Zubereitung von Pflanzenextrakten
Ein erstes Exemplar von Piper amalago var. amalago wurde im Februar 2018 gesammelt und über einen Zeitraum von 72 Stunden an der Luft trocknen gelassen. Das Exemplar wurde von dem Botaniker und dem Herbariumskurator identifiziert. Das Exemplar wurde unter den Gutscheinnummern 36616 und 36617 montiert und im Herbarium der University of the West Indies in Mona, Jamaika, deponiert. Nachfolgende Pflanzenproben wurden entnommen, um Ethanol- oder Hexanextrakte herzustellen. Die Extraktionen wurden wie folgt durchgeführt: Die getrockneten Blätter, Stängel sowie Blätter und Stängel wurden pulverisiert und dann 72 Stunden lang in 350 ml Ethanol oder Hexan in analytischer Qualität getaucht. Nach Ablauf der 72 Stunden wurde jeder Extrakt mit einem mit 90 mm dickem Filterpapier ausgekleideten Büchner-Trichter mit einer angebrachten Vakuumpumpe abgesaugt, um die Pflanzenpartikel vom Extrakt zu trennen. Der Extrakt wurde dann durch Rotationsverdampfung konzentriert, dekantiert und unter einen Abzug gelegt, um überschüssiges Lösungsmittelzu entfernen 23. Die endgültige Masse jedes Extrakts wurde erhalten. Um eine mögliche Oxidation der Extrakte zu verhindern, wurde routinemäßig Pflanzenmaterial gesammelt und extrahiert.
Mückenzucht
Ae. aegypti-Larven und -Puppen wurden zunächst im September 2019 von Mückenbrutstätten in Gemeinden in den Gemeinden Kingston und St. Andrew (KSA), Jamaica51, gesammelt, und nachfolgende Generationen (F1 - F12) wurden aufgezogen. Die Mücken wurden in einem Inkubator bei einer konstanten Temperatur von 27 ± 2 °C und 70 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit gehalten. New Orleans (NO) Ae. aegypti-Stämme wurden als Kontrollstamm für alle Experimente verwendet. Routinemäßig wurden die Larven in Schalen gehalten und bis zur Verpuppung mit Koi-Pellets gefüttert. Die Puppen wurden entnommen und in Becher in Insektenaufzuchtkäfigen pro Stamm umgesiedelt. Erwachsene Mücken erhielten 10 % Saccharose ad libitum. Nachfolgende Mückensammlungen wurden durchgeführt, um ihre Populationen nahe an der von Feldmücken zu halten.
Prüfung der Insektizidresistenz (IR)
Die Anfälligkeit des KSA-Stammes gegenüber Deltamethrin wurde mit dem Flaschentest 52,53,54 der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bewertet. Flaschen-Bioassays wurden an erwachsenen Weibchen im Alter von 3-5 Tagen durchgeführt. Erwachsene, die nicht mit Blut gefüttert wurden (n = 20-25), wurden mit einem Aspirator, der durch Absaugung von der Inhalation angetrieben wurde, aus ihrem Käfig auf 250-ml-Flaschen übertragen, die mit Deltamethrin in der CDC-diagnostischen Dosis von 10 μg/Flasche vorbeschichtet waren. Die Kontrollflaschen wurden mit Aceton vorbeschichtet. Die Mortalität wurde alle 15 min bis zu 2 h53,54 aufgezeichnet. Mücken galten als tot, wenn sie nicht stehen konnten53,54. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Testmücken wurden nach der CDC-Richtlinie53,54 als anfällig oder resistent eingestuft.
Insektizider Assay - Topische Anwendung
Jeder vorbereitete Pflanzenextrakt wurde in Ethanol resuspendiert, um eine anfängliche Stammlösung (1 mg/μl) zu erhalten, und weiter seriell (0-0,25 mg/μl) mit Ethanol verdünnt. Der resuspendierte Extrakt wurde topisch auf den Thorax von 3-5 Tage alten, nicht blutgefütterten adulten weiblichen Mücken (n = 10) nach den zuvor veröffentlichten Methodenaufgetragen 23,24,55. Kurz gesagt, die weiblichen Mücken wurden mit einem Inhalationsaspirator aus ihrem Käfig in Becher umgesiedelt und auf Eis betäubt/niedergeschlagen. Der resuspendierte Extrakt von 0,2 μl wurde mit einer 10-μl-Spritze der Serie 700, die an einem Repeating-Dispenser befestigt war, auf den dorsalen Thorax aufgetragen. Für die Kontrollgruppe wurde Ethanol, 0,2 μl, topisch aufgetragen. Nach jeder Behandlungsexposition wurden die Mücken in Pappbecher umgefüllt und mit 10%iger Saccharoselösung gefüttert. Veränderungen des Fluges oder des Gangs der Mücken, falls vorhanden, wurden in den ersten 5 Stunden nach der ersten Exposition festgestellt. Die Mortalität wurde nach 24 Stunden unter normalen insektarischen Bedingungen gemessen. Jede Assay-Konzentration wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt.
Synergistische Assays
Um das Potenzial des Extrakts als Synergist zu bestimmen, wurde ein modifizierter Flaschenbioassay mit einem Synergisten verwendet23. Nicht mit Blut gefütterte weibliche Mücken, 3-5 Tage alt (n = 20-25), wurden topisch Pflanzenextrakt in der Letaldosis von 25% (LD25) Konzentration ausgesetzt, während sie betäubt/niedergeschlagen wurden, wie oben beschrieben. Die Mücken wurden in einen Netzbecher umgefüllt und 1 Stunde lang beobachtet. Nach 1 h aktivem Fliegen wurden die Mücken mit einem Aspirator, der durch Absaugung aus der Inhalation55 angetrieben wurde, vorsichtig aus den Bechern entfernt und dann in Flaschen überführt, die mit 10 μg Deltamethrin vorbeschichtet waren (insgesamt beschichtete Flaschen = 4). Ethanol wurde als Kontrollmittel für die topische Anwendung verwendet. Die Kontrollflaschen wurden mit Aceton beschichtet. Die Mortalitätsrate wurde alle 15 Minuten bis zu 2 Stunden oder bis zum Erreichen einer 100%igen Mortalität beobachtet. Die Wirksamkeit des Extrakts als Synergist wurde mit der eines bekannten Synergisten, Piperonylbutoxid (PBO), verglichen, wie zuvor vermutetwurde 53,54. Zunächst wurden die Mücken 1 h lang Flaschen ausgesetzt, die mit 400 μg PBO behandelt wurden. Nach der 1-stündigen Exposition wurden die Mücken dann in Netzbecher umgefüllt und mit einer 10%igen Zuckerlösung gefüttert. Nach 1 h wurden die Mücken mit Hilfe des Aspirators schonend auf Flaschen übertragen, die mit 10 μg Deltamethrin beschichtet waren (Gesamt beschichtete Flaschen = 4)53,54. Die Mücken wurden alle 15 Minuten bis zu 2 Stunden oder bis zu einer 100%igen Mortalität beobachtet. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt.
Charakterisierung von Pflanzenextrakten mittels Gaschromatographie - Massenspektrometrie (GC - MS) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Der Extrakt von P. amalago var. amalago wurde mittels GC-MS-System analysiert, das mit einem massenselektiven Detektor mit DB-5 ms-Säule gekoppelt war (60 m × 0,25 mm; 0,25 μm Schichtdicke). Als Trägergas wurde reines Helium mit einer Durchflussrate von 1 mL/min verwendet. Das Temperaturprogramm wurde bei 45 °C gestartet und mit einer Rate von 1 °C/min auf 280 °C erhöht, wo die Rate dann auf 2 °C/min erhöht wurde. Die Temperaturen des Injektors und des Detektors wurden bei 210 °C bzw. 220 °C gehalten. Das Injektionsvolumen des Extrakts betrug 1 μl. Die Retentionsindizes wurden nach dem Kovats-Verfahren berechnet. Die Verbindungen im Extrakt wurden durch einen Vergleich der Massenspektraldaten mit denen der Massenspektraldatenbank (NIST) 17 des National Institute of Standards and Technology identifiziert, wie zuvor beschrieben56.
Die Identifizierung der vorhandenen Verbindung erfolgte durch Vergleich des Extrakts mit einem Referenzstandard mittels HPLC. Die Trennung des Extrakts erfolgte mittels einer stationären HPLC. Die verwendete Säule war C-18 mit 75 % Acetonitril und 25 % Wasser als Lösungsmittel. Der Extrakt wurde gegen den wichtigsten sekundären Pflanzenstoff standardisiert, der durch die GC-MS-Analyse mit einer Sicherheit von 99 % identifiziert wurde.
In-vitro-Mücken-CYP-Assays
Die Michaelis-Menten-Kinetik wurde zunächst für CYP9J32 (90 pmol/ml; Km 19,52 μM) Enzym, die Konzentration, die im inhibitorischen Assay verwendet wird. Die CYP-Assays wurden unter Verwendung des gereinigten Piperinextrakts durchgeführt, der in einer Endkonzentration von 0,1 % Acetonitril gelöst war. Das fluorogene Substrat DEF wurde in DMSO gelöst. Die Endkonzentration von DMSO betrug 0,5 %. Eine Lösungsmittelkontrolle, die mit 0,5 % DMSO und 0,1 % Endacetonitril hergestellt wurde, wurde getestet, um etwaige Auswirkungen der Lösungsmittel über den gesamten Verdünnungsbereich zu korrigieren. Als Referenz zum Vergleich der inhibitorischen Eigenschaft von Piperin wurden Deltamethrin und PBO als Standardkontrollen verwendet. Das Verfahren folgte ähnlichen Methoden wie zuvor beschrieben23. Die enzymatischen Reaktionen wurden in 96-Well-Platten in 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung mit 5 mM MgCl2 durchgeführt, angepasst an pH 7,4, wobei die Konzentration der Testverbindung variiert wurde. Alle Reaktionen wurden 5 Minuten lang bei 37 °C vorinkubiert, während 420 U/min auf einem Schüttler gehalten wurden. Ein NADPH-erzeugendes System, das aus NADP+ (0,001 mM), Glucose-6-Phosphat (0,025 mM) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (5 Einheiten/ml) bestand, wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu initiieren. Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung betrug 200 μl. Die Reaktionen wurden bei 485 nm/530 nm (Anregung/Emission) mit einem Fluoreszenzspektrophotometer mit Inkubator und Shaker überwacht. Die inhibitorischen Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Untersuchungsergebnisse wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Homologie-Modellierung
Vorläufige Strukturmodelle für CYP9J32 (Ae. aegypti) wurden mit AlphaFold57 erstellt. Die Häm-Gruppe wurde nach einer strukturellen Ausrichtung mit Homo sapiens CYP3A4 (PDB-ID: 6DAA)58 positioniert. Eine molekulardynamische Simulation der Strukturkoordinaten für CYP9J32 im Wasser wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Parameter23 durchgeführt.
Molekulares Andocken
Die endgültigen Koordinaten der oben beschriebenen Molekulardynamik-Simulation wurden verwendet, um molekulare Docking-Analysen mit Piperin unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls23 durchzuführen.
Datenanalyse
Die Toxizitätsdaten bei der Verwendung von Insektiziden werden als % Mortalität ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Toxizitätstests für Pflanzenextrakte wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Daten der Toxizitätstests für Pflanzenextrakte werden als letale Dosen (Konzentration des Pflanzenextrakts pro Körpergewicht des weiblichen Ae. Aegypti) bei einer Mortalität von 50 % und 95 % ± einem Konfidenzintervall von 95 % (95 % KI) pro Population (R-Version 3.6.2). Die Mortalität in der Kontrollgruppe betrug bei allen Toxizitätstests weniger als 20 %. Abbotts Formel wurde verwendet, um die Mortalitätsrate in jeder behandelten Gruppe bei Bedarf zu korrigieren72. Die statistischen Auswertungen wurden mit SPSS für Windows (Version 17.0) durchgeführt. Eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um nach Möglichkeit signifikante Unterschiede (p < 0,05) zwischen den Mittelwerten zu bestimmen.