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Methodenartikel

Weiße und braune Fetttransplantate: Ein Ansatz zur Korrektur von Fortpflanzungs-, Stoffwechsel- und Nierendefiziten bei übergewichtigen Mäusen mit schwarzer und brauner Brachyury (BTBR)

1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/68759

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9. September 2025

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1Albert Einstein Research and Education Institute, Hospital Israelita Albert Einstein, 2School of Medicine, Faculdade Israelita de Ciências da Saúde Albert Einstein, 3Nephrology Division, Federal University of São Paulo

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Transplantationsprotokoll für weißes und braunes Fettgewebe vor, das eine vielversprechende Strategie zur Umkehrung von Subfertilität, Fettleibigkeit und Hyperglykämie bietet und gleichzeitig die Nierenfunktion bei diabetischen und adipösen BTBR-Mäusen verbessert.

Zusammenfassung

Die Transplantation von weißem Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BVT) hat sich als vielversprechende therapeutische Strategie zur Umkehrung von Stoffwechselstörungen erwiesen, ohne dass eine nachhaltige Verabreichung von exogenen Wirkstoffen erforderlich ist. WAT fungiert als wichtiges endokrines Organ, das an der Energiehomöostase beteiligt ist, während BAT ein thermogenes Gewebe ist, das für die Thermoregulation entscheidend ist. Das adipöse Mausmodell des Black and Tan Brachyuric (BTBR) ahmt die wichtigsten Merkmale von Fettleibigkeit, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und diabetischer Nierenerkrankung (DKD) genau nach, einschließlich Hyperglykämie, Insulinresistenz, Hypometabolismus und Subfertilität.

Unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls führte die kombinierte Transplantation von WAT und BAT von BTBR-Wildtyp- und heterozygoten Spendern in BTBR-adipöse Empfänger zu einer Umkehrung der Subfertilität, einer Abschwächung der Gewichtszunahme, einer Normalisierung der glykämischen Kontrolle und einer Verbesserung der Nierenparameter. Insbesondere die renale Hypertrophie und Apoptose wurden reduziert, während die Podozytenzahlen erhalten blieben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kombinierte WAT- und BAT-Transplantation eine alternative therapeutische Strategie für die Behandlung von T2DM darstellen könnte, mit gleichzeitigen Vorteilen bei der Linderung von DKD und Adipositas. Darüber hinaus kann dieser Ansatz dazu beitragen, die Anzahl lebensfähiger BTBR-adipöser Mäuse innerhalb von Vivariumkolonien zu erhöhen. Weitere Untersuchungen der zugrundeliegenden Mechanismen können die klinische Umsetzung dieser Intervention erleichtern.

Einleitung

Diabetische Nierenerkrankung (DKD), Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und Adipositas stellen miteinander verknüpfte, multifaktorielle Erkrankungen dar, die erhebliche und wachsende globale gesundheitliche Herausforderungen mit sich bringen. DKD, definiert als das Nebeneinander von Diabetes mellitus (DM) und chronischer Nierenerkrankung in Ermangelung anderer identifizierbarer Ursachen für Nierenschäden, betrifft etwa 20-40% der Personen mitDM 1,2. T2DM ist eine systemische Stoffwechselstörung, die durch chronische Hyperglykämie und Störungen der Glukose-, Lipid- und Insulinhomöostase gekennzeichnet ist. Sie gehört zu den zehn häufigsten Todesursachen weltweit und betrifft derzeit über 500 Millionen Menschen3. Fettleibigkeit, die durch ein chronisches Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und -verbrauch verursacht wird, betrifft heute jeden achten Menschen weltweit und trägt wesentlich zur Morbidität und Mortalität bei4. Diese drei Erkrankungen sind eng miteinander verknüpft: Fettleibigkeit erhöht das Risiko, an T2DM zu erkranken, deutlich, was wiederum das Risiko für DKD 1,4 deutlich erhöht. Die weltweit steigende Prävalenz von Adipositas, T2DM und DKD unterstreicht die dringende Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses ihrer pathophysiologischen Mechanismen und der Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien.

Die BAT-Transplantation hat sich als vielversprechende therapeutische Strategie zur Bekämpfung von Fettleibigkeit und T2DM erwiesen. Diese Intervention wurde mit einer Verringerung des Körpergewichts, einer Verbesserung der Insulinresistenz und der Lebersteatose sowie einer Zunahme des zirkulierenden Adiponektins, der β3-adrenergen Rezeptorexpression und der an der Fettsäureoxidation beteiligten Gene in Verbindung gebracht5. Zu beachten ist, dass das Fettgewebe von Säugetieren anhand der Farbe in drei Haupttypen eingeteilt werden kann: weiß, braun und beige6. WAT beginnt sich kurz nach der Geburt auszudehnen und ist weit im Körper verteilt. Es fungiert als wichtiges endokrines Organ und speichert überschüssige Energie in Form von Triglyceriden, indem es zirkulierende Glukose und freie Fettsäuren bindet6. Im Gegensatz dazu spielt die BVT eine entscheidende Rolle bei der Thermoregulation, indem sie Energie als Wärme über eine nicht zitternde Thermogenese abgibt, anstatt sie als ATP6 zu speichern. Die BAT-Aktivität nimmt mit zunehmendem Alter, Fettleibigkeit und TM ab. Bei Erwachsenen umfasst die BVT einen kleinen Teil des gesamten Fettgewebes und befindet sich beim Menschen hauptsächlich im supraklavikulären und zervikalen Bereich, während sie bei Mäusen überwiegend im interscapularen Bereich lokalisiertist 6. BAT ist reich an Mitochondrien, verbraucht erhebliche Mengen an Glukose und Fettsäuren und wird mit der Resistenz gegen Gewichtszunahme in Verbindung gebracht7. Neue Erkenntnisse belegen die Rolle von BAT bei der Förderung eines schlankeren und metabolisch günstigeren Phänotyps und wecken ein wachsendes Interesse an seiner therapeutischen Anwendung durch Transplantation.

Leptin, ein Hormon, das hauptsächlich von WAT ausgeschüttet wird, spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Energiehaushalts, des Stoffwechsels und der Fruchtbarkeit8. Es wirkt auf das zentrale Nervensystem, um die Sekretion des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) im Hypothalamus zu stimulieren, was anschließend die Freisetzung von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH) aus dem Hypophysenvorderlappen fördert9. Leptin wirkt auch direkt auf die Theka- und Granulosazellen der Eierstöcke, um die Follikelentwicklung zu unterstützen9.

Das BTBRob/ob (BTBR fettleibig) Mausmodell, genetisch als BTBR bezeichnet. Cg-Lep ob/WiscJ (schwarz und braun, fettleibig, büschelig; siehe Materialtabelle) ist homozygot für einen spontanen Funktionsverlust im Leptin-Gen (Lep) und zeigt eine Reihe von metabolischen und reproduktiven Anomalien, einschließlich Hyperglykämie, Glukoseintoleranz, Hyperinsulinämie, Hypertriglyceridämie, gestörte Wundheilung, Hypometabolismus, Hypothermie und Subfertilität aufgrund von hypogonadotropem Hypogonadismus. Männchen entwickeln T2DM in der Regel im Alter von sechs Wochen, während Weibchen dies im Alter von acht Wochen tun10. Hyperglykämie ist schwerwiegend und progredient, wobei der Nüchternblutzuckerspiegel nach zehn Wochen 400 mg/dl übersteigt. Darüber hinaus zeigen BTBR-adipöse Männchen in der achten Woche eine zeitabhängige Albuminurie, die zu einer histologisch offensichtlichen DKD fortschreitet, einschließlich mesangialer Expansion und Podozytenentzündung. Diese Merkmale etablieren BTBR-adipöse Mäuse als robustes präklinisches Modell, das den menschlichen DKD10 genau rekapituliert.

Angesichts der tiefgreifenden metabolischen Folgen eines Leptinmangels wurden mehrere Strategien untersucht, um den ob/ob-Phänotyp umzukehren, einschließlich einer Leptinersatztherapie und einer Fettgewebstransplantation. Während in den meisten Studien ob/ob-Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund verwendet wurden, haben relativ wenige diese Interventionen bei dem metabolisch stärker beeinträchtigten BTBR-Stamm untersucht. Bei C57BL/6 ob/ob-Mäusen hat sich gezeigt, dass die WAT-Transplantation den Insulinspiegel normalisiert, die Insulinsensitivität verbessert und die Fruchtbarkeit wiederherstellt8. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die BAT-Transplantation in magere C57BL/6-Mäuse eine Körpergewichtszunahme verhindert, die Glukosetoleranz und die Insulinsensitivität verbessert und gleichzeitig die Insulinresistenz verringert, insbesondere im Zusammenhang mit fettreicher Ernährung, die durch Fettleibigkeit induziert wird11. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die BAT-Transplantation die kardiale Hämodynamik und die metabolische Gesundheit verbessert12. Trotz ermutigender Ergebnisse weisen diese Studien einige wichtige Einschränkungen auf. Die meisten Untersuchungen wurden an C57BL/6 ob/ob-Mäusen durchgeführt, die im Vergleich zu den stärker betroffenen BTBR-ob /ob-Mäusen einen relativ milden metabolischen Phänotyp aufweisen. Folglich ist die Verallgemeinerbarkeit dieser Ergebnisse auf Modelle mit ausgeprägterer Insulinresistenz, Hyperglykämie, Adipositas und Nierenerkrankungen begrenzt. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von Leptinersatz und Fettgewebstransplantation vor dem BTBR-Hintergrund unzureichend untersucht, was eine kritische Lücke in der Literatur darstellt. Viele dieser Interventionen wurden auch an mageren Tieren oder über kurze Zeiträume untersucht, die die Komplexität und chronische Natur menschlicher Stoffwechselerkrankungen möglicherweise nicht angemessen erfassen. Obwohl über Verbesserungen der Insulinsensitivität, der Glukosetoleranz und der Fertilität berichtet wurde, sind die zugrunde liegenden Mechanismen nach wie vor wenig verstanden, und die translationale Relevanz dieser Ergebnisse für das klinische Umfeld ist noch ungewiss. Bemerkenswert ist, dass die kombinierten metabolischen Effekte der Transplantation von weißem und braunem Fettgewebe bei BTBR ob/ob-Mäusen weitgehend unerforscht sind.

Ziel dieser Studie ist es, ein Protokoll für die kombinierte WAT- und BAT-Transplantation bei BTBR-adipösen Mäusen zu standardisieren und seine Auswirkungen auf die Wiederherstellung der Fertilität, die Nierenfunktion und histologische Veränderungen zu bewerten. Ein sekundäres Ziel ist es, die Expansion der BTBR-adipösen Kolonie zu erleichtern und gleichzeitig den Verlust von heterozygoten (BTBR ob/+) und Wildtyp-Mäusen (BTBR +/+) im Vivarium zu reduzieren.

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Protokoll

Alle Versuche wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE) genehmigt und beim Jewish Institute of Research and Education, São Paulo, SP, Brasilien registriert (N°. 3309-18 und N°. 4900-21). Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

HINWEIS: BTBR-adipöse Mäuse (Leptin-Gen-Knockout, homozygot, ob/ob) wurden als Modell für T2DM, DKD und Adipositas verwendet. Weibliche BTBR-adipöse Mäuse im Alter von 4-5 Wochen dienten als Empfänger für die Fettgewebstransplantation. Bei den Spendertieren handelte es sich um weibliche BTBR ob/+ (heterozygot) oder +/+ (Wildtyp) Mäuse (Genotyp nicht bestätigt, aber phänotypisch mager). Zum Zeitpunkt der Transplantation hatten die Empfängermäuse ein durchschnittliches Körpergewicht von 25 bis 32 g. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen in individuell belüfteten Käfigen untergebracht, mit Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser, einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und einer Kontrolle der Umgebungstemperatur. Pro Käfig wurden maximal fünf Tiere untergebracht.

1. Chirurgischer Eingriff

  1. Euthanasieren Sie Spendermäuse mit einer 100%igen v/v-Isofluran-Überdosierung (2,5-5%), gefolgt von einer Zervixluxation (Abbildung 1A).
  2. Lagern Sie das Tier in Rückenlage (Bauch nach oben) und desinfizieren Sie den Unterbauch mit 0,5 % alkoholischem Chlorhexidin-Digluconat. Machen Sie einen 2-3 cm langen Bauchschnitt in der Mittellinie, um leistenden WAT zu entnehmen (Abbildung 1B). Legen Sie das herausgeschnittene Gewebe in ein 3-ml-Röhrchen auf Eis.
  3. Positionieren Sie das Tier in Bauchlage (Bauch nach unten) und machen Sie einen 1-2 cm langen Mittellinienschnitt zwischen den Schulterblättern, um interscapulares BAT zu entnehmen (Abbildung 1C). Pool-Fettgewebe von 10-14 Spendern. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtmenge WAT + BAT 10–15 % des Körpergewichts des Empfängers entspricht.
  4. Homogenisieren Sie WAT und BAT getrennt mit einer 16-g-Nadel und einer 3-ml-Spritze (Abbildung 1D).
  5. Messen Sie das endgültige Fettgewicht mit einer Analysenwaage (Abbildung 1E) und bewahren Sie die Proben bis zur Transplantation auf Eis auf.
  6. Betäuben Sie die übergewichtigen BTBR-Mäuse des Empfängers in einer 100% v/v Isoflurankammer (2,5-5% Induktion) und halten Sie die Anästhesie über eine Gesichtsmaske aufrecht (1,5-2,5%). Sobald die Atmung auf ≤1 Atemzug alle 3 s abnimmt, legen Sie das Tier in Bauchlage (Abbildung 1F).
  7. Desinfizieren Sie den Rückenbereich mit 2,0 % nichtalkoholischem Chlorhexidin-Digluconat (Abbildung 1G).
  8. Injizieren Sie 100-200 μl homogenisiertes Fett pro Stelle mit einer 16-G-Nadel über 6-26 Stellen auf der dorsalen Oberfläche. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Verteilung zu unterstützen. Tragen Sie nach der Transplantation 0,5% ige Chlorhexidinlösung auf jede Injektionsstelle auf (Abbildung 1H).
  9. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Dosis Tramadol (40 mg/kg; 50 mg/ml Lösung) für Analgesie und Haustiere einzeln, um Verletzungen während der Genesung zu vermeiden.
  10. Reinigen Sie am nächsten Tag die Injektionsstellen mit 0,5% iger Chlorhexidinlösung und verabreichen Sie eine zweite Dosis Tramadol.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Verfahrens der Fetttransplantation. (A) Sterbehilfe des Spenders mit Isofluran in einer geschlossenen Box. (B) Entnahme von Leisten-WAT. (C) Entnahme von interscapularer BVT. (D) Homogenisierung des Fettes. (E) Wiegen von Fett. (F) Anästhesie des Empfängers. (G) Rücken-Asepsis. (H) Fettinjektion mit zangengestützter Technik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Paarung nach der Transplantation

  1. Zwei Wochen nach der Transplantation werden weibliche BTBR-adipöse Mäuse mit männlichen BTBR ob/+ (heterozygoten) Mäusen zur Paarung zusammengebracht.

3. Funktionale Bewertungen

  1. Messen Sie wöchentlich das Körpergewicht mit einer Analysenwaage.
  2. Bestimmen Sie den Nüchternblutzucker mit einem Blutzuckermessgerät zu fünf Zeitpunkten: Wochen 4-7, 8-10, 14-16, 18-20 und 24-26.
  3. Setzen Sie das Tier für 6 Stunden in einen Stoffwechselkäfig mit Zugang zu Wasser, um eine Urinprobe zu entnehmen.
  4. Messen Sie den Albuminspiegel im Urin mit der ELISA-Methode und bestimmen Sie den Kreatininspiegel im Urin mit der kolorimetrischen Pikrinsäuremethode nach 6-8 Wochen. Berechnen Sie das Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR) im Urin, indem Sie die Albuminkonzentration (μg) durch die Kreatininkonzentration (mg) dividieren.

4. Morphologische Analyse

  1. Einschläferung der Empfängermäuse im Alter von 24 Wochen durch Verabreichung einer Überdosis von 100 % v/v Isofluran (2,5-5 %), gefolgt von einer Zervixluxation, um den Tod sicherzustellen.
  2. Entnehmen Sie Eierstöcke, Nieren und Bauchspeicheldrüse im Alter von 24 Wochen.
  3. Legen Sie die entnommenen Organe in 10% neutrales gepuffertes Formalin und fixieren Sie sie bei Raumtemperatur für 24-48 h.
  4. Nach der Fixierung wird das Gewebe mit einem automatischen Gewebeprozessor verarbeitet, um Wasser zu entfernen, und für die histologische Analyse in Paraffin eingebettet.
    1. Tauchen Sie das Gewebe nacheinander für jeweils 1 h in die folgenden Ethanollösungen: 70 %, 85 %, 95 % (2x) und 100 % (2x).
    2. Übertragen Sie das Gewebe für 1 h in frisches Xylol, gefolgt von einem zweiten Xylolbad für weitere 1 h.
    3. Tauchen Sie das Gewebe 1 h lang bei 6 °C in geschmolzenes Paraffinwachs und geben Sie es dann für weitere 1 h in frisches Paraffin.
    4. Richten Sie das Gewebe in einer erhitzten, mit geschmolzenem Paraffin gefüllten Form aus und lassen Sie es bei Raumtemperatur erstarren.
    5. Schneiden Sie aus jedem Block mit einem Mikrotom vier nicht aufeinanderfolgende 3,5 μm dicke Abschnitte. Schweben Sie die Bänder zum Abflachen auf einem 4 °C warmen Wasserbad und montieren Sie dann einzelne Abschnitte auf positiv geladene Glasobjektträger. Überschüssiges Wasser abgießen und die Objektträger für 60 min auf eine 3 °C warme Warmhalteplatte legen.
  5. Bestimmen Sie die Follikelzahl in den Eierstöcken und die Größe der Pankreasinseln mithilfe der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E).
    1. In Paraffin eingebettete Gewebeobjektträger in einem Ofen bei 6 °C für 1 h inkubieren. Übertragen Sie die Objektträger in einen Behälter mit frischem Xylol und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, um Paraffin aufzulösen, und ersetzen Sie das Xylol nach 15 Minuten durch eine frische Lösung.
    2. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für jeweils 30 s in ein Xylol:Ethanol-Gemisch, 100 % Ethanol, 85 % Ethanol und 70 % Ethanol.
    3. In Leitungswasser abspülen (10 s), mit Harris Hämatoxylin einfärben (30 s) und in 95 % Ethanol tauchen (3 s).
    4. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für jeweils 30 s in 70 %, 85 %, 100 % Ethanol und Xylol:Ethanol-Gemisch.
    5. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in frisches Xylol, gefolgt von einem zweiten Xylolbad für weitere 5 Minuten, um die Fleckenfixierung zu gewährleisten.
    6. Montieren Sie Dias mit Deckgläsern mit einem Montagemedium.
  6. Bewertung der glomerulären Größe und der Expansion der mesangialen Matrix mit Hilfe der periodischen Säure-Schiff (PAS)-Färbung von Nierenschnitten.
    1. Objektträger 1 h bei 6 °C inkubieren und 5 min in frisches Xylol tauchen, um die Gewebeschnitte zu entparaffinieren.
    2. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für jeweils 30 s in 99 %, 95 % und 70 % Ethanol ein.
    3. 10 s in Leitungswasser spülen.
    4. 10 Tropfen periodische Säure auftragen und 10 Minuten inkubieren.
    5. 3 min unter fließendem Wasser abspülen und trocknen.
    6. Fügen Sie 10 Tropfen Schiff Reagenz hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang in einer dunklen Kammer.
    7. 3 min unter fließendem Wasser abspülen und trocknen.
    8. Fügen Sie 10 Tropfen Harris Hämatoxylin hinzu, um eine Gegenfärbung zu erhalten, und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang.
    9. Spülen Sie die Objektträger 3 Minuten lang unter fließendem Wasser ab und trocknen Sie sie.
    10. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für jeweils 30 s in 70 %, 85 %, 100 % Ethanol und Xylol:Ethanol-Gemisch.
    11. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in frisches Xylol, gefolgt von einem zweiten Xylolbad für weitere 5 Minuten, um den Fleck zu fixieren.
    12. Montieren Sie Dias mit Deckgläsern mit einem Montagemedium.
  7. Beurteilung der follikulären Apoptose (gespaltene Caspase-3) in Eierstöcken und Nieren und der Podozytenzahl (WT-1+-Zellen) in den Nieren durch Immunhistochemie (IHC).
    1. Die Objektträger 1 h lang bei 6 °C inkubieren, anschließend 30 min lang mit Xylol behandeln (Xylol nach 15 min ersetzen).
    2. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in 100 %, 90 % und 70 % Ethanol und Wasser (jeweils 30 s).
    3. Führen Sie eine Antigen-Entnahme durch, indem Sie die Objektträger in Citratpuffer (pH 6,0) 12 Minuten lang bei 95 °C erhitzen, wobei Sie eine Mikrowelle verwenden, um die Antigenstellen zu demaskieren.
    4. In 1x Waschpuffer 15 min spülen, Puffer alle 5 min wechseln.
    5. Blockieren Sie die endogene Peroxidase mit Wasserstoffperoxid, um Hintergrundfärbungen zu vermeiden und eine unspezifische Bindung mit Rinderserumalbumin (BSA) zu verhindern.
      HINWEIS: Bei gespaltener Caspase-3-Färbung ist die endogene Peroxidaseaktivität für 7 min und 30 s zu blockieren; für WT-1 Färbung für 5 Min. blockieren.
    6. Wiederholen Sie den Waschvorgang wie in 4.7.4.
    7. 10 μl Primärantikörper gegen gespaltene Caspase-3 (Apoptose) und WT-1 (Podozyten) werden angewendet. Über Nacht bei °C in einer dunklen, befeuchteten Kammer inkubieren.
    8. Wiederholen Sie den Waschvorgang wie in 4.7.4.
    9. 10 μl Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper 1,5 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auftragen.
    10. Wiederholen Sie den Waschvorgang wie in 4.7.4.
    11. Wenden Sie 10 μl DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Chromogen an, um die HRP-Aktivität sichtbar zu machen, wodurch ein brauner Niederschlag entsteht.
      HINWEIS: Für gespaltene Caspase-3-Färbung 1 min und 30 s mit DAB inkubieren; für WT-1-Färbung 45 s inkubieren.
    12. Wiederholen Sie den Waschvorgang wie in 4.7.4.
    13. Gegenfärbung der Schnitte mit Harris Hämatoxylin für 30 s bis 1 min, je nach gewünschter Intensität.
    14. 1-2 Minuten in Leitungswasser spülen oder bis das Wasser klar ist.
    15. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in 70 %, 85 %, 95 % und 100 % Ethanol (jeweils 30 s) und ein Xylol:Ethanol-Gemisch (30 s).
    16. Legen Sie die Objektträger für 5 Minuten in frische Xylollösung und geben Sie sie für weitere 5 Minuten in ein zweites Xylolbad.
    17. Montieren Sie Dias mit Deckgläsern mit einem Montagemedium.
  8. Analysieren Sie gefärbte Schnitte mit einem inversen Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Verwenden Sie automatisierte Bildanalysesoftware, um für jedes Organ interessante Regionen (ROIs) auszuwählen.
    1. Eierstöcke (H&E): Zählen und klassifizieren Sie Follikeltypen pro Abschnitt.
    2. Bauchspeicheldrüse (H&E): Wählen Sie Inselzellen mit dem ROI-Tool aus, um den Umriss jeder Pankreasinsel manuell nachzuzeichnen. Sobald der ROI definiert ist, berechnet die Software automatisch die Fläche in Quadratmikrometern (μm 2).
    3. Niere (H&E): Quantifizieren Sie die glomeruläre Fläche, indem Sie das ROI-Tool auswählen, um den äußeren Rand jedes glomerulären Büschels manuell nachzuzeichnen. Verwenden Sie die Funktion Fläche messen , um die Fläche inμm 2 zu erhalten. Nach dem Tracing berechnet die Software automatisch die Fläche inμm 2.
    4. Nieren (PAS)
      1. Um die mesangiale Matrix zu quantifizieren, verwenden Sie das Werkzeug "Schwellenwert ", um PAS-positive (magenta/rosafarbene) Regionen innerhalb des Glomerulus zu identifizieren und auszuwählen. Passen Sie die Farb- und Intensitätsschwellenwerte nach Bedarf an, um PAS-gefärbte Bereiche genau auszuwählen, indem Sie das Vorschaufenster verwenden, um die Auswahl zu verfeinern. Definieren Sie die ausgewählte PAS-Region als ROI. Nach dem Tracing berechnet die Software automatisch die Fläche inμm 2.
      2. Normalisieren Sie die Expansion der mesangialen Matrix, indem Sie den prozentualen Anteil der PAS-positiven Fläche im Verhältnis zur gesamten glomerulären Fläche berechnen.
    5. Eierstöcke und Nieren (IHC für gespaltene Caspase-3)
      1. Wählen Sie ROIs aus, die follikulären oder glomerulären Strukturen entsprechen. Wenden Sie eine Farbmaske an, um DAB-positive (braune) Färbungen zu identifizieren, indem Sie die Schwellenwerte für Farbton, Sättigung und Intensität anpassen. Verwenden Sie die Vorschaufunktion , um eine genaue Auswahl des DAB-Signals sicherzustellen und die Schwellenwerteinstellungen zu verfeinern, um Hämatoxylin (blau), Gegenfärbung und unspezifischen Hintergrund auszuschließen.
      2. Sobald der gewünschte Schwellenwert definiert ist, stellen Sie die Auswahl als ROI ein und messen Sie den DAB-positiven Bereich (μm 2). Berechnen Sie den Prozentsatz der gefärbten Fläche, indem Sie die DAB-positive Fläche durch die gesamte ROI-Fläche dividieren und mit 100 multiplizieren.
    6. Nieren (IHC für WT-1+): Zählen Sie braun gefärbte Zellkerne pro Glomerulus, um die Podozytenzahl zu schätzen.
      HINWEIS: Die Follikelzahlen pro Abschnitt (mittlere ± SD) waren: BTBR adipös (7,7 ± 3,11), transplantiert (5,8 ± 3,24), BTBR mager (4,6 ± 5,62). Die Anzahl der Inselzellen pro Abschnitt (mittlere ± SD) war: BTBR adipös (18,3 ± 8,42), transplantiert (9,7 ± 5,45), BTBR mager (6,8 ± 1,72). Bestimmen Sie 30 Glomeruli pro Tier für die Messung der glomerulären Fläche und der mesangialen Matrixexpansion. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) bzw. als Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test beurteilt. Die unidirektionale ANOVA mit dem Post-hoc-Test von Tukey wurde für Vergleiche zwischen normalverteilten Gruppen angewendet. Wiederholte Messungen wurden mit Hilfe von bidirektionalen ANOVA- oder Mixed-Effects-Modellen analysiert, gegebenenfalls mit Geisser-Greenhouse-Korrektur. Für nicht normalverteilte Daten wurde der Kruskal-Wallis-Test mit den Mehrfachvergleichen von Sidak verwendet. Führen Sie alle Analysen mit einer geeigneten Statistiksoftware durch, wobei die statistische Signifikanz auf p < 0,05 festgelegt ist (siehe Materialtabelle für Details).

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Ergebnisse

Menge des transplantierten Fettes und Wirksamkeit des Protokolls
Nach der Standardisierung des Protokolls wurden zwei Fetttransplantationsvolumina (5-9,9 % und 10-15 % bezogen auf das Körpergewicht des Spenders) auf ihre Wirksamkeit hin untersucht, d. h. das Erreichen von mindestens einer Schwangerschaft, die zu lebensfähigen Nachkommen führt. Die 5-9,9 %-Gruppe wies eine Erfolgsquote von 23,8 % auf, während die 10-15 %-Gruppe 52,2 % erreichte, was einer 2,2-fachen St...

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Diskussion

Diese Studie zeigt, dass die kombinierte WAT- und BAT-Transplantation ein wirksamer therapeutischer Ansatz zur Kontrolle von Hyperglykämie, zur Verhinderung von Körpergewichtszunahme und Inselzellhypertrophie, zur Wiederherstellung der weiblichen Subfertilität und zur Verbesserung der Nierenfunktion durch Verringerung der Apoptose und Erhaltung der Podozytenzahl in einem präklinischen Modell von T2DM, DKD und Adipositas ist.

Obwohl frühere Studien die WAT- und...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Wir danken den technischen Teams des Experimental and Surgical Training Center (CETEC) und des Jewish Institute of Research and Education (IIEP) für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Master-Forschungsstipendium von CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals) an S.B., ein direktes Promotionsstipendium von CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals) an M.L.F. ein Master-Forschungsstipendium der FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; Nr. 2024/08173-6) an M.O.M. und ein Scientific Initiation Fellowship Grant der FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; Nr. 2019/12636-3) an M.T.A.B-R. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse der FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/São Paulo Research Foundation; Nr. 2017/23195-2 und Nr. 2021/02216-7) und der EFSD (European Foundation for the Study of Diabetes) an É.B.R. unterstützt. Die Autoren erklären, dass sie in diesem Manuskript keine mit künstlicher Intelligenz (KI) erzeugte Arbeit verwendet haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 % alkoholische Chlorhexidin-DiglukonatlösungRioquí MicaSKU 1068253
16-Gauge-NadelBecton DickinsonSKU 305198
2,0 % alkoholfreie Chlorhexidin-Digluconat-LösungRioquí MicaSKU 1113045
3-mL-SpritzeBecton DickinsonSKU 309657
Accu-Check-Streifen – PerformaRocheEAN 4015630981960
Alcian Blue PAS-TrikotEasyPathSKU EP-11-20019
Rinderserum-Albumin (BSA)Sigma-AldrichA4612
CellSens-SoftwareOlympusCELLENS
Citratpuffer pH 6,0: Zitronensäuremonohydrat + NatriumhydroxidSigma-AldrichC1909 + 28-3010
Gespaltener Caspase-3-AntikörperZell-Signaltechnik9661
Cobas C 111 AnalyzerRoche4528778001
Kreatinin KLabtest96-300
EnVision FLEX DAB+ ChromogenAgilent-DakoK3468
EnVision FLEX / HRP-DetektionsreagenzAgilent-DakoSM802
Envision FLEX Peroxidase-Blockierendes ReagenzAgilent-DakoSM801
EnVision FLEX SubstratpufferAgilent-DakoSM803
EnVision FLEX war Puffer 20xAgilent-DakoK800721-2
EosinAgilent-DakoCS701
GloMax Discover Mikroplatten-LeserPromegaGM3000
Glucometer Accu-Check – PerformaRocheEAN 4015630980512
GraphPad Prism 8 Software (statistische Software)GraphPad von Dotmatics-
100 % v/v Isoforin (Isofluran)Cristá Lia-
HämatoxylinAgilent-DakoCS700
IX51-LichtmikroskopOlympusIX51
Metabolischer Käfig für einzelne MausTecniplast3600M021
Montagemedium – EntellanSigma-Aldrich100869
Maus-Albumin ELISA-KitAbcamAb207620
Mausstamm: BTBR. Cg-Lepob/WiscJJAX-Labore4824
Periodic Acid Schiff (PAS) KitEasyPathEP-11-20014
RM255 MicrotomeLeica Biosystems14050237960
TP1020 GewebeprozessorLeica BiosystemsTP-1020
Tramadol 50 mg/mLGrü nenthal4022444
WT-1-AntikörperSanta CruzSC-192

Referenzen

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