Methodenartikel

Verbesserung der Technologie für chimäre Antigenrezeptor-extrazelluläre Vesikel (CAR-EV): Die Zukunft der Krebstherapie

DOI:

10.3791/68726

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19. September 2025

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1INOVIQ Ltd., 2Centre for Clinical Research, Faculty of Medicine, The University of Queensland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel (EVs) hat das Potenzial, die Krebsbehandlung und die Verabreichung von Medikamenten zu revolutionieren. Von chimären Antigenrezeptoren (CAR) abgeleitete EVs (CAR-EVs), die mittels Ionenaustauschchromatographie isoliert wurden, weisen eine erhöhte Frachtkapazität auf, was ihre funktionelle Wirksamkeit erheblich verbessert. In dieser Studie werden CAR-EVs weiter charakterisiert, um ihre biologische Aktivität und ihr therapeutisches Potenzial aufzuklären.

Zusammenfassung

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CAR-Zelltherapien haben die personalisierte Behandlung mehrerer hämatologischer Malignome erheblich verbessert. Derzeit sind sieben CAR-Zell-Produkte von der Food and Drug Administration (FDA) und sechs von der Europäischen Arzneimittelagentur (EMA) zur Behandlung von Lymphomen, multiplen Myelomen und chronischer lymphatischer Leukämie zugelassen. Es gibt noch einige Herausforderungen und Einschränkungen, wobei das Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS) und das Immuneffektorzell-assoziierte Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) die wichtigsten sind. Zellfreie Therapien, wie z. B. CAR-EVs, bieten substanzielle Vorteile gegenüber ihren zellulären Pendants. Dazu gehören eine verstärkte Tumorinfiltration und das Potenzial für eine wiederholte Verabreichung bei gleichzeitiger Minimierung des Risikos von CRS, ICANS und anderen unerwünschten Nebenwirkungen. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit von CAR-EVs durch die Einbeziehung von zytotoxischen Wirkstoffen und funktionsmodifizierenden Ribonukleinsäuren (RNAs) optimiert werden. Darin berichten wir über die Entwicklung einer skalierbaren CAR-EV-Plattform zur Herstellung von tunablen CAR-EVs. Diese Plattform umfasst das Engineering und die Vorkonditionierung von EV-Produzentenzellen (z. B. CAR-T- und CAR-Natural Killer (CAR-NK)-Zellen), die Isolierung und Anreicherung von CAR-EVs unter Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie-Plattform (IEX) nach Good Manufacturing Practice (GMP), die vollautomatische Hochdurchsatz-Analyse von EV-Subpopulationen und In-vitro Bewertung der funktionellen zytotoxischen Aktivität von CAR-EV. Die Plattform wurde unter Verwendung von CAR-NK-EVs und CAR-T-EVs sowohl für hämatologische als auch für solide Tumorzelllinien validiert. Die CAR-EV-Plattform stellt einen vielversprechenden Ansatz für die schnelle Entwicklung von handelsüblichen therapeutischen CAR-EVs dar, die auf spezifische Krankheitsindikationen zugeschnitten sind und das Potenzial haben, unerwünschte Nebenwirkungen im Zusammenhang mit CAR-Zell-basierten Therapien zu reduzieren.

Einleitung

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CAR-Zell-basierte Therapien sind für die Behandlung hämatologischer Malignome zugelassen, jedoch bestehen nach wie vor erhebliche Herausforderungen und Einschränkungen1. Insbesondere die Risiken von CRS und ICANS bleiben kritische Faktoren bei der Beurteilung der Eignung von Patienten für die CAR-Therapie, was die Notwendigkeit kontinuierlicher Fortschritte bei den Behandlungsstrategien unterstreicht2.

EVs, die von CAR-Zellen abgeleitet sind (CAR-EVs), haben sich als wirksamere und potenziell sicherere allogene Therapieoption erwiesen. Solche EVs bieten mehrere Vorteile, darunter eine verringerte Immunogenität, ein geringeres Risiko für CRS, eine verbesserte Tumorinfiltration, die Eignung für wiederholte Verabreichungen, das Potenzial für Kombinationstherapien sowie effiziente Produktions- und Lagerprozesse3. Biologisch gewonnene EVs können so verändert werden, dass sie krebsbekämpfende Moleküle exprimieren, die mit hoher Affinität an spezifische Oberflächenrezeptoren auf Krebszellen binden. Nach der Modifikation stellen diese Designer-Elektrofahrzeuge eine vielversprechende Strategie für die selektive Verabreichung von therapeutischer Fracht dar, mit dem Potenzial, Off-Target-Effekte zu minimieren. Diese aus CAR-Zellen gewonnenen Elektrofahrzeuge weisen verbesserte funktionelle Eigenschaften auf, die eine präzisere und wirksamere therapeutische Verabreichung ermöglichen. Ihre inhärenten Eigenschaften bieten mehrere Vorteile, die zusammen zu einer verbesserten Wirksamkeit der Behandlung beitragen.

Zwei Haupthürden für den effektiven Einsatz von Elektrofahrzeugen in der Klinik sind Skalierbarkeit und Wirksamkeit. Die hierin beschriebenen Methoden weisen eine inhärente Skalierbarkeit auf und sind über ein breites Spektrum experimenteller Paradigmen hinweg leicht anpassbar. Die Hochskalierung der EV-Produktion auf die Herstellung in klinischer Qualität ist ein Bereich der aktiven Entwicklung, der jedoch weitere Optimierungen erfordert, um ausreichende Mengen an Material in klinischer Qualität zu generieren4. Wichtig ist, dass neuere Studien vielversprechende Ansätze zur Verbesserung der EV-Wirksamkeit gezeigt haben, wie z. B. die Präkonditionierung von Elternzellen mit Interleukinen (z. B. IL-7, IL-15, IL-21) und die Erzeugung von EVs unter hypoxischen (1-2 %O2) Bedingungen 5,6,7.

Ziel dieser Studie war es, das therapeutische Potenzial von CAR-EVs, die auf den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) abzielen, in vitro unter Verwendung von MCF-7-Brustkrebszellen und K562-myeloischen Leukämiezellen zu untersuchen. EVs wurden mittels IEX aus zellkonditionierten CAR-Medien (CM) isoliert und angereichert, mittels Nanopartikel-Tracking und Western-Blot-Analyse charakterisiert und funktionellen Assays unterzogen. CAR-EVs, die endogene zytotoxische Fracht enthalten, induzierten in vitro effektiv den Zelltod. Die gewonnenen Daten belegen die Machbarkeit einer skalierbaren, zielgerichteten EV-Produktion für therapeutische Anwendungen.

Protokoll

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HINWEIS: Behandeln Sie alle lebenden Zellen in einem zertifizierten Schrank der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) mit geeigneter PSA (z. B. Handschuhe, Laborkittel). Biologisch gefährliche Materialien, wie z. B. Zellpellets, die lebende Zellen enthalten, müssen mit einer endgültigen 10%igen Natriumhypochloritlösung (Bleichlösung) dekontaminiert werden.

1. Zellkultur und CM-Entnahme

  1. Kultivierung von CAR-Zellen
    HINWEIS: Obwohl die in dieser Studie verwendeten lentiviral transduzierten CAR-Zellen ausgelagert wurden, bleibt das Protokoll auf CAR-T/NK-Zellen anwendbar, die intern mit Standard-Zell-Engineering-Techniken erzeugt wurden.
    1. Halten Sie CAR NK/T-Zellen in xenofreier Kultur (Wachstumsmedium ergänzt mit 100 IE/ml IL-2) bei einer Dichte von 0,5-1 x 106/ml, in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C (5 % CO2, 21 % O2). Überwachen Sie alle 2-3 Tage und begrenzen Sie die Zellzahl aufgrund von Einschränkungen der Durchgangskapazität auf 3 Mal wöchentlich.
    2. Bestätigen Sie die CAR-Expression durch Mikroskopie und stellen Sie sicher, dass die Zellen fluoreszierend sind (falls entsprechend markiert). Zellen in gesunden Klumpen sind ein Hinweis auf eine robuste CAR-Zellkultur.
  2. CM-Kollektion
    1. Sobald die Zellkulturen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und bestimmen Sie die Dichte lebender Zellen mit Hilfe der automatisierten Zellzählanalyse mit Trypanblau.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g (Raumtemperatur) für 5 min, um ein Pellet zu bilden.
    3. Den Überstand vorsichtig auffangen und bei 3.000 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren, um ihn zu klären.
    4. Lagern Sie das geklärte CM bei -80 °C, bis es für die EV-Anreicherung bereit ist.

2. Isolierung und Anreicherung von Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Die folgenden Methoden skizzieren zwei Ansätze für die Anreicherung extrazellulärer Vesikel (EV): die IEX-Methode, die für die EV-Isolierung für funktionelle In-vitro-Analysen entwickelt wurde, und die Pan-Exosomen-Capture-Hochdurchsatzmethode, die für nachgelagerte Charakterisierungsstudien optimiert ist.

  1. Anreicherung von funktionsfähigen CAR-EVs über IEX
    HINWEIS: Alle volumetrischen Spezifikationen werden als Säulenvolumen (CV) ausgedrückt und spiegeln das proportionale Verhältnis zwischen dem Reagenzvolumen und dem Harzbettvolumen innerhalb der chromatographischen Säule wider.
    1. Bringen Sie die IEX-Säule (siehe Materialtabelle für Details zur verwendeten Säule) auf Raumtemperatur (RT), indem Sie sie vor dem Gebrauch 15 Minuten stehen lassen. 10 CV Regenerationspuffer zugeben, gefolgt von der Äquilibrierung mit 10 CV isotonischem Gleichgewichtspuffer (bei pH 7,4) (siehe Materialtabelle für Details zu den Puffern).
      HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht über einen längeren Zeitraum trocken laufen. Halten Sie die Säule immer aufrecht.
    2. Tauen Sie das CM auf und passieren Sie einen 0,22 μm Polyethersulfon (PES)-Filter.
    3. Geben Sie die Probe in die äquilibrierte Säule (bis zu 31,2 CV), gefolgt von 10 CV isotonischem Waschpuffer (bei pH 7,4). Fügen Sie 2,5 CV hypertonen Elutionspuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und sammeln Sie den Durchfluss, da es sich um die EV-Eluatprobe handelt.
    4. Führen Sie einen Pufferaustausch des EV-Eluats mit handelsüblichen Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltern (30 kDa-Cutoff) und einer isotonischen Lösung als Verdünnungsmittel durch, um einen minimalen Verdünnungsfaktor von 100x zu gewährleisten. Das Zielvolumen nach dem Pufferaustausch kann vom Benutzer entsprechend seinen experimentellen Parametern bestimmt werden.
    5. Führen Sie einen abschließenden Filtrationsschritt mit einem 0,22-μm-Filter durch, um die angereicherten EVs für In-vitro-Funktionsassays zu sterilisieren.
    6. Bestimmen Sie die Größenverteilung, Konzentration und Ausbeute von CAR-EV mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)8,9.
  2. Hochdurchsatz-Pan-Exosomen-EV-Isolierung (über ein automatisiertes Aufreinigungssystem, das bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt wird) zur Charakterisierung eines begrenzten oder großen Arrays von Proben10,11.
    1. Bereiten Sie drei 96 Deep-Well-Platten (DW) mit 1 ml 1x PBS pro Well vor.
    2. Erstellen Sie eine "Elutions"-Platte, indem Sie 35 μl 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer in jede Vertiefung geben.
    3. Bereiten Sie eine "Binding"-Platte vor, die 1 ml der CM-Probe und 30 μl EXO-NET Pan-Exosomen-Capture-Kügelchen pro Vertiefung enthält.
    4. Nehmen Sie die folgenden Einstellungen für das automatische Isolationssystem vor:
      1. Schritt 1: Tipp aufnehmen: Stellen Sie sicher, dass das Isolationsprotokoll damit beginnt, dass das Gerät in einen 96-Deep-Well-Spitzenkamm einrastet, um die Manipulation der magnetischen Beads während des gesamten Isolationsprozesses zu ermöglichen.
      2. Schritt 2: Stellen Sie sicher, dass die CM-Probe und die magnetischen Beads 30 Minuten lang unter kontinuierlichen Bedingungen mit langsamer Geschwindigkeit gemischt werden, um ein effizientes Einfangen von EVs auf den magnetischen Partikeln zu ermöglichen. Nach dem Mischen sind 5 Zyklen von je 30 s enthalten, um das Einfangen der magnetischen Kügelchen zu gewährleisten.
      3. Schritt 3: Stellen Sie sicher, dass jeder der drei Waschschritte eine sanfte 30-Sekunden-Mischung mit langsamer Geschwindigkeit verwendet, um unspezifisch gebundene Verunreinigungen zu entfernen und gleichzeitig die Integrität der gebundenen Elektrofahrzeuge zu erhalten. Wie zuvor endet der Schritt mit 5 Zyklen von je 30 s, um die magnetischen Kügelchen einzufangen.
      4. Schritt 4: EV-Protein-Elution (Lyse): Stellen Sie sicher, dass gebundene EVs für die Proteinrückgewinnung in einem zweistufigen Prozess lysiert werden. Ein erstes Mischen für 30 s (Bottom-Mixing) wird durchgeführt, bevor eine Inkubation für 7 min und 30 s im pausierten Zustand durchgeführt wird, wobei die Spitzenposition über der Vertiefung gehalten wird. Nach Ablauf der Zeit gibt es eine zweite 30 s Vermischung und Pause für weitere 7 min und 30 s. Abschließend werden 5 Zyklen à 30 s eingebaut.
      5. Schritt 5: Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass sich der Proteingehalt im Puffer befindet, während die Kügelchen an der Spitze befestigt sind. Nach dem Elutionsschritt wird der verwendete Spitzenkamm verworfen, wodurch das Protokoll abgeschlossen ist.
        HINWEIS: EXO-NET Pan-Exosome Capture Kügelchen enthalten 0,05 % (w/w) Konservierungsmittellösung. Obwohl sie nach den Vorschriften der Occupational Safety and Health Administration (OSHA) nicht als gefährlich eingestuft ist, sollte bei der Handhabung geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet werden, insbesondere im Zusammenhang mit Bioflüssigkeiten.

3. Charakterisierung von EVs mittels Western Blotting

HINWEIS: CAR-EVs wurden durch Western Blot (Granzym B und Calnexin) charakterisiert, im Vergleich zu Zellen als Kontrolle.

  1. Bereiten Sie Zelllysate vor, indem Sie 10 μl 1x Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer (mit Proteaseinhibitoren) pro 1 × 106 Zellen hinzufügen. 30 Minuten auf Eis inkubieren und dann 15 Minuten lang bei 14.000 × g (4 °C) zentrifugieren, um Zelltrümmer zu entfernen. EVs können mit demselben Puffer oder 1 % SDS lysiert werden.
  2. Quantifizieren Sie die Proteinmenge mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay (oder einem geeigneten Nanospektrophotometer).
  3. Montieren Sie ein 4-12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel in einem Elektrophoresegerät gemäß dem Protokoll des Herstellers. Bereiten Sie Proteinlysate mit Laemmli-Puffer vor.
    HINWEIS: Gelsysteme können je nach Marke variieren
  4. Laden Sie 5 μg Probe in jede Vertiefung und lassen Sie die Gele 20 Minuten lang bei 200 V laufen.
  5. Führen Sie einen Western-Transfer mit Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen durch und blockieren Sie die Blots mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (1x TBST).
  6. Inkubieren Sie die Blots in primären monoklonalen Antikörpern (Granzym B und Calnexin, 1 zu 500 Verdünnung in einer Lösung von 5 % BSA in 1x TBST), stagnierend (nicht schüttelnd) und über Nacht bei 4 °C.
  7. Am nächsten Tag waschen Sie die Blots 3x für jeweils 5 min mit 10-15 mL 1x TBST, bevor Sie in Sekundärantikörper inkubieren (speziesabhängig, 1 zu 1.000 Verdünnung in einer Lösung von 5% BSA in 1x TBST für 1 h bei RT). Erkennen Sie Banden mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL), wobei Bilder über eine CCD-Digitalkamera (Charged-Coupled Device) aufgenommen werden.

4. Funktioneller Assay (über MTS)

HINWEIS: Die Zytotoxizität wurde durch einen In-vitro-MTS-Assay [(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] untersucht, bei dem Zellen die Tetrazoliumverbindung zu einem löslichen farbigen Formazanprodukt reduzieren, das bei einer Extinktion von 490 nm messbar ist. MCF-7-Brustkrebs- und K-562-Blutkrebszellen wurden in drei unabhängigen Experimenten bis zu 3 Tage lang mit steigenden Konzentrationen (0-500.000 Partikel/Zelle) von CAR-EVs behandelt.

  1. Keimen Sie 5.000 Empfängerzellen pro Well (50 μl/Well) in einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Reservieren Sie eine Spalte für das leere Medium (für die Hintergrundsubtraktion des MTS-Reagenzes). Vermeiden Sie Randvertiefungen und füllen Sie sie mit 200 μl sterilem Wasser.
    HINWEIS: Adhärente Zellen sollten einen Tag im Voraus plattiert werden, um die zelluläre Anhaftung an die Plattenoberfläche vor der Behandlung sicherzustellen.
  2. Fügen Sie EVs in zunehmender Menge hinzu (z. B. 2,5 x 105 und 4,5 x 105 oder 0,5, 0,75 und 1 Million EVs pro Zelle). Eingeschlossene Kontrollen: "Kein EV", 1x PBS "EV-Puffer" und eine positive Zellabtötungskontrolle (z. B. ein zielspezifischer niedermolekularer Inhibitor oder 0,1 % TX-100).
  3. Inkubieren Sie die Zellen in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C (5 % CO2, 21 % O2) für 2-3 Tage.
  4. Untersuchen Sie die Zellen zum angegebenen Behandlungszeitpunkt mit dem Mikroskop. Fügen Sie das MTS-Reagenz hinzu (20 μl pro 100 μl Kultur pro Well). Inkubieren Sie zwischen 1 und 4 Stunden und messen Sie die Extinktion stündlich mit einem Plattenlesegerät bei 490 nm.
  5. Subtrahieren Sie den Absorptionswert des leeren Mediums für die Datenanalyse. Berechnen Sie Statistiken mit dem Student-t-Test für Vergleiche mit zwei Gruppen oder mit der unidirektionalen ANOVA mit mehreren Vergleichen für drei oder mehr Gruppen.

Ergebnisse

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Ein typischer Arbeitsablauf der CAR-T/NK-Zellkultivierung, gefolgt von der EV-Isolierung, Charakterisierung und Verwendung von EVs in einem funktionellen Assay, ist in Abbildung 1 dargestellt. CM aus der Kultivierung von CAR-T/NK-Zellen wird vor der EV-Anreicherung und der nachgelagerten Charakterisierung (einschließlich Nanopartikel-Tracking-Analyse) gesammelt und die funktionelle Aktivität mit einem Multi-Well-Platten-MTS-Assay bewertet (Abbildung 1).

GFP-markierte CAR-Zellen können mittels Mikroskopie sichtbar gemacht werden, um die Expression des CAR-Konstrukts in Kultur zu bestätigen. Die Mikroskopie sollte als Routineschritt vor und während der Entnahme des CM durchgeführt werden, um eine ausreichende Transduktionseffizienz zu gewährleisten. Es ist wichtig, Hellfeld- und GFP-Kanäle zu überlagern, um potenzielle Autofluoreszenz bei der Bewertung des Wirkungsgrads zu erfassen. Bemerkenswert ist, dass T-Zellen eine Tendenz zur natürlichen Verklumpung besitzen (ähnlich beobachtet bei NK-Zellen; Daten nicht gezeigt), und Fluoreszenz kann deutlich beobachtet werden, wenn Zellen einen verklumpten Phänotyp aufweisen (Abbildung 2).

Nach der EV-Anreicherung können EVs mittels NTA und westlichem Immunblotting charakterisiert werden. Mit Hilfe von NTA kann die Analyse der Partikelausbeute eine erhöhte Konzentration in den isolierten EVs im Vergleich zu CM bestätigen (Abbildung 3A). Western-Blot-Daten bestätigen ferner die Expression des zytolytischen Markers Granzym B in CAR-Zellen und EVs und die Abwesenheit von Calnexin in letzteren, was die Abwesenheit von zellulärem Material in Präparaten bestätigt. HEK293T Zellen sind als CAR-Negativkontrolle enthalten (Abbildung 3B).

Die Analyse der EV-Funktionalität wurde mittels MTS-Assay durchgeführt, um die Lebensfähigkeit/Proliferationskapazität der Zellen zu bestimmen. Die Wirkung von EGFR- und HER2-gerichteten CAR-EVs auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von MCF-7-Brustkrebs- und K562-Blutkrebszellen wird durch Messung des kolorimetrischen MTS-Reagenzes bei einer Extinktion von 490 nm (nach Entfernung des Hintergrundsignals) bestimmt. In diesem Beispiel reduzierte EGFR, das auf CAR-EVs abzielte, die Viabilität von MCF-7- und K562-Zellen um 70 % bzw. 40 %. HER-2, das auf CAR-EVs abzielte, reduzierte MCF-7 um ~10 % (wie durch den Student's t-Test bestimmt). Unter Berücksichtigung des experimentellen Aufbaus kann die Verwendung eines nicht-parametrischen Tests (z. B. Mann-Whitney U) in nachfolgenden Studien robustere Erkenntnisse bieten (Abbildung 4).

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Abbildung 1: CAR-EV-Generierung, Anreicherung, EV-Charakterisierung und Funktionsauslesung. Schematisches Diagramm, das einen typischen Arbeitsablauf für die Erzeugung, Produktion und Charakterisierung von angereicherten CAR-EV-Proben vor der Analyse der Funktionalität darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentative mikroskopische Analyse durch Bestätigung der GFP-Expression in HER2-targetingierenden CAR-T-Zellen. Die Bilder wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Der weiße Maßstabsbalken stellt eine Länge von 50 μm dar. T-Zellen haben eine natürliche Tendenz, in Klumpen zu wachsen, bevor sie sich in einzelne Zellen ablösen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Charakterisierung von CAR-Zellen und EVs. (A) Nano-Tracking-Partikelanalyse von CAR-T CM und angereicherten EVs. Die Partikelkonzentration von EVs war 1,6-2,1-mal höher als die von CM, während die Proteinkonzentration um >80% reduziert wurde. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit der Einweg-ANOVA und dem Mehrfachvergleichstest von Tukey getestet; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) Die Western-Blot-Analyse von transduzierten T-Zellen und angereicherten CAR-EVs bestätigte das Vorhandensein von zytolytischem Granzym B sowohl in CAR-Zellen als auch in EVs, während in HEK293T Nicht-CAR-Zellen ein Fehlen festgestellt wurde. Calnexin wurde in CAR-EV nicht nachgewiesen, was auf eine geringe Kontamination durch endoplasmatische Retikulumpartikel hinweist. Proteinbelastung pro Bahn = 5 μg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Wirkung von CAR-EVs auf die Lebensfähigkeit der Zielzellen (MCF-7 Brustkrebszellen und K562 chronische myeloische Leukämie-Zelllinie). Die Zielzellen wurden mit einer Einzeldosis von 4,5 x 105 und 2,5 x 105 EVs/Zelle (EGFR bzw. HER2 CARs) oder Kontrolle (EV-Puffer) für bis zu 3 Tage behandelt. (A) CAR-EVs-Zellen, die auf EGFR abzielen. (B) HER2-zielgerichtete CAR-EVs. In beiden Zelllinien wurde eine Abnahme der Absorptionswerte (ein Hinweis auf die Wirksamkeit der Behandlung) beobachtet. Die Daten stellen die mittlere Absorption ± SD (n = 3) dar, die mit einem zweiseitigen, ungepaarten Student's t-Test analysiert wurde, wobei die p-Werte eine statistische Signifikanz anzeigen; ** p≤ 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Die Kombination der nachgewiesenen Wirksamkeit der CAR-Therapie mit den vielversprechenden Vorteilen einer auf extrazellulären Vesikeln (EV) basierenden Therapie kann die Wirksamkeit von Krebsbehandlungen verbessern, wie in Studien zur Behandlung von Brust- und Lungenkrebs gezeigtwurde 12,13. Der CAR-EV-Therapieansatz adressiert die aktuellen Einschränkungen der CAR-Therapie, wie z. B. Herausforderungen bei der Verabreichung und die damit verbundene Toxizität, und nutzt gleichzeitig die Biokompatibilität und die Targeting-Fähigkeiten von EVs. Die Integration dieser Modalitäten kann die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Krebs erleichtern und die Möglichkeiten für die Anwendung von EVs im klinischen Umfeld erweitern. Darüber hinaus bietet die Entwicklung und Anreicherung funktioneller EVs eine sicherere (durch Verkapselung der zytolytischen Fracht) und präzisere Methode (d. h. die Hinzufügung von Zieldomänen) für die Verabreichung von therapeutischer Fracht, insbesondere an schwierige Stellen wie den Tumorkern, das Knochenmark und Bereiche, die durch Barrieren wie die Blut-Hirn- oder Blut-Hoden-Schranke geschützt sind 14,15,16. Trotz der etablierten Methode der EV-Anreicherung mittels Ultrazentrifugation gibt es noch einige Einschränkungen. Zu den bemerkenswerten Einschränkungen gehören: Skalierbarkeit, Co-Isolierung von Verunreinigungen und begrenzte Ausbeute nach der Produktion17. Es besteht ein klarer Bedarf an verbesserten Prozessen zur Erzeugung therapeutischer EVs in großem Maßstab.

Diese Proof-of-Concept-Studie zeigt, dass IEX eine skalierbare und effektive Methode zur Herstellung, Isolierung und Anreicherung funktionaler CAR-EVs ist, wobei geklärtes CM aus CAR-exprimierenden Zellen als Input verwendet wird. IEX ermöglicht die Verarbeitung mit hohem Durchsatz und unterstützt sowohl die Forschung als auch die Produktion im cGMP-Maßstab, wodurch die Qualitätskontrolle während des gesamten Arbeitsablaufs ermöglicht – von der EV-Generierung bis zur Prüfung des endgültigen Arzneimittels18,19. Während die EV-Charakterisierung für die Bestätigung der Funktion unerlässlich ist, kann die Ausbeute aufgrund von Unterschieden im Probenvolumen, der Eingangskonzentration und EV-spezifischen Eigenschaften wie Oberflächenladung und Bindungseigenschaften erheblich variieren. Interne Daten mit MCF-7-Zellen zeigen eine durchschnittliche Vorreinigungsausbeute von ~2,85 × 108 Partikeln/ml, wobei die Konzentrationen nach der Reinigung typischerweise zwischen 3 × 1011 und 1 × 1012 Partikeln/ml liegen. Diese Pegel können angepasst werden, indem das Resuspensionsvolumen während des Pufferwechsels an die nachgelagerten Anforderungen angepasst wird. Angesichts dieser Variabilität wird den Anwendern dringend empfohlen, das Protokoll mit CM zu optimieren, das für ihren Versuchsaufbau relevant ist, um reproduzierbare und robuste Erträge zu gewährleisten.

Mehrere Schritte innerhalb des Protokolls sind entscheidend für die erfolgreiche Produktion von CAR-EVs, wobei der Schwerpunkt auf der Probenlade- und Elutionsphase liegt. Diese Schritte beeinflussen direkt die Effizienz der EV-Erfassung durch die Säule und damit den Gesamtertrag. Der Schritt des Pufferaustauschs ist von entscheidender Bedeutung, da eine unvollständige Entfernung überschüssiger gelöster Bestandteile die EV-Stabilität beeinträchtigen und im Laufe der Zeit zu einer Verschlechterung führen kann. EVs können dann mit Methoden wie NTA oder proteomic profiling charakterisiert werden. Wenn CAR-EVs für funktionelle Assays vorgesehen sind, wie z. B. zelluläre Aufnahmestudien oder therapeutische Eingriffe, ist die Sterilität von größter Bedeutung. Ein abschließender "terminaler" (0,22 μm) Sterilisationsschritt ist unerlässlich, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern, die die Versuchsergebnisse verfälschen oder Risiken für die biologische Sicherheit darstellen kann. Angesichts dieser Faktoren wird den Anwendern dringend empfohlen, bei diesen Schritten besondere Sorgfalt walten zu lassen, um die Reproduzierbarkeit und funktionelle Integrität der endgültigen EV-Zubereitung zu erhalten.

Mehrere Protokollmodifikationen können erforderlich sein, um häufige Probleme zu beheben, die bei der CAR-EV-Produktion auftreten. Eine geringe Ausbeute wird in der Regel durch eine suboptimale Beladung von CM verursacht, die die Bindungskapazität der Säule entweder über- oder unterschreitet. Um das optimale Eingangsvolumen zu bestimmen, ist es ratsam, eine CM-Titrationsstudie durchzuführen und die Last schrittweise zu erhöhen, um den Punkt der maximalen EV-Erholung zu identifizieren. Verstopfungen der Filter, die typischerweise während des letzten Sterilfiltrationsschritts beobachtet werden, resultieren häufig aus einer zu hohen Probenkonzentration und Viskosität, die die EV-Aggregation fördern kann. In solchen Fällen wird eine Verdünnung des endgültigen EV-Präparats empfohlen. Wenn eine Verdünnung nicht möglich ist, kann vor dem Pufferwechsel eine Sterilfiltration durchgeführt werden. Dieser Ansatz erfordert jedoch, dass alle nachfolgenden Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, um die Sterilität zu erhalten.

Die Entwicklung von Elektrofahrzeugen als Krebstherapeutika erfordert reproduzierbare Produktionsprozesse und eine robuste Validierung ihrer Wirksamkeit gegenüber Zielkrebszelllinien. Eine häufige Einschränkung von IEX bei der EV-Anreicherung ist die Co-Isolierung von Nicht-EV-Partikeln – eine Herausforderung, die durch die nachgelagerte Analyse von EV-spezifischen Markern erkennbar ist und durch weitere CM-Optimierung reduziert werden kann. Die Charakterisierung der Kontrollfreisetzung von EVs sollte Folgendes umfassen: NTA zur Bestimmung der Partikelanzahl und -größe sowie der EV-Konzentration nach der Anreicherung; genetische und Transkriptanalyse der Expression von CAR-Konstrukten; Bestimmung der zellulären und EV-Proteinexpression des CAR, kanonischer EV-Biomarker und zytolytischer Marker (z. B. Granzym B und Perforin); sowie On- und Off-Target-Effekte. Die Einbeziehung zusätzlicher Techniken, wie z. B. der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), wird eine morphologische Validierung ermöglichen, um die größenbasierte Charakterisierung zu ergänzen und eine umfassendere Analyse zu unterstützen. Um die Qualitätskontrolle aufrechtzuerhalten, sollten EV-Produkte auf Mykoplasmen- und Endotoxinkontaminationstests getestet werden, um die Sterilität und Eignung für die klinische Produktion zu überprüfen. Die Verwendung geeigneter Formulierungen für die Langzeitlagerung von funktionellen CAR-EVs kann Möglichkeiten bieten, ihre Stabilität zu verbessern, einschließlich der Aufrechterhaltung von Qualität, Quantität und therapeutischer Wirksamkeit. Eine konsequente Bewertung der Funktionsfähigkeit ist für die Sicherstellung der Produktintegrität unerlässlich. Bemerkenswert ist, dass der in dieser Studie verwendete MTS-Assay eine indirekte Bewertung der Zytotoxizität durch Messung der Stoffwechselaktivität bietet. Zukünftige Studien würden von der Integration standardisierter Zytotoxizitätsassays profitieren, wie z. B. der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH), der Annexin V/PI-Färbung oder der Erstellung von Caspase-Aktivierungsprofilen, um zytotoxische Wirkungen genauer abzugrenzen. Darüber hinaus könnte die Einbeziehung von CAR-Zellkomparatoren (die in der aktuellen Studie aufgrund von Einschränkungen bei der Beschaffung nicht berücksichtigt wurden) entweder allein oder in Kombination mit CAR-EVs und die parallele Behandlung von Kontrollzelllinien, die keine Krebszellen sind, den interpretativen Wert der Ergebnisse erhöhen.

Diese Studie unterstreicht den potenziellen Einsatz von EGFR/HER2-CAR-EVs als praktikable therapeutische Strategie für bestimmte Krebsarten. Die Verbesserung der Wirksamkeit von CAR-EVs kann durch Mehrfachdosierung oder Voraktivierung von Eltern-T-Zellen erreicht werden, um die Zytotoxizität zu erhöhen. Darüber hinaus bieten Fortschritte bei neuen Ansätzen, wie z. B. siRNA-Ladungen, und Verbesserungen der EGFR/HER2-Bindungskapazität Möglichkeiten, das Design dieser therapeutischen Plattformen zu verfeinern20,21. Die vielversprechende Anwendung von dualen chimären Antigenrezeptoren (dual-CARs) in der Zelltherapie bietet eine zusätzliche Chance zur Weiterentwicklung. Die Ausweitung der Verwendung von Dual-CARs durch die Verwendung ihrer EV-Pendants in Therapeutika könnte ein entscheidender Schritt sein, um ihr therapeutisches Spektrum zu erweitern und die Behandlungsmodalitäten zu verbessern22,23. Die Echtzeitüberwachung der Zytotoxizität von Krebszellen durch CAR-Elektrofahrzeuge (z. B. Caspase 3/7-Aktivierung, Impedanzmessung) liefert wertvolle Erkenntnisse für die Bestimmung optimaler Dosierungsschemata und erleichtert die optimierte Umsetzung in zukünftige In-vivo-Anwendungen.

Offenlegungen

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Asari K, Chelvaretnam C, Mom KT, Bhuiyan S, Pham Q, Fitri A, Palma C, Shojaee M, Khanabdali R, Hinch L und Rice G sind Mitarbeiter von INOVIQ Ltd.

Danksagungen

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Die Autoren danken Siena Barton, Hiba Rashid, Sara Nikseresht, Shayalini Wignarajah und Abel Sujeev für ihre Beiträge zum Labor. Die Autoren danken allen internen und externen Mitarbeitern, wobei diese Studie von INOVIQ Ltd. unterstützt und finanziert wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materialien
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4Gibco10010049Anreicherung von Elektrofahrzeugen
1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)SigmaL3771-100G1 g SDS-Pulver in 10 mL Reinstwasser auflösen
1x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST)Thermo Scientific ChemikalienNr. J77500. K2Mit Reinstwasser verdünnen, um eine 1x-Lösung herzustellen (alternativ eine 0,1%ige Polysorbat-20/Tween-20-Lösung in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung herstellen)
96-Well-Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit klarem Flachboden, TC-behandelt, sterilCorning3595In vitro funktioneller Assay
Bolt Bis-Tris Plus Mini Protein Gele, 4-12%, 1,0 mm, WedgeWell-FormatInvitrogenCharakterisierung von Zellen/EVs
RinderserumalbuminSigma-AldrichNr. A9647-100GCharakterisierung von Zellen/EVs
Calnexin-AntikörperZelluläre Signalübertragung2433SCharakterisierung von Zellen/EVs
CAR-NK/T-ZellenProMab BiotechnologienVariiertDie extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von CAR hängt vom bevorzugten Ziel auf den Empfängerzellen ab
CellTiter 96 AQueous One Solution Zellproliferations-Assay (MTS)PromegaNr. G3580In vitro funktioneller Assay
cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer-CocktailRoche11836170001Zelllyse
ECL Western Blotting DetektionsreagenzAmershamRPN2232Charakterisierung von Zellen/EVs
Elutions-PufferINOVIQEV-Anreicherung/Isolierung
ÄquilibrierungspufferINOVIQEV-Anreicherung/Isolierung
EXO-ACE IEX-SäuleINOVIQEV-Anreicherung/Isolierung für nachgelagerte Funktionsassays
Patent-ID AU2024901931
EXO-NET Pan-Exosomen-Capture-KügelchenINOVIQEV-Isolierung für die nachgelagerte Charakterisierung
Patent-ID WO/2014/011673
Granzyme B AntikörperZelluläre Signalübertragung4275Charakterisierung von Zellen/EVs
Humanes IL-2 IS, Premium-QualitätMiltenyi Biotec130-097-744Xenofreie Kultur von T/NK-Zellen
iBlot 2 Transferstacks, PVDFInvitrogenCharakterisierung von Zellen/EVs
ImmunoCult-XF (cGMP)Stammzellen-Technologien100-0956Xenofreie Kultur von T/NK-Zellen
K-562ATCCCCL-243In vitro funktioneller Assay
MCF-7ATCCHTB-22In vitro funktioneller Assay
Millex-GP Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22 & Mikro; mMerck MilliporeSLGPR33RSTerminale Filtration
Puffer für die RegenerationINOVIQEV-Anreicherung/Isolierung
RIPA-Puffer (10-fach)Zell-Signaltechnik9806Zelllyse
Trypanblau-Lösung, 0,4 %Gibco15250061Beurteilung der Zellviabilität und -dichte
Puffer waschenINOVIQEV-Anreicherung/Isolierung
Ausrüstung
Automatisierter ZellzählerInvitrogenGräfin II FLBeurteilung der Zellviabilität und -dichte
Automatisiertes Tisch-ExtraktionsgerätInvitrogenKingFisher Apex-SystemAutomatisiertes Aufreinigungssystem mit hohem Durchsatz
Weitere Informationen zum Protokoll finden Sie unter dem Link: https://www.inoviq.com/site/technology/resources
Fluoreszenz-MikroskopZeissAxio Observer 7Zellkultur
Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)Particle Metrix GmbHZetaview PMX-130Partikel-Analyse
Teller-LesegerätBMG LabtechSPECTROstar NanoIn vitro funktioneller Assay
Gekühlte TischzentrifugeBeckman CoulterAvanti J-15RZellkultur & Verarbeitung der EV-Anreicherung
SDS-PAGE Mini-Gel-TankInvitrogenNr. A25977Charakterisierung von Zellen/EVs
Western-Blot-TransfersystemInvitrogeniBlot 2Charakterisierung von Zellen/EVs

Referenzen

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CAR extrazellul re VesikelExosomenisolierungIonenaustauschchromatografieNanopartikel TrackingGMP konforme IsolierungRNA Therapeutika DeliveryHochdurchsatz EV AnalyseEGFR CAR VesikelHER2 CAR Vesikel

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