Digitale Polymerase-Kettenreaktion von Mikrotröpfchen zum präzisen Nachweis von Mutationen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zum sensitiven und spezifischen Nachweis von EGFR T790M-Mutationen mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (ddPCR) vor, das auch erweitert werden kann, um andere Tumormutationen wie G719S, L858R, L861Q und S768I schnell zu identifizieren.

Zusammenfassung

Auf globaler Ebene ist Lungenkrebs nach wie vor die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle, wobei seine Prävalenz nach Nierenkrebs an zweiter Stelle steht. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht etwa 80-85% aller gemeldeten Lungenkrebsfälle aus. Die T790M-Mutation im EGFR-Gen ist eine weithin anerkannte primäre Determinante der erworbenen Resistenz gegen epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitoren (EGFR-TKIs). Das Vorhandensein dieser Erkrankung wurde bei etwa 50-60% der Patienten mit fortschreitender Erkrankung beobachtet. Daher ist die Implementierung eines schnellen und hochgradig reaktionsschnellen Ansatzes zum Nachweis von T790M-Mutationen im EGFR-Gen für die rasche Identifizierung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs unerlässlich. In der aktuellen Studie wurde die ddPCR zum Nachweis der T790M-Mutation mit einer Nachweisgrenze von 10 Kopien/μL verwendet, was 10-fach höher ist als die Sensitivität der qPCR (1 × 10² Kopien/μL). Bei den 15 simulierten Proben war die ddPCR in der Lage, das Vorhandensein von T790M-Mutationen im EGFR-Gen nachzuweisen, die bei der Analyse mittels qPCR in reduzierten Konzentrationen beobachtet wurden. Der Nachweis von T790M-Mutationen innerhalb des EGFR-Gens durch ein schnelles Nachweisverfahren wird untersucht, um seine Eignung zu bestimmen.

Einleitung

Lungenkrebs ist weltweit die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität und stellt insgesamt die zweithäufigste bösartige Erkrankung dar. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht mit etwa 80 % bis 85 % der gemeldeten Lungenkrebsfälle eine signifikante Mehrheit aus 1,2,3,4. Bei Patienten, bei denen ein fortgeschrittenes NSCLC mit EGFR-Mutationen diagnostiziert wurde, beinhaltet der etablierte Therapieansatz die Anwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) der ersten, zweiten oder dritten ^{Generation5,6,7}. Die meisten Patienten, die mit EGFR-TKIs der ersten oder zweiten Generation behandelt werden, entwickeln jedoch schließlich eine erworbene Resistenz gegen das Medikament. Diese Resistenz wird häufig auf das Vorhandensein der T790M-Mutation im EGFR-Gen zurückgeführt, die bei etwa 50-60% der Patienten mit Fortschreiten der Erkrankung gefunden wird 8,9,10,11,12.

Traditionell werden genetische Anomalien in der Tumor-DNA aus Gewebeproben mit Techniken wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder Next-Generation-Sequencing (NGS) ^{identifiziert13,14}. Dennoch können Gewebebiopsien aufgrund der Unzugänglichkeit des Tumors, des schlechten Gesundheitszustands der Patienten oder des unzureichenden Gehalts an Tumorzellen eine Herausforderung darstellen 15,16,17. Als Alternative bieten Flüssigbiopsien, insbesondere aus Plasma, eine weniger invasive Möglichkeit, Treibermutationen durch den Nachweis zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) zu identifizieren. Tumorzellen geben DNA in den Blutkreislauf, die Pleuraflüssigkeit, den Speichel oder den Kot ab und stellen eine wertvolle Quelle für die genetische Analyse dar^18,19. Das genetische Profil der ctDNA spiegelt oft die genetische Ausstattung des Tumors wider und bietet einen umfassenden Überblick über die Tumorheterogenität - ein entscheidender Faktor für eine genaue Diagnose und personalisierte Krebsbehandlung^20,21.

Unter den verschiedenen Techniken zur Identifizierung von EGFR-Mutationen im peripheren Blut, einschließlich Sequenzierung, Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), digitaler PCR, denaturierender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Amplifikations-refraktärem Mutationssystem (ARMS) und mutantenangereicherter PCR (ME-PCR), hat sich die digitale Mikrotröpfchen-PCR (ddPCR) als hochwirksames Werkzeug für den Nachweis von ctDNA-Mutationen erwiesen^22,23. Seine überlegene Empfindlichkeit, Präzision und Fähigkeit, Mutationen mit geringer Abundanz mit hoher Genauigkeit zu erkennen, zeichnen ihn aus. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR werden bei der ddPCR Proben in Tausende von Tröpfchen aufgeteilt, was die absolute Quantifizierung von Ziel-DNA-Sequenzen ohne Standardkurven ermöglicht. Damit eignet es sich hervorragend zum Nachweis seltener Mutationen wie der T790M-Mutation in EGFR. Trotz der Vorteile der ddPCR wurde ihre breite klinische Anwendung durch Herausforderungen bei der Probenvorbereitung, der Systemoptimierung und der vergleichenden Leistungsanalyse mit etablierten Techniken wie der qPCR eingeschränkt. Eine kritische Lücke besteht bei der Optimierung von ddPCR-Protokollen für den Nachweis von ctDNA-Mutationen, insbesondere im Hinblick auf die Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit, die für die klinische Einführung unerlässlich sind.

In dieser Studie stellen wir die Hypothese auf, dass die ddPCR im Vergleich zu herkömmlichen qPCR-Methoden eine überlegene Sensitivität und Zuverlässigkeit beim Nachweis der EGFR T790M-Mutation in ctDNA bietet. Wir konzentrierten uns auf die Optimierung des Nukleinsäure-Extraktionsprozesses, um die Effizienz zu steigern, gefolgt von der ddPCR-Optimierung für den Mutationsnachweis. Darüber hinaus verglichen wir die Leistung von ddPCR und qPCR in Bezug auf Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit anhand von simulierten Proben. Durch die systematische Evaluierung des Potenzials der ddPCR wollen wir sie als praktikable und überlegene Alternative zur qPCR für den EGFR-Mutationsnachweis in Flüssigbiopsien etablieren.

Protokoll

An dieser Studie nahmen weder menschliche Teilnehmer noch menschliches Gewebe oder Lebendtierversuche teil. Daher war keine formelle ethische Genehmigung erforderlich. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt. Das mutierte Plasmid T790M wurde kommerziell synthetisiert. Schweineblut, das zur Simulation klinischer Proben verwendet wird, wurde von einem zertifizierten Lieferanten unter Einhaltung der Tierschutzbestimmungen und ohne Beteiligung lebender Tiere bezogen. Alle anderen Reagenzien, einschließlich magnetischer Beads, Primer, Sonden und PCR-Enzyme, wurden kommerziell beschafft und gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet.

Nukleinsäure-Extraktion
Die Nukleinsäureextraktion wurde mit einem magnetischen Bead-Extraktionskit und einem vollautomatischen Nukleinsäureextraktionsinstrument durchgeführt. Das Standardverfahren bestand darin, 200 μl Probe und 20 μl Proteinase K in Spalte 1 oder 7 der vorgepackten Deep-Well-Platte zu geben. Dann wurden 15 μl magnetische Kügelchen, die mit dem Kit geliefert wurden, in Spalte 2 oder 8 gegeben. Das Extraktionsprogramm wurde am Instrument gestartet, wobei die Magnethülse an der dafür vorgesehenen Stelle platziert wurde. Nach der Extraktion wurde die Flüssigkeit aus Säule 6 oder 12 in ein neues 1,5 mL nukleasefreies Röhrchen überführt und bei -20 °C gelagert.

Um die Extraktion von niedrig konzentrierten Zielnukleinsäuren zu optimieren, wurden Optimierungsexperimente durchgeführt. Die empfohlenen Extraktionsparameter waren: Lysetemperatur 70 °C, Lysezeit 10 min, 1 min für jede der drei Waschlösungen, 2 min Trocknung und 3 min Elution bei 56 °C. Die einflussreichsten Parameter wurden systematisch optimiert: Lysetemperatur (62 °C, 66 °C, 70 °C, 74 °C und 78 °C), Lysezeit (1, 3, 5, 7 und 9 min) und magnetische Bead-Größe (100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm und 1000 nm). Diese Optimierungen wurden unter Verwendung des mutierten T790M-Plasmids bei 1 × 10⁵ Kopien/μl durchgeführt. Die magnetischen 100-nm-Kügelchen wurden mit dem Extraktionskit geliefert, während andere Partikelgrößen von einem Biotechnologieunternehmen bezogen wurden. Die Effizienz jeder Extraktionsbedingung wurde durch die Analyse der qPCR-Amplifikationskurven und Ct-Werte der extrahierten Proben bewertet. Die statistische Auswertung dieser Ergebnisse erfolgte mit Hilfe einer Statistiksoftware.

Standard-Plasmid-DNA
Das mutierte Plasmid T790M des EGFR-Gens wurde von einem Biotechnologieunternehmen individuell synthetisiert. Vier Mikrogramm des trockenen Plasmidpulvers wurden in 100 μl 1x TE Puffer resuspendiert. Die Plasmidkonzentration wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers bestimmt. Die Kopienzahl pro Mikroliter wurde nach folgender Formel berechnet: Kopienzahl/μL = [(6,02 × 10²³) × (DNA-Konzentration (ng/μL) × 10-9)] / (^DNA-Länge in Basenpaaren × 660). Die Konzentration des synthetisierten Fragments betrug 1,26 × 10⁹ Kopien/μl. Dieses Stammplasmid wurde dann 126-fach verdünnt, um eine Arbeitskonzentration von 1 × 10⁸ Kopien/μl zu erhalten.

Primer-Design und -Synthese
Die Primer und eine TaqMan-Sonde für die EGFR T790M-Mutation wurden mit Primer 6 basierend auf den Standard-Primer-Designprinzipien entwickelt. Grundierung stromaufwärts: 5′-CCTCACCTCCACCGTGC-3′; Grundierung^{stromabwärts 24}: 5′-AGGCAGCCGAAGGGCA-3′; Sonde: 5′-FAM-AGCTCATCACGCAGCTCA-BHQ1-3′. Alle Primer und Sonden wurden von einem kommerziellen Oligonukleotid-Synthesedienst synthetisiert.

Etablierung und Optimierung des quantitativen Fluoreszenznachweissystems ddPCR und TaqMan
Ein T790M-Plasmidbestand von 1 × 10⁸ Kopien/μl wurde unter Verwendung von 1× TE-Puffer auf 1 × 10⁶ Kopien/μl verdünnt, um in ddPCR- und qPCR-Systemoptimierungsexperimenten verwendet zu werden.

Optimierung des ddPCR-Systems: Das ddPCR-System wurde auf der Grundlage der Empfehlungen des Enzymherstellers optimiert. Das anfänglich empfohlene System umfasste: 7,5 μl 4x PCR-Mix, 1,2-3 μl Upstream-Primer (10 μM), 1,2-3 μl Downstream-Primer (10 μM), 0,3-1,8 μl Sonde (10 μM), 1-15 μl DNA-Template und nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 30 μl. Der empfohlene Amplifikationszyklus umfasste zunächst 10 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 °C und 60 s bei 55-65 °C. Die Glühtemperatur (55-61,8 °C), die Primerkonzentration (1-3 μL), die Sondenkonzentration (0,75-1,75 μL) und die Template-Konzentration (3-15 μL) wurden systematisch optimiert. Die Optimierungsergebnisse wurden mit Hilfe einer Statistiksoftware statistisch ausgewertet.

Optimierung des qPCR-Systems: Das qPCR-System wurde gemäß den Empfehlungen des Enzymherstellers optimiert. Das ursprünglich vorgeschlagene System umfasste: 5 μl Taq-Polymerase, 0,45 μl 250 mM MgCl2, 0,5-2,5 μl Forward-Primer (10 μM), 0,5-2,5 μl Reverse-Primer (10 μM), 0,5-2,5 μl Sonde (10 μM), 5 μl DNA-Probe und nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 μl. Das empfohlene Amplifikationsprogramm betrug 5 Minuten bei 95 °C; gefolgt von 45 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 30 s bei 56-64 °C, mit Fluoreszenzsammlung bei 56-64 °C. Die Glühtemperatur (56-64 °C), die Primerkonzentration (1-3 μL), die Sondenkonzentration (0,5-2,5 μL) und die Template-Konzentration (1-5 μL) wurden optimiert. Die statistische Auswertung dieser Ergebnisse erfolgte mit Hilfe einer Statistiksoftware.

ddPCR und quantitativer Fluoreszenz-PCR-Sensitivitätstest
Um die Sensitivität der ddPCR im Vergleich zur qPCR zu bewerten, wurde das 1 × 10⁸ Kopien/μl T790M Plasmid seriell 10-fach mit 1x TE Puffer verdünnt, um einen Konzentrationsgradienten von 10⁶ bis 10¹ Kopien/μl zu erzeugen. Für die ddPCR wurden sieben Reaktionslösungen nach dem optimierten ddPCR-System hergestellt, eine für jede Konzentration, inklusive einer Negativkontrolle. Die Proben wurden auf einen Mikrotröpfchen-Generator-Chip geladen und mit einem Tröpfchenerzeugungsinstrument verarbeitet, um Mikrotröpfchen zu erzeugen. Diese Tröpfchen wurden dann mit einem PCR-Thermocycler amplifiziert und anschließend mit einem digitalen PCR-Nachweisgerät analysiert. Gleichzeitig wurden sieben Reaktionslösungen auf Basis des optimierten qPCR-Systems mit identischen Templates hergestellt. Diese wurden auf einem real-time PCR-Instrument durchgeführt, um die jeweiligen Sensitivitäten der beiden Ansätze (n = 3) zu bewerten.

ddPCR-Wiederholbarkeitstests
Um die Wiederholbarkeit zu beurteilen, wurde die Standard-T790M-Plasmid-DNA bei 1 × 10⁸ Kopien/μl verdünnt, um hohe (1 × 10⁶ Kopien/μl), mittlere (1 × 10⁴ Kopien/μl) und niedrige (1 × 10² Kopien/μl) Konzentrationsstandards zu erzeugen. Sechs Reaktionslösungen wurden nach dem optimierten ddPCR-System hergestellt. Die Proben wurden auf einen Mikrotröpfchen-Generator-Chip geladen und mit einem Tröpfchenerzeugungsinstrument zu Mikrotröpfchen verarbeitet. Die Mikrotröpfchen wurden dann mit einem Thermocycler amplifiziert und mit einem digitalen PCR-Nachweisgerät analysiert. Eine Negativkontrolle war enthalten. Das Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Reproduzierbarkeit wurde durch den Vergleich von Amplifikationsprofilen und die Berechnung der Werte des Variationskoeffizienten (CV) aus den drei experimentellen Replikaten bewertet.

Analoge Probenprüfung
Um die Zuverlässigkeit der ddPCR- und qPCR-Systeme der T790M-Mutation zu testen, verwendeten wir Schweineblut, das nach dem Zufallsprinzip mit hohen bzw. niedrigen Konzentrationen von T790M-Mutationsstandardplasmiden gemischt wurde, und Schweineblut ohne gemischte Standardplasmide wurde als negative Probe verwendet, und 15 simulierte Proben wurden nach dem Zufallsprinzip präpariert und Nukleinsäure wurde aus den simulierten Proben extrahiert. und mit der ddPCR- bzw. qPCR-Methode nachgewiesen werden.

Statistische Analyse
Alle Experimente wurden in mindestens drei technischen Replikaten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 10 durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden gegebenenfalls mit dem Student's t-Test oder der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Optimierung der Nukleinsäure-Extraktion
Der ddPCR-basierte Workflow zum Nachweis der EGFR T790M-Mutation ist in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst. Zunächst ermittelten wir die optimale Lysetemperatur. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ergab eine Spalttemperatur von 66 °C den kleinsten durchschnittlichen Ct-Wert, was auf die effizienteste Spaltung hinweist. Daher wurde für nachfolgende Experimente eine Temperatur von 66 °C gewählt. Als nächst...

Diskussion

Lungenkrebs, als weltweit häufigste krebsbedingte Todesursache, steht seit jeher im Mittelpunkt der medizinischen Forschung. In dieser Studie untersuchen wir mehrere kritische Aspekte von Lungenkrebs mit dem Ziel, tiefere Einblicke in seine Diagnose, Behandlung und Prognose zu geben. Der Eckpfeiler einer präzisen Diagnose und Behandlung von Lungenkrebs sind genaue Gentests. Wie Zhao et ^al.25 gezeigt haben, sind traditionelle Gentests in hohem Maße auf qualitativ h...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1&mal; TE Buffer	Sangon Biotech	B548144	Tris-EDTA-Puffer für die 4-fache DNA-Verdünnung
; Unimix-U Enzymmischung	TargetingOne Bio	UNIMIXU-4X	ddPCR Enzymmischung
A300 Fast Thermal Cycler	LongGene	A300	PCR-Amplifikation
Biochip-Analysator	SEED Bio	DigitalPCR-Biochip	Detektionssystem für digitale PCR
Drop Marker Probenvorbereitungsinstrument	Xinyi Biotechnologie	Digitale PCR-Plattform TD-2	Präparation von Mikrotröpfchen
Magnetic Bead Nukleinsäure-Extraktionskit	LemnisCare Technology	MXP-1005
	TargetingOne Biotech	MG-Chip-01	Wird zur Erzeugung von Mikrotröpfchen für ddPCR
verwendet NanoDrop	Allsheng	NC-500	Nukleinsäurekonzentrationsmessung nach Probenextraktion
NanoDrop ND-500 Spektralphotometer	Allsheng Instrumente	ND-500	Spektralphotometer für die DNA-Quantifizierung
PCR-Gerät A300 Fast Thermal Cycler	LongGene	A300	Thermal Cycler für PCR-Amplifikation
Primer und TaqMan-Sonde	Sangon Biotech	Kundenspezifische synthetisierte	Primer und TaqMan-Sonde für den T790M-Nachweis
qPCR-Gerät Gentier mini	Tianlong Technologie	Gentier mini	Real-time PCR Instrument
T790M Mutationsplasmid	Tsingke Biologie	T790M	Standardkurve und Nachweisgrenztest