Methodenartikel

Ein orthotopes Xenotransplantat des Ischiasnervs für Neurofibromatose Typ 1 Neurofibrome

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DOI:

10.3791/68694

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10. Oktober 2025

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1Institut Cochin, Inserm U1016, CNRS UMR8104, Université Paris Cité, CARPEM, 2Institut Curie, INSERM U934/CNRS UMR 3215, Paris Sciences et Lettres Research University, Sorbonne University, 3Laboratory of preclinical investigation, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 4Faculty of Pharmaceutical and Biological Sciences, Paris Cité University, 5Genetics Department, Institut Curie, 6Department of Plastic Surgery, Hôpital Ambroise Paré, APHP (Assistance Publique-Hôpitaux de Paris), 7Université Versailles Saint Quentin en Yvelines

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) führt zu gutartigen Tumoren der peripheren Nervenscheide (Neurofibrome), die für ihr Wachstum eine spezifische Nervenmikroumgebung benötigen. Es wurde ein optimiertes orthotopes Xenotransplantatmodell entwickelt, bei dem intraneurale Injektion von humanen Schwann-Zellen in NSG-Mäuse verwendet wurde. Dieses Modell rekapituliert humane Neurofibrome und bietet eine wertvolle Plattform zur Evaluierung therapeutischer Strategien.

Zusammenfassung

Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine genetische Störung, die durch pathogene Varianten im NF1-Gen verursacht wird und zum Verlust der Neurofibromin-Funktion und zur Entwicklung von gutartigen Tumoren der peripheren Nervenscheide, den sogenannten Neurofibromen, führt. Während gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) unser Verständnis der NF1-Pathophysiologie verbessert haben, gelingt es ihnen oft nicht, die spontane Tumorgenese und die Komplexität der Mikroumwelt von patienteneigenen Neurofibromen zu replizieren. Eine zentrale Herausforderung bei der Modellierung gutartiger Neurofibrome ist ihre Abhängigkeit von der Nervenmikroumgebung, die mit herkömmlichen Xenotransplantat-Ansätzen nicht rekapituliert wird. In dieser Arbeit wurde ein optimiertes orthotopes Xenotransplantatmodell für NF1-assoziierte Neurofibrome entwickelt. Unter Verwendung der intraneuralen Injektion von immortalisierten, aus Neurofibromen gewonnenen menschlichen Schwann-Zellen in den Ischiasnerv von immundefizienten NSG-Mäusen rekapituliert dieses Modell Schlüsselmerkmale der menschlichen Neurofibrombiologie, einschließlich des nervenabhängigen Wachstums und der Wechselwirkungen zwischen Tumormikroumgebung. Dieses Protokoll ermöglicht eine dynamische Echtzeit-Überwachung des Tumorverlaufs mittels Biolumineszenz-Bildgebung und bietet eine reproduzierbare und quantitative Methode zur Beurteilung des Neurofibromwachstums. Im Gegensatz zu GEMMs ermöglicht dieses Modell eine kontrollierte Tumorinitiierung und eine präzise Evaluierung präklinischer Therapiestrategien. Darüber hinaus dient es als Brücke zwischen GEMMs und patienteneigenen Xenotransplantatmodellen, wodurch die translationale Relevanz der Neurofibromforschung erhöht wird. Indem es ein physiologisch relevantes Setting für die Untersuchung von Tumor-Nerven-Interaktionen bietet, bietet dieses Modell eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der Neurofibrombiologie und die Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen. Zukünftige Verfeinerungen, einschließlich der Integration von Immunkomponenten oder fortschrittlicher Bildgebungstechniken, könnten die Anwendung in der NF1-Forschung weiter verbessern.

Einleitung

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine genetische Störung, die durch pathogene Varianten im NF1-Gen verursacht wird und zum Funktionsverlust von Neurofibromin führt, einem wichtigen Tumorsuppressor, der den RAS-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Signalwegherunterreguliert 1. NF1 ist ein Tumorprädispositionssyndrom2 mit wichtigen klinischen Manifestationen, die das Nervensystem, die Haut und das Skelettsystem betreffen und hauptsächlich Gewebe der Neuralleiste betreffen. Ein Kennzeichen von NF1 ist die Entwicklung von gutartigen Tumoren des peripheren Nerven, die als Neurofibrome bekannt sind. Diese Tumoren bestehen hauptsächlich aus Schwann-Zellen, die eine biallelische NF1-Inaktivierung (NF1-/-)3 beherbergen, zusammen mit anderen stromalen Elementen wie NF1+/- Fibroblasten, perineurialen Zellen, Immunzellen und extrazellulären Matrixkomponenten4.

Tiermodelle sind essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie des Neurofibroms und für die Erprobung therapeutischer Strategien. Mäuse, die homozygot für eine Nf1-Knockout-Mutation (KO) (Nf1-/-) sind, starben in utero; Nf1+/− Mäuse sind lebensfähig, fruchtbar und krebsanfällig, wie ihre menschlichen Gegenstücke5. Diese Tiere entwickeln jedoch keine charakteristischen Merkmale der menschlichen NF1-Krankheit: Nf1+/−-Mäuse zeigten weder Pigmentanomalien noch Neurofibrome. In den letzten zehn Jahren wurde eine Vielzahl von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs) etabliert, um einige der Symptome durch bedingte KO-Ansätze unabhängig voneinander zu modellieren. Einige GEMMs wurden entwickelt, um die Bildung von Neurofibromen durch bedingte Inaktivierung von Nf1 in Schwann-Zell-Vorläufern zu induzieren 6,7,8.

Während diese GEMMs unser Verständnis von NF19 erheblich verbessert haben, erfordern ihre phänotypische Komplexität und Heterogenität alternative und komplementäre Mausmodelle für therapeutische Assays. Orthotope Xenotransplantate stellen eine wertvolle Alternative dar, indem sie es ermöglichen, menschliche Zellen direkt in ihre angestammte anatomische Nische zu implantieren und so ein physiologisch relevanteres Modell zu bieten. Die meisten auf Xenotransplantaten basierenden Studien konzentrierten sich jedoch auf maligne Tumoren der peripheren Nervenscheide (MPNSTs)10, wahrscheinlich weil die Neurofibrome nicht ektopisch transplantieren, was eine Lücke bei der Modellierung gutartiger Tumoren hinterlässt.

Diese Studie beschreibt ein neuartiges orthotopes NF1-Neurofibrommodell, das auf der intraneuralen Injektion von immortalisierten Neurofibrom-abgeleiteten humanen Schwann-Zellen (hTERT NF1 ipNF04.4 CVCL_UI78 Zelllinie) in den Ischiasnerv von NOD SCID gamma (NSG) immundefizienten Mäusen basiert. Dieser Ansatz nutzt die Vorteile der nativen Nervenmikroumgebung voll aus und ermöglicht eine gutartige Tumorbildung, während er gleichzeitig eine dynamische Überwachung durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ermöglicht.

Dieses Protokoll zielt darauf ab: (1) ein reproduzierbares orthotopes Neurofibrommodell für NF1 zu etablieren, (2) eine robuste präklinische Plattform zur Untersuchung von Tumor-Nerven-Interaktionen und zur Evaluierung neuartiger Therapien bereitzustellen und (3) die Lücke zwischen GEMMs11,12 und patienteneigenen Xenotransplantaten (PDX)13 zu schließen, indem ein intermediäres, kontrolliertes experimentelles System angeboten wird. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Tumorentwicklung - typischerweise innerhalb von 5 Tagen nach der Injektion - ohne die Erzeugung transgener Mauslinien, wodurch die Zugänglichkeit von Xenotransplantaten mit der anatomischen Relevanz der orthotopen Platzierung kombiniert wird.

Dieses Neurofibrom-Orthotop-Zelllinien-abgeleitete Tumor-Xenotransplantat (CDX)-Mausmodell bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Im Gegensatz zu GEMMs, die auf genetischen Veranlagungen beruhen, um die Tumorgenese voranzutreiben, ermöglicht dieses Modell eine direkte Kontrolle über die Tumorentstehung und -progression.

Das Protokoll der orthotopen Transplantation von malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs)10 wurde an die Modelle der gutartigen Neurofibrome angepasst. Dies stellt einen bedeutenden Fortschritt in der translationalen NF1-Forschung dar, mit potenziellen Anwendungen bei der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele und der Erprobung innovativer Behandlungsstrategien.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Institut Curie CEEA-IC #118 (Genehmigung #50186 von der nationalen Behörde) in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien überprüft und genehmigt und von geschultem Personal nach ethischen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt. NOD SCID gamma (NSG) Mäuse (NOD. Cg-Prkdc Il2rg/SzJ) wurden für diese Studie ausgewählt, da sie eine schwere Immundefizienz aufweisen, die eine erfolgreiche Transplantation humaner Zellen ermöglicht. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Tiermodells und der Zelllinie

  1. Führen Sie am Tag vor der Transplantation eine Haarentfernung an der Operationsstelle mit einem Elektrorasierer durch, um das Verfahren für große Kohorten von NSG-Mäusen zu optimieren.
  2. Um eine beidseitige Beeinträchtigung der Hintergliedmaßen zu verhindern, injizieren Sie in allen Experimenten nur einen Ischiasnerv (linke Seite) pro Maus. Überwachen Sie Mäuse auf Anzeichen von Stress, Gewichtsverlust und motorischen Defiziten.
  3. Lassen Sie die Mäuse nach dem Eingriff auf einem Heizkissen in einem Käfig ohne Einstreu vollständig genesen, um ein versehentliches Einatmen von Einstreu zu verhindern. Sobald die Mäuse voll beweglich sind und keine Anzeichen von Benommenheit zeigen, setzen Sie sie wieder in die Tiereinrichtung ein.
  4. Verwenden Sie für die Xenotransplantation die NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78)-Zelllinie, eine hTERT-immortalisierte humane Schwann-Zelllinie, die von einem NF1-Patienten abstammt14. Diese Zellen wurden stabil mit einem CMV-Luziferase-Konstrukt, pLenti CMV Puro LUC (w168-1), transduziert, was eine longitudinale Nachverfolgung über BLI unter Verwendung eines kommerziellen Luziferase-Assay-Systems ermöglichte.
  5. Halten Sie Zellen in DMEM, ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C mit 5 % CO2. Erweitern Sie die Zellen auf 80 % Konfluenz, um optimale Wachstumsbedingungen aufrechtzuerhalten.
  6. Am Tag der Transplantation trypsinisieren die Zellen (≤4 min bei 37 °C); Zählen und resuspendieren Sie sie bei 5 × 103 Zellen in 4 μl pro Maus.

2. Chirurgisches Verfahren bei der orthotopen Xenotransplantation

  1. Präoperative Vorbereitung
    1. Bereiten Sie die Operationsstation vor der Narkoseeinleitung vor, indem Sie den Arbeitsbereich gründlich desinfizieren. Decken Sie alle Kontaktflächen des Operationsmikroskops und des Beleuchtungssystems mit einer sterilen transparenten Folie ab und stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente zuvor durch Autoklavieren sterilisiert wurden.
    2. Behandeln Sie Mäuse 30 Minuten vor der Operation mit subkutanem Buprenorphin (0,1 mg/kg), um eine adäquate Anfangsanalgesie zu gewährleisten.
    3. Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (15 mg/kg), frisch in steriler Kochsalzlösung zubereitet und basierend auf dem Körpergewicht angepasst (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkneifreflex, bevor Sie fortfahren.
    4. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs mit einem Heizkissen aufrecht, einschließlich Anästhesie, Transplantation und Erholung.
    5. Tragen Sie Gleittropfen auf die Augen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
  2. Ablauf der Injektion
    1. Legen Sie die Maus auf die rechte Seite, wobei die Hinterbeine vorsichtig gespreizt sind. Decken Sie den Operationsbereich mit einem sterilen Tuch ab, bevor Sie mit dem Schnitt beginnen.
    2. Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld mit Povidon-Jod vor.
    3. Schnitt und Dissektion: Machen Sie mit einer feinen Schere einen kleinen Hautschnitt (~5 mm) parallel zum Oberschenkelknochen. Trennen Sie vorsichtig den darunter liegenden Muskel, um den Ischiasnerv freizulegen: Trennen Sie die Muskelschichten mit einer feinen Pinzette und einer Mikroschere sanft und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Identifizieren Sie den Ischiasnerv als eine weiße, schnurartige Struktur, die sich medial des Oberschenkelknochens befindet.
    4. Bewahren Sie die Zellsuspension in einem 1,5-ml-Röhrchen auf und schnippen Sie vorsichtig, um alle abgesetzten Zellen wieder zu resuspendieren. Laden Sie 4 μl der Zellsuspension in eine 10 μl Hamilton-Spritze mit einer 33-G-Nadel (die gewählt wurde, um das Nerventrauma zu minimieren und gleichzeitig eine hohe Zellviabilität zu erhalten).
      1. Führen Sie die Nadel parallel zur Ischiasnervenachse (um eine Perforation zu verhindern) bis zu einer Tiefe von ~2 mm ein. Beginnen Sie langsam mit der Injektion, um Druck und einen Spalt zwischen dem Nerv und der peripheren Hülle zu erzeugen. Schieben Sie die Nadel langsam weitere 4 bis 5 mm vor. Injizieren Sie dann langsam die Suspension, während Sie die Nadel aus dem Nerv zurückziehen. Vermeiden Sie jegliche Anspannung oder Bewegung des Nervs.
      2. Führen Sie den Eingriff durch, ohne den Ischiasnerv zu dehnen, um Schäden zu vermeiden, und verwenden Sie keine Klemmen. Warten Sie 10-15 s, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen, um den Reflux zu minimieren.
    5. Stellen Sie nach der Injektion sicher, dass der Ischiasnerv an der Injektionsstelle leicht geschwollen erscheint, ohne Leckagen oder Verfärbungen. Eine erfolgreiche Injektion wird durch ein stabiles Nervenbild ohne Extravasation angezeigt.
    6. Verschließen Sie den chirurgischen Schnitt mit 3 bis 4 einfachen unterbrochenen Nähten mit nicht resorbierbarem Material (3-0, 30 mm, 3/8 c), um Entzündungen an der Operationsstelle zu vermeiden. Wenn die Operation länger als 10 Minuten dauert, verabreichen Sie 1 ml Ringer-Laktat (s.c.). Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) am Ende des Tages verabreichen.
    7. Markieren Sie jede Maus zur eindeutigen Identifizierung mit einem Ohrlocher oder Etikett unmittelbar nach der Operation und vor der Genesung von der Narkose.
    8. Lassen Sie die Mäuse sich in einer temperaturkontrollierten Umgebung erholen und überwachen Sie sie auf postoperative Komplikationen.

3. Biolumineszenz-Bildgebung zur Transplantation und Überwachung des Tumorwachstums

  1. Um die erfolgreiche Transplantation und das Fortschreiten des Tumors zu beurteilen, führen Sie BLI zu mehreren Zeitpunkten durch. Verwenden Sie für die In-vivo-Überwachung ein In-vivo-Bildgebungssystem , um das Licht zu erfassen, das von der enzymatischen Reaktion zwischen der Glühwürmchen-Luziferase, die von den Tumorzellen exprimiert wird, und ihrem Substrat D-Luciferin emittiert wird. Dieser Ansatz lieferte eine genaue Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Tumoraktivität und bot wertvolle Einblicke in die Tumordynamik im Laufe der Zeit.
  2. Quantifizierung von Biolumineszenzsignalen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Transplantation, einschließlich der Tage 5, 12, 19, 26, 30 und 33 nach der Transplantation (Abbildung 1). In der Regel werden fünf Mäuse gleichzeitig abgebildet, um den Prozess zu rationalisieren und die Konsistenz der Messungen zu wahren.

4. Einrichtung der Bildgebung

  1. Betäuben Sie Mäuse während der Bildaufnahme mit 2% Isofluran und verwenden Sie ein Heizkissen, das in den IVIS-Imager integriert ist.
  2. Positionieren Sie die Mäuse konsistent in der gleichen Ausrichtung und bilden Sie sie 10 Minuten nach der intraperitonealen Injektion von D-Luciferin in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht ab (Stammkonzentration: 15 mg/ml in PBS, frisch zubereitet und filtriert).
  3. Nehmen Sie das Bild mit der Datenerfassungssoftware 1 Minute lang auf und stellen Sie sicher, dass während des Vorgangs keine Pixel gesättigt werden.
  4. Messen Sie die Intensität des Biolumineszenzsignals als relative Photonenzahl/s. Verwenden Sie das Bildgebungssystem mit den folgenden Einstellungen: Belichtungszeit: Automatisch; Einteilung: Mittel; Blende: 1,2; Sichtfeld: 12,5 cm; Software: Living Image Software v4.7.3.
  5. Messen Sie die Lichtemission von Tumorregionen, die als relative Photonenzahl pro Sekunde angegeben wird, mit proprietärer Software. Visualisieren Sie die Biolumineszenzintensität mithilfe von Pseudofarbskalierungen, die gleichzeitig aufgenommene Schwarzweißbilder überlagert werden.

5. Kriterien für den Erfolg der Transplantation

  1. Mäuse sind auszuschließen, wenn sie keine nachweisbare Biolumineszenz aufweisen oder wenn das Signal mit der Zeit abnimmt.
  2. Eingeschlossen sind nur Mäuse mit einem fortschreitenden Anstieg der Lumineszenz zwischen Tag 5 und 12.
  3. Fahren Sie mit der Tumorüberwachung mit Biolumineszenz-Bildgebung fort, wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben.

Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde erfolgreich ein orthotopes Ischiasnerv-Tumormodell in NSG-Mäusen mit immortalisierten Neurofibrom-abgeleiteten Zellen etabliert (ipNF04.4). Die Biolumineszenz-Bildgebung mit D-Luciferin zeigte bereits am 5. Tag eine klare Lokalisation des Tumors im Ischiasnerv mit Hinweisen auf ein exponentielles Wachstum im Laufe der Zeit. Die Transplantation war bei 90% (37/41) der injizierten Mäuse erfolgreich. Die Tumorprogression wurde an den Tagen 5, 12, 19, 26, 30 und 33 überwacht (Abbildung 1A), und während des gesamten Überwachungszeitraums wurden keine unspezifischen Signale beobachtet. Die Mäuse wurden am Tag 33 gemäß den institutionellen Richtlinien beim ersten Anzeichen von Stress oder übermäßiger Tumorbelastung eingeschläfert. Bei der Dissektion schien der Tumor gut entwickelt und in den Ischiasnerv integriert zu sein, ohne Anzeichen einer Abszessbildung (Abbildung 1B). Bemerkenswert ist, dass Mäuse unmittelbar nach der Genesung von der Narkose eine normale Gehfähigkeit zeigten.

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Abbildung 1: Biolumineszenz-Bildgebung und makroskopische Analyse von orthotopen Xenotransplantaten des Ischiasnervs in NSG-Mäusen. (A) Longitudinale Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von zwei NSG-Mäusen, die intraneural mit ipNF04.4-Zellen in den linken Ischiasnerv injiziert wurden. Die Bilder wurden an den Tagen 5, 12, 19, 26, 30 und 33 nach der Injektion aufgenommen und veranschaulichen das fortschreitende Tumorwachstum im Laufe der Zeit bei denselben Mäusen. Die Zunahme der biolumineszierenden Signalintensität spiegelt die erfolgreiche Transplantation und Tumorexpansion innerhalb der Nervenmikroumgebung wider. (B) Makroskopische Ansicht des Ischiasnervs am Tag 33 nach der Transplantation, die einen gut entwickelten, integrierten Tumor ohne Anzeichen von Abszessbildung zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Mikroaufnahme der Transplantatstelle dieser Maus, die das Tumorwachstum und die fokale Invasion zeigt. Paraffineingebettete Gewebeschnitte, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Es werden Beispiele für typische Tumoren von drei Mäusen gezeigt. Maßstabsbalken: 2000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Körpergewichtsentwicklung von NSG-Mäusen (n=15) im Verlauf des Xenotransplantat-Experiments. Es wurde kein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

Die erfolgreiche Etablierung eines orthotopen Neurofibrom-Zelllinien-abgeleiteten Xenotransplantat-Modells (CDX) in NSG-Mäusen stellt einen bedeutenden Fortschritt in der NF1-Forschung dar und behebt die wichtigsten Einschränkungen bestehender Modelle. Das Protokoll bestätigt, dass humane immortalisierte NF1-assoziierte Schwann-Zellen (ipNF04.4)14,15,16 effizient in den Ischiasnerv immundefizienter Mäuse transplantiert werden können, was zu einer reproduzierbaren Tumorentwicklung in einer physiologisch relevanten Mikroumgebung führt. Orthotope Xenotransplantate von Schwann-Zelllinien wurden in den ursprünglichen Studien zur Etablierung humaner Schwann-Zelllinienerwähnt 14,15, und ein detailliertes Protokoll wird hier bereitgestellt.

Der Schlüssel zum Erfolg dieses Protokolls war die sorgfältige Vorbereitung und Überwachung sowohl der zellulären Komponenten als auch der Wirtstiere. Während des Eingriffs wurde die Anästhesie sorgfältig kontrolliert, um sicherzustellen, dass die Mäuse ohne nennenswerten Stress in einem angemessenen Narkosezustand gehalten wurden. Um mögliche Schäden zu minimieren, wurde der Ischiasnerv nicht mit Klemmen oder Zangen gedehnt, und es wurde sehr darauf geachtet, mechanische Belastungen des Gewebes zu vermeiden. Die Verwendung von Luciferase-basierter BLI ermöglichte eine nicht-invasive, longitudinale Überwachung des Tumorwachstums und lieferte quantitative und reproduzierbare Daten. Diese bildgebende Strategie bestätigte nicht nur die Lebensfähigkeit des Transplantats, sondern ermöglichte auch die Identifizierung früher Abweichungen in der Tumordynamik. Das Fehlen eines signifikanten Gewichtsverlusts (ergänzende Abbildung 1), einer motorischen Dysfunktion oder anderer Anzeichen von Stress bei den Mäusen unterstreicht die Vereinbarkeit dieses Protokolls mit den ethischen Prinzipien des Tierschutzes und den 3Rs (Replacement, Reduction, Refinement).

Im Vergleich zu GEMMs, die auf einer bedingten Nf1-Inaktivierung 6,7,9 beruhen, bietet dieser Ansatz mehrere deutliche Vorteile. GEMMs erfordern spezifische genetische Modifikationen, replizieren jedoch möglicherweise nicht vollständig die komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen, die bei menschlichen Neurofibromen beobachtet werden 1,17. Dieses Modell ermöglicht die direkte Untersuchung menschlicher Schwann-Zellen in ihrer nativen Nervennische unter Beibehaltung zellextrinsischer Faktoren4. Im Gegensatz zu GEMMs, bei denen sich Tumore im Laufe der Zeit unvorhersehbar entwickeln, ermöglicht das Xenotransplantat-Modell eine präzise raumzeitliche Kontrolle der Tumorbildung. Dieses Modell bietet eine schnelle und reproduzierbare Plattform für die Erprobung von Therapiekandidaten, wobei BLI eine Echtzeitüberwachung der Tumorprogression und des Ansprechens auf die Behandlung ermöglicht.

Darüber hinaus stimmen diese Ergebnisse mit früheren Studien zu MPNSTs überein, in denen gezeigt wurde, dass orthotope Xenotransplantation die Genauigkeit von Tumormodellen verbessert5. Gutartige Neurofibrome stellen jedoch besondere Herausforderungen dar, da ihr Wachstum stark von spezifischen Nerveninteraktionen abhängt, die herkömmliche subkutane Transplantationsmethoden nicht rekapitulierenkönnen 6. Die Ergebnisse bestätigen, dass die intraneurale Injektion ein optimales Umfeld für die nachhaltige Entwicklung von Neurofibromen bietet.

Daher kann dieses In-vivo-Modell als relevante ergänzende Alternative zu GEMMs für präklinische therapeutische Tests angesehen werden. Es gibt jedoch Einschränkungen für das Modell. Humane Schwann-Zellen, die von Neurofibromen abstammen, wurden immortalisiert und weisen einen Tumorphänotyp auf, der als aggressiver als der eines plexiformen Neurofibroms angesehen werden könnte, mit dichter Zellproliferation (Abbildung 2). Bei Tieren wurden keine Hinweise auf eine Fernverbreitung beobachtet, und eine vollständige maligne Transformation wurde nicht nachgewiesen. Weitere Studien sind erforderlich, um zu zeigen, ob der Zellphänotyp dem "intermediären" Phänotyp entsprechen könnte, der an atypische Neurofibrome erinnert, wie z. B. atypische neurofibromatöse Neoplasien mit unbekanntem biologischem Potenzial (ANNUBP)18. Eine weitere entscheidende Einschränkung des Modells liegt in seiner Abhängigkeit von immundefizienten Mäusen. Das Fehlen eines adaptiven Immunsystems bei NSG-Mäusen schränkt die Untersuchung von Immun-Tumor-Interaktionen ein, die zunehmend als Schlüsselfaktoren für die Neurofibrombiologie anerkannt werden 7,19,20,21. Zukünftige Verfeinerungen könnten humanisierte Mausmodelle oder alternative Strategien einbeziehen, um die immunologischen Aspekte der Krankheit besser zu erfassen. Darüber hinaus kann die Abhängigkeit von der Luciferase-Expression für die Tumorüberwachung zwar hochwirksam, aber die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf Versuchsaufbauten ohne Zugang zu BLI-Geräten einschränken. Obwohl BLI eine sensitive und nicht-invasive Methode ist, bietet sie keine direkten Einblicke in histopathologische Veränderungen. Komplementäre Analysen, wie MRT oder fortgeschrittene Histologie, könnten die Charakterisierung des Neurofibromverlaufs weiter verbessern.

Mehrere Verfahrensschritte können optimiert werden müssen, um eine erfolgreiche Tumortransplantation zu gewährleisten. Ein Injektionsversagen kann durch eine unsachgemäße Positionierung der Nadel oder ein übermäßiges Auslaufen der Zellsuspension verursacht werden. Um dies zu mildern, muss die Nadel vorsichtig parallel zum Ischiasnerv eingeführt und nach der Injektion langsam zurückgezogen werden. Die Variabilität der Biolumineszenzsignale kann durch eine inkonsistente Luciferin-Dosierung oder eine Fehlausrichtung während der Bildgebung entstehen. Es wird empfohlen, den Zeitpunkt der Injektion nach der Luciferin-Injektion (10 Minuten) zu standardisieren und bei allen Tieren identische Bildgebungseinstellungen beizubehalten. Wenn die Variabilität des Tumorwachstums hoch bleibt, bestätigen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen vor der Injektion und minimieren Sie den Stress der Tiere während der Handhabung.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein neuartiges und reproduzierbares orthotopes Neurofibrom-Xenotransplantatmodell etabliert, das eine effektive präklinische Plattform für die Untersuchung von NF1-assoziierten gutartigen Tumoren bietet. Durch die Nutzung menschlicher Schwann-Zellen in ihrer natürlichen Nervenmikroumgebung ahmt dieses Modell die menschliche Neurofibrombiologie genau nach und ermöglicht gleichzeitig eine Echtzeit-Tumorüberwachung und kontrollierte therapeutische Interventionen. Dieses Modell stellt einen wesentlichen Schritt zwischen GEMMs und patientenabgeleiteten Modellen (PDXs) dar und ebnet den Weg für klinisch relevantere Ansätze in der Neurofibromforschung und -behandlung.

Zukünftige Verfeinerungen sollten darauf abzielen, Immunkomponenten, wie z. B. humanisierte Mausmodelle, zu integrieren, um die Rolle der Tumormikroumgebung zu untersuchen6. Die Erweiterung der Bildgebungsmodalitäten, einschließlich MRT- oder PET-Scans, könnte BLI durch strukturelle und metabolische Erkenntnisse ergänzen22. Die Verlängerung der experimentellen Zeitpläne wird unerlässlich sein, um die langfristige Entwicklung von Neurofibromen und potenzielle maligne Transformationsrisiken zu untersuchen. Durch die Überbrückung der Lücke zwischen GEMMs- und PDX-Modellen verbessert diese Plattform die translationale Forschung in NF1 und bietet neue Möglichkeiten für therapeutische Innovationen bei gutartigen Tumoren der peripheren Nervenscheide.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Institut national du cancer (Inca_18828) unterstützt. Wir danken der HistIM-Plattform (unter der Leitung von Maryline Favier) und Pierre Sohier am Institut Cochin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BuprenorphinBuprecareFür präoperative Analgesie
HeizmattenANIPHYVI-653246Zur Aufrechterhaltung der Normothermie während der Mausoperation
hTERT NF1 ipNF04.4 (CVCL_UI78) Zelllinie Angewandte biologische MaterialienT0194Unsterbliche menschliche NF1-nulle Schwann-Zelllinie
IsofluraneIso-VetZur Mausanästhesie während der Biolumineszenzbildgebung
IVIS Lumina Serie IIIRevvityFür die biolumineszenzbildende Bildgebung
KetaminKetamin 1000 VirbacZur chirurgischen Anästhesie bei Mäusen
Living Image SoftwareRevvityEnthalten mit IVISFür Bildaufnahme und Quantifizierung
Luciferase-Assay-SystemPromegaE1500Zur BLI-Detektion
MeloxicamMETACAMNichtsteroidales Antirheumatikum (NSAID)
Monofilament-nicht-absorbierbare NahtETHILONF2419HZum Nähen des Schnitts
Nadel für SpritzeHamiltonGepflogenheitGA33/12,7 mm/PST4-12 °E;
NOD SCID gamma (NSG) Mäuse Charles River614NSG
pLenti CMV Puro LUC (w168-1)Addgene17477Zur Ausdrucksweise von Glühwürmchen-Luciferase
Povidon iod &eakut; E dermique 10%Viatris330200775Topisches Antiseptikum zur Hautdesinfektion
SkalpellklingeFST10015-00Für Hautschnitte während der Operation
Stereomikroskop L125LeicaZur Visualisierung der Zellinjektionsstelle im Ischiasnerv
Spritze 10 & Mikro; lHamilton1701RNZur Zellinjektion in den Ischiasnerv
XilazinRompun 2 %Zur chirurgischen Anästhesie bei Mäusen

Referenzen

  1. Brems, H., Beert, E., De Ravel, T., Legius, E. Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1. Lancet Oncol. 10 (5), 508-515 (2009).
  2. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  3. Gutmann, D. H., et al. Neurofibromatosis type 1. Nat Rev Dis Primers. 3 (1), 17004(2017).
  4. Mazuelas, H., et al. Modeling iPSC-derived human neurofibroma-like tumors in mice uncovers the heterogeneity of Schwann cells within plexiform neurofibromas. Cell Rep. 38 (7), 110385(2022).
  5. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nat Genet. 7 (3), 353-361 (1994).
  6. Radomska, K. J., et al. Cellular origin, tumor progression, and pathogenic mechanisms of cutaneous neurofibromas revealed by mice with Nf1 knockout in boundary cap cells. Cancer Discov. 9 (1), 130-147 (2019).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the Hippo pathway. Cancer Discov. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Wu, J., et al. Plexiform and dermal neurofibromas and pigmentation are caused by Nf1 loss in desert hedgehog-expressing cells. Cancer Cell. 13 (2), 105-116 (2008).
  9. Li, S., Chen, Z., Le, L. Q. New insights into the neurofibroma tumor cells of origin. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i13-i22 (2020).
  10. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. J Vis Exp. (49), e2558(2011).
  11. Jessen, W. J., et al. MEK inhibition exhibits efficacy in human and mouse neurofibromatosis tumors. J Clin Invest. 123 (1), 340-347 (2013).
  12. Jousma, E., et al. Preclinical assessments of the MEK inhibitor PD-0325901 in a mouse model of neurofibromatosis type 1: MEK inhibition in neurofibroma. Pediatr Blood Cancer. 62 (10), 1709-1716 (2015).
  13. Blanchard, Z., Brown, E. A., Ghazaryan, A., Welm, A. L. PDX models for functional precision oncology and discovery science. Nat Rev Cancer. 25, 153-166 (2024).
  14. Li, H., Chang, L. J., Neubauer, D. R., Muir, D. F., Wallace, M. R. Immortalization of human normal and NF1 neurofibroma Schwann cells. Lab Invest. 96 (10), 1105-1115 (2016).
  15. Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells. Am J Pathol. 158 (2), 501-513 (2001).
  16. Wu, M., Wallace, M. R., Muir, D. Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient Schwann cells in culture and as syngrafts in Nf1 knockout mice. J Neurosci Res. 82 (3), 357-367 (2005).
  17. Rasmussen, S. A., Friedman, J. M. NF1 gene and neurofibromatosis 1. Am J Epidemiol. 151 (1), 33-40 (2000).
  18. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1: A consensus overview. Hum Pathol. 67, 1-10 (2017).
  19. Pundavela, J., et al. Stimulator of interferon gene facilitates recruitment of effector CD8 T cells that drive neurofibromatosis type 1 nerve tumor initiation and maintenance. Sci Adv. 10 (42), eado6342(2024).
  20. Fletcher, J. S., Pundavela, J., Ratner, N. After Nf1 loss in Schwann cells, inflammation drives neurofibroma formation. Neurooncol Adv. 2 (Suppl 1), i23-i32 (2020).
  21. Le, L. Q., Parada, L. F. Tumor microenvironment and neurofibromatosis type I: Connecting the GAPs. Oncogene. 26 (32), 4609-4616 (2007).
  22. Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. Non-invasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice. Mol Ther. 4 (4), 297-306 (2001).

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