Methodenartikel

Verwendung von zerebraler Offenfluss-Mikroperfusion zur longitudinalen Sammlung von Zwischenflüssigkeit in einem Tiermodell des Glioblastoms

DOI:

10.3791/68748

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23. Dezember 2025

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1Department of Neurological Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In vivo sind interzelluläre Kommunikationen, die vielen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zugrunde liegen, wie etwa das Glioblastom (GBM), notorisch schwer zu messen und zu charakterisieren. Hier beschreiben wir Verfahren der zerebralen offenen Mikroperfusion (cOFM), die verwendet werden können, um interstitielle Flüssigkeitskomponenten in einem longitudinalen Tiermodell von GBM zu beproben.

Zusammenfassung

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Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) äußern sich durch ein komplexes, dynamisches Netzwerk interzellulärer Kommunikation. Glioblastom (GBM), der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor, ist beispielhaft für diese Komplexität, da sein rascher Fortschreiten und die düstere Prognose in Monaten statt Jahren gemessen werden. Die Biologie von GBM wird durch komplexe Signalmolekülaustausche zwischen neoplastischen und stromalen Zellen angetrieben, was den aggressiven Krankheitsverlauf zugrunde liegt. Hier beschreiben wir ein detailliertes cerebrales Open-Flow-Mikroperfusionsprotokoll (cOFM) in GBM-Mausmodellen, das eine Echtzeit-Langzeitüberwachung der Tumormikroumgebungsdynamik innerhalb der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) ermöglicht. Unser Ansatz beschreibt die Implantation langlebiger Führungskanonen-Kopfmontagen, deren Einsatz für die intrazerebrale Gliom-Engraftment direkt durch die Führung sowie die Sammlung hochpräziser cOFM-Proben für metabolome und proteomische LC-MS-Analysen. Entscheidend ist, dass cOFM die Molekulargrößenbeschränkungen der traditionellen Mikrodialyse überwindet. Über GBM hinaus verspricht die cOFM-Methodik transformative Einblicke in ein Spektrum von ZNS-Erkrankungen, darunter neurodegenerative, epileptische und neuropsychiatrische Erkrankungen, durch ihre Fähigkeit, etiologische und behandlungsrelevante Biomarker in ihren jeweiligen Tiermodellen bereitzustellen.

Einleitung

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Die Untersuchung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist berüchtigt herausfordernd, da die komplexe, multimodale interzelluläre Signalübertragung durch die Interstitielle Flüssigkeit (ISF)1,2,3,4 vermittelt wird. Diese Komplexität ist besonders bei Hirntumoren wie dem Glioblastom (GBM) ausgeprägt, bei denen interzelluläre Signale zwischen neoplastischen und stromalenZellen 5,6,7,8,9 übertragen werden. In vielen Fällen trägt der aberrante Austausch verschiedener Biomoleküle, darunter Metaboliten und proteinreiche Botenstoffe, zur zugrunde liegenden Ätiologie der Pathologien des ZNS. Diese experimentelle Herausforderung wird insbesondere bei GBM dadurch verschärft, dass die molekulare Zusammensetzung von ISF zeitlich dynamisch ist und sich im Verlauf der Krankheit sowie als Reaktion auf interventionelle Behandlungenentwickelt.

Traditionelle präklinische GBM-Untersuchungsmethoden umfassen In-vitro-Studien und Tiermodelle mit einem einzelnen Endpunkt. Die Natur dieser Ansätze begrenzt ihre breitere klinische Anwendbarkeit, da sie sowohl die Eigenschaften des Tumormikroumfelds als auch die longitudinalen zeitlichen Veränderungen nicht erfassen können. Fortschritte Anfang der 1980er Jahre überwanden diese kontextuellen Einschränkungen durch die Entwicklung der intrazerebralen Mikrodialyse (cMD)12,13,14,15. Seit seiner Einführung vor 45 Jahren hat sich cMD als Standardmethode zur longitudinalen Probenahme von interstitieller Flüssigkeit (ISF) im lebenden Gehirnetabliert. Dies geschieht durch die freie Diffusion und Konvektion hochkonzentrierter ISF-Lösungen durch eine halbdurchlässige Membran in ein kontinuierlich fließendes, niedrig gelöstes Perfusat, typischerweise künstliche Gehirnspinalflüssigkeit (aCSF)17. Diese semipermeablen Membranen bestehen aus verschiedenen biokompatiblen Polymeren mit üblichen molekularen Porengrößenabgrenzungen von 20 kDa bis 3 MDa18. Dieses minimalinvasive Verfahren ermöglicht die longitudinale In-situ-Sammlung einer Vielzahl von Analyten, von kleinen Molekülen wie Metaboliten oder Neurotransmittern bis hin zu großen Proteinen wie Antikörpern. Die strukturelle Porosität von cMD-Membranen in Verbindung mit der adsorptiven Natur ihrer Zusammensetzungspolymere kann jedoch die relative Rückgewinnung von Analyten mit bestimmten biochemischen oder dimensionalen Eigenschaften, wie Lipiden oder Antikörpern, erheblich beeinflussen19,20.

Fortschritte zur Überwindung dieser Einschränkung der cMD-Membranen begannen Anfang der 2010er Jahre mit der Entwicklung der cerebralen offenen Mikroperfusion (cOFM)21. Unter ähnlichen allgemeinen Prinzipien wie cMD beseitigt cOFM biochemische Einschränkungen, die durch halbdurchlässige Membranen auferlegt werden, indem es sie durch eine Kunststoffgittersonde mit makroskopischen Öffnungen mit wenig adsorptionsarmen Öffnungen von etwa 100 μm Größe20 austauscht. Eine Vielzahl von Berichten hat die verbesserte Nützlichkeit von cOFM gegenüber cMD durch die Sammlung nachweisbarer ISF-Komponenten gezeigt, darunter Peptidhormone, Nanokörper/Antikörper, kleine lipophile Therapeutika und PEGylierte Liposomen 19,22,23,24,25. Frühere Berichte, die die physiologische Gewebereaktion auf die Implantation der cOFM-Guide-Sonde untersuchen, zeigen, dass die Integrität der Blut-Hirn-Schranke bereits 15 Tage nach der Implantation wiederhergestellt ist und dass bis zu 30 Tage nach der Implantationkeine glialen Narben entstehen. Durch den Ersatz von Mikrodialysemembranen durch makroskopische Öffnungen haben Forscher auch die innovative Fähigkeit von cOFM-Führungssonden demonstriert, die Injektion xenografierter Gliomzellen in die Gehirne immundefizienter Ratten zu erleichtern, sodass atraumatische Tumortransplantationen und -wachstum direkt um cOFM-Probebereich27 stattfinden.

Überlegungen bei der Anwendung von cOFM bei der Untersuchung von ZNS-Pathologien müssen dennoch ihre methodischen Einschränkungen anerkennen. Aufgrund seiner Abhängigkeit von der passiven Diffusion und Konvektion von ISF-Analyten in ein fließendes Perfusat drehen sich diese Einschränkungen um die Analytenkonzentration und dasProbenvolumen 18. Die beprobten ISF-Komponenten werden im gesammelten cOFM-Perfusat im Vergleich zu endogenen Niveaus verdünnt, was viele Untersuchungen dazu veranlasst, die relativen Analytverhältnisse zwischen experimentellen Bedingungen28 zu vergleichen. Typische Durchflussraten liegen zwischen 0,1 μL/min und 1,0 μL/min, was nur 6 μL/h bis 60 μL/h entspricht. Bei der Berücksichtigung der Leerräume im Rohr sollte auch die gesamte Probenahmedauer berücksichtigt werden. Dies ist besonders wichtig bei der Durchführung von cOFM-Sammlungen bei narkosierten Tieren, bei denen Tierschutzbedenken sorgfältig berücksichtigt werden müssen. Eine ausführlichere Beschreibung dieser und anderer Überlegungen ist in einem früheren Methodenbericht des cOFM-Entwicklungsteams29 verfügbar.

In diesem Manuskript stellen wir ein aktualisiertes Protokoll zur Anwendung von longitudinaler cOFM-Probenahme bei der Untersuchung neurologischer Erkrankungen bereit, mit Schwerpunkt auf GBM. Das Protokoll umfasst Schritte zur Implantation einer cOFM-Leitkanüle, der Injektion von Tumorzellen und der Transplantation durch die cOFM-Leitung sowie zwei cOFM-Probenahmekonfigurationen bei wachen, frei bewegenden Tieren. Wir präsentieren repräsentative Daten, die Behandlungseffekte auf metabolome und proteomische ISF-Komponenten, gemessen durch cOFM, den Einfluss der Probenahmekonfiguration auf die Analytkonzentrationen sowie die Wirksamkeit der cOFM-geführten Tumorzellimplantation zeigen.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren innerhalb dieses Protokolls sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University (Protokoll-ID: IS00021383) genehmigt und folgen den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH). Dieses Protokoll wurde für die Anwendung bei C57BL/6J-Mäusen, sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Mindestalter von 8–10 Wochen entwickelt. Die in diesem Protokoll verwendete Mausgliomzelllinie, CT2A, wurde vom Seyfried-Labor der Boston University bereitgestellt und nach sterilen Gewebekulturbedingungen kultiviert und vorbereitet.

1. Chirurgische Planung und Vorbereitung

  1. Tierinformationen: Für cOFM-Experimente verwenden Sie Mäuse, die mindestens 8-10 Wochen alt sind, um vollständiges Wachstum und Entwicklung zu ermöglichen. Schädelimplantate in fester Position können sich lösen oder das richtige Wachstum im noch entwickelnden Schädel und/oder Gehirn beeinträchtigen.
  2. Chirurgische Koordinatenauswahl: Verwenden Sie einen tierischen Gehirnatlas, um die orthogonalen Koordinaten der interessierenden Region relativ zu Bregma zu lokalisieren. Zum Beispiel werden Gliomzellimplantationen typischerweise im Striatum durchgeführt, um die native GBM-Mikroumgebungen bestmöglich zu replizieren und die Wirksamkeit der anschließenden Tumorentwicklung zu maximieren. Die in diesem Protokoll verwendeten cOFM-Leitkoordinaten sind mittelseitlich (ML) = 2,5 mm, anteroposterior (AP) = 0 mm und dorsoventral (DV) = 3,5 mm.
    HINWEIS: Stereotaktische Koordinaten können je nach Mausstamm und Alter variieren. Bitte verwenden Sie art- und stammspezifische Atlaskoordinaten, um die gewünschte Platzierung des cOFM-Leitguides sicherzustellen.
  3. Auswahl geeigneter cOFM-Komponentenkonfigurationen: Bauteile für geeignete cOFM-Konfigurationen in spezifischen Gesamtlängen von 2 mm bis 22 mm bestellen, mit offenen Oberflächenlängen von 1 mm bis 2 mm.
    HINWEIS: Tiere können sich beim Pflegeverhalten falsch implantierte cOFM-Leitkopfhalterungen lösen. Um den mechanischen Hebelwirkung auf der Kopfhalterung während dieser Aktivität zu minimieren, empfehlen wir, Führungen nicht länger als 2 bis 3 mm mehr als der vorgesehene DV-Koordinatenabstand zu verwenden.
  4. Planung von Zeitpunkten für chirurgische und Probenahmeverfahren für experimentelle Ziele: Je nach interessierender Krankheit und Modellmerkmalen wird der Zeitpunkt und die Reihenfolge der cOFM-bezogenen Verfahren sorgfältig geplant, um die zugrunde liegende Biologie optimal zu untersuchen.
    1. Wenn ISF-Zusammensetzungsunterschiede zwischen gesunden Gehirn- und Tumormikroumgebungen untersucht werden, führen Sie cOFM-Probenahmeverfahren vor und nach der Tumorimplantation im selben Tier durch.
    2. Wenn die Auswirkungen klinischer Interventionen auf ZNS-Pathologien untersucht werden, führen Sie cOFM-Probenahmeverfahren vor und nach der Verabreichung in parallelen Tierkohorten durch, die entweder Kontroll- oder experimentelle Behandlung erhalten.

2. cOFM-Leit-Platzierungs-Operation

  1. Chirurgische Werkzeuge für die Platzierung der cOFM-Führungsoperation ( Materialtabelle) zusammenbauen und bei Bedarf per Autoklav sterilisieren.
  2. Vorbereitung auf den chirurgischen Arbeitsplatz:
    1. Biosicherheitsschrank desinfizieren: Führen Sie chirurgische Eingriffe in einem ordnungsgemäß desinfizierten Biosicherheitsschrank durch. Aktivieren Sie den Luftstrom des Bio-Sicherheitsschranks und reinigen Sie die Innenflächen mit einer von der Institution zugelassenen Desinfektions- und Reinigungsmethode. Klebe die Unterseite des Schranks mit sterilen Vorhängen aus.
    2. Stellen Sie stereotaktische Instrumente vor: Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen mit einem Desinfektionsmittel und platzieren Sie ihn in den Bio-Sicherheitsschrank. Ebenso reinigen und desinfizieren Sie den stereotaktisch montierten Bohrer und den Führungshalter und platzieren Sie ihn in den Bio-Sicherheitsschrank.
    3. Chirurgisches Heizkissen: Verwenden Sie ein Heizkissen auf der stereotaktischen Operationsstufe, um während der Betäubung zusätzliche Wärme zu erzeugen. Reinigen und desinfizieren Sie die Oberfläche des Heizkissens und legen Sie sie auf den stereotaktischen Rahmen, an dem das Tier platziert wird. Schalte das Heizkissen auf niedrige Hitze ein und lege 1-2 sterile Vorhänge darüber.
    4. Stellen Sie zusätzliche chirurgische Instrumente und Geräte bereit: Bringen Sie aseptisch zusätzliche sterilisierte Geräte in den Biosicherheitsschrank.
    5. Aufbau des Erholungs-Käfigs: Stell einen sauberen Erholungs-Käfig auf ein Heizkissen, das auf die niedrigstmögliche Temperatur eingestellt ist. Jedes Tier muss in einen individuellen Erholungskäfig gesetzt werden, bis es vollständig genesen ist; daher hängt die Gesamtzahl der Aufholgefänge von der Operationsleistung und der Erholungszeiten ab.
  3. Prächirurgische Tierpräparate (zusammengefasst in Abbildung 1A):
    1. Anästhesie: Verabreichen Sie institutionell zugelassene Anästhesiemittel und -dosierungen, um eine angemessene Anästhesietiefe zu erreichen, indem Sie den Pfotenkniffreflex sowie die Atemtiefe/-frequenz verwenden, um eine ausreichende Anästhesie sicherzustellen. Beispielsweise reicht eine intraperitoneale Injektion eines Ketamin-Xylazin-Cocktails (100 mg/kg - 10 mg/kg in Kochsalzlösung) aus, um eine angemessene Anästhesietiefe für C57BL/6J-Mäuse zu erreichen.
    2. Analgesie: Verabreichen Sie institutionell zugelassene Schmerzmittel zur Unterstützung der peri- und postoperativen Schmerzbehandlung. Zum Beispiel ist eine subkutane Injektion von Meloxicam (20 mg/kg, in Kochsalzlösung) für die perioperative Schmerzbehandlung geeignet.
    3. Haarentfernung (Rasieren, Enthaarungscreme): Entfernen Sie Haare von der vorgesehenen Operationsstelle auf dem Schädel mit einem elektrischen Rasierer und/oder Enthaarungscreme. Wenn Sie Enthaarungscreme verwenden, stellen Sie sicher, dass sie nicht zu lange auf der Haut bleibt, um Reizungen zu vermeiden.
    4. Augensalbe: Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Baumwollspitze, um die Augensalbe vorsichtig auf beide Augen aufzutragen, um das Trocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern.
    5. Tierplatzierung in den stereotaktischen Rahmen: Setzen Sie das Tier richtig in den stereotaktischen Rahmen, indem Sie Schneidezähne in den Bissblock setzen, die Ohrenstangen fest, aber sanft in die Gehörgänge einführen und die Nasenklemme über dem Nasenbein des Tieres befestigen ( Abbildung 1B). Wenn es richtig positioniert ist, sollte der Schädel des Tieres fest befestigt sein, ohne sich zu bewegen.
    6. Vorbereitungen für aseptische Operationsstellen: Wischen Sie die Haut um den Operationsbereich mit drei abwechselnden Abstrichen von Alkohol (Ethyl- oder Isopropyl-) und Povidonjod ab, um den Bereich aseptisch für den Schnitt zu desinfizieren.
  4. Schnitt und Schädeloberflächenvorbereitung:
    HINWEIS: Alle folgenden Schritte sollten so aseptisch wie möglich durchgeführt werden. Zu diesem Zweck sollte der primäre Tierarzt vor dem Fortfahren zum Schnitt sterile chirurgische Handschuhe über herkömmlichen Laborhandschuhen tragen.
    1. Schnittposition und -länge: Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen sagittalen Mittellinienschnitt entlang der Schädeloberfläche zu machen, beginnend zwischen den Augen und kaudal 8–10 mm ( Abbildung 1C).
    2. Hautretraktion: Verwenden Sie sterile Pinzetten, Applikatoren mit Baumwollspitze und/oder eine Skalpellklinge, um die Haut seitlich vom Mittellinienschnitt zurückzuziehen. Stellen Sie sicher, dass sowohl Bregma als auch Lambda sichtbar sind, und verlängern Sie den Schnitt, falls nicht.
    3. Periostschnitt: Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen Schnitt in das Periost zu machen, und ziehen Sie das Gewebe seitlich mit der Pinzette zurück.
    4. Wasserstoffperoxid-Abstrich: Reinigen Sie die Schädeloberfläche mit verdünntem 1%-3% Wasserstoffperoxid und einem sterilen, baumwollbedeckten Applikator ( Abbildung 1D). Dies hilft auch bei der Identifikation von Bregma und Lambda durch sagittale, koronale und lambdoiale Schädelnähte.
    5. Selbstätzender Zahnklebstoff: Verwenden Sie eine 0,3 mL bis 1,0 ml Insulinspritze, um gleichmäßig 20–40 μL selbstätzenden Zahnklebstoff auf die Schädeloberfläche aufzutragen ( Abbildung 1D). Tragen Sie eine Zahnaushärtungslampe auf, um das Gravieren zu unterstützen. Nach dem Aushärten verwenden Sie sterile Baumwoll-Applikationen und Kochsalzlösung, um überschüssigen Kleber zu entfernen.
      VORSICHT: Selbstätzende Zahnklebstoffe wie Bond Force sind potenziell gefährliche Substanzen: brennbare Gefahr (GHS02: H225), Gesundheitsgefahr (GHS07 und GHS08: H315, H319, H317, H361fd, H336) und Umweltgefährdung (GHS09: H412). Bitte befolgen Sie lokale und institutionelle Richtlinien zur ordnungsgemäßen Entsorgung gefährlicher Abfälle.
  5. Lokalisierung und Bohren von Gratlöchern:
    1. Setzen Sie einen sterilisierten 0,7-mm-Bohrer in den Mikrobohrer ein und setzen Sie den Bohrer mit dem entsprechenden Halter in den stereotaktischen Rahmen ein.
    2. Lokalisieren Sie Bregma an der Schnittstelle der sagittalen und koronalen Nähte und verwenden Sie stereotaktische Mikromanipulatoren, um den Bohrer dort zu positionieren.
    3. Positionieren Sie den Bohrer auf die cOFM-Führungskoordinate (ML = 2,5, AP = 0,0), greifen Sie den Bohrer auf 15.000 U/min ein und bohren Sie vorsichtig ein Gratloch, indem Sie das DV-Mikromanipulator-Dial einstellen (Abbildung 1E). Machen Sie beim Bohren häufig Beobachtungen der Schädeldicke, um Schäden am darunterliegenden Gehirn zu verhindern. Verwenden Sie beim Bohren physiologische Kochsalzlösung, um Knochenreste wegzuspülen und die Wärme zwischen Bohrer und Schädel zu reduzieren.
    4. Wiederholen Sie das Bohrverfahren für jede Ankerschraubenkoordinate (Abbildung 1E). Empfohlene Positionen der Ankerschrauben sind ML = 2,5, AP = -2,5 und ML = -2,5, AP = -2,5.
    5. Nachdem die Bohrlöcher gebohrt wurden, lösen Sie den Mikrobohrer und den Bohrhalter vom stereotaktischen Rahmen.
    6. Benutze eine 30-G-Nadel, um die Dura Mater sanft unter dem cOFM-Führungsmahlloch zu durchbohren.
  6. Installieren Sie Ankerschrauben mit einer sterilen Zange und einem entsprechend großen sterilen Schraubendreher (Abbildung 1F). Je nach Gewindewinkel der Schraube ist die Verankerung ausreichend, wenn die Schraube ein bis zwei Gewindelängen tief eingesetzt wird. Achte darauf, die Ankerschrauben nicht zu tief einzuziehen, um Schäden am Kortex zu vermeiden.
  7. Installieren Sie die cOFM-Führung und die cOFM-Dummy-Assemblage in den Führungshalter und den Halter am stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie die cOFM-Führungsspitze über dem Gratloch (ML = 2,5 mm, AP = 0,0 mm) in einer DV-Höhe entsprechend der von Bregma und lassen Sie die cOFM-Führung langsam durch das Gratloch auf die vorgegebene vorgegebene Tiefe mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/min hinab ( Abbildung 1F). Zum Beispiel beträgt die Platzierungstiefe der cOFM-Führung mit anschließend beabsichtigter Tumorzellimplantation DV = -3,5 mm.
  8. Tragen Sie Zementmittel auf die Oberfläche des Schädels auf und sorgen Sie dafür, dass die Bereiche unter und um die cOFM-Führung und die Ankerschrauben in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht bedeckt werden. Verwenden Sie eine zahnärztliche Aushärtungslampe, um jede Zementschicht zu härten, bevor Sie die nächsten Schichten auftragen ( Abbildung 1G). Tragen Sie das Zementmittel weiter auf, bis die Schädeloberfläche zwischen den einzelnen Komponenten bedeckt ist, die Ankerschrauben vollständig bedeckt sind und der Bereich unter dem cOFM-Führer bis zur Nut und um die Nut abgedeckt ist. Seien Sie vorsichtig, das Zementmittel nicht auf oder in der Nähe des Verriegelungskeils aufzubringen.
    VORSICHT: Zementierungsmittel wie Tetric EvoFlow sind potenziell gefährliche Substanzen: Gesundheitsgefahr (GHS07: H317, H319, H335, H360). Bitte befolgen Sie lokale und institutionelle Richtlinien zur ordnungsgemäßen Entsorgung gefährlicher Abfälle.
  9. Lösen Sie den Führungshalter vom cOFM-Führer und heben Sie den Führungshalter langsam mit dem DV-Einstellknopf des Mikromanipulators an. Entferne den Mikromanipulator aus dem stereotaktischen Rahmen.
  10. Lösen Sie das Tier vom stereotaktischen Rahmen, indem Sie zuerst die Ohrenstangen lockern und entfernen, die Nasenklemme lockern und zurückziehen und dann die Schneidezähne aus dem Bissblock heben.
  11. Die Nahthaut wird über dem zahnärztlichen Zementierungsmittel geschlossen, sodass der cOFM-Führungskörper freiliegt. Absorbierbare 4-0-Nähte, wie Polyglykolsäure (PGA) oder Polyglactin (Vicryl), werden empfohlen (Abbildung 1H).
  12. Tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf den Hautbereich neben dem ursprünglichen Schnitt auf.
  13. Tierrettung und Unterstützung:
    1. Bringen Sie das Tier in einen isolierten Erholungskäfig (jeweils ein Tier pro Käfig) und geben Sie zusätzliche Wärme über ein auf niedrig eingestelltes Heizkissen.
    2. Optional: Geben Sie dem Tier ein Anästhetikumkehrmittel, um die Genesung zu beschleunigen. Zum Beispiel beschleunigen subkutane Injektionen von Atipamezol (1 mg/kg, in physiologischer Kochsalzlösung) die Erholungszeit der Anästhesie von etwa 1 auf ca. 20 Minuten.
    3. Stellen Sie kontinuierliche Beobachtung und Unterstützung bereit, bis das Tier ausreichend zu Bewusstsein und zur Liegen im Sternenbereich zurückgekehrt ist. Lassen Sie Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig von Operation und Anästhesie genesen sind.
    4. Sobald das Tier vollständig genesen ist, kann es mit anderen Tieren in gemeinschaftliche Käfige zurückgebracht werden.
    5. Einen Tag nach der Operation bieten Sie zusätzliche schmerzlindernde Unterstützung durch die Verabreichung eines institutionell zugelassenen Schmerzstillers wie Meloxicam (siehe Schritt 2.3.2).
  14. Planen Sie eine 14-tägige Erholungszeit nach der cOFM-Anleitung ein, um die vollständige Heilung der Blut-Hirn-Schranke zu ermöglichen, bevor weitere Eingriffe an den Tieren durchgeführt werden.

3. Intrakranielle Tumorzellimplantation nach cOFM-Leitfaden

  1. Zellkultur und Präparation:
    1. Zellen kultivieren und erweitern gemäß zelltypspezifischen Protokollen. Zum Beispiel können syngene Mausgliomzellen wie CT2A in 10 cm großen Schalen oder T-75-Kolben mit DMEM gezüchtet werden, mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Supplementen.
    2. Bereiten Sie kultivierte Zellen für die Einnistung gemäß zelltypspezifischen Protokollen vor.
      1. Zum Beispiel werden bei syngenen CT2A-Gliomzellen Wachstumsmedium entfernt, kurz mit PBS gewaschen und Zellen 5 Minuten lang in 0,05 % Trypsin (mit 0,53 mM EDTA) bei 37 °C inkubiert.
      2. Neutralisieren Sie Trypsin mit einem gleichen Volumen von 1 % FBS-haltigem DMEM, übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie mit 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C auf Pelletzellen.
      3. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS (oder physiologischer Kochsalzlösung). Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen pro mL entweder mit einem manuellen oder automatischen Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C, entfernen Sie den Supernatant und suspendieren Sie sie in einem geeigneten Volumen PBS (oder Kochsalzlösung) erneut, um 50.000 Zellen pro μL zu erreichen. Stellen Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie einpflanzbereit ist (Schritt 3.5.2).
  2. Chirurgische Werkzeuge für die intrakranielle Tumorzellimplantation zusammenstellen (Materialtabelle) und bei Bedarf per Autoklav sterilisieren.
  3. Vorbereitung des chirurgischen Arbeitsbereichs
    1. Biosicherheitsschrank desinfizieren: Siehe Schritt 2.2.1.
    2. Stelle stereotaktische Instrumente vor: Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen mit Desinfektionsmitteln und legen Sie ihn in den Bio-Sicherheitsschrank. Ebenso reinigen und desinfizieren Sie den stereotaktisch montierten Spritzenhalter und befestigen Sie ihn am stereotaktischen Rahmen.
    3. Führen Sie die Schritte 2.2.3.-2.2.5 aus. für die verbleibenden Vorbereitungsschritte.
  4. Prächirurgische Tiervorbereitungen:
    1. Führen Sie die Schritte 2.3.1., 2.3.2., 2.3.4. und 2.3.5 durch. zur Tierpräparation.
  5. Tumorzellimplantation:
    1. Spritzen- und Infusionsinsert-Assembly (zusammengefasst in Abbildung 2)
      1. Weichen Sie die Flansch-Rohrverbinder mindestens 5 Minuten in 70 % Ethanol ein.
      2. Führen Sie die Spitze einer sterilisierten 10 μL oder 25 μL gasdichten Glasspritze in ein Ende eines geflanschten Rohranschlusses ein.
      3. Setzen Sie den Einlass eines cOFM-Infusionseinsatzes in das andere Ende des Schlauchanschlusses.
      4. Befestigen Sie die Spritzeninfusionseinheit in den stereotaktisch montierten Spritzenhalter.
    2. Füllen Sie die Spritzen-Infusions-Einsatzeinheit mit einem geeigneten Volumen Zellsuspension. Zum Beispiel werden 3 μL Zellsuspension mit 50.000 Zellen pro μL geladen, was eine Gesamtinjektion von 150.000 Zellen pro Tier ergibt.
    3. Ersatz des Dummy-Einsatzes durch den Infusionseinsatz:
      1. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil von der cOFM-Führung und der Dummy-Baugruppe zu entfernen, und heben Sie dann vorsichtig die cOFM-Dummy aus der Führung.
      2. Verwenden Sie die ML- und AP-Verstellknöpfe am Mikromanipulator, um die Spritzen-Infusions-Einsatz-Einheit über der cOFM-Führung zu bewegen. Verwenden Sie den DV-Verstellknopf, um den Infusionseinsatz vorsichtig in die cOFM-Führung zu lassen und ihn durch das Feststecken des Verriegelungskeils fest mit einer Zange fest zu sichern.
    4. Injizieren Sie 3 μL Zellsuspension aus der Spritze mit einer Geschwindigkeit von 1 μL/min. Beobachten Sie sorgfältig den Bereich um die cOFM-Führung und den Infusionseinsatz, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus der Baugruppe austritt. Nachdem das gesamte Volumen injiziert wurde, warten Sie weitere 1 Minute, bis der intrakranielle Druck sich ausgeglichen hat.
    5. Ersetze den Infusionseinsatz durch den Dummy-Einsatz.
      1. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil aus der cOFM-Führung und dem Infusionseinsatz zu entfernen, und stellen Sie dann vorsichtig den DV-Verstellknopf des Mikromanipulators ein, um den cOFM-Infusionseinsatz aus der Führung zu heben.
      2. Setzen Sie die cOFM-Dummy in die Führung ein und sichern Sie sie, indem Sie den Verriegelungskeil mit einer Pinzette wieder einsetzen.
  6. Lösen Sie das Tier vom stereotaktischen Rahmen, indem Sie zuerst die Ohrenstangen lockern und entfernen, die Nasenklemme lockern und zurückziehen und dann die Schneidezähne aus dem Bissblock heben.
  7. Tierrettung und Unterstützung:
    1. Bringen Sie das Tier in einen isolierten Erholungskäfig (jeweils ein Tier pro Käfig) und geben Sie zusätzliche Wärme über ein auf niedrig eingestelltes Heizkissen.
    2. Optional: Geben Sie dem Tier ein anästhetisches Umkehrmittel (wie Atipamezol) zur Beschleunigung der Genesungszeit, siehe Schritt 2.13.2.
    3. Stellen Sie kontinuierliche Beobachtung und Unterstützung bereit, bis das Tier ausreichend zu Bewusstsein und zur Liegen im Sternenbereich zurückgekehrt ist. Lassen Sie Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie vollständig von Operation und Anästhesie genesen sind.
    4. Sobald das Tier vollständig genesen ist, kann es zusammen mit anderen Tieren in gemeinschaftliche Käfige zurückgebracht werden.
    5. Am Tag nach der Operation sollten Sie zusätzliche schmerzlindernde Unterstützung leisten, indem Sie ein institutionell zugelassenes Schmerzmittel wie Meloxicam verabreichen (siehe Schritt 2.3.2).
      HINWEIS: Bei Verwendung von luciferase-positiven Zelllinien kann die biolumineszente Bildgebung (BLI) 1–2 Wochen nach der Zellimplantation durchgeführt werden, um den Erfolg der Tumortransplantation zu überprüfen. Obwohl körperliche Merkmale wie Tierfell oder Kopfmontage die detektierte Lumineszenz behindern können, kann es dennoch genutzt werden, um grobe Annäherungen über das Vorhandensein oder Fehlen eines Tumors zu machen. Alternativ kann eine MRT durchgeführt werden, wenn die Ankerschrauben, die in der cOFM-Führung verwendet werden, nicht ferromagnetisch und MRT-kompatibel sind.

4. cOFM-Probenahme der Gehirninterstitieller Flüssigkeit

HINWEIS: Aufgrund seiner Abhängigkeit von passiver Analytdiffusion enthalten cOFM-Proben im Vergleich zur endogenen ISF-Umgebung verdünnte Analytkonzentrationen. Aus diesem Grund wurden bereits mehrere Methoden vorgeschlagen, um Probenmessungen so zu kalibrieren, dass sie die In-situ-Konzentrationen 18 besser widerspiegeln. Dieser Abschnitt beschreibt zwei verschiedene Stichprobenmodalitäten. Schritt 4.1. beschreibt den vom Hersteller empfohlenen Konfigurationsmodus (von hier als fraktioniert bezeichnet), der eine höhere zeitliche Empfindlichkeit bietet, jedoch auf Kosten der Analytkonzentration. Schritt 4.2. beschreibt eine alternative Konfigurationsweise, die wir entwickelt haben (hier als rezirkuliert bezeichnet), die eine höhere Analytkonzentration erreichen kann, allerdings auf Kosten einer verringerten zeitlichen Auflösung.

  1. Fraktionierte cOFM-Probenahme (zusammengefasst in Abbildung 3A):
    1. Weichen Sie die Flansch-Rohrverbinder mindestens 5 Minuten in 70 % Ethanol ein, um die Befestigung an Schläuchen und Probeeinsätzen zu erleichtern.
    2. Laden Sie den Beutel mit ausreichendem aCSF-Filter ein. Zum Beispiel reichen 680 μL minimal sowohl für eine 20-minütige Leitungsspülung bei 10 μL/min als auch für eine 8-Stunden-Abtastung bei 1 μL/min. aus. Allerdings wird ein Mindestvolumen von 2 mL empfohlen, um ein Zusammenbrechen und eine Fehlfunktion des Perfusatbeutels zu verhindern.
    3. Sowohl Push- als auch Pull-Rohrleitungen mit einem passenden Volumen aCSF mit gasdichten Glasspritzen vorfüllen. Zum Beispiel hat Universal Push-Pull Low-Bind Tubing einen Innendurchmesser von 0,25 mm und einzelne Tubinglängen von 100 cm. Dies entspricht etwa 1 μL pro 2 cm, also etwa 55 μL im Push-Tubing und 100 μL im Pull-Tubing.
    4. Installieren Sie den peristaltischen Abschnitt des Rohrs korrekt in den Pumpkopf der Mikroperfusionspumpe, wie in Abbildung 3A gezeigt.
      HINWEIS: Siehe das BASi-Handbuch für weitere Anweisungen, falls erforderlich.
    5. Verbinden Sie den Perfusatbeutel mit dem Push-Abschnitt des Rohrs über den Luer-Lock-Anschluss (Abbildung 3A, Bauteil i).
    6. Verbinden Sie den Probeeinsatz mit den Schlauchleitungen über geflanschte Rohrverbindungen. Der Einlass zum Probeeinsatz (längere Wellenlänge) sollte am Ausgangsende des Schubrohrs befestigt werden, gegenüber der Leitung des Perfusatbeutelrohrs (Abbildung 3A, oben links). Der Probeeinsatzausgang (kürzere Welle) sollte am Eingangsende des Ziehrohrs parallel zur Leitung des Perfusatbeutelrohrs (Abbildung 3A, oben rechts) befestigt werden. Setzen Sie den angeschlossenen Probeeinsatz in ein steriles Mikrozentrifugenrohr mit 750 μL aCSF ein, um das System zu spülen.
    7. Verbinden Sie die Fraktionssammelnadel mit einem geflanschten Rohranschluss an die Ausgangsleitung des Ziehrohrs (entgegengesetztes Ende des Probeneinsatzausgangs).
    8. Führen Sie eine 20-minütige Spülung des Rohrsystems bei 10 μL/min durch, um alle eingeschlossenen Gasblasen im Rohrsystem zu entfernen.
    9. Fraktionssammler-Aufbau:
      1. Beschriften und wiegen Sie die Teilaufnahmeröhren und annotieren Sie jedes Gewicht für den späteren Vergleich und die Validierung des gesammelten Probenvolumens. Setze die Röhren in die entsprechenden Schlitze des Fraktionssammelkarussells.
      2. Schalten Sie den Bruchkollektor ein und konfigurieren Sie die Einstellungen auf die gewünschten Werte. Beispieleinstellungen sind # von Samples, Sample-Zeit (m), Verzögerung (Stunden), Refrig-Kühlung und _cannula-Modus.
        HINWEIS: Das Abgeben des Totraum-Flüssigkeitsvolumens im Zugrohr, das nie mit orthotopischer ISF in Kontakt kam, wird durch i) Rohrlänge und -volumen (ca. 2 cm/μL für OFM-PP2-100-LB), ii) Durchflussrate und iii) Verzögerung (Stunden) angenähert. Diese Parameter sollten bei der Einrichtung des Sammlungssystems sorgfältig berücksichtigt werden, um eine ordnungsgemäße Fraktionserfassung sicherzustellen.
  2. Rezirkulierte cOFM-Probenahme (zusammengefasst in Abbildung 3B):
    1. Weichen Sie Flansch-Rohrverbinder in 70 % Ethanol ein, um die Befestigung an Schläuchen und Probeeinsätzen zu erleichtern.
    2. Prefill-Ziehrohrleitung mit entsprechendem Volumen aCSF und gasdichten Glasspritzen.
    3. Installieren Sie den peristaltischen Abschnitt des Rohrs korrekt in den Pumpkopf der Mikroperfusionspumpe.
    4. Verbinden Sie den Probeeinsatz mit den Schlauchleitungen über geflanschte Rohrverbindungen. Der Einlass des Probeeinsatzes (längere Wellenlänge) sollte am Ausgangsende des Ziehrohrs befestigt werden. Der Ausgang des Probeneinsatzes (kürzere Welle) sollte am Eingangsende des Ziehrohrs befestigt werden. Setzen Sie den angeschlossenen Probeeinsatz in ein steriles Mikrozentrifugenrohr mit 750 μL aCSF ein, um das System zu spülen.
    5. Führen Sie eine 20-minütige Spülung des Rohrsystems bei 10 μL/min durch, um alle eingeschlossenen Gasblasen im Rohrsystem zu entfernen.
  3. Aufbau des rotierenden Käfigsystems:
    HINWEIS: Rotierende Tierkäfigsysteme wie das Raturn-System erleichtern die cOFM-Probenahme von wachsamen Tieren, indem sie ein Überwickeln und Verheddern des Push-and-Pull-Schlauchs verhindern. Dies kann auch die Automatisierung der cOFM-Probenahme unterstützen, indem es das manuelle Entwirren von Röhrchen während wacher cOFM-Sammelsitzungen überflüssig macht.
    1. Platziere saubere Käfigeinstreu gleichmäßig über den rotierenden Käfigboden und statte den Käfig mit leicht zugänglichen Futter- und Wasserquellen aus.
    2. Schalten Sie den Drehregler des Käfigs ein und testen Sie seine Aktivität, indem Sie die aufgehängte Leine drehen. Der Käfig sollte sich relativ zur Drehrichtung des Seils gegendrehen. Stellen Sie den Rotationsregler auf Standby, bis das Tier an die Leine angeschlossen ist.
  4. Verbindung von Tier zum cOFM-System:
    HINWEIS: Die Verbindung und das Abkoppeln der Tiere an das cOFM-System erfolgen am einfachsten, während das Tier unter vorübergehender Isofluran-Anästhesie steht. Bei korrekter Ausführung dauert dieser Vorgang nicht länger als 5 Minuten pro Tier; Die Verwendung einer Augensalbe wird jedoch dringend empfohlen.
    1. Tieranästhesie: Bringen Sie das Tier in die Isofluran-Anästhesie-Induktionskammer. Beginnen Sie mit der Anästhesie mit einem Sauerstofffluss von 2 L/min und Isofluran, eingestellt auf 3 %. Beobachten Sie das Tier, bis es ein angemessenes Narkoseniveau erreicht hat (unbeweglich mit einer Atemfrequenz von etwa 1 Atemzug/s). Das Tier wird aus der Induktionskammer in die Anästhesiemaske übertragen, die auf 2 L/min Sauerstofffluss und 3 % Isofluran eingestellt ist.
    2. Tierjacke: Legen Sie das Tier in eine passende Jacke, ziehen Sie die Vordergliedmaßen vollständig durch die Armöffnungen und befestigen Sie die Jacke sicher am Rücken des Tieres (siehe Abbildung 3C).
    3. Ersatz von Dummy-Einsatz durch Probeneinsatz: Verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil von Führung und Dummy-Einheit zu entfernen und heben Sie die Dummy vorsichtig aus der Führung. Setzen Sie die Probenahme vorsichtig ein, setzen Sie sie in die Führung ein und setzen Sie dann den Verriegelungskeil wieder ein.
    4. Nehmen Sie das Tier aus der Narkose und legen Sie es in das rotierende Käfigsystem. Befestige die Käfigleine an der Tierjacke und aktiviere das rotierende Käfigsystem.
  5. Durchführung von cOFM-Sampling:
    1. Stellen Sie die Mikroperfusionspumpen auf 5 μL/min ein und führen Sie eine 2-minütige Spülung durch, um eventuelle Mikroblasen zu entfernen, die durch die Installation des cOFM-Probeeinsatzes entstanden sein könnten.
    2. Ändern Sie die Einstellungen der Mikroperfusionspumpe auf die korrekt gewünschte Durchflussrate für den Pumpenmodus (zum Beispiel 1 μL/min).
    3. Aktiviere den Pumpenmodus. Bei fraktionierter cOFM-Probenahme aktivieren Sie den Fraktionskollektor.
    4. Während der Anfangsphase der cOFM-Probenahme sollten Sie das Push-and-Pull-Rohr genau beobachten, um das Fehlen von Gasblasen sicherzustellen, da diese die ordnungsgemäße Maschinenfunktion und Probenentnahme beeinträchtigen und das Tier potenziell gefährden könnten. Wenn Gasblasen beobachtet werden, stoppen Sie Systemkomponenten, lösen Sie das Tier vom cOFM-System und entfernen Sie Gasblasen durch eine aCSF-Spülung durch den Schlauch.
    5. Während des gesamten cOFM-Probenahmeprozesses sollten zusätzliche häufige Beobachtungen des cOFM-Schläuchens und des Tierverhaltens durchgeführt werden. Wenn das Tierverhalten auf plötzliche gesundheitliche Veränderungen hinweist, sollten Sie sofort Systemkomponenten stoppen und das Tiergesundheitsproblem angehen. Konsultieren Sie bei Bedarf das veterinärmedizinische Personal der Institution.
  6. Trennung eines Tieres vom cOFM-System:
    1. Deaktiviere das rotierende Käfigsystem und löse die Käfigverbindung von der Tierjacke.
    2. Übertragen Sie das Tier in die Isofluran-Anästhesie-Induktionskammer, wobei Probeeinsatz und cOFM-Schlauch noch angebracht sind. Beginnen Sie mit der Anästhesie mit einem Sauerstofffluss von 2 L/min und Isofluran, eingestellt auf 3 %. Beobachten Sie das Tier, bis es ein angemessenes Narkoseniveau erreicht hat (unbeweglich mit einer Atemfrequenz von etwa 1 Atemzug/s). Das Tier wird aus der Induktionskammer in die Anästhesiemaske übertragen, die auf 2 L/min Sauerstofffluss und 3 % Isofluran eingestellt ist.
    3. Ersatz des Probeeinsatzes durch den Dummy-Einsatz: Benutze eine Zang, um den Verriegelungskeil aus der Führung und dem Probeeinsatz zu entfernen, und hebe den Probeeinsatz vorsichtig aus der Führung. Setzen Sie den Dummy-Einsatz vorsichtig wieder in die Führung ein und setzen Sie dann den Verriegelungskeil wieder ein.
    4. Entmanteln: Schließen Sie die Verschlüsse von der Rückseite der Tierjacke ab und entfernen Sie die Jacke vorsichtig vom Tier.
    5. Tiergenesung und Beobachtung: Entfernen Sie das Tier aus der Isofluran-Anästhesie und setzen Sie es in einen sauberen Erholungskäfig, wobei kontinuierliche Beobachtung gewährleistet wird, bis das Tier vollständig zu Bewusstsein und sternaler Rückgelag zurückkehrt. Sobald das Tier vollständig genesen ist, in einen Häuskäfig einsetzen.
  7. Probenentnahme und -lagerung:
    1. Fraktionierte Probenahme:
      1. Entfernen Sie die Fraktionssammelröhren aus dem Fraktionssammler und legen Sie sie für den kurzfristigen Transport auf Eis.
      2. Wiegen Sie jedes Sammelrohr und vergleichen Sie es mit dem Vorabab-Gewicht, um das Probenvolumen zu überprüfen.
      3. Fahren Sie mit nachgelagerten Analysen von cOFM-Proben durch oder legen Sie sie in einen -80 °C Gefrierfach zur Langzeitlagerung.
    2. Rezirkulierte Probenahme:
      1. Lassen Sie das Zugrohr am Ausgang des cOFM-Probeeinsatzes (kürzere Welle) befestigt, lösen Sie sich vom restlichen Aufbau und setzen das Rohr sowie den Probeeinsatz in ein neues, sauberes Mikrozentrifugenrohr.
      2. Befestige eine sterile 18G-Nadel an eine 1 mL bis 5 mL sterile Spritze und fülle sie mit Luft.
      3. Führe die Nadel vorsichtig in den Schlauchanschluss am Eingangsende des Ziehrohrs ein.
      4. Um sicherzustellen, dass der cOFM-Probeeinsatz im Mikrozentrifugenröhrchen bleibt, drücken Sie auf den Spritzenkolben, um das zirkulierte cOFM-Probevolumen mit Luft aus dem Zugrohr auszustoßen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte cOFM-Probe aus dem Zugrohr in das Mikrozentrifugenrohr ausgestoßen wird, wobei die Spritze abgelöst und bei Bedarf wieder mit Luft gefüllt wird.
      5. Legen Sie die recirculierte cOFM-Probe für den kurzfristigen Transport auf Eis.
      6. Fahren Sie mit nachgelagerten Analysen über oder legen Sie sie in einen -80 °C Gefrierfach zur Langzeitlagerung.
  8. Speicherung von cOFM-Versorgungen bei wiederholter cOFM-Probenahme im selben Tier:
    HINWEIS: Die Wiederverwendung von cOFM-Einweggeräten, wie Probeneinsätze und Ein- und Auslassschläuchen, wird vom Hersteller nicht empfohlen.
    1. Spülen Sie das cOFM Push-Pull-Rohr mit etwa 500 μL sterilem aCSF oder Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von maximal 10 μL/min. Folgt eine ähnliche Spülung von 1-2 ml 70 % Ethanol. Verwenden Sie schließlich eine 5- oder 10-ml-Spritze mit einer 18-G-Nadel und einem Flansch-Schlauchanschluss, um das Rohr mit Luft auszuspülen.
    2. Spülen Sie Ein- und Auslassrohre des cOFM-Probeeinsatzes mit 50 μL sterilem aCSF oder Kochsalzlösung mit einer gasdichten Glasspritze mit einem geflanschten Rohranschluss. Danach 50 μL 70 % Ethanol. Lösen Sie den cOFM-Probeeinsatz vom Schlauchanschluss und lagern Sie ihn in einem Fläschchen, das mit 70 % Ethanol gefüllt ist, bis er wiederverwendet werden kann.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschiedene evaluative Maßnahmen zur Bestimmung des experimentellen Erfolgs können je nach spezifischer Natur der zugrundeliegenden Pathologie und des experimentellen Tiermodells bereits in Zwischen- oder Kulminationsphasen auftreten. Für Untersuchungen der GBM-Biologie kann die biolumineszente Bildgebung (BLI) als Zwischenbewertungsmaß für die Wirksamkeit der cOFM-guide-vermittelten Tumorzelltransplantation verwendet werden (Abbildung 4A). Dies wird jedoch...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in diesem Protokoll beschriebenen cOFM-Verfahren haben das Potenzial, die Erforschung von ZNS-Erkrankungen durch ihre Fähigkeit zu revolutionieren, endogene Komponenten des ISF pathologischs Gewebes longitudinal zu entnehmen. Der wissenschaftliche Erfolg dieser Methodik hängt jedoch von der ordnungsgemäßen Durchführung mehrerer kritischer Schritte ab. Von diesen ist die korrekte und sichere Platzierung der cOFM-Führungskanone eine der wichtigsten. Unsachgemäße chirurgische Eingriffe ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant 1R01NS096376, 1R01NS112856 und P50CA221747 SPORE for Translational Approaches to Brain Cancer (A.U.A.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,7 mm BohrerFeine wissenschaftliche Werkzeuge19008-07Bohren von Bohrlöchern
1 bis 5 mL SpritzeBD#309646Rezirkulierte Perfusatproben-Retreival
18-G-NadelBD#305195Rezirkulierte Perfusatproben-Retreival
30G-NadelBD Ultra-Fine328438Dura durchbohren
4-0 Vicryl-NähteDynarex9130Schließende Chirurgie würde
AlkoholtücherFisherBrand22-363-750Hautdesinfektion an der chirurgischen Stelle
AnkerschraubenBASiMD-1310cOFM-Kopfmontage
Künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF)BASi (Joanneum)MD-2400Sampling ISF
cOFM-Dummy-EinsatzBASi (Joanneum)cOFM-D- #cOFM-Kopfmontage
cOFM-LeitfadenBASi (Joanneum)cOFM-GD-#- #cOFM-Kopfmontage
cOFM-LeithalterBASi (Joanneum)OFM-STM-1cOFM-Kopfmontage
cOFM-Infusions-EinsatzBASi (Joanneum)cOFM-I- #Zellinjektion
cOFM-VerriegelungskeilBASi (Joanneum)cOFM-LOCKcOFM-Kopfmontage
cOFM-ProbeeinsatzBASi (Joanneum)cOFM-S-XSampling ISF
Applikatoren mit BaumwollspitzenFisherBrane22363160Flüssigkeitsabsorption, Anwendung von Wasserstoffperoxid
CT2A-MausgliomzelllinieSeyfried-Labor – Boston UniversityNAEngrafierte Tumorzellen
ZahnbetonmittelIvoClar595953UScOFM-Kopfmontage
ZahnaushärtungslichtHenry Schein5700253cOFM-Kopfmontage
EnthaarungscremeVeet3116875Haarentfernung an der chirurgischen Stelle
Elektrischer RasiererWahl Clipper Corp. 8841Haarentfernung an der chirurgischen Stelle
Fein gespitzte ZangeFeine wissenschaftliche Werkzeuge5 FußEinschnitt, Befestigung der Ankerschraube
FlanschrohrverbinderBASi (Joanneum)MD-1510Zellinjektion
FraktionssammlungsfläschchenBASi (Joanneum)MF-5281Fraktionierte Probenlagerung
Gasdichte Glasspritze (25 & mu; L)Hamilton80465Zellinjektion
Wasserstoffperoxid (1–3 %)WalgreensNDC: 0363-0268-32Schädeloberflächenreinigung
Insulinspritzen (0,3 bis 1,0 ml) mit 31G-NadelnBD Ultra-Fine328438Anästhetikum und Schmerzlinderung
MikrozentrifugenröhrenBasix02-682-002Rezirkulierte Perfusatproben-Retreival
Mikrobohrer und stereotaktischer HalterHarvard-Apparat75-1874Bohren von Bohrlöchern
MausjackeLomirMJ 02Tierverbindung zum rotierenden Käfigsystem
OFM-FlachbindungsrohreBASi (Joanneum)OFM-PP2-100-LBSampling ISF
OFM-Pumpe – MikroperfusionspumpeBASi (Joanneum)MPP102-PCSampling ISF
AugensalbeDechra211-38Peri-sugriske Augenschmierung
Passive MetallprobennadelBASi (Joanneum)MW-2310Fraktionierte Probenlagerung
PerfusationsbeutelBASi (Joanneum)OFM-BAGSampling ISF
Physiologische KochsalzlösungICU Medizinisch 0990-7983-03Schädeloberflächenreinigung, Unterstützung beim Bohren von Bohrlöchern
Povidon-Jod-AbströcherPDI HealthcareSKU B40600Hautdesinfektion an der chirurgischen Stelle
SondenhalterStoelting51633
Gekühlter FraktionssammlerBASi (Joanneum)MD-1201Fraktionierte Probenlagerung
Rotierendes KäfigsystemBASi (Joanneum)AMD-R RaturnAutomatisierte Gehäuse für wache, cOFM-Probenahme
Skalpellklingen und -griffeFisher Scientific 22079693Schnitt
SchraubenziehercOFM-Kopfmontage
Selbst-ätzender Zahnklebstoff TokuyamaSchädeloberflächenpriming für Zementmittel
Silikon-Schubkappe für SammelphiolenBASi (Joanneum)MF-5283Fraktionierte Probenlagerung
Stereotaktischer RahmenStoelting51725

Referenzen

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