Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Forschungsartikel
In dieser Studie wurden die hepatoprotektiven Wirkungen von Blaufuchsgalle auf alkoholinduzierte Leberschäden bei Mäusen untersucht. Blaufuchsgalle, die TUDCA, UDCA, Bilirubin und TCDCA enthält, reduzierte die Marker für Leberschäden und wirkte über den AGE-RAGE-Signalweg, AKT1 und PPARG, wobei sie entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften zeigte.
Tierische Galle, wie z. B. Bärengalle, wird in der traditionellen Medizin seit langem wegen ihres therapeutischen Nutzens verwendet. Es wird angenommen, dass die Blaufuchsgalle, ähnlich wie die Bärengalle, in bestimmten traditionellen Praktiken hepatoprotektive Eigenschaften besitzt. In dieser Studie wurden die Bestandteile und Auswirkungen von Blaufuchsgalle auf alkoholassoziierte Leberschäden bei Mäusen untersucht. Die Galle wurde von 30 Blaufüchsen gesammelt und zu getrocknetem Pulver verarbeitet. Die chemische Zusammensetzung der Blaufuchsgalle wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Quadrupol-Flugzeitspektrometrie analysiert. Die Netzwerkpharmakologie wurde eingesetzt, um potenzielle bioaktive Verbindungen, Ziele und Signalwege zu identifizieren, die mit alkoholassoziierten Leberschäden verbunden sind. Ein Mausmodell für alkoholassoziierte Leberschäden wurde an Kunming-Mäusen etabliert, denen Blaufuchs-Gallepulver in niedrigen und hohen Dosen verabreicht wurde. Es wurden die Alaninaminotransferase im Serum, die Aspartataminotransferase und der Gesamtcholesterinspiegel gemessen. Das Lebergewebe wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und Malondialdehyd-Assay bestimmt. Molekulares Docking wurde durchgeführt, um die Bindungsaffinität zwischen Wirkstoffen und Kernzielen vorherzusagen. Es wurde festgestellt, dass die Blaufuchsgalle Tauroursodeoxycholsäure (TUDCA), Ursodeoxycholsäure, Bilirubin und Taurochenodeoxycholsäure enthält. Die histopathologische Analyse ergab keine signifikanten Anomalien oder toxischen Wirkungen in wichtigen Organen nach oraler Verabreichung von Blaufuchs-Gallepulver. Zu den Hauptzielen der Blaufuchsgalle gehörten die Proteine AKT1, PPARG, IGF1, MMP9 und CASP3. Die Behandlung mit Blaufuchsgalle senkte die Serum-ALT-, AST-, Cholesterin- und MDA-Spiegel in Mausmodellen für alkoholbedingte Leberschäden. Die Netzwerkpharmakologie und das molekulare Docking deuten darauf hin, dass die hepatoprotektive Wirkung der Blaufuchsgalle mit dem fortgeschrittenen Glykationsendproduktrezeptor für den fortgeschrittenen Glykationsendprodukt-Signalweg zusammenhängen könnte. Insgesamt zielt die Blaufuchsgalle mit ihrem TUDCA-Gehalt, der dem der Bärengalle ähnelt, auf Proteine wie AKT1 und PPARG ab und zeigt potenzielle entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen bei der Behandlung von alkoholbedingten Leberschäden.
Die alkoholassoziierte Lebererkrankung (ALD) umfasst ein Spektrum von Leberschäden, das von asymptomatischen Laboranomalien über fortgeschrittene Lebererkrankungen mit Leberzirrhose bis hin zu lebensbedrohlichen Lebererkrankungen im Endstadium mit Multiorganversagen reicht1. Die Prävalenz von ALD, einschließlich der alkoholassoziierten Fettlebererkrankung, stellt eine relativ milde und potenziell reversible Form von ALD1 dar. Die alkoholassoziierte Hepatitis ist durch eine Entzündung gekennzeichnet, deren klinisches Erscheinungsbild von der asymptomatischen Steatohepatitis bis zur akuten alkoholischen Hepatitis reicht, die mit akuter Gelbsucht einhergeht und zu Leberversagen mit hoher Kurzzeitmortalität führen kann1. Alkohol und seine Metaboliten verändern den Fettstoffwechsel und fördern die Lipidakkumulation (Steatose) durch mehrere Mechanismen, einschließlich der Hemmung der mitochondrialen Fettsäure-β-Oxidation und der Stimulation der Lipogenese2. Ethanol reguliert die Expression des Transferrinrezeptors 1 hoch und erhöht dadurch die Eisenaufnahme in der Leber2. Sowohl Alkohol als auch Acetaldehyd können Hepatozyten direkt verletzen, was zu erhöhtem oxidativem Stress, Hemmung der Regeneration von s-Adenosylmethionin, Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPS), Exposition gegenüber bakteriellen Endotoxinen im Pfortaderkreislauf und Bildung von Proteinaddukten führt2. Die Behandlung von ALD bleibt aufgrund der zahlreichen pathogenen Wege eine Herausforderung3. Zu den zukünftigen Strategien, die untersucht werden, gehören empirische Probiotika, Wachstumsfaktoren, Antioxidantien, monoklonale Antikörper, die auf entzündungsbezogene Faktoren abzielen, und technologiegestützte Verhaltensinterventionen. Es müssen jedoch noch weitere umfassende Therapiestrategien erforscht werden.
Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass tierische Galle aufgrund ihrer entzündungshemmenden und antioxidativen Eigenschaften ein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung alkoholassoziierter Lebererkrankungen (ALD) haben kann 4,5. Tierische Galle ist ein wichtiger Bestandteil der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM)6. In der TCM wird tierische Galle zur Stärkung der Leber- und Gallenblasenfunktion sowie zur Linderung von Schmerzen, Fieber, Husten und Entzündungen eingesetzt. Es wird bei der Behandlung von Lebererkrankungen, einschließlich Zirrhose, eingesetzt6. Tierische Galle besitzt entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften6, und Entzündungen und oxidativer Stress spielen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von ALD7. Es wurde auch berichtet, dass eine Gallensäure-Supplementierung die Lebersteatose verbessert8. Derzeit ist Bärengalle das am weitesten verbreitete Arzneimittel aus Galle, wobei Ursodeoxycholsäure (UDCA) und Taurocholsäure (TUDCA) die Hauptwirkstoffe sind 6,9. Bemerkenswert ist, dass TUDCA in der Galle anderer Tiere wie Schafe, Kühe, Hühner und Schlangen nicht vorkommt6. TUDCA hat therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von akuten Leberschäden gezeigt10. Gegenwärtig wird TUDCA durch Bärengalledrainage (was Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes aufwirft), chemische Synthese (die kostspielig ist) oder Biotransformation von Hühnergallenpulver in ein Bärengalleäquivalent (das nicht mit authentischer Bärengalle gleichwertig ist) gewonnen11,12. Der Blaufuchs (Alopex lagopus), auch Polarfuchs genannt, wird in Gefangenschaft vor allem wegen seines Fells gezüchtet. China ist einer der drei größten Exporteure von Pelzbekleidung weltweit, und die inneren Organe von geernteten Blaufüchsen werden in der Regel weggeworfen13. Dies bietet die Möglichkeit, die Gallenblase als potenzielle medizinische Ressource aufzuwerten. Blaufüchse und Bären sind beide Fleischfresser und haben Ähnlichkeiten in der Verdauungsphysiologie, im Stoffwechsel und in der Ernährung, was darauf hindeutet, dass ihre Gallenzusammensetzung und -wirkung ebenfalls ähnlich sein könnten. Diese Möglichkeit wurde jedoch noch nicht ausgelotet.
Daher zielte diese Studie darauf ab, die pharmakologischen Wirkungen und die zugrunde liegenden Mechanismen der Blaufuchsgalle in Modellen der ALD zu untersuchen. Die Ergebnisse können neue Forschungswege für die Entwicklung von Bärengalleersatzstoffen aufzeigen, eine wissenschaftliche Grundlage für die Nutzung der Blaufuchs-Gallenblase als medizinische Ressource schaffen, Industrieabfälle in wertvolle Produkte umwandeln und die zukünftige therapeutische Entwicklung informieren.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Heilongjiang University of Chinese Medicine geprüft und genehmigt (Zulassung #2023021101). Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) und den einschlägigen nationalen und institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Da es sich bei dieser Studie um Tierversuche handelte, war die Einwilligungserklärung nach Aufklärung nicht anwendbar. Alle Verfahren zur Tierzucht und Pelzernte hielten sich strikt an die chinesischen Technischen Vorschriften für das Management der Wildtierzucht. Die Studie wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Heilongjiang University of Chinese Medicine, China genehmigt (Zulassung #2023021101).
Probenvorbereitung für Blaufuchsgalle
Die Ressource Blaufuchsgalle ist in der Materialtabelle angegeben. Insgesamt 30 Blaufüchse (Vulpes lagopus) wurden durch Elektroschocks eingeschläfert, gefolgt von der Fellernte und der Gallenblasenentnahme. Die Gallenblase des Blaufuchses hat eine ovale Form mit einem schmalen oberen Teil und einem geschwollenen unteren Abschnitt. Seine äußere Oberfläche ist dunkelbraun mit sichtbaren Falten, und die Kapselmembran ist dünn. Die Galle wurde sofort mit einer sterilen 1-ml-Einwegspritze aspiriert und erschien dunkelschwarz oder dunkelgrün. Die Gallenblasen wurden dann 48 h lang bei 37 °C getrocknet, um getrocknetes Blaufuchs-Gallepulver zu erhalten (Abbildung 1). Das resultierende Gallenpulver wies einen gelb-braunen Farbton mit einer glänzenden, brüchigen Textur auf. Die durchschnittliche Ausbeute an getrocknetem Gallenpulver pro Gallenblase betrug etwa 0,82 ± 0,30 g. Zur Probenvorbereitung wurden 250 mg getrocknetes Gallenpulver von Blaufuchs (wie oben beschrieben) oder Bär (siehe Materialtabelle) in 1 ml 70 % Methanol in Chromatographiequalität gelöst. Die Lösung wurde mit Ultraschall (40 kHz, 300 W) beschallt, durch eine 0,22-μm-Membran filtriert, auf ein Endvolumen von 50 ml (d. h. auf 5 mg/ml) verdünnt und für die anschließende Analyse weiter auf eine Arbeitskonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf ist in der ergänzenden Abbildung 1 zusammengefasst.
In dieser Studie betrug der Dosierungsbereich von Blaufuchs-Gallepulver, das für Tierversuche verwendet wurde, 5-10 g/kg, basierend auf früheren Toxizitätsbewertungen und pharmakologischen Studien, wobei bei diesen Konzentrationen keine signifikanten unerwünschten Wirkungen beobachtet wurden14,15. Bei der Aufbereitung von Gallenpulver wurden die Gallenblasen 48 h lang bei 37 °C getrocknet; Die Trocknungszeit kann jedoch je nach lokaler Luftfeuchtigkeit und Probenvolumen variieren, daher sollte der Feuchtigkeitsgehalt überprüft werden, um eine vollständige Dehydrierung zu gewährleisten. Für die Auflösung war eine Konzentration von 5 mg/ml in Methanol in Chromatographiequalität optimal für HPLC- und UPLC-Q-TOF-MS-Analysen; Eine unvollständige Auflösung oder Partikelrückstände können die analytische Genauigkeit beeinträchtigen und eine zusätzliche Beschallung oder Filtration erfordern. Eine bekannte Einschränkung ist die Variabilität in der Gallenzusammensetzung aufgrund saisonaler, ernährungsbedingter und individueller physiologischer Unterschiede bei Blaufüchsen, die sich auf die relative Häufigkeit von Wirkstoffen wie TUDCA und UDCAauswirken könnten 16. Daher wird vor der pharmakologischen Anwendung eine Chargenvalidierung durch chromatographische Profilerstellung empfohlen, um konsistente Komponentenprofile zu gewährleisten.
Pharmakologische Netzwerkanalyse
Die chemische Zusammensetzung der Blaufuchsgalle wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (siehe Materialtabelle) und Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) analysiert. Die HPLC wurde unter Verwendung einer SB-C18-Säule (4,6 mm x 150 mm, 5 μm) mit einer mobilen Phase bestehend aus 0,03 M Natriumdihydrogenphosphat (pH-Wert auf 4,4 mit Phosphorsäure eingestellt) als Phase A und Methanol (siehe Materialtabelle) als Phase B (Tabelle 1) durchgeführt. Die Detektionswellenlänge wurde auf 210 nm eingestellt, mit einer Flussrate der mobilen Phase von 1,0 mL/min und die Säulentemperatur betrug 40 °C. Das Injektionsvolumen betrug 10 μL. DIE UPLC-Q-TOF/MS-Analyse wurde mit einer UPLCTM HSS T3-Säule durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A)-0,1%iger wässriger Ameisensäurelösung (B; siehe Materialtabelle). Das Gradientenelutionsprogramm war wie folgt: 0-25,0 min, 98%-2% A und 25,0-28,0 min, 2%-2% A bei einer Flussrate von 4 mL/min. Die Säulentemperatur wurde bei 35 °C gehalten. Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) mit folgenden Parametern durchgeführt: Lösungsmittelgasdurchfluss von 650 l/h, Lösungsmittelgastemperatur von 350 °C, Kegelgasdurchfluss von 50 l/h, Ionenquellentemperatur von 120 °C, Kapillarspannung von 2,8 kV (positiver Ionenmodus) und 2,0 kV (negativer Ionenmodus), Kegelspannung von 25 V und Kollisionsenergie von 6 eV. Die Spektren wurden alle 0,2 s mit einem Intervall von 0,02 s aufgenommen. Leucin-Enkephalin (siehe Materialtabelle; [M+H]+=556.2771) wurde als Referenzkalibrierlösung bei einer Konzentration von 40 fmol/μL und einer Flussrate von 15 μL/min verwendet17.
Analyse der chemischen Zusammensetzung und Vorhersage des Ziels
Die Wirkstoffe der Blaufuchsgalle wurden mittels HPLC und UPLC-Q-TOF/MS mit Aurocholsäure und Natriumtauuroursodeoxycholat (siehe Materialtabelle) als interne Standards identifiziert18. Die Strukturformeln der identifizierten Verbindungen wurden aus der PubChem-Datenbank abgerufen (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Um potenzielle bioaktive Ziele zu erforschen, wurden die Wirkstoffe der Blaufuchsgalle in der PharmMapper-Datenbank (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/) abgefragt, um assoziierte Genziele zu identifizieren.
Unter Verwendung von alkoholischen Leberschäden und alkoholinduzierten Leberschäden als Schlüsselwörter wurden krankheitsbezogene Gene aus den Datenbanken GeneCards (https://www.genecards.org/) und OMIM (https://omim.org/) gewonnen. In der GeneCards-Datenbank wurden die Ziele nach dem Relevanz-Score gescreent, wobei der Schwellenwert auf ≥ 20 festgelegt wurde. Dieser häufig verwendete empirische Cutoff gewährleistet ein Gleichgewicht zwischen Sensitivität und Spezifität, wobei die meisten potenziell relevanten Gene erhalten bleiben (hoher Recall), während schwach verwandte oder verrauschte Gene herausgefiltert werden (hohe Präzision). Im Gegensatz dazu wurde in der OMIM-Datenbank keine zusätzliche Filterung angewendet, da sie Ziele mit starken genetischen Beweisen erfasst und damit die rechnerischen Relevanzwerte von GeneCards ergänzt. Die erhaltenen Zieldaten wurden zusammengeführt und dupliziert, um Ziele zu identifizieren, die mit ALD in Verbindung stehen. Die Wirkstoff- und Krankheitsziele wurden mit Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) zur Visualisierung verglichen. Die Schnittpunkte wurden als potenzielle Ziele von Blaufuchsgalle gegen ALD identifiziert und in die STRING-Datenbank (http://version10.string-db.org/) importiert. In der STRING-Datenbank wurde das Interaktionsnetzwerk mit den Standardparametern (mittlerer Konfidenzwert ≥ 0,4) konstruiert, und freie Knoten wurden ausgeblendet, um die Klarheit der Visualisierung zu verbessern. Freie Knoten wurden ausgeblendet, um das Netzwerkdiagramm der Protein-Protein-Interaktion (PPI) zu erstellen, das mit der Cytoscape-Software (Version 3.9.1) visualisiert wurde. Die topologische Analyse wurde durchgeführt, um Gradwerte zu berechnen, und die sechs Ziele mit den höchsten Gradwerten wurden unter Verwendung der Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) mit einem Signifikanzschwellenwert von p < 0,05 identifiziert. Die Datenbank der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurde für die Analyse der Signalanreicherung verwendet.
Molekulares Andocken
Molekulares Docking wurde durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen den Kernzielproteinen und den bioaktiven Komponenten der Blaufuchsgalle zu bewerten. Die dreidimensionalen Strukturen der Kernzielproteine wurden aus der Proteindatenbank des Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) (https://www.rcsb.org/) und die Strukturen der Gallenkomponenten aus der PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) entnommen. Die Docking-Simulationen wurden mit der Software Molecular Operating Environment (MOE) (Version 2022.02) durchgeführt. Für AKT1 wurde die Kristallstruktur (PDB-ID: 4EKL) heruntergeladen, und die Vorverarbeitung in MOE umfasste die Entfernung von Wassermolekülen und ursprünglichen Liganden, die Wasserstoffaddition mit Protonierung bei physiologischem pH-Wert (7,0) und die Energieminimierung. Die Ligandenstrukturen (TUDCA, UDCA, TCDCA, TCA und Bilirubin) wurden aus PubChem entnommen und der Energieaufwand vor dem Andocken minimiert. Während des Andockprozesses wurden mehrere Ligandenkonformationen erzeugt, und jede Konformation wurde in verschiedenen räumlichen Orientierungen in die Bindungstasche des Rezeptors eingebracht. Das Docking wurde unter Verwendung des Induced Fit-Protokolls durchgeführt, mit London dG für die Erstplatzierung und Affinity dG als Scoring-Funktion. Für jeden Liganden wurden dreißig Konformationen generiert, und die endgültigen Posen wurden durch Kraftfeldoptimierung verfeinert. Alle anderen Parameter wurden ohne weitere Feinabstimmung auf MOE-Standardwerte gesetzt. Die Affinität zwischen jeder Ligandenkonformation und dem Rezeptor wurde mit der Scoring-Funktion der Software bewertet. Die Docking-Ergebnisse wurden anhand der Bindung der freien Energie bewertet, wobei die stärkste Konformation mit negativer Energie im größten Cluster als repräsentativer Bindungsmodus gewählt wurde. Für die Visualisierung wurde der Bindungsmodus mit der stärksten Affinität und optimalen Konformation ausgewählt. Affinitätswerte unter -4,25 kcal/mol deuten auf eine Liganden-Ziel-Bindung hin, Werte unter -5,0 kcal/mol auf eine moderate Bindung und Werte unter -7,0 kcal/mol auf eine starke Bindungsaffinität 19.
Mausmodelle von ALD
Für diese Studie wurden 30 spezifische pathogenfreie (SPF) Kunming-Mäuse (18-22 g, 6-8 Wochen alt, 15 Männchen, 15 Weibchen) gekauft. Die Tiere wurden unter kontrollierten Bedingungen bei 25 ± 2 °C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % ± 10 % untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Vor dem Experiment wurden die Mäuse 1 Woche lang akklimatisiert.
Das ALD-Modell wurde wie folgt aufgebaut. Eine 70%ige Ethanollösung wurde hergestellt, indem 70,21 ml wasserfreies Ethanol in einen Messkolben abgemessen und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 100 ml hinzugefügt wurde. Die Lösung wurde mit einem Magnetrührer 1 min lang gerührt und 5 min stehen gelassen, bis keine Phasentrennung mehr beobachtet wurde. Die Sondendosis betrug 2 ml/kg Körpergewicht und wurde einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Am Morgen des 7. Tages, 4 Stunden nach der letzten Sonde, wurden Blutproben und Lebergewebe für die weitere Analyse entnommen. Die Etablierung des Modells wurde durch die Auswertung typischer Indikatoren für Leberschäden bestätigt. Die Serumspiegel von Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), Gesamtcholesterin (T-CHO) und Malondialdehyd (MDA) wurden gemessen. Darüber hinaus wurde das Lebergewebe einer histopathologischen Untersuchung mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) unterzogen, um die Morphologie der Hepatozyten, die zytoplasmatische Vakuolisierung, die Nekrose und die Infiltration entzündlicher Zellen zu beurteilen. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt (n=6 pro Gruppe): Die leere Kontrollgruppe erhielt 2 ml/kg destilliertes Wasser; Die Modellgruppe erhielt 2 ml/kg 70 % Ethanol ohne Behandlung; der Positivkontrollgruppe wurden hepatoprotektive Tabletten in einer Menge von 0,4 g/kg verabreicht (siehe Materialtabelle); der hochdosierten Blaufuchs-Gallepulvergruppe wurden 10 g/kg Blaufuchs-Gallenpulver verabreicht; Der niedrig dosierten Blaufuchs-Gallepulvergruppe wurden 5 g/kg Blaufuchs-Gallepulver verabreicht. Allen Gruppen mit Ausnahme der Blindkontrolle wurde an 7 aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich 70 % Ethanol (2 ml/kg) oral verabreicht, um eine alkoholische Leberschädigung zu induzieren. Am 7. Tag, 4 h nach der Ethanolverabreichung, wurden die entsprechenden Behandlungen (hepatoprotektive Tabletten oder Blaufuchs-Gallepulver) verabreicht und nachfolgende Experimente durchgeführt. Die Blindkontrollgruppe erhielt während des gesamten Experiments destilliertes Wasser.
Messung von Serumtransaminasen (ALT und AST) und Gesamtcholesterin-Kit (T-CHO)
Die Blutproben wurden bei 1.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Die Proben wurden bis zur Analyse bei -20 °C gelagert. Kommerzielle Kits wurden verwendet, um die ALT-, AST- und T-CHO-Werte (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen.
Überwachung des Körpergewichts
Nach 7 aufeinanderfolgenden Tagen der Ethanolverabreichung wurden die Behandlungen an Tag 7 verabreicht und die Experimente wurden 4 Stunden nach der morgendlichen Dosierung durchgeführt. Das Körpergewicht wurde während des Beobachtungszeitraums 2x täglich gemessen. Das nicht nüchterne Körpergewicht wurde an den Tagen 1, 2, 3, 5, 7, 10 und 14 nach der Verabreichung mit einer elektronischen Analysenwaage gemessen.
Verarbeitung von Gewebeproben
Am Tag 14 nach der Verabreichung wurden das Körpergewicht und die verbleibende Nahrungsaufnahme aufgezeichnet. Am Nachmittag wurden die Tiere dann gefastet und hatten freien Zugang zu Wasser. Am folgenden Tag (nach einer Fastenzeit von 12-16 h) wurde das nüchterne Körpergewicht vor der Euthanasie durch Zervixluxation gemessen. Makroskopische pathologische Untersuchungen wurden durchgeführt, um morphologische Veränderungen in wichtigen Organen zu beurteilen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Herz, Leber, Milz, Lunge, Nieren, Nebennieren, Gehirn, Magen, Darm, Hoden, Prostata, Eierstöcke und Gebärmutter. Gewebeproben aus Herz, Leber, Milz, Lunge, Nieren, Magen und Darm wurden nach dem Zufallsprinzip aus der blinden Kontrollgruppe (CN) und der niedrig dosierten Blaufuchs-Gallegruppe (LH) entnommen, in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für die histopathologische Beurteilung gefärbt. Gewebeschnitte wurden untersucht und unter dem Mikroskop abgebildet.
H&E-Färbung
Leberproben wurden mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Die Schnitte wurden in Xylol I und II entparaffinisiert, in absteigenden Ethanolkonzentrationen (100 %, 95 %, 85 % und 75 %) rehydriert und mit Wasser gewaschen, differenziert, erneut gewaschen und mit Bläuelösung gebläut. Nach dem Spülen wurden die Schnitte jeweils 5 min lang in 85 % und 95 % Ethanol dehydriert, 5 min lang mit Eosin gefärbt und in wasserfreiem Ethanol I, II und III (jeweils 5 min) dehydriert. Abschließend wurden die Abschnitte in Xylol I und II (je 5 min) geräumt und mit neutralem Gummi montiert. Die Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (100x) aufgenommen.
Bestimmung von Malondialdehyd (MDA) in Lebergeweben
Leberproben wurden in 9 Volumina physiologischer Kochsalzlösung mit Hilfe eines Gewebewolfs homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 700 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der MDA-Assay wurde am Überstand mit einem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Statistische Analyse
Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen (SDs) dargestellt. Die Gruppenvergleiche wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von dem Post-hoc-Test der geringwertigsten Differenz (LSD). Zweiseitige p-Werte <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Identifizierung der Wirkstoffe in der Blaufuchsgalle
Blaufüchse und Bären sind beide Fleischfresser und teilen eine ähnliche Verdauungsphysiologie und einen ähnlichen Stoffwechsel20. Daher kann ihre Galle vergleichbare Zusammensetzungen haben. Unter den oben beschriebenen chromatographischen Bedingungen wurde jede Verbindung gut getrennt (Abbildung 2). In diesem Experiment wurde die Retentionszeit des TUDCA-Standards21 verwe...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Laut dem Globalen Statusbericht über Alkohol und Gesundheit der Weltgesundheitsorganisation (WHO) aus dem Jahr 2018 stieg der Pro-Kopf-Alkoholkonsum in China von 4,1 l im Jahr 2005 auf 7,2 l im Jahr 2016, was einem Anstieg von 76 % entspricht. ALD, die durch chronischen Alkoholkonsum verursacht wird, ist nach wie vor eine wichtige Ätiologie der leberbedingten Morbidität und Mortalität22. Bo et al. etablierten ein Modell für Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4)...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China Youth Science Foundation (Nr. 82204562) unterstützt.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0.03M Natriumdihydrogenphosphat | N/A | N/A | HPLC mobile phase A |
| 0,1 % Ameisensäure in Wasser | Fisher Scientific, USA | N/A | Mobile Phase für UPLC |
| 0,22 μm M Membranfilter | N/A | N/A | Filtration von Proben |
| 4% Paraformaldehyd | N/A | N/A | Fixierung des Gewebes |
| Acetonitril, Chromatographie-Qualität | Fisher Scientific, USA | N/A | Mobile Phase für UPLC |
| ALT-, AST-, T-CHO-Bausätze | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., China | N/A | Biochemische Analyse des Serums |
| Analytische Waage | N/A | N/A | Messung des Tiergewichts |
| Aurocholsäure | Chinesisches Institut für Lebensmittel- und Arzneimittelkontrolle | N/A | Interner Standard für HPLC/MS |
| Bärengalle Pulver | Chinesisches Institut für Lebensmittel- und Arzneimittelkontrolle, Peking | N/A | Referenzmaterial |
| Bilirubin | Keine Angabe | N/A | Identifizierter Wirkstoff in der Galle |
| Blaufuchs | Suihua Fox Farm, Heilongjiang, China | N/A | Quelle der Galle |
| Blaufuchs-Gallepulver | Vorbereitung im Haus | N/A | Probe für die Bauteilanalyse |
| C18 HPLC-Säule | Agilent Technologies, USA | ZORBAX SB-C18 (4,6-fach; 150 mm, 5 μ m) | HPLC-Trennung |
| Zytoscape | https://cytoscape.org/ | Version 3.9.1 | Netzwerkvisualisierung und topologische Analyse |
| DAVID | NIH | https://david.ncifcrf.gov/ | GO/KEGG-Anreicherungsanalyse |
| GeneCards | Weizmann-Institut | https://www.genecards.org/ | Krankheitsbedingte Gengewinnung |
| Hämatoxylin und Eosin (H& E) | N/A | N/A | Histologische Färbung |
| HPLC-System | Agilent Technologies, USA | 1200 Unendlichkeit | Analyse der Zusammensetzung der Galle |
| Kunming-Mäuse (SPF, 18– 22g) | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. | SCXK (Liao) 2020-0010 | Modell der alkoholischen Leberschädigung |
| Leucin-Enkephalin | Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika | N/A | MS-Kalibrierstandard (40 fmol/μ L) |
| MDA-Nachweis-Kit | Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., China | N/A | Messung von oxidativem Stress in der Leber |
| Methanol, Chromatographie-Qualität | Fisher Scientific, USA | N/A | Lösungsmittel für die Probenvorbereitung |
| MOE | Arbeitsgruppe Chemisches Rechnen | MOE 2022.02 | Molekulare Docking-Analyse |
| OMIM | NIH | https://omim.org/ | Krankheitsbedingte Gengewinnung |
| Lichtmikroskop | N/A | N/A | Histologische Beobachtung |
| PharmMapper | ECUST | http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | Vorhersage von Wirkstoffzielen |
| Phosphorsäure | N/A | N/A | pH-Einstellung der mobilen Phase |
| PubChem (Englisch) | NCBI (englisch) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ | Rückgewinnung von Verbundstrukturen |
| RCSB Protein-Datenbank | https://www.pdbus.org/ | N/A | Protein-3D-Strukturquelle |
| Gekühlte Zentrifuge | N/A | N/A | Trennung von Serum und Gewebe |
| Natriumtauroursodeoxycholat (TUDCA) | Chinesisches Institut für Lebensmittel- und Arzneimittelkontrolle | N/A | Interner Standard für HPLC/MS |
| SCHNUR | EMBL | http://version10.string-db.org/ | Analyse der Protein-Protein-Wechselwirkung |
| UniProt | EMBL-EBI | https://www.uniprot.org/ | Ziel-Standardisierung |
| UPLC-Q-TOF-MS-System | Waters, USA | UPLC HSS T3 (100-fach; 2,1 mm, 1,8 μ m) | Identifizierung von Komponenten |
| Venny | CSIC | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html | Visualisierung der Zielkreuzung |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.