Method Article

Mikrofluidik-basierte Hochdurchsatz-Sortierung von zirkulierenden Tumorzellen und Einzelzellsequenzierungstechnologie

DOI:

10.3791/68708

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November 14th, 2025

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1Department of Urology, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Institute of Molecular Medicine, Ren Ji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

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Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind entscheidend für die Untersuchung des Fortschreitens und der Metastasierung von Krebs. In diesem Artikel wird ein integriertes Protokoll mit hohem Durchsatz für die CTC-Anreicherung und die Einzel-CTC-Sequenzierung vorgestellt, das die Abscheidungseffizienz und CTC-Reinheit verbessert und gleichzeitig die Kontaminations- und Sequenzierungskosten senkt und so die Präzisionsonkologieforschung und klinische Anwendungen voranbringt.

Abstract

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Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) dienen als vielversprechender Biomarker für die Verfolgung von Krebsmetastasen, -progression und -rezidiv. Flüssigbiopsietechniken, die sich auf die CTC-Detektion konzentrieren, haben aufgrund ihrer nicht-invasiven Natur und ihrer Fähigkeit, die Tumordynamik in Echtzeit zu überwachen, ein erhebliches Potenzial gezeigt. Herkömmliche Massen-CTC-Analysen erfassen jedoch nicht die intrinsische Heterogenität zwischen CTC-Populationen, was wichtige Erkenntnisse über die Tumorbiologie verschleiert. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht eine hochauflösende Charakterisierung der CTC-Heterogenität und bietet neue Möglichkeiten für die Präzisionsonkologie und mechanistische Studien der Tumorprogression. Trotz dieser Vorteile neigen die bestehenden Methoden für die Single-CTC-Sequenzierung zu Ineffizienzen, einschließlich niedriger Wiederfindungsraten, arbeitsintensiver Arbeitsabläufe und Kontaminationsrisiken, die mit mehreren manuellen Handhabungsschritten verbunden sind. Um diese Einschränkungen zu beheben, stellen wir ein integriertes mikrofluidisches Protokoll vor, das CTC-Anreicherung, -Aufreinigung und Einzelzellsequenzierung in einem einheitlichen Arbeitsablauf zusammenfasst. Die Methode verwendet einen dynamisch kontrollierten magnetischen Einfang in einem Fischgräten-strukturierten Chip, wobei das Wirbelmischen und die kumulative immunomagnetische Bead-Bindung eine robuste CTC-Isolierung mit hohem Durchsatz bei minimaler Zellschädigung ermöglichen. Die anschließende Aufreinigung mit einem mit Leukozyten-Antikörpern beschichteten Mikrofluidik-Chip entfernt effektiv die Nicht-Zielzellen, wodurch die CTC-Reinheit durch negative Selektion weiter verbessert wird. Schließlich ermöglicht ein hochpräziser Einzelzell-Sequenzierungschip, der auf dem Prinzip des differentiellen Strömungswiderstands basiert, die effiziente Einzelzellerfassung und -kopplung mit einzigartig barcodierten Mikrokügelchen. Diese neuartige Plattform überwindet die Einschränkungen von Poisson-verteilungsbasierten Methoden und verbessert die CTC-Nutzung bei gleichzeitiger Minimierung des Mikrobead-Verbrauchs und der Sequenzierungskosten. Unser integriertes Protokoll verbessert die Effizienz der CTC-Erfassung, die Reinheit und den Durchsatz bei der Einzelzellsequenzierung erheblich und eignet sich daher gut für klinische Anwendungen und die groß angelegte Krebsforschung. Durch die Ermöglichung einer präziseren und skalierbareren Analyse der CTC-Heterogenität hat diese Methode das Potenzial, die Krebsfrüherkennung, die Therapieüberwachung und die mechanistische Untersuchung von Metastasen zu verfeinern und letztendlich das Gebiet der Präzisionsonkologie voranzubringen.

Introduction

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Die Tumormetastasierung ist ein komplexer und mehrphasiger Prozess, der mit der Ausbreitung beginnt und dann die Ruhephase und Besiedlung durch Tumorzellen innerhalb des Primärtumors durchläuft. Diese Zellen dringen nach und nach durch die Basalmembran in tiefere Gewebe ein und intravasieren anschließend in Blutgefäße oder Lymphgefäße. Sobald diese Zellen im Kreislauf sind, werden sie zu zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), die zu entfernten Organen reisen können1. Das Auftreten von CTCs ist ein kritischer Schritt in der Metastasenkaskade, da sie als Keimzelle für die Fernmetastasierungdienen 1. In den letzten Jahren hat die CTC-basierte Flüssigbiopsie-Technologie aufgrund ihrer Vorzüge, einschließlich der nicht-invasiven und bequemen Natur des Verfahrens sowie der Fähigkeit zur dynamischen Überwachung in Echtzeit, erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Diese Technologie ermöglicht eine präzise, umfassende und umfassende Beurteilung der Tumorbiologie in Echtzeit und bietet einzigartige Vorteile bei der Überwachung der Behandlungswirksamkeit, der Vorhersage von Rezidiven und der Steuerung der Therapie 2,3,4. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass CTCs auch in Stadien mit geringer Tumorlast, wie z. B. Krebs im Frühstadium, Frühmetastasierung oder Rezidiv, im peripheren Blut vorhanden sind 5,6. Folglich überwindet die CTC-Flüssigbiopsie die Einschränkungen herkömmlicher Gewebebiopsien, die auf bildgebend nachweisbare solide Tumoren beschränkt sind7. Es bietet eine neue Perspektive und technologische Unterstützung für die Krebsfrüherkennung, die Überwachung von Rezidiven und Metastasen, die Behandlungsanleitung sowie die Aufklärung der Mechanismen der Tumorentstehung, -progression und -metastasierung. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass die Anzahl der CTCs im peripheren Blut als unabhängiger Prädiktor sowohl für das progressionsfreie Überleben als auch für das Gesamtüberleben bei Krebspatienten dient, wobei höhere CTC-Zahlen auf eine schlechtere Prognose hinweisen8. Dynamische Veränderungen der CTC-Zahlen sind auch eng mit dem Fortschreiten der Erkrankung und der Tumorlast nach der Behandlung verbunden 9,10.

Jüngste Studien haben mikrofluidikbasierte Technologien als transformative Werkzeuge für die Isolierung von CTCs hervorgehoben. Diese Technologien lassen sich grob in physikalische und biologische Ansätze einteilen, die jeweils unterschiedliche Vorteile bieten und gleichzeitig mit spezifischen Herausforderungen konfrontiert sind. Physikalisch basierte Methoden beruhen auf Unterschieden in Größe und Verformbarkeit, um CTCs zu trennen und so eine markierungsfreie Sortierung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Diese unspezifische Trennstrategie kann jedoch aufgrund der inhärenten Heterogenität der CTCs sowohl die Abscheidungseffizienz als auch die Reinheit beeinträchtigen. Zum Beispiel berichteten Lu et al. über einen mikrofluidischen Chip, der ein Fokustrennungs- und Geschwindigkeitsreduktionsdesign mit Trap-Arrays integrierte, das die meisten herkömmlichen physikalischen Techniken in Bezug auf CTC-Anreicherung und -Reinigung übertraf11. Dennoch erreichte der Chip nur eine 3-4 log lange Depletion der weißen Blutkörperchen (WBCs), was für klinische Anwendungen nicht ausreicht. Auf der anderen Seite bieten immunaffinitätsbasierte CTC-Isolationsstrategien in der Regel eine höhere Rückgewinnungsrate und Reinheit der Zielzelle. Die Bindungswechselwirkung zwischen Fängermolekülen und CTCs schränkt jedoch häufig den Durchsatz solcher Ansätze ein12,13. Dementsprechend ist eine Isolierungsmethode, die sowohl eine hohe Anreicherungseffizienz als auch einen hohen Durchsatz in Einklang bringt, für die effektive Verarbeitung klinischer Proben mit seltenen CTC-Populationen unerlässlich.

Darüber hinaus stellt die erhebliche Heterogenität zwischen den CTCs eine erhebliche Herausforderung für nachgelagerte Analysendar 10,14,15, da herkömmliche Massen-CTC-Analysen häufig die individuellen zellulären Unterscheidungen verschleiern. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht eine umfassende Charakterisierung der Heterogenität der CTC-Genexpression auf molekularer Ebene und bietet Einblicke in die Klassifikation, den Zustand und die Funktion von CTCs. Diese Technologie bietet neuartige Ansätze für die Präzisionsonkologie und erleichtert die Erforschung von Tumorentstehungs-, Progressions- und Metastasenmechanismen16. Zum Beispiel konstruierten Fan et al. einen Transkriptomatlas mit einem einzelnen CTC aus verschiedenen vaskulären Stellen bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom, der die räumliche Heterogenität zwischen den CTCs aufdeckte und Schlüsselmediatoren der Immunevasion identifizierte17. Gleichzeitig identifizierten Miyamoto et al. Androgenrezeptor-Genmutationen und Spleißvarianten in CTCs von Prostatakrebspatienten und klärten damit die Mechanismen auf, die der Arzneimittelresistenz zugrunde liegen18.

Die Entwicklung der Single-CTC-Transkriptomsequenzierung schreitet jedoch nur langsam voran. Bestehende Methoden leiden unter Mängeln bei der Automatisierung und Integration, was zu einer geringen CTC-Wiederherstellungseffizienz, komplexen Verfahren und niedrigen experimentellen Erfolgsraten führt19. Aktuelle Protokolle erfordern beispielsweise einen sequentiellen Prozess, der CTC-Anreicherung, Aufreinigung, Einzelzellisolierung und Nukleinsäureamplifikation umfasst. Diese Schritte werden in separaten Zentrifugenröhrchen durchgeführt, was mehrere Pipettier- und Transferschritte erfordert. Die arbeitsintensiven Verfahren verringern nicht nur die Effizienz, sondern erhöhen auch das Risiko von CTC-Verlust und Kontamination20. Herkömmliche Ansätze, wie z. B. die kapillarbasierte Zellentnahme, schränken den Durchsatz und die analytische Effizienz bei der Einzelzellisolierung weiter ein21. Darüber hinaus sind traditionelle Methoden auch durch die Poisson-Verteilung eingeschränkt, ein statistisches Phänomen, das die zufällige Verkapselung von Zellen beschreibt. Dies führt zu einem hohen Anteil an leeren Tröpfchen oder mehreren Zellen pro Tröpfchen, wodurch die Abscheideeffizienz eingeschränkt wird. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben Forscher integrierte mikrofluidische Chips für die Transkriptomanalyse von Einzelzell-CTC entwickelt. Diese Plattformen konsolidieren mehrere Schritte in einem einzigen Chip-Workflow, wodurch Kontaminationsrisiken reduziert und die analytische Effizienz verbessert werden. Zum Beispiel entwickelten Euisik Yoon et al. die Hydro-Seq-Methode, die eine auf Strömungsdynamik basierende Größenauswahl verwendet, um CTCs in Mikrokammern zu isolieren und einzelne CTCs effizient mit einzigartig barcodierten Mikrokügelchen zu paaren22. Dieser Ansatz ermöglicht die parallele Einzelzellanalyse mehrerer CTCs mit hohem Durchsatz.Diese Methode beruht jedoch auf einer größenbasierten CTC-Trennung, die oft zu einer geringen CTC-Reinheit und einem begrenzten Durchsatz (10 μL/min) führt, was sie für die Verarbeitung großvolumiger klinischer Proben ungeeignet macht. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung eines integrierten Einzelzell-CTC-Analysesystems mit hohem Durchsatz, geringem Volumen und Kontaminationsresistenz.

Hier beschreiben wir ein effizientes Hochdurchsatzprotokoll für die CTC-Anreicherung und Einzelzellsequenzierung, das aus drei Hauptkomponenten besteht: CTC-Sortierung, Aufreinigung und einem Einzelzell-Sequenzierungschip (Abbildung 1). Der mikrofluidische Chip für die CTC-Sortierung basiert auf dem Prinzip der dynamisch geregelten magnetischen Einfangkräfte (Abbildung 2A). Es ermöglicht eine Hochdurchsatz-CTC-Anreicherung durch Wirbelmischung innerhalb der Fischgrätstruktur sowie die kumulative Erfassung durch immunomagnetische Beads. Die zerstörungsfreie Freisetzung von CTCs wird anschließend durch eine präzise Modulation des Magnetfeldes erreicht. Anschließend wird ein Aufreinigungschip eingesetzt, bei dem mit Leukozyten-Antikörpern beschichtete Mikrokanäle für die Negativselektion verwendet werden, was zu hochreinen CTCs führt (Abbildung 2B). Schließlich wurde eine hocheffiziente Einzelzell-Manipulationsplattform auf Basis des differentiellen Strömungswiderstands eingesetzt, die die Einschränkungen der Poisson-Verteilung erfolgreich überwand und eine effiziente Paarung und Einfangung von Einzelzellen und kodierten Mikrosphären ermöglichte (Abbildung 3A). Es verbessert die Nutzung von CTC erheblich und reduziert gleichzeitig den Verbrauch von Mikroperlen und die Sequenzierungskosten.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der mikrofluidikbasierten CTC-Sortier- und Einzelzellsequenzierungstechnologie. Dieser Arbeitsablauf veranschaulicht den Prozess, bei dem sich Tumorzellen von den Tumorläsionen lösen, in den Blutkreislauf gelangen und CTCs bilden. Periphere Blut- oder Leukopak-Proben, die CTCs enthalten, werden sequentiell durch die CTC-Erfassungs-, Reinigungs- und scRNA-Seq-Chips verarbeitet, was letztendlich eine transkriptomische Sequenzierung und bioinformatische Analyse der CTCs ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

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1. Methode 1: Mikrofluidik-basierte CTC-Isolierung

  1. Herstellung von Fischgräten-Chips (HB-Chips)
    1. Vorbereitung der Meisterform
      1. Bereiten Sie einen sauberen Silikonwafer vor und backen Sie ihn über Nacht bei 135 °C, um Feuchtigkeit zu entfernen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur behandeln Sie den Wafer 1 Minute lang mit einem Sauerstoffplasmareiniger bei 150 W, um die Oberfläche zu aktivieren.
      2. Strukturieren Sie die erste Schicht des Chips, um ein Stützsäulenarray zu bilden (28 Spalten × 7 Reihen, nummeriert von #1 bis #28 entlang der Fließrichtung) mit SU-8-Fotolack. Stellen Sie den Schleudercoater so ein, dass er sequenziell mit 500 U/min für 10 s, 2350 U/min für 55 s und 500 U/min für 10 s läuft. Stellen Sie sicher, dass die Höhe dieser Schicht 50 μm beträgt.
      3. Die erste Schicht bei 65 °C 1 min weich backen, gefolgt von 95 °C für 20 min, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      4. Belichten Sie die erste Ebene mit einer Fotomaske mit dem entsprechenden Stützpfeiler-Design. Stellen Sie die Expositionsdosis auf 130 mJ/cm2 ein.
      5. Nach der Belichtung 1 Minute lang bei 65 °C backen, gefolgt von 95 °C für 6 Minuten.
      6. Nach dem Abkühlen wird der SU-8-Entwickler auf die Waferoberfläche aufgetragen, um unvernetzten Fotolack zu entfernen und die untere Schicht zu erhalten. Lassen Sie es 30 s lang pfützen, spülen Sie es dann mit entionisiertem Wasser ab.
      7. Die zweite SU-8-Schicht mit den gleichen Schleuderparametern wie in Schritt 1.1.1.2 auf die erste Schicht aufschichten. Die zweite Schicht wird so strukturiert, dass Fischgrätstrukturen in einem Winkel von 45° zur Kanalwand mit einer Rillenbreite von 100 μm, einem Abstand von 200 μm und sechs Rippen pro Zyklus gebildet werden. Stellen Sie sicher, dass die Höhe dieser Schicht ebenfalls 50 μm beträgt.
        HINWEIS: Ein schematisches Diagramm, das alle relevanten Abmessungen der Mikrostrukturmerkmale (einschließlich des Stützpfeiler-Arrays und der Fischgrätenrillen) veranschaulicht, wurde in der ergänzenden Abbildung 1 bereitgestellt.
      8. Die erste Schicht bei 65 °C 1 min weich backen, gefolgt von 95 °C für 20 min, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      9. Belichten Sie die zweite Ebene mit einer Fotomaske im Fischgrätenmuster. Stellen Sie die Expositionsdosis auf 130 mJ/cm2 ein.
      10. Nach der Belichtung 1 Minute lang bei 65 °C backen, gefolgt von 95 °C für 6 Minuten.
      11. Verwenden Sie nach dem Abkühlen den SU-8-Entwickler, um unvernetzte Bereiche zu entfernen und die vollständige zweischichtige Mikrostruktur freizulegen.
    2. Vorbereitung des PDMS-Replikats
      1. Formulieren Sie das PDMS-Gemisch, indem Sie das Prepolymer und den Vernetzer in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 kombinieren. Bereiten Sie 10-15 ml der Mischung für einen einzelnen Chip vor.
      2. Gießen Sie die Mischung in die Urform und beseitigen Sie eingeschlossene Luft durch Entgasung. Härten Sie das PDMS aus, indem Sie die Form für 30 min bei 95 °C in einen Ofen stellen.
      3. Entfernen Sie das ausgehärtete PDMS-Replikat aus der Form. Erstellen Sie einen Einlass und einen Auslass mit einer PDMS-Stanzmaschine mit einem Durchmesser von 1 mm.
    3. HB-Chip-Bestückung
      1. Stellen Sie den Sauerstoff-Plasma-Reiniger für 3 min auf eine Leistung von 150 W ein. Aktivieren Sie die Oberflächen, indem Sie sowohl die PDMS-Replik als auch die vorgeklebte PDMS-Schicht auf einem sauberen Objektträger behandeln.
        HINWEIS: Aufgrund der Fülle an Si-O-Bindungen in PDMS-Polymerketten ermöglicht die Plasmaaktivierung eine kovalente Bindung zwischen PDMS und Substraten wie Glas und Silizium, wodurch die Chipversiegelung erleichtert wird.
      2. Richten Sie die behandelten PDMS-Strukturen aus und verbinden Sie sie fest. Vergewissern Sie sich, dass das Stützsäulen-Array und die Fischgrätenfunktionen vollständig in das Glassubstrat integriert sind, um den HB-Chip fertigzustellen.
  2. Herstellung von immunomagnetischen Beads (IMBs)
    1. Inkubieren Sie 25 μl gewaschene und resuspendierte Streptavidin-modifizierte magnetische Kügelchen (SA-MBs) (1 μm) (≈4 × 108 Beads pro ml) mit 1 μg biotinyliertem EpCAM-Antikörper (Epithelial Cell Adhesion Molecule) bei Raumtemperatur mit Rotation bei 20 U/min für 40 Minuten, um die IMBs vorzubereiten.
    2. Entfernen Sie nach der magnetischen Trennung auf einem Magnetgestell den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in 25 μl Isolationspuffer (1 % BSA, 2 mM EDTA, D-PBS).
  3. Betrieb des Isolationschips
    1. Pipettieren Sie 20 μl der magnetischen Bead-Suspension innerhalb von 1-2 s und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen gebildet werden.
    2. Platzieren Sie den Chip sofort senkrecht auf einem Magneten und lassen Sie die Kügelchen 5 Minuten lang ungestört einwirken.
    3. Entnehmen Sie die Blutprobe (peripheres Blut oder experimentelle Leukopak-Proben) und ziehen Sie sofort 4 ml in eine Spritze, wobei Sie sicherstellen, dass die Luftblasen entfernt werden. Verschließen Sie den Ein- und Auslass des Späns mit Flüssigkeit, um Luftblasen zu entfernen. Führen Sie die Probeneinlass- und -auslassrohre in den Chip ein.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit biologischen Proben grundlegende persönliche Schutzmaßnahmen getroffen werden.
    4. Injizieren Sie die Probe mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 1,5 mL/h.
    5. Nach dem Laden der Probe injizieren Sie 60 μl D-PBS mit einer Flussrate von 0,2 mL/h in den HB-Chip, um die ungebundenen Zellen abzuwaschen.
    6. Entfernen Sie den Magneten und injizieren Sie manuell 1,5 ml BSA (5 % w/v in D-PBS), um den Chip zu waschen und die eingefangenen Tumorzellen aus dem HB-Chip freizusetzen.

2. Methode 2: Mikrofluidik-basierte CTC-Aufreinigung

  1. Modifikation des HB-Chips
    1. Bereiten Sie eine (3-Mercaptopropyl)-trimethoxysilan (MPTS)-Lösung in Ethanol mit einem Volumenanteil (v/v) von 10 % vor. Sofort 20 μl MPTS-Lösung in den HB-Chip geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Einmal mit wasserfreiem Ethanol spülen und 1 h bei 100 °C trocknen.
    3. Bereiten Sie eine N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimidester (GMBS)-Lösung in Ethanol in einer Konzentration von 0,5 mg/ml vor. Kühlen Sie den Chip auf 37 °C ab, geben Sie die GMBS-Lösung ein und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Tragen Sie bei der Verwendung von MPTS und GMBS immer Handschuhe, einen Laborkittel und eine Maske. Diese Reagenzien besitzen toxische und schleimhautreizende Eigenschaften und sollten in einem gut belüfteten Bereich vorsichtig gehandhabt werden.
    4. Spülen Sie zweimal mit ddH2O, gefolgt von zwei Spülgängen mit D-PBS.
    5. Sofort 15 μg/ml Streptavidin (SA) zugeben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    6. Zweimal mit D-PBS spülen.
    7. Bereiten Sie den CD45-Antikörperpuffer vor: 0,2 % (w/v) BSA und 20 μg/ml biotinylierter CD45-Antikörper, verdünnt mit D-PBS.
    8. Injizieren Sie 20 μl des CD45-Antikörperpuffers in den HB-Chip zur negativen Selektion der weißen Blutkörperchen. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dann mit D-PBS spülen.
    9. Eine Blockierungslösung mit 3 % (w/v) BSA und 0,05 % (w/v) Tween-20 zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Vor dem Laden der Probe mit D-PBS spülen.
  2. Laden von Proben
    1. Aspirieren Sie die Probe mit einer Spritze und stellen Sie sicher, dass die Luftblasen entfernt werden. Verschließen Sie den Ein- und Auslass des Späns mit Flüssigkeit, um Luftblasen zu entfernen. Führen Sie die Probeneinlass- und -auslassrohre in den Chip ein.
    2. Injizieren Sie die Probe mit einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,6 mL/h ein.
    3. Sammeln Sie die gereinigten Tumorzellen aus dem Auslass für die Zählung und Einzelzellsequenzierung.

3. Methode 3: Mikrotiter-basierte Einzelzell-Barcoding- und Sequenzierungstechnologie

  1. Aufbereitung von Reagenzien und Materialien
    1. Chip-Vorbehandlung
      1. Geben Sie 200 μl 1x D-PBS und 0,5 % F-68-Lösung in den Chip-Einlass.
      2. Führen Sie die Beschallung im Wasserbad durch, während Sie den Chip halten. Wenn Blasen im gesamten mikroporösen Bereich sichtbar sind, setzen Sie die Beschallung 30 s lang fort, um Blasen aus den Doppelvertiefungen zu entfernen.
    2. Vorbereitung von Barcode-Perlen
      1. Die Stammlösung aus magnetischen Kügelchen mit Barcode wird gründlich gemischt und 200 μl in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Führen Sie eine magnetische Trennung durch, bis sich die Lösung geklärt hat, und entsorgen Sie den Überstand.
      2. Waschen Sie die Barcode-Kügelchen zweimal mit 500 μl TE-TW (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01 % Tween-20).
      3. Waschen und resuspendieren Sie die Barcode-Kügelchen in 200 μl 20x TE (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 mM EDTA) und 50 mM DTT-Lösung, dann auf Eis legen.
    3. Herstellung einer einzelligen Suspension
      1. Die gereinigten Tumorzellen werden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 400 × g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Waschen und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL 1x D-PBS.
      2. Führen Sie eine Zellzählung durch und bereiten Sie die Einzelzellsuspension entsprechend vor. Das Probenladevolumen sollte 200 μl betragen, mit insgesamt 80.000 Zellen (400 Zellen/μl).
    4. Bereiten Sie den Zelllysepuffer vor, der 1x Kochsalzlösungs-Natriumcitrat (SSC), 0,5 M LiCl, 0,6 % Triton X-100, 10 mM EDTA, 5 mM DTT und 1 U/μl RNase-Inhibitor enthält.
  2. Mikrofluidische Chip-Operation
    1. Zell-Erfassung
      1. Injizieren Sie 200 μl der Tumorzellsuspension in den Chip (60000 Dual-Wells) und schütteln Sie sie dann 5 Minuten lang bei 10 U/min auf einem Entfärbungsschüttler, damit sich die Zellen durch die Schwerkraft in den Capture-Wells absetzen können.
      2. Pipettieren Sie die Zellsuspension im Chip vorsichtig zweimal auf und ab. Legen Sie dann den Chip 5 Minuten lang bei 10 U/min auf einen Entfärbungsschüttler, um die nicht eingefangenen Zellen wieder zu suspendieren und sie wieder absetzen zu lassen.
      3. Geben Sie 200 μl 1x D-PBS und 0,5 % F-68-Lösung durch den Einlass und saugen Sie die Lösung aus dem Auslass an. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt drei Wäschen des Chips.
    2. Bead-Erfassung mit Barcode
      1. Resuspendieren Sie die Barcode-Bead-Suspension und injizieren Sie dann sofort 200 μl der Suspension durch den Einlass in den Chip. Schütteln Sie bei 10 U/min für 20 s.
      2. Pipettieren Sie die Perlensuspension zweimal vorsichtig und schütteln Sie sie dann 20 s lang bei 10 U/min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
      3. Ziehen Sie die Barcode-Bead-Suspension aus dem Auslass, fügen Sie 200 μl 20x TE (pH = 7,5) und 50 mM DTT-Lösung hinzu und ziehen Sie dann die Flüssigkeit aus dem Auslass. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, für insgesamt drei Wäschen.
    3. Zelllyse und mRNA-Einfang
      1. Geben Sie langsam 200 μl des Zelllysepuffers durch den Einlass in den Chip. Unmittelbar danach fügen Sie langsam 200 μl Mineralöl hinzu, um die Doppelvertiefungen abzudichten.
        HINWEIS: Die Versiegelung muss sofort erfolgen, um eine Kontamination zu vermeiden.
      2. Entfernen Sie die Lösung, die aus dem Späneauslass in den Abfallbehälter fließt. Legen Sie den Chip waagerecht und lassen Sie ihn 5 min bei Raumtemperatur stehen.
    4. Rückgewinnung von Barcode-Beads
      1. Geben Sie nach der Lyse langsam 200 μl 6x SSC durch den Einlass, entfernen Sie die Abfallflüssigkeit und saugen Sie die restliche Lösung aus dem Chipauslass an.
      2. Fügen Sie langsam 200 μL 6x SSC hinzu, um den Chip zu füllen. Halten Sie einen Magneten nahe an die Oberfläche des Chips und bewegen Sie ihn langsam vom Einlass zum Auslass, um Barcode-Perlen aus den Fangwellen zu sammeln. Saugen Sie dann schnell die Lösung sowie die mit Barcodes versehenen Kügelchen vom Chip in ein Zentrifugenröhrchen ab, das mit 6x SSC vorgeladen ist.
      3. Dreimal mit 200 μl 6x SSC waschen, gefolgt einmal mit 1x RT-Puffer (siehe Materialtabelle).
  3. Reverse Transkription (RT), Exonuklease-I-Behandlung und PCR
    1. RT
      1. Resuspendieren Sie die barcodierten Kügelchen in 100 μl Reverse-Transkriptionsreaktionsmix, der 1× RT-Puffer, 1 mM GTP, 1 mM dNTP, 5 % PEG 8000, 2,5 μM Template-Switch-Oligo (siehe Materialtabelle), 1 U/μL RNase-Inhibitor und 10 U/μL Reverse Transkriptase enthält. Die Lösung bei 42 °C 120 min inkubieren.
    2. Exonuklease-Behandlung
      1. Nach der reversen Transkription waschen Sie die Kügelchen einmal mit 200 μL 1x TE-SDS (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS), einmal mit 200 μL 1x TE-TW und einmal mit 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl Exonuklease-Mix, der 1x Exonuklease I Puffer und 1 U/μl Exonuklease I enthält, und inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 37 °C.
    3. Synthese des zweiten Strangs
      1. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 200 μL 1x TE-SDS. Die Kügelchen werden in 200 μl 0,1 M NaOH resuspendiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer Rotation bei 30 U/min inkubiert, um das mRNA-cDNA-Hybridprodukt zu denaturieren. Anschließend die Kügelchen einmal mit 200 μL 1x TE-TW und einmal mit 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0) waschen.
      2. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl des Reaktionsmixes, der 1x RT-Puffer, 1 mM dNTP, 5 % PEG 8000, 0,5 μM Zweitstrangsynthese-Primer (siehe Materialtabelle) und 0,125 U/μl Klenow-Fragment enthält. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 °C für 60 Minuten.
    4. cDNA-Amplifikation
      1. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 200 μL 1x TE-SDS, einmal mit 200 μL 1x TE-TW und einmal mit 200 μL 10 mM Tris-HCl (pH = 8,0).
      2. Resuspendieren Sie die Beads in 150 μl PCR-Mix, einschließlich 1x PCR-Reaktionsmix und 0,8 μM ISPCR-Oligo (siehe Materialtabelle). Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt ein: 95 °C für 3 min; vier Zyklen von 98 °C für 20 s, 65 °C für 30 s und 72 °C für 3 min; acht Zyklen von 98 °C für 20 s, 67 °C für 20 s und 72 °C für 3 min; 72 °C für 5 min.
      3. Reinigen Sie das PCR-Produkt zweimal mit 0,6x Festphasen-Magnetkügelchen mit reversibler Immobilisierung (SPRI) für die DNA-Aufreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie in 20,5 μl H2O. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungsassay.
      4. Führen Sie eine zweite Amplifikation des gereinigten PCR-Produkts mit einem PCR-Mix durch, der 1x PCR-Reaktionsmix und 0,8 μM ISPCR-Oligo enthält (siehe Materialtabelle). Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt ein: 98 °C für 3 min; fünf Zyklen von 98 °C für 20 s, 67 °C für 20 s und 72 °C für 3 min; 72 °C für 5 min.
      5. Das PCR-Produkt wird zweimal mit 0,6x SPRI-Magnetkügelchen für die DNA-Aufreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt und in 20,5 μl H2O eluiert. Die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts wird mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungsassaygemessen 23.
    5. Aufbau einer cDNA-Bibliothek
      1. Konstruieren Sie die Bibliothek mit einem Standard-DNA-Bibliotheksvorbereitungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Amplifizieren Sie die Bibliothek durch PCR mit dem Primerpaar N70X / P5 (siehe Ergänzende Tabelle). Stellen Sie das PCR-Programm wie folgt ein: 72 °C für 3 min; 98 °C für 30 s; zwölf Zyklen von 98 °C für 15 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 3 min; 72 °C für 5 min.
      3. Reinigen Sie die Bibliothek mit 0,6x SPRI-Magnetkügelchen für die DNA-Aufreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie in 20 μl H2O. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungsassay.
        HINWEIS: Im Allgemeinen wird eine endgültige DNA-Bibliothekskonzentration von ≥ 2 ng/μl und eine Gesamtmenge von ≥ 50 ng als akzeptabel angesehen24.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Aufbau und die Freigabe der CTC-Erfassungsschnittstelle kann mikroskopisch ausgewertet werden. Eine gleichmäßige Verteilung der magnetischen Kügelchen (MBs) an der Unterseite des HB-Chips unter einem Magnetfeld deutet auf eine erfolgreiche Assemblierung hin, während minimale oder keine verbleibenden MBs die erfolgreiche Freisetzung bestätigen (Abbildung 2C). Dieser Schritt ist entscheidend für die Bestimmung der Ausbeute und Reinheit von aufgefangenen CTCs. Um die Erfassungseffizienz des CTC-Isolationschips zu validieren, haben wir ein Spike-in-Experiment durchgeführt. Eine kleine Anzahl von Tumorzellen mit hoher EpCAM-Expression (PC3 oder LNCaP) wurde in PBS gespikt, das eine große Population von Jurkat-Zellen enthielt, die eine niedrige EpCAM-Expression aufweisen und das Vorhandensein von reichlich vorhandenen Blutzellen im Umlauf simulieren. Der CTC-Isolationschip erfasste effizient Tumorzellen sowohl aus 1-ml- als auch aus 10-ml-Proben und demonstrierte damit seinen hohen Durchsatz und seine effiziente CTC-Sortierfähigkeit (Abbildung 2D). Um die Spezifität der IMB-basierten Erfassung zu bewerten, verwendeten wir einen Kontrollchip, der mit SA-MBs modifiziert wurde, denen eine EpCAM-Antikörperkonjugation fehlte. Das Fehlen eines signifikanten Tumorzelleinfangs bestätigte die Spezifität der IMB-vermittelten CTC-Isolierung (Abbildung 2D).

Neben der Abscheideeffizienz ist die Reinheit ein weiterer kritischer Parameter bei der Bewertung von CTC-Isolationsplattformen. Wir verglichen die Reinheit von Tumorzellen, die entweder mit dem Capture-Chip oder dem Reinigungschip allein isoliert wurden, sowie die Reinheit, die durch sequentielle positive und negative Selektion erreicht wurde (Abbildung 2E). Beide Chips verbesserten die Reinheit der Tumorzellen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant und zeigten ihre Wirksamkeit bei der Isolierung von CTCs. Noch wichtiger ist, dass die kombinierte Verwendung von positiver und negativer Selektion die Reinheit und Ausbeute der Tumorzellen im Vergleich zur Verwendung einer einzigen Methode weiter verbesserte.

Um die Leistung der CTC-Erfassungs- und Sortierchips im klinischen Umfeld weiter zu bewerten, haben wir periphere Blutproben (PB) von sechs gesunden Spendern entnommen und Spiking-Experimente durchgeführt. Angesichts der extrem geringen Häufigkeit von CTCs in klinischen Proben wurden etwa 500-1000 LNCaP-Zellen in jede 10 ml PB-Probe gespickt. Die Leukozytenzahlen in allen gesammelten PB-Proben lagen im Normbereich (4-10 × 106 Zellen/ml). Die Ergebnisse zeigten, dass das CTC-Sortiersystem auch bei der Verarbeitung klinischer Proben eine hohe Einfangeffizienz und Reinheit der Tumorzellen beibehielt (Abbildung 2F-G und ergänzende Abbildung 2).

figure-results-1
Abbildung 2: Fischgrät-strukturierte CTC-Erfassungs- und Aufreinigungsplattform. (A) Arbeitsablauf des CTC-Isolationschips. Zunächst bilden ein stabiles Magnetfeld und EpCAM-Antikörper-konjugierte IMBs die Capture-Grenzfläche. Als nächstes erhöht die Wirbelmischung innerhalb des HB-Chips die Effizienz des Stofftransports zwischen CTCs und IMBs und erleichtert so die akkumulierte Abscheidung. Schließlich wird eine schonende Freisetzung von CTCs durch Entfernen des Magnetfeldes erreicht. (B) Arbeitsablauf des CTC-Aufreinigungschips. Der HB-Chip wird mit Antikörpern mit negativer Selektion modifiziert, und das Wirbelmischen erleichtert die Interaktion zwischen Leukozyten und Antikörpern weiter, was letztendlich zu hochgereinigten CTCs führt. Maßstabsleiste, 100 μm. (C) Die mikroskopische Bildgebung zeigt die erfolgreiche Assemblierung und Freisetzung des Capture-Chips. (D) Balkendiagramme vergleichen die CTC-Erfassungseffizienz der Isolationsplattform über verschiedene Probenvolumina hinweg, wobei nicht-funktionalisierte SA-MBs als Kontrolle verwendet werden. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD, n = 3. (E) Balkendiagramme vergleichen die Reinheit von CTCs, die mit nur einem einzigen HB-Chip erhalten wurden, mit solchen, die einer sequenziellen Erfassung und Reinigung unterzogen wurden. Die Kontrollgruppe steht für die Reinheit von unbehandeltem CTC. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD, n=3. (F) Zellidentifikation im CTC-Isolationschip. LNCaP-Zellen wurden mit Hoechst und Calcein AM gefärbt, während Blutzellen nur mit Hoechst gefärbt wurden. Maßstabsleiste, 100 μm. (G) Reinheit und Erfassungseffizienz von Tumorzellen in Spike-Experimenten mit 1 ml oder 10 ml peripherem Blut. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die isolierten Tumorzellen wurden anschließend einer Hochdurchsatz-Einzelzellsequenzierung unterzogen. Unser Protokoll beinhaltet ein Einzelzell-Barcoding-System, das aus 60.000 verschachtelten Mikrovertiefungen besteht (Abbildung 3A-B). Die unteren, quadratischen Mikrovertiefs dienen zum Einfangen einzelner Zellen, während die oberen Mikrovertiefungen für die Beladung mit Beads ausgelegt sind. Jede untere Mikrovertiefung misst 25 μm in Länge, Breite und Höhe und ist für die meisten Zelltypen geeignet. Die oberen sechseckigen Vertiefungen haben einen eingeschriebenen Kreisdurchmesser und eine Höhe von 50 μm, um Kügelchen aufzunehmen, die typischerweise von 30 bis 50 μm reichen. Das System verbessert die Effizienz der Zelleinfangung auf der Grundlage der kumulativen Erfassung und vermeidet gleichzeitig Zelldubletten durch die Mikrovertiefungen mit Größenausschluss. Um das Zellladeprotokoll zu optimieren, untersuchten wir die Effizienz des Zelleinfangs und das Belegungsverhältnis der Mikrotiter unter verschiedenen Zelleingangsbedingungen (Abbildung 3C). Die Ergebnisse zeigten, dass eine Erhöhung des Zelleinsatzes die Einfangeffizienz nicht verringerte; vielmehr konnte der Auslastungsgrad deutlich gesteigert werden. Für den 60.000-Well-Capture-Chip erreichte die Mikrowell-Belegungsrate ein Plateau, als der Zelleneingang 80.000 erreichte, und zeigte keinen weiteren Anstieg mit zusätzlichem Input. Um das Auftreten von Dubletten durch übermäßige Zellbeladung zu minimieren, haben wir 80.000 Zellen als optimalen Eingang ausgewählt. Wie in Abbildung 3D gezeigt, erreichte der einzellige Barcode-Chip eine Belegung der Beads von 85,6 % mit Zellen und 95,7 %, was zu einer Paarungsrate von 81,9 % führte. Darüber hinaus wurden mehrere Absetzungen gemäß dem Protokoll durchgeführt, was die Abscheideeffizienz und die Paarungsrate durch den kumulativen Abscheidungseffekt signifikant verbesserte (Abbildung 3D). Bemerkenswert ist, dass der beobachtete Unterschied in den Belegungsverhältnissen zwischen Zellen und Kügelchen auf die größere Dichte und Masse der Kügelchen im Vergleich zu Zellen zurückgeführt wird, wodurch sie sich unter der Schwerkraft effizienter in den Mikrovertiefungen absetzen können. Daher wird unter optimierten Lastbedingungen eine Pairing-Auslastung von ca. 80 % im Allgemeinen als ideal angesehen.

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Abbildung 3: Mikrotiter-basierte Hochdurchsatz-Einzelzell-Barcoding- und Sequenzierungstechnologie. (A) Ablauf des Einzel-CTC-Sequenzierungsprotokolls. (B) Die Mikrokopie demonstriert mikrofluidische Einzelzell-/Barcode-Strukturen für die Bead-Capture-Well. Die Prozesse des Zelleinfangs, des Kügelcheneinfangs und der Rückgewinnung von Kügelchen werden von links nach rechts dargestellt. Maßstabsbalken 30 μm. (C) Liniendiagramme veranschaulichen die Effizienz der Zellerfassung und das Belegungsverhältnis der Mikrotiterfelder des Einzelzell-Barcode-Chips (60000 Dual-Wells) unter verschiedenen Zelleingangsbedingungen. (D) Belegungsraten von Zellen und Barcode-Beads unter optimierten Zelleingabebedingungen, zusammen mit dem entsprechenden Zell-Beads-Paarungsverhältnis. Das linke und rechte Feld zeigen den Erfassungsansatz, bei dem mehrere Absetzversuche bzw. nur ein Absetzversuch verwendet werden. Fehlerbalken, Mittelwert ± SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um das integrierte Protokoll für die CTC-Sortierung und scRNA-Seq zu validieren, mischten wir schließlich PC3-, LNCaP- und Jurkat-Zellen in einem geschätzten Verhältnis von 1:3:4000 und luden sie auf die mikrofluidischen Chips für die Tumorzellerfassung, -reinigung und -sequenzierung. Durch die effiziente Plattform zur Isolierung von Tumorzellen erhielten wir hochreine EpCAM-positive Tumorzellen (Abbildung 4B). Gleichzeitig demonstrierte der mikrofluidikbasierte scRNA-seq-Chip eine präzise Fähigkeit zur Profilierung von Zelltypen, wobei die Ergebnisse durch t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)-Analyse visualisiert wurden (Abbildung 4A). Es gelang uns, drei verschiedene Zellpopulationen zu identifizieren, von denen jede durch einzigartige Marker unterschieden werden konnte (Abbildung 4C). Darüber hinaus stimmten die Anteile der Zellen in der Endausgabe eng mit denen des gereinigten Inputs überein, was bestätigt, dass der Einzelzell-Barcoding-Prozess unverzerrt und frei von Verunreinigungen war (Abbildung 4B). Ein Cluster wurde basierend auf der spezifischen Expression von TRBC1, IGLL1, CD1E und CD3D als Jurkat-Zellen identifiziert (Abbildung 4D). Die Analyse der Signalanreicherung bestätigte die Robustheit dieser Klassifizierung (Abbildung 4E). Darüber hinaus wurden die beiden Prostatakrebszelllinien nach differentiell exprimierten Genen (DEGs) eindeutig in einzelne Cluster getrennt (Abbildung 4F-G). Der PC3-Cluster zeichnete sich durch eine hohe Expression von Mikroseminoprotein (MSMP) aus, das auch als PC3-sezerniertes Mikroprotein bekannt ist. Auf der anderen Seite exprimierte der LNCaP-Cluster eindeutig Marker, die mit Zelladhäsion, Proliferation und Pluripotenz in Verbindung stehen, wie NEDD4, CTNNA1 (α-Catenin 1) und RBBP7.

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Abbildung 4: Validierung der CTC-Sortierung und Einzelzellsequenzierung mit Hilfe eines Spike-in-Experiments. (A) t-SNE-Diagramm, das die Zelltyp-Profilierung der gefangenen und gereinigten Zellen zeigt. (B) Balkendiagramm, das die Anteile der drei Zelltypen in drei Stadien darstellt: Ersteingabe, Nachreinigung und endgültige Sequenzierungsausgabe. (C) Punktdiagramm, das die Expression einzigartiger Markergene über verschiedene Zellcluster hinweg veranschaulicht. (D) Expressionsniveaus von TRBC1, IGLL1, CD1E und CD3D in allen Zellen. (E) Analyse der Anreicherung des GO- und KEGG-Signalwegs von differentiell exprimierten Genen (DEGs) im Jurkat-Cluster. (F) Expressionsmuster von NEDD4 und MSMP in allen Zellen. (G) Vulkandiagramm mit DEGs zwischen den Clustern PC3 und LNCaP. Rote Punkte stehen für Gene, die in PC3 hochreguliert sind; Blaue Punkte stehen für diejenigen, die in LNCaP hochreguliert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MastermixReagenzAbschließende VerdünnungTyp des Puffers
0,5 % F-68F-680.50%DEPC Behandeltes Wasser
PBS1×
TE-TWTris-HCl (pH=8,0)ca. 10 mMDEPC Behandeltes Wasser
EDTA1 mM
Tween-200.01%
20× TE (pH=7,5)Tris-HCl (pH=7,5)ca. 200 mMDEPC Behandeltes Wasser
EDTAca. 20 mM
TE-SDSTris-HCl (pH=8,0)ca. 10 mMDEPC Behandeltes Wasser
EDTA1 mM
SDS0.50%

Tabelle 1: Zusammensetzung der Reagenzienmischung für die Vorbereitung der Einzel-CTC-Sequenzierung. Dargestellt sind Teile der für scRNA-seq benötigten Reagenzien, die vor dem Chipbetrieb vorbereitet werden können, um einen schnellen und reibungslosen Prozess zu gewährleisten.

Ergänzende Abbildung 1: Aufbau für den HB-Chip. (A) Schematische Darstellung der zweischichtigen mikrofluidischen Struktur. Decke: Deckschicht mit Fischgrätstruktur. Ein vergrößerter Einschub zeigt die detaillierte Geometrie des Fischgräts, das in einem Winkel von 45° zur Kanalwand ausgerichtet ist, mit einer Rillenbreite von 100 μm und einem Abstand von 200 μm. Unten: Untere Schicht bestehend aus einem Stützpfeiler-Array (28 Spalten × 7 Reihen), nummeriert von #1 bis #28 entlang der Fließrichtung. (B) Seitenansicht des Fischgrätensplitters. Die Fischgrätrillen haben eine Breite von 100 μm. Die Höhen sowohl der Fischgrätstrukturen als auch der Stützpfeiler betragen 50 μm. (C) Draufsicht auf den Fischgrätensplitter. Jede Stützsäule misst 500 μm in der Breite und 1150 μm in der Länge, mit einem Abstand von 550 μm zwischen den benachbarten Pfeilern. (D) Foto des hergestellten HB-Chips. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Repräsentatives Bild, das fluoreszenzgefärbte Tumorzellen und Blutzellen zeigt, die in der Abfallflüssigkeit vorhanden sind, die aus dem Auslass des CTC-Isolationschips gesammelt wurde. LNCaP-Zellen wurden mit Hoechst und Calcein AM gefärbt, während Blutzellen nur mit Hoechst gefärbt wurden. Maßstabsleiste 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle: Oligonukleotidsequenzen, die in der reversen Transkription und Bibliotheksvorbereitung verwendet werden Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CTCs dienen als wertvolle Biomarker für die Krebsdiagnose, Behandlungsempfehlungen und Studien zur Tumorentstehung, -progression und -metastasierung25. Bestehende CTC-Isolationsmethoden erreichen jedoch nicht sowohl eine hohe Effizienz als auch einen hohen Durchsatz26. Darüber hinaus führt die geringe Freisetzungseffizienz von CTCs häufig zu einer geringen Reinheit und einer hohen Zellschädigung, was ihre Kompatibilität mit nachgelagerten Analysen einschränkt27. Hier haben wir ein integriertes Protokoll für die Hochdurchsatz-CTC-Sortierung und die Einzel-CTC-Sequenzierung vorgeschlagen, das aus drei Hauptverfahren besteht: CTC-Erfassung, -Aufreinigung und scRNA-seq.

Diese mikrofluidikbasierte Plattform bietet Flexibilität und Skalierbarkeit. Die Anzahl der parallelen Kanäle in den HB-Chips sowie die Capture-Wells im Barcode-Chip können je nach Probenanforderung angepasst werden, um hohen Durchsatzanforderungen gerecht zu werden. Im CTC-Capture-Chip können IMBs entsprechend der spezifischen Krebsart optimiert werden. In Proben von Prostatakrebspatienten können IMBs beispielsweise mit einem Cocktail aus EpCAM- und PSMA-Antikörpern funktionalisiert werden, um die Einfangeffizienz zu verbessern. Darüber hinaus kann die ausschließliche Verwendung von EpCAM-basierter Erfassung zum Verlust von mesenchymalen CTCs führen, die eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben. Um dieses Problem zu lösen, können zusätzliche Antikörper gegen das Hitzeschockprotein 70 (HSP-70) oder das Zelloberflächenvimentin (CSV) eingebaut werden, um CTCs in verschiedenen EMT-Stadien einzufangen.

Da die HB-Chips für die CTC-Erfassung und -Reinigung auf Mikrofluidik basieren, ist eine sorgfältige Handhabung während der Experimente unerlässlich. Vor dem Einbringen von Reagenzien in den Chipeinlass müssen alle Luftblasen entfernt werden, und sowohl der Einlass als auch der Auslass können abgedichtet werden, um eingeschlossene Luft zu eliminieren. Darüber hinaus sollten Reagenzien schnell (innerhalb von 1-2 s) eingeführt werden, da eingeschlossene Luftblasen den Durchgang von IMBs und Zellen behindern können, was die Abscheidungseffizienz und -reinheit erheblich verringert. Darüber hinaus ist, wie bereits erwähnt, die gleichmäßige Verteilung der IMBs entscheidend für eine erfolgreiche CTC-Erfassung. Nach dem Laden der IMBs muss der Chip senkrecht auf dem Magneten platziert und mindestens fünf Minuten lang in Position gehalten werden, um zu verhindern, dass Änderungen im Magnetfeld die IMB-Verteilung stören. Insbesondere sollte die im Protokoll angegebene Zelllastflussrate auf der Grundlage verschiedener Probentypen optimiert werden. Zum Beispiel weisen Leukopak-Proben erhöhte Leukozytenkonzentrationen und Viskositäten auf. Wenn die Durchflussrate zu schnell ist, kann dies effiziente Wechselwirkungen zwischen CTCs und IMBs behindern, wodurch ein akkumulierter magnetischer Einfang verhindert und somit die CTC-Reinheit verringert wird. Um die Leistung unserer CTC-Isolations- und -Reinigungsplattform bei der Verarbeitung klinischer Blutproben zu bewerten, haben wir PB von mehreren gesunden Spendern gesammelt und eine kleine Anzahl von LNCaP-Zellen (ca. 50-100 Zellen pro ml) in die Proben gespickt. Obwohl die Plattform eine hohe Einfangeffizienz und Reinheit für Tumorzellen in PB-Proben aufwies, war ihre Leistung etwas geringer als die in den PBS-basierten Zellproben beobachtete (Abbildung 2D, Abbildung 2E und Abbildung 2G). Wir spekulieren, dass diese Diskrepanz auf die höhere Viskosität des Blutes und das Vorhandensein von reichlich roten Blutkörperchen und Blutplättchen im Vergleich zu PBS zurückzuführen ist. Daher können bei der Handhabung klinischer Blutproben Vorbehandlungsschritte wie die Lyse roter Blutkörperchen oder die PBMC-Extraktion in Betracht gezogen werden, um die Leistung zu verbessern.

Ähnlich wie HB-Chips erfordert der mikrofluidikbasierte Einzelzell-Barcode-Chip eine sorgfältige Handhabung, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Angesichts der Vielfalt der beteiligten Reagenzien können einige Reagenzien vor Beginn der Chipvorgänge vorbereitet werden (Tabelle 1). Beim Laden von Zellen und Kügelchen ist eine sorgfältige Kontrolle der Injektionsgeschwindigkeit erforderlich, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, da die Zellen eine geringere Dichte haben, während die Kügelchen mit Barcode dichter sind. Typischerweise sollte die Zellsuspension langsam über 3~5 s hinzugefügt werden, gefolgt von der schnellen Zugabe der Perlensuspension innerhalb von 1~2 s. Führen Sie nach dem Laden der Zellen und Kügelchen zwei Aspirations- und Dispensierungsrunden durch und platzieren Sie den Chip dann auf einem Schüttler, um den kumulativen Erfassungsprozess abzuschließen. Dieser Schritt ist entscheidend für die Verbesserung des Belegungsverhältnisses und der Paarungsrate. Während der Zelllyse wird eine Ölversiegelungsmethode verwendet, um die Oberflächen der Mikrowells zu isolieren und eine Kreuzkontamination zwischen den Wells zu verhindern. Insbesondere sollte Mineralöl unmittelbar nach der Lyse ohne Verzögerung zugegeben werden. Nach der Lyse erfolgt die barcodierte Bead-Rückgewinnung, indem der Magnet langsam vom Einlass zum Auslass bewegt wird, um eine hohe Bead-Rückgewinnungsrate zu gewährleisten. Bei Bedarf kann dieser Schritt mehrmals wiederholt werden. Schließlich werden die zurückgewonnenen magnetischen Kügelchen im Zentrifugenröhrchen einer RT, einer Zweitstrangsynthese, einer PCR-Amplifikation und einem Bibliotheksaufbau unterzogen, gefolgt von Next-Generation-Sequencing (NGS).

Diese integrierte mikrofluidische Plattform birgt ein erhebliches Potenzial für klinische Anwendungen. Durch die Verbesserung der Effizienz und des Durchsatzes der CTC-Isolierung erhöht es die CTC-Detektion in Stadien mit geringer Tumorlast und ermöglicht die Etablierung eines Klassifikationsmodells, das die CTC-Zählung mit dem Tumor-Staging verbindet. Diese Weiterentwicklung bietet einen neuartigen Ansatz für die Krebsdiagnose, die Therapieüberwachung, die Prognosebewertung und die Vorhersage eines erneuten Auftretens. Darüber hinaus ermöglicht die einzelzelluläre Transkriptomanalyse von CTCs die Identifizierung wichtiger molekularer Merkmale, einschließlich essentieller Genwege, Interaktionsnetzwerke und Biomarker-Gene. Diese Analyse bietet Einblicke in die kritischen Faktoren, die die Metastasierung von Krebs im Frühstadium antreiben, und enthüllt die molekularen Mechanismen, die der Bildung metastasierender Läsionen zugrunde liegen, und bietet potenzielle therapeutische Ziele für Patienten mit rezidivierendem oder metastasierendem Krebs. Darüber hinaus ist diese Plattform hochgradig skalierbar. Es kann an spezifische analytische Anforderungen angepasst und erweitert werden, um Multi-Omics-Analysen, einschließlich Transkriptomik und Genomik, zu unterstützen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82227801) unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilan Sigma Aldrich175617-100GMPTS-Lösung
20& Mal; SSC-PufferSangon BiotechB548109-0200
5& Mal; RT-PufferSangon BiotechB610020-0500
Biotinylierter CD45-Monoklonaler AntikörpereBioscience13-0459-82Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
Biotinylierter EpCAM-monoklonaler AntikörpereBioscience13-9326-82Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
Rinderserumalbumin (BSA)Sangon BiotechA600332-0100Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
DEKODER-Cartridge-ChipDynamische Biosysteme2203106Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
DECODER-Kartuschenreagenz-KitsDynamische Biosysteme2203206Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
DEPC behandeltes WasserSangon BiotechB501005-0500
D-PBSSangon BiotechE607009-0500Enthält: NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,10 mM; KH2PO4 1,47 mM. pH=7,2-7,4 
DTTThermowissenschaftlichR0861Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
Dynabeads MyOne SA T1Invitrogen65602SA-MBs, 1 & mu; m
EDTASangon BiotechB540625-05000,5 M, pH = 8,0
KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKK26012& Male; PCR-Reaktionsmischung
Lithiumchlorid-Ausfällungssoln.InvitrogenAM94800.2 &Mikro; m gefiltert
N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimidesterThermowissenschaftlich22309GMBS-Lösung
Pluronic F-68Sangon BiotechA600749-0025
Qubit 1& Times; dsDNA HS Assay KitThermowissenschaftlichQ33231
SDS-LösungSangon BiotechB648118-010010 % Sicherheitsvorsorge
StreptavidinSigma Aldrich189730Lagerung bei 2 °C; C bis 8 Grad; C 
SU-8-PhotoresistMicroChemSU-8 3050
SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-KitDow Corning4019862
Tris-HCl (pH 7,5)LEAGENENR00721 mol/L, pH = 7,5, frei von RNasen
Tris-HCl (pH 8,0)LEAGENENR00731 mol/L, pH = 8,0, frei von Rnase
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
Trueprep DNA Library Prep Kit V2 für Illumina VazymeTD502DNA-Bibliotheks-Vorbereitungsset
Tween-20Sangon BiotechA600560-0500
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411Festphasen-reversible Immobilisierung (SPRI) magnetische Perlen zur DNA-Reinigung

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