Ein standardisiertes Mausmodell mit einem drei-Personen-Arbeitsablauf zur Untersuchung akuter zellulärer und antikörpervermittelter Abstoßung bei Xenotransplantation

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert zwei standardisierte Maus-Xenotransplantationsmodelle, um gezielt akute zelluläre Abstoßung und akute antikörpervermittelte Abstoßung zu replizieren. Diese Modelle dienen als verlässliche Plattform zur Untersuchung von Mechanismen der Xenograft-Immunabstoßung, zur Bewertung immunsuppressiver Strategien und zur Weiterentwicklung präklinischer Xenotransplantationsforschung.

Zusammenfassung

Trotz jüngster Fortschritte in der Xenotransplantation bleibt die akute Abstoßung ein großes Hindernis für ihre klinische Anwendung. Akute zelluläre Abstoßung (ACR) und akute antikörpervermittelte Abstoßung (AMR) sind die primären Immunantworten, die bei Xenotransplantatempfängern zu einem frühen Transplantatversagen führen. Während Großtiermodelle wie nicht-menschliche Primaten und gentechnisch veränderte Schweine wertvolle Erkenntnisse geliefert haben, ist ihre Nutzung durch hohe Kosten, ethische Einschränkungen und erhebliche experimentelle Variabilität begrenzt. Kleintiermodelle bieten eine praktische, reproduzierbare Alternative für mechanistische Studien zur Immunabstoßung. In dieser Studie wurden zwei standardisierte Maus-Xenotransplantationsmodelle entwickelt, um gezielt ACR und AMR nachzuahmen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und die Variabilität durch den Bediener zu minimieren, wurde ein strukturiertes dreiköpfiges chirurgisches Protokoll mit Fließband-Workflow implementiert, das eine konsistente Modellgenerierung mit hoher Effizienz und Qualität ermöglicht. Die resultierenden Modelle replizieren nicht nur die wichtigsten immunopathologischen Merkmale der klinischen Xenograft-Abstoßung, sondern bieten auch eine robuste Plattform zur Untersuchung von Immunmechanismen und zur Bewertung gezielter immunsuppressiver Strategien. Diese Modelle werden dazu beitragen, die präklinische Entwicklung von Xenotransplantationstherapien zu beschleunigen.

Einleitung

Xenotransplantation hat sich als eine der vielversprechendsten Strategien erwiesen, um dem Mangel an Spenderorganen für Transplantationen entgegenzuwirken. In den letzten Jahren haben schnelle Fortschritte in den Technologien der genetischen Editierung, Immunregulationsstrategien und biomedizinischer Technik zu bedeutenden Fortschritten in^{diesem Bereich geführt}. In den letzten drei Jahren haben weltweit zahlreiche Forschungsteams klinische Studien mit Xenotransplantation am Menschen durchgeführt, darunter zwei Fälle gentechnisch veränderter Schweineherztransplantation an der University of Maryland, eine Studie zur Niertransplantation von Schweinen am Massachusetts General Hospital und eine Thymonierentransplantationsstudie an der New York University 2,3,4,5 . Trotz dieser beispiellosen Fortschritte bleibt die Immunabstoßung die Hauptherausforderung, die die klinische Anwendung der Xenotransplantation einschränkt. Selbst bei hochoptimierten gentechnisch veränderten Spenderorganen und kombinierten immunsuppressiven Regimen bleibt Abstoßung ein großes Hindernis. Aktuelle Studien zeigen, dass akute Abstoßung eine entscheidende Hürde bei der Xenotransplantation darstellt, hauptsächlich in akute zelluläre Abstoßung (ACR) und akute antikörpervermittelte Abstoßung (AMR) eingeteilt. ACR wird hauptsächlich durch T-Zellen vermittelt, die durch eine umfangreiche T-Zell-Infiltration in das Transplantat gekennzeichnet sind, was zu Gewebeschäden und funktionellen Beeinträchtigungen führt. Seine zugrunde liegenden Mechanismen umfassen die xenogene Antigenpräsentation, die Aktivierung von T-Zellen und die Freisetzung entzündlicher Zytokine ^6,7. Im Gegensatz dazu wird AMR durch vorgefertigte oder neu erzeugte donorspezifische Antikörper angetrieben. Diese Antikörper binden an Endothelzellen im Transplantat, lösen eine Komplementaktivierung und eine robuste Immunantwort aus, was letztlich zu Mikrovaskulären Verletzungen, Thrombose und Transplantatversagen^führt. Daher sind ein tieferes Verständnis dieser Abstoßungsmechanismen und die Entwicklung präziserer immunregulatorischer Strategien unerlässlich, um die Xenotransplantation von der präklinischen Forschung bis zur langfristigen klinischen Anwendung voranzutreiben.

Um die Herausforderung der akuten Abstoßung bei der Xenotransplantation anzugehen, ist es unerlässlich, zur Grundlagenforschung und präklinischen Studien zurückzukehren, um die zugrunde liegenden immunologischen Mechanismen aufzuklären. Großtiermodelle, insbesondere nichtmenschliche Primaten (NHPs) und gentechnisch veränderte Schweine, wurden aufgrund ihrer engen anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen in der Xenotransplantationsforschung weit verbreitet eingesetzt. Diese Modelle liefern wichtige Einblicke in Immunabstoßmechanismen und immunmodulatorische Strategien. Ihre Anwendung ist jedoch erheblich durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und die Komplexität der langfristigen postoperativen Versorgung eingeschränkt. Darüber hinaus beeinflusst die erhebliche Variabilität der Immunantworten zwischen einzelnen NHPs die Reproduzierbarkeit experimenteller Ergebnisse 11,12,13. Obwohl Großtiermodelle für die klinische Übersetzung unentbehrlich bleiben, unterstreichen ihre Einschränkungen in experimenteller Machbarkeit und Konsistenz den dringenden Bedarf an kosteneffizienteren, skalierbareren und mechanistisch relevanteren Kleintiermodellen.

Angesichts dieser Herausforderungen gewinnen Kleintiermodelle aufgrund ihrer niedrigen Kosten, kurzen experimentellen Zyklen und der einfachen Anwendung in Xenotransplantationen immer mehr an Bedeutung. Diese Modelle bieten nicht nur eine wesentliche Plattform zur Untersuchung von Immunabstoßmechanismen, sondern dienen auch als entscheidende Brücke zwischen In-vitro-Studien und Großtierversuchen und ermöglichen eine präzisere Untersuchung immunregulatorischer Strategien. In dieser Studie wurden zwei standardisierte Maus-Xenotransplantationsmodelle etabliert, die speziell ACR und AMR nachahmen. Um Reproduzierbarkeit und Konsistenz zu gewährleisten, wurden ein standardisiertes chirurgisches Protokoll für drei Personen sowie ein vereinfachter Fließbandansatz zur Modellgenerierung implementiert. Dieser standardisierte Workflow minimiert die operatorabhängige Variabilität und führt zu hoch einheitlichen Herztransplantationsmodellen. Diese Verfeinerungen bieten eine verlässliche Grundlage für mechanistische Untersuchungen und die Bewertung neuartiger immunsuppressiver Strategien. Dieses Protokoll eignet sich besonders für Forscher, die Kleintierstudien zu Xenotransplantations-Immunmechanismen und zur Bewertung immunsuppressiver Strategien durchführen. Sie bietet Vorteile wie niedrige Kosten, hohe Reproduzierbarkeit und einen standardisierten Arbeitsablauf und bietet eine zuverlässige experimentelle Grundlage für nachfolgende Großtier- und präklinische Studien.

Protokoll

Dieses Protokoll kann von einem einzelnen Bediener oder von einem dreiköpfigen Team durchgeführt werden, wobei jedes Mitglied für die Entnahme des Spenderherzens, die Vorbereitung des Empfängers und die Anastomose des Spenderherzs verantwortlich ist. Der gesamte Prozess wird innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen, was eine schnelle, durchgängige und standardisierte Modellgenerierung ermöglicht.

Die Tierversuche in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Fuwai Hospital, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, genehmigt (Genehmigungsnummer 0108-1-70-ZX(X)-41). Alle Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit Tierschutzvorschriften und ethischen Richtlinien durchgeführt, um die Einhaltung der relevanten Standards sicherzustellen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Vorbereitung der Manschette
   1. Verwenden Sie Polyimid-Schläuche zur Herstellung der Manschetten für die Transplantationsoperation. Für die arterielle Manschette wählen Sie Polyimidrohr mit einem Innendurchmesser von 0,3–0,5 mm und schneiden Sie sie unter einem Stereomikroskop (10×–20× Vergrößerung in 2-mm-Segmente).
   2. Schneiden Sie den Klemmabschnitt jedes Segments umkreisend in zwei Hälften, um eine griffartige Verlängerung zu bilden. Für die venöse Manschette wählen Sie Polyimidrohr mit einem Innendurchmesser von 0,4–0,7 mm und schneiden Sie es in 3-mm-Segmente. Ebenso wird der Klemmabschnitt umkreisend teilweise halbiert, um eine griffartige Verlängerung zu schaffen.
      HINWEIS: Die Manschetten 30 Minuten in 75 % Ethanol einweichen und dann gründlich mit Kochsalzlösung abspülen.
2. Mauspräparation: Verwenden Sie neonatale Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 10–12 Tagen als Spender sowie C57BL/6 oder Balb/c-Mäuse im Alter von 7–8 Wochen als Empfänger. Um eine angemessene Betreuung sicherzustellen und Stress zu minimieren, transportieren Sie neonatale Spenderratten zusammen mit der Mutterratte. Halten Sie alle Tiere in einer speziellen, krankheitserregerfreien (SPF) Umgebung unter.

2. Ernte von Spenderherzen

1. Fixierung und Anästhesie
   1. Betäuben neonatale Ratten durch intraperitoneale Injektion von 30 μL/g Tribromoethanol (Jitianbio, JT0781) (nach institutionell zugelassenen Protokollen).
   2. Nach vollständiger Betäubung legen Sie die Ratte in Rückenlage und sichern Sie sie unter einem Stereomikroskop. Desinfizieren Sie den Thorakoabdominalbereich mit Povidon-Jod-getränkten Wattebäuschen.
      HINWEIS: Behandle Tribromoethanol mit Handschuhen und Augenschutz in einem belüfteten Bereich; Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen.
2. Heparinisierung
   1. Desinfizieren Sie den Thorakoabdominalbereich mit Povidon-Jod-getränkten Wattebäuschen. Bewege den Darm vorsichtig zur Seite mit einem Wattestäbchen, um die untere Vena cava freizulegen.
   2. Heparinisiertes Kochsalzlösungsmittel (0,2–0,5 ml) wird mit einer Insulinspritze in die untere Vena cava injiziert, gefolgt von einer sanften Kompression der Injektionsstelle mit einem Wattebäusch, um eine Blutung zu verhindern.
      HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz beim Zubereiten oder Injizieren von heparinisiertem Kochsalzlösung; Entsorgen Sie Spritzen als scharfen Abfall. Bereiten Sie heparinisierte Kochsalzlösung vor, indem Sie ein Fläschchen medizinisch hochwertiges Natriumheparin (125 mg) in 100 mL normaler Kochsalzlösung auflösen.
3. Herzstillstand
   1. Schneiden Sie das Zwerchfell auf, schneiden Sie die Brustwand beidseitig durch und ziehen Sie sie zurück, um das Herz vollständig freizulegen. Entferne die Thymus. Durchtrennen Sie die obere Vena cava, um den Druck zu entlasten, und perfundieren Sie 1 ml Lösung der University of Wisconsin (UW) in die Aorta, um einen Herzstillstand auszulösen.
   2. Setzen Sie die Perfusion fort, bis das Herz von rot zu blass wechselt. Gleichzeitig legt man ein Mullbindenpad, das in eiskalten Kochsalzlösung getränkt ist, über das Herz, um die Temperatur zu senken und Dehydrierung zu verhindern.
      HINWEIS: Schneiden Sie sterile Mullbinde in 1 cm × 1 cm große Stücke und weichen Sie sie vor der Verwendung in eiskalter Kochsalzlösung vor.
4. Entnahme des Spenderherzens
   1. Ligaiere die obere und untere Vena cava mit einer 8–0 Seidennaht und schneide sie dann durch. Die Aorta am Aortenbogen durchtrennen und die Lungenarterie an ihrer Bifurkation durchtrennen.
   2. Schließlich ligatiere alle Lungenvenen mit einem 8-0 Seidennaht verwenden und das Spenderherz entfernen. Lagern Sie das geerntete Herz vorübergehend in eiskalter Kochsalzlösung zur Konservierung.

3. Vorbereitung des Empfängers

1. Anästhesie
   1. Betäuben Sie die empfangende Maus mit derselben Methode und legen Sie sie zur Stabilisierung in Rückenlage.
2. Desinfektion
   1. Entfernen Sie Haare aus dem Nackenbereich mit einer Enthaarungscreme, gefolgt von einer Hautdesinfektion mit Povidon-Jod.
3. Hautschnitt
   1. Machen Sie mit einer Augenschere einen 2 cm langen Längsschnitt etwa 1 cm rechts von der Mittellinie am Hals. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um das subkutane Fett und die Muskelschichten schrittweise zu entfernen, und entfernen Sie die Submandibulardrüse.
      HINWEIS: Beim Ausschneiden der Untermandibulardrüse sollten die basalen Blutgefäße mit einer 8–0-Seidennaht ligiert oder mit einem Elektrokauteriestift kauterisiert werden, um Blutungen zu verhindern.
4. Vorbereitung der externen Jugularvene
   1. Nach der Exposition der äußeren Jugularvene werden die Äste einzeln mit einem Elektrokauteriestift auf niedrigen Gerinnungsmodus (5–10 W) verbrannt. Platz zwei 8:0 Seidennähte nahe dem distalen Ende der Vene zur Ligation.
   2. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Schere, um die äußere Jugularvene zwischen den beiden Ligaturen zu durchschneiden. Führe die äußere Jugularvene durch die venöse Manschette ein, drücke die Manschette an die Venenbasis und sichere sie mit einer Gefäßklemme.
   3. Entfernen Sie die Ligaturen mit einer mikrochirurgischen Schere und spülen Sie das Restblut in der Vene mit heparinisiertem Kochsalzlösungslösungsmittel aus. Die äußere Drosselvene über der Manschette mit einer mikrochirurgischen Pinzette legen und sie mit einem 8-0 fixieren Seidennaht.
      HINWEIS: Bedienen Sie den Elektrokauteriestift sorgfältig und achten Sie darauf, Verbrennungen zu vermeiden. Die äußere Jugularvene hat mehrere Zuflüsse, die sorgfältig isoliert und verschlossen werden sollten, um Blutungen zu minimieren.
5. Vorbereitung der Halsschlagader
   1. Führen Sie eine stumpfe Dissektion hinter dem Musculus sternocleidomastoideus durch, um die Karotisscheide zu lokalisieren. Öffnen Sie die Halsschlagaderscheide und trennen Sie vorsichtig die Arteria Halsschlagader Halsschlagader und den Vagusnerv interna.
   2. Ligate und durchschneide die Arterie auf die gleiche Weise wie die Vene. Führen Sie das untere Ende der durchschnittenen Arterie durch die arterielle Manschette ein, setzen Sie sie ab und sichern Sie sie an Ort und Stelle.
      HINWEIS: Die Halsschlagader, die Vene der Halsschlagader interna und der Vagusnerv sind in der Halsschlagaisscheide eingeschlossen. Beim Öffnen der Hülle sollte darauf geachtet werden, den Vagusnerv nicht zu schädigen. Die Halsschlagader hat einen kleineren Durchmesser als die äußere Vene Jugularis, ist aber elastischer, was die Eversion schwieriger macht als die der Vene.

4. Anastomose des Spenderherzens

1. Aorta-zu-Karotisarterie-Anastomose
   1. Nach dem Trimmen des Spenderherzs legen Sie es sofort in den Hals der empfangenden Maus. Benutze einen 8-0 Seidennaht mit einem lockeren Knoten, um eine Schlaufe um die Spenderaorta zu bilden.
   2. Schieben Sie die Spenderaorta über die arterielle Manschette an der Halsschlagader des Empfängers und sichern Sie sie mit einem 8-0 Seidenligatur.
      HINWEIS: Beim Sichern der Aorta sollte die Naht oberhalb der Ligaturlinie der Halsschlagader gebunden werden, um direkten Kontakt zwischen der Ligaturstelle und dem Blut des Empfängers zu verhindern.
2. Anastomose von Pulmonarterie zu externer Jugularvene
   1. Benutze einen 8-0 Seidennaht mit lockerem Knoten, um eine Schlaufe um die Spenderlungenarterie zu bilden. Schieben Sie die Lungenarterie über die venöse Manschette der äußeren Halsvene des Empfängers und sichern Sie sie mit einem 8-0 Seidenligatur.
3. Herzwiederaufnahme
   1. Lösen Sie die Gefäßklemmen an der Halsschlagader und der externen Jugularvene des Empfängers, um die Durchblutung wiederherzustellen. Beachten Sie, dass das Spenderherz wieder starke Kontraktionen aufnimmt und innerhalb von 10 Sekunden schnell rot wird.
4. Verschluss des Schnitts
   1. Sobald das Spenderherz wieder einen stabilen Rhythmus gefunden hat, passen Sie seine Position an und schließen Sie den Hautschnitt am Hals des Empfängers mit 4-0 Nähten. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidonjod.

5. Postoperative Versorgung

1. Postoperative Analgesie
   1. Trage Lidocain-Gel topisch zur Schmerzlinderung auf, nachdem die Haut abgeschlossen ist. Wenn die Maus deutliche Schmerzanzeichen zeigt, verabreichen Sie Meloxicam (2 mg/kg) per peritonealer Injektion.
      HINWEIS: Meloxicam wird in 10 % DMSO und 90 % Maisöl gelöst, und das Injektionsvolumen wird basierend auf der erforderlichen Dosis berechnet.
2. Genesung
   1. Lege die Maus auf eine warme, weiche Matte, die bei 37–38 °C gehalten wird, um die Körpertemperatur zu erhalten, und beobachte sie, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Sobald sie vollständig wach ist, halten Sie die Maus einzeln in einem Käfig mit ausreichendem Zugang zu Futter und Wasser.
3. Überwachung
   1. Überwachen Sie das transplantierte Herz täglich durch visuelle Inspektion und Palpation, um seinen Schlag und die Gesamtlebensfähigkeit des Transplantats zu beurteilen.
      HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren mit geeigneter PSA durch und halten Sie sich an institutionelle Vorschriften zur Biosicherheit und Tierpflege. Alle während des Versuchs entstandenen chemischen Rückstände, Perfusaten und tierisches Gewebe sollten gemäß institutionellen Vorschriften gesammelt und entsorgt werden. Lösungen, die Tribromoethanol oder Heparin enthalten, sollten als gefährliche chemische Abfälle behandelt werden, während tierisches Gewebe und blutbasierte Materialien als biologische Abfälle behandelt und durch Autoklavierung sterilisiert oder über zertifizierte Einrichtungen entsorgt werden sollten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den standardisierten kollaborativen Workflow mit drei Personen zur Erstellung eines Mausen-Xenotransplantationsmodells. In diesem System arbeiten drei Bediener parallel und führen jeweils wiederholt eine bestimmte Aufgabe aus: Empfängervorbereitung, Spenderherzbeschaffung oder Spenderherz-Anastomose. Diese Arbeitsteilung ermöglicht es, alle 10 Minuten ein komplettes Transplantationsmodell fertigzustellen. Während ein einzelner Bediener ein ...

Diskussion

Die Maus-Xenotransplantation ist ein hochinvasives Verfahren, das vom Bediener ein hohes Maß an technischer Kompetenz und Konsistenz verlangt. Während der Modellentwicklung hat der Betreiber einen erheblichen Einfluss auf experimentelle Ergebnisse ^14,15. In einem Einzel-Personen-Workflow führen die Komplexität und Länge des Verfahrens zu einer ungefähren Betriebszeit von 30 Minuten pro Modell, was zu geringer Effizienz führt. Dar...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-CD3-Antikörper	Abcam	ab16669
Anti-CD68-Antikörper	Bioss	bs-1432R
DAPI	Thermofisher	P36971
Enthaarungscreme	Veet	-
Elektrokauterstift	Yuyan Instrument	-
Fluoreszierende Sekundärantikörper	Thermofisher	A-11008
HE-Färbesatz	Beyotime	C0105S
Eismaschine	Shjingmi	IMS-20
Insulinspritzen	KDL	U-40
Lidocain-Gel	Tide Pharm
Meloxicam	Sigma-Aldrich	444800
Mikrochirurgische Zangen	ZHENHAO	FS217
Mikrochirurgische Nadelhalter	BIOFIVEN	HH01231
Mikrochirurgische Scheren	ZHENHAO	FS237
Normale Kochsalzlösung	Kelun Pharmaceutical	-
Polyimid-Rohre	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Innendurchmesser: 0,3-0,5 mm
Polyimid-Rohre	Guangzhou Wanlixin Metal Products Co., Ltd.	-	Innendurchmesser: 0,4-0,7 mm
Povidon-Jod-Lösung	INOHV	-
Natriumheparin	Qianhong bio-pharma	-
Stereomikroskop	Murzider	MSD204
Chirurgische Nähte	Jinhuan Medical	8-0 und 4-0 Seidenfäden
Chirurgisches Wärmekissen	Hani Pet	-
Tribromoethanol	Jitianbio	JT0781
University of Wisconsin-Lösung	Belzer	-
Gefäßklemmen	RWD Life	R31005-10