Nadel auf, das bündig mit der Spritze abschließt, um als Stopfen zu dienen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nur 4 mm tief in die Lunge eindringt.
  7. Injizieren Sie die 50-μl-Zellsuspension direkt darunter in die vierte Rippe im Interkostalraum zwischen Rippe vier und fünf in einem 90°-Winkel senkrecht zur Lunge. Halten Sie die Nadel nach der Injektion der Zellsuspension 2-3 s lang an Ort und Stelle, damit das Matrigel aushärten kann und die Zellen die Injektionsstelle nicht verlassen.
  8. Entfernen Sie die Nadel langsam im gleichen Winkel und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
  9. Nähen Sie die Haut mit 2-3 Stichen, schließen Sie sie mit quadratischen Knoten und fügen Sie veterinärchirurgischen Klebstoff hinzu, um sicherzustellen, dass die Wunde ausreichend geschlossen ist.

8. Postoperative Eingriffe

  1. Platzieren Sie die Maus in einem leeren Käfig auf einem von der IACUC zugelassenen Heizgerät. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat, was 1-2 Minuten dauern sollte.
  2. Sobald die Maus wach ist und sich bewegt, setzen Sie sie in einen Käfig mit frischer Einstreu. Beobachten Sie die Maus innerhalb der ersten 24 Stunden häufig auf Anzeichen von Schmerzen oder Infektionen.
  3. Verabreichen Sie das NSAID-Analgetikum Meloxicam (2 mg/kg Gewicht) als subkutane Injektion für 2 Tage nach der Operation.

9. Überwachung des Tumorwachstums durch in vivo BLI

  1. Überwachen Sie das Tumorwachstum in der Lunge mit BLI bereits am Tag nach der Operation und bis zu einmal täglich.
  2. Führen Sie In-vivo-Bildgebung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) durch.
    1. Stellen Sie Luciferin mit 15 mg/ml in 1x PBS ohne Magnesium oder Kalzium her. Für eine 20 g Maus entspricht dies der Injektion von 200 μl der 15 mg/ml Luciferin-Lösung.
      HINWEIS: Schützen Sie die vorbereitete Luciferin-Lösung vor Licht, indem Sie sie bei Nichtgebrauch mit Aluminiumfolie abdecken, da sie lichtempfindlich ist.
    2. Öffnen Sie die Software und stellen Sie die Parameter für die Biolumineszenz-Bildgebung ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf Automatisch. Legen Sie den Binning-Faktor auf 4 fest.
    3. Injizieren Sie Mäusen intraperitoneal 150 mg Luciferin pro kg Gewicht.
    4. Wenn Sie ein neues Krebszellmodell zum ersten Mal abbilden, führen Sie eine kinetische Kurve durch, um die optimale Luziferin-Aufnahmezeit zu ermitteln, die dadurch angezeigt wird, dass die Lumineszenz ihren Höhepunkt erreicht, bevor sie ein Plateau erreicht.
      1. Injizieren Sie Mäusen Luciferin. Warten Sie 3 Minuten, bis Luciferin aufgenommen wurde.
      2. Bilden Sie Mäuse alle 5-10 min für 60 min ab.
        HINWEIS: Die optimale Aufnahmezeit für verschiedene Zelllinien variiert in der Regel zwischen 5 und 15 Minuten.
    5. Verwenden Sie für alle nachfolgenden Bildgebungssitzungen die optimale Luziferin-Aufnahmezeit. Anästhesieren Sie die Mäuse zur Vorbereitung auf die Bildgebung während dieser Zeit. Setzen Sie die Mäuse in eine Induktionskammer mit 2 % Isofluran und einer Flussrate von 2,0 l/min.
    6. Nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist, nehmen Sie zwei Bilder auf, indem Sie "Erfassen" auswählen.
      1. Stellen Sie sich zunächst vor, wie die Maus in der richtigen seitlichen Liegeposition liegt. Auf diese Weise kann die Kamera die Injektionsstelle erfassen, die sich im linken seitlichen Teil der Maus befindet. Verwenden Sie diese Ansicht, um das Tumorwachstum zu quantifizieren. Bilder, die in dieser Position aufgenommen wurden, werden von hier an als linke Seitenansicht bezeichnet.
      2. Unmittelbar nachdem das erste Bild fertig ist, nehmen Sie ein zweites Bild der Maus in Rückenlage auf. Auf diese Weise kann die Kamera die vom Tumor in der Brusthöhle emittierten Photonen aus der ventralen Ansicht erfassen. Verwenden Sie diese Ansicht (hier als ventrale Ansicht bezeichnet), um die Lokalisation des Krebses innerhalb der Brusthöhle abzuschätzen.
  3. Um die Bilder zu analysieren, ändern Sie die Einheiten von "Anzahl" in "Strahlstärke".
  4. Öffnen Sie die Werkzeugpalette. Gehen Sie zu Image Adjust und wählen Sie Manuell. Wählen Sie ein Minimum und Maximum für den Farbbalken, der am besten zu den aufgenommenen Bildern passt.
  5. Öffnen Sie ROI-Tools. Wählen Sie das Dropdown-Menü "Kreis" aus, um dem Bild einen ROI-Kreis (Region of Interest) hinzuzufügen. Verschieben Sie den Kreis über den Schnitt für die linke Seitenansicht und über die Mitte des Brustkorbs für die Bauchansicht.
  6. Wählen Sie ROIs messen aus.

10. Bewertung der Ein- und Ausschlusskriterien

  1. Bestätigen Sie zunächst das Vorhandensein von Tumorlumineszenz in der Lunge, indem Sie das linke Bild in der Seitenansicht betrachten.
  2. Bestätigen Sie als Nächstes das Vorhandensein von Tumorlumineszenz in der linken Brusthöhle in der ventralen Ansicht. Vergewissern Sie sich dann, dass es nur eine einzige Lumineszenzstelle in der ventralen Ansicht gibt.
  3. Wenn diese beiden Kriterien (Schritte 10.1, 10.2) erfüllt sind, ist die Bewertung auf Ausschlusskriterien durchzuführen, indem sichergestellt wird, dass die Lumineszenz die Mittellinie in der Brusthöhle im ventralen Ansichtsbild nicht überschreitet. Wenn nach zwei aufeinanderfolgenden IVIS-Bildern über einen Zeitraum von 4 Tagen nach der Operation keine Lumineszenz im linken Seitenbild nachweisbar ist, schließen Sie diese Maus von weiteren Studien aus, da die Krebszellen wahrscheinlich nicht aufgenommen haben.

11. Beurteilung von Tumoren am Ende der Studien

  1. Wenn der Gesamtfluss der Tumorlumineszenz 1 × 108 Photonen/s (p/s) oder mehr erreicht, entnehmen Sie die Mäuse für die Endpunktbewertung.
  2. Entnehmen Sie den Tumor für die grobanatomische Analyse oder Histologie, indem Sie die folgenden Schritte zur Anästhesie und Perfusion der Lunge durchführen, wie zuvorbeschrieben 37.
    1. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer, um sie mit Isofluran zu betäuben. Stellen Sie den Sauerstoffdurchfluss auf 2,0 l/min und den Verdampfer auf 2 % Isofluran ein. Überwachen Sie die Atmung der Maus und setzen Sie einen Pedal-Rückzugsreflex ein, um eine angemessene Anästhesie zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann je nach Größe der Maus angepasst werden.
    2. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage in einem Nasenkonus. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit dem Pedalzurücknahmereflex richtig betäubt ist, bevor Sie fortfahren.
    3. Öffnen Sie die Brusthöhle der Maus, um die Lunge und das Herz hinter dem Zwerchfell sichtbar zu machen.
    4. Machen Sie einen langen vertikalen Schnitt nach unten entlang der Mittellinie der Maus. Bewegen Sie den Darm, um die linke Nierenarterie sichtbar zu machen.
    5. Schneide durch das Zwerchfell, um das Herz sichtbar zu machen.
    6. Schneiden Sie die linke Nierenarterie durch.
    7. Injizieren Sie ca. 5-10 ml 1x PBS durch den rechten Ventrikel des Herzens mit einer Geschwindigkeit von ca. 5 ml/min.
    8. Mache einen Schnitt entlang des Halses. Entfernen Sie jegliches Unterhautfett, das sich über der Luftröhre befindet. Achten Sie darauf, die Luftröhre nicht zu durchtrennen.
    9. Durchstechen Sie die Luftröhre parallel mit einer Nadel, um 10% Formalin direkt in die Luftröhre zu injizieren, um die Lunge aufzublasen und zu fixieren.
    10. Verschaffen Sie sich die Lunge aus der Brusthöhle, indem Sie die Luftröhre oberhalb der Lungenspitze durchtrennen und die Pleura und die Bänder, die die Lunge mit der Brusthöhle verbinden, durchtrennen.
    11. Zum Fixieren 10% Formalin hinzufügen.

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Ergebnisse

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In dieser Studie wurden C57BL6/N-Mäuse gemäß dem vorgestellten Protokoll injiziert (Abbildung 1). Es wurden LLC-Zellen verwendet, die gentechnisch verändert wurden, um Luciferase (LLC-luc) zu exprimieren. Zusätzlich wurde einer Scheinmaus Matrigel ohne Krebszellen injiziert. Die BLI bei IVIS kann bereits 1 Tag nach der Operation eingeleitet werden. Diese LLC-luc-Studie wurde auf BLI optimiert, um Lungenkrebs im Frühstadium zu beurteilen. Das in diesem Artike...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes, minimal-invasives Verfahren, das schnelle Genesungszeiten und eine nahezu sofortige Tumorüberwachung ermöglicht, was sich von den zuvor beschriebenen chirurgisch intensiveren Methodenunterscheidet 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C.H. und C.S.C. sind Gründer von Geminii, Inc. Die Bedingungen dieser Vereinbarung wurden vom University of Iowa Conflict of Interest in Research Office geprüft und genehmigt. Alle anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Mitgliedern der Labore in Carter und Sheffield, Susan Walsh, Bryan Allen und Kranti Mapuskar für die wertvollen Gespräche. Wir möchten uns auch bei Samantha Eckley, leitende klinische Tierärztin im Office of Animal Resources, für ihre Anleitung und ihren Rat bedanken. Wir möchten uns für die Verwendung des IVIS Lumina S5 Imaging Systems an der Small Animal Imaging Core Facility bedanken, einer zentralen Ressource, die von der Abteilung für Radiologie der University of Iowa unterstützt wird. Grafische Illustrationen von Figuren, die mit Biorender (https://biorender.com) erstellt wurden. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der National Institutes of Health NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Free Radical Radiation Biology Program NCI T32CA078586 (S.C.H.), IVIS Lumina S5 Imaging System, das auf 1S10OD026835 erworben wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-056
10 % neutrales gepuffertes FormalinVWR16004-112
100 mm x 20 mm Gewebekultur-behandelte SchalenDot Scientific Inc.667621
190 Proof reines EthanolDecon Labs2801
3/10 ml Insulinspritze mit BD Ultra-Fine Nadel 31 G x 5/16 Zoll.Beckton Dickinson328438
3M Vetbond3M1469SB
ATPSigmaA5394
Betadin-Lösung 10 % Povidon-Jod AntiseptikumArvio Health L.P.67618-150-04
C57BL6/N MäuseCharles River Laboratories
Cell Strainer 40um Nylon Falke352340
KompaktanästhesiemaschineVetamac Anästhesie 
Ferninfrarot-Wärmepad mit ControllerKent Scientific Corporation 
Konventioneller chirurgischer Klingengriff, Größe 3Brad-Parker371030
Gebogene Mittelpunkt-UniversalzangeFisherbrand16-100-110
DithiothreitolResearch Products InternationalD11000
D-Luziferin (Natriumsalz)Cayman Chemical14682
Vorhang, chirurgisch 18" x 26" Nicht gefenestratiert, sterilGeteilt783410
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (1x)Gibco11965-092
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1xGibco14190-144
EGTASigmaE3389
Fetales RinderserumGibcoA5670402
FL150 Lichtquelle des GlasfasermikroskopsMeiji 
Gentamycin-SulfatlösungIBI ScientificIB02030
GlycerinResearch Products InternationalG22025
IsofluranePrimal Pharma Limited66794-013-25
IVIS Lumina S5PerkinElmer 
Living Image SoftwarePerkinElmer 
LL/2 (LLC1)ATCCCRL-1642Verwenden Sie die Krebszelllinie, die am besten zu den Bedürfnissen der Studie passt.
MagnesiumsulfatFisher ScientificM63
Matrigel-Basementmembran-MatrixCorning354234
Mayo-Hegar-Nadelhalter, 6", gezackte KieferMiltex8-44TC
Micro-Adson-TangetteFeine wissenschaftliche Werkzeuge10018-12
N5 Hundepfotentrimmer mit doppelten KlingenOneisall 
Nicht-sterile 12-lagige MullschwämmeNDCP157112
Optixcare AugengleitgelAventix5914304
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Perma-Hand Seidennaht 6-0 1 x 18"Ethicon K802H
Phosphorsäure 85 %Fisher ScientificA242
Skalpellklinge Größe 10, Edelstahl, sterilCincinnati Surgical110
Schraubverschlussrohr konisch 50 mLSarstedt62.547.100
Gewebeschere 4,5" Staight PremiumOnsungSCT115
Triton X-100SigmaT6878
Trizma-BasisSigmaT1503
Trypan Blue Stain (0,4 %)Gibco15250-061
Vielseitiges Aluminiumfolienband mit FutterIPGALF150L
Applikatoren mit Holzschäft-BaumwollspitzenNDC76200

Referenzen

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