Methodenartikel

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

DOI:

10.3791/68779

⸱

4. November 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induzierbare Genexpressionswerkzeuge können neuartige Anwendungen in der menschlichen Gesundheit und Biotechnologie eröffnen, aber die derzeitigen Optionen sind oft teuer, schwer rückgängig zu machen und haben unerwünschte Off-Target-Effekte. Optogenetische Systeme verwenden lichtempfindliche Proteine, um die Aktivität von Regulatoren so zu steuern, dass die Expression mit dem "Umlegen eines Schalters" gesteuert wird. Diese Studie optimiert ein vereinfachtes lichtaktiviertes CRISPR-Effektorsystem (2pLACE), das eine abstimmbare, reversible und präzise Kontrolle der Genexpression von Säugetieren ermöglicht. Die OptoPlate-96 ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie für die Einzelzellanalyse und die schnelle Optimierung von 2pLACE. Diese Studie zeigt, wie das 2pLACE-System mit der OptoPlate-96 in HEK293T Zellen verwendet werden kann, um die optimalen Komponentenverhältnisse zur Maximierung des Dynamikbereichs zu identifizieren und die Reaktionskurve der Blaulichtintensität zu ermitteln. Ähnliche Arbeitsabläufe können für andere Säugetierzellen und für andere optogenetische Systeme und Wellenlängen des Lichts entwickelt werden. Diese Fortschritte verbessern die Präzision, Skalierbarkeit und Anpassungsfähigkeit optogenetischer Werkzeuge für Biomanufacturing-Anwendungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Werkzeuge der synthetischen Biologie wie induzierbare Genexpressionssysteme haben einen bedeutenden Beitrag zur biologischen Forschung geleistet. Ihre Fähigkeit, die Genexpression auf abstimmbare, reversible und präzise Weise zu regulieren, kann die Kontrolle der Proteinproduktion 1,2,3,4,5,6, der Zellmorphologie 7,8,9,10,11,12 und der Stoffwechselwege 13,14,15 verbessern ,16,17,18 und andere Ziele für die Bioproduktion und therapeutische Anwendungen. Chemisch induzierbare Systeme könnenRest-19,20 oder Off-Target-Effekte haben. Chemische Additive können auch sehr teuer und aufgrund zusätzlicher nachgelagerter Reinigungsprozesse industriell schwer zu skalierensein 21,22,23. Lichtinduzierbare Genexpressionssysteme können eine skalierbare und präzise Methode für Bioproduktionspraktiken bieten 24,25,26,27.

Viele lichtinduzierbare Genexpressionssysteme wurden als nützliche Werkzeuge der synthetischen Biologie in einer Vielzahl von Anwendungenentwickelt 28,29,30,31,32,33,34,35,36 und Wellenlängen von Blau 35,37,38, Rot/Fernrot 12,39,40 oder grünes41-Licht. Im Falle der CRISPR-basierten optogenetischen Genregulation kann die Modifikation der Menge der einzelnen abgegebenen Guide-RNAs (gRNAs) die mRNA-Expression endogener Gene beeinflussen42 und muss für verschiedene Zelllinien optimiert werden. Transaktivierungsproteine wie VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544 oder Fusionen von ihnen47 können ebenfalls verwendet werden, wodurch die Modularität optogenetischer Systeme erhöht wird. Um komplexe und miteinander verflochtene biologische Signalwege 12,40,48,49,50,51,52,53 zu untersuchen, können verschiedene Kombinationen dieser bekannten Komponenten getestet werden. Darüber hinaus können verschiedene Zelllinien Unterschiede in der Induktion mit demselben Systemaufweisen 52. Unterschiedliche Induktionsniveaus können zu einer unzureichenden Genexpression oder Sensitivität bei der präzisen Kontrolle der Genexpression führen, was strenge Tests erfordert, um ein optimales optogenetisches System in neuen oder biologisch relevanteren Zelllinien zu finden. Mit zunehmendem Tempo und zunehmender Anwendbarkeit der optogenetischen Genregulation ist es unerlässlich, diese verschiedenen Systeme schnell zu charakterisieren.

Aktuelle Methoden zur Charakterisierung optogenetischer Werkzeuge verwenden entweder eine stabile oder eine transiente Expression von Genen12,54. Die Generierung stabil exprimierender Zelllinien und die Optimierung der Systemdynamik für eine maximale Expression kann zeitaufwändig und damit kostspielig sein. Die transiente Expression ermöglicht schnelle und wertvolle Erkenntnisse, insbesondere bei der Prüfung optogenetischer Mehrkomponentensysteme. Hier haben wir das Blaulicht-aktivierte CRISPR-dCas9-Effektor (LACE)37-System verwendet, das aus Cryptochrom 2 (CRY2) und Cryptochrom-interagierendem basic-helix-loop-helix N-Terminal (CIBN) besteht. Es wurde verwendet, um die Genexpression in Säugetierzellen wie HEK293T (menschliche embryonale Nierenzellen)37,38, CHO-DG44 (Eierstockzellen des chinesischen Hamsters)55 und C2C12 (Myoblastenzellen der Maus)38 zu kontrollieren. Sein modularer Aufbau ist ideal für die schnelle Charakterisierung der Systemleistung durch transiente Expressions- und Hochdurchsatzmethoden. Zum Beispiel können Mehrkomponentensysteme wie LACE eine Optimierung der Massenverhältnisse erfordern, um die Induktion zu verbessern, ein Schritt, der normalerweise bei der charakterisierung optogenetischer Systeme nicht angewendet wird.

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Optimierung und Charakterisierung von zwei Plasmid-LACE (2pLACE)38-Systemen. In diesem Aufbau steuert 2pLACE die Expression eines fluoreszierenden Reporters, eGFP (enhanced green fluorescent protein), in HEK293T Zellen. Die Aktivierung erfolgt in schwarzen 96-Well-Platten mit Glasboden unter Verwendung einer OptoPlate-96, einem 3D-gedruckten LED-Array, das von Lukasz Bugaj und seinen Kollegen 56,57,58,59 entworfen und konstruiert wurde. Dieses Protokoll optimiert speziell die maximale Expression mit unterschiedlichen Massenverhältnissen des Zwei-Plasmid-Systems. Es enthält auch einen benutzerfreundlichen Code zur Steuerung verschiedener Lichtintensitäten, um die Abstimmbarkeit des Systems und seinen vollen Dynamikbereich zu untersuchen. Die Durchflusszytometrie wird zur Datenerfassung und -analyse eingesetzt. Protokolle zur Generierung von Plasmidkonstrukten und 3D-Druckmaterialien für das LED-Array finden Sie in früheren Publikationen54,56. Diese Methoden unterstreichen eine schnelle Hochdurchsatz-Pipeline für die Charakterisierung lichtinduzierbarer Genexpressionssysteme.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plattieren HEK293T Zellen in einem 96-Well-Format

  1. In einer Biosicherheitswerkbank werden ein Behälter für Bleichmittelabfälle, serologische Pipetten, Pipettenhilfe, Dulbecco-Phosphatpuffersalzlösung (DPBS), Dulbecco-modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und ein T-75-Zellkulturkolben mit konfluenten HEK293T Zellen gesammelt. Das Medium auf 37 °C vorwärmen.
  2. Überprüfen Sie in einem T-75-Kolben durch ein inverses Mikroskop, ob die Konfluenz zu etwa 80 % bis 100 % konfluent ist.
  3. In der Biosicherheitswerkbank wird das verbrauchte Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Zellkulturkolben abgesaugt. Vermeiden Sie es, die Oberfläche oder den Kunststoff des Kolbens zu berühren. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und den Absauger im Abfallbehälter.
  4. Die Zellen werden vorsichtig mit etwa 10 ml DPBS gewaschen, indem man es in eine Ecke des Kolbens aspiriert und vorsichtig um die Oberfläche herum wirbelt. Saugen Sie das DPBS aus dem Kolben an und entsorgen Sie die Wäsche und den Aspirator im Abfallbehälter.
  5. 1,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA werden zugegeben, um die Oberfläche des Kolbens zu bedecken, und 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
  6. 8,5 ml frisches DMEM in den Kolben geben. Die Zellen werden resuspendiert und mit einer serologischen Pipette gemischt, bis alle Aggregate durch Auf- und Absaugen aufgebrochen sind.
  7. Sammeln Sie 9 ml Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
    1. 9 ml frisches DMEM werden in den Kolben gegeben und in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gegeben.
  8. Mischen Sie mit einem Hämozytometer 10 μl suspendierte Zellen mit 10 μl Trypanblau-Farbstoff im Verhältnis 1:1, um die Konzentration der Zellen zu berechnen. Verwenden Sie diesen Wert, um genügend Zellen für die Aussaat auf der Platte vorzubereiten.
  9. ~35.000 Zellen in 100 μl für jede Vertiefung einer schwarzen Hochleistungs-96-Well-Glasbodenplatte #1,5 aussäen und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator stellen.

2. Optimierung der 2pLACE-Transfektion

  1. Für eine Vertiefung und einen Überschuss von 10 % aliquotieren Sie 11 μl warmes serumfreies DMEM (SFM) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Unter Verwendung eines CRY2-eGFP: CIBN-gRNA-Plasmid-Massenverhältnisse gleich 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 und 9:1 aliquotiert 110 ng für jede Vertiefung der Gesamt-DNA zu den Aliquoten der SFM (Tabelle 1).
  3. Als Positivkontrolle aliquotiert die gleiche Masse des CMV-eGFP-Plasmids auf verschiedene Aliquote von SFM.
  4. Für jede Vertiefung aliquotieren Sie 11 μl SFM für die Verdünnung des Transfektionsreagenzes.
  5. Bereiten Sie das Transfektionsreagenz in einem Verhältnis von 1:3 (μg) zu Volumen (μL) von DNA und Transfektionsreagenz vor.
  6. Geben Sie verdünntes Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA und inkubieren Sie es 12 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Transfektionskomplexe zu erzeugen.
  7. Geben Sie ~20 μl des Transfektionskomplexes in jede Vertiefung. Achten Sie darauf, dass es die Wände des Brunnens nicht berührt.
  8. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und legen Sie sie für 24 h bei 37 °C und 5% CO2 in einen Inkubator.

3. 2pLACE-Aktivierung

  1. Ändern Sie den Mikrocontroller-Eingabecode, um die gewünschten Wells mit diesen Einstellungen zu beleuchten (Supplementary Coding File 1, Zeilen 147 - 158).
    1. LED-Intensität: 9,27 mW/cm2 (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200 - 215).
    2. Impulslänge: 1 s (Ergänzende Kodierungsdatei 1, Zeilen 280 - 290).
    3. Impulsfrequenz: 0,067 Hz (alle 15 s) (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 264 - 278).
      HINWEIS: Die Wellenlängeneinstellungen werden durch die Art der installierten LEDs bestimmt.
  2. Besprühen Sie den 3D-gedruckten Deckel der OptoPlate mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn in einer Biosicherheitswerkbank trocknen.
  3. Schalten Sie eine Rotlichtlampe in der Dunkelkammer ein, legen Sie die 96-Well-Platte in eine Biosicherheitswerkbank und ersetzen Sie den Deckel durch den getrockneten 3D-gedruckten Deckel.
    HINWEIS: Optional können die CMV-eGFP-Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie betrachtet werden, um die Transfektionseffizienz abzuschätzen.
  4. Nehmen Sie die 96-Well-Platte und setzen Sie sie auf das LED-Array, um das LED-Array-Gerät zu bauen. Stellen Sie sicher, dass die Platte einrastet.
  5. Schließen Sie den Mikrocontroller, die LED und die Lüfteranschlüsse an eine Stromquelle an.
  6. Sprühen Sie die Drähte vorsichtig mit 70 % Ethanol ein und wischen Sie sie trocken.
  7. Stellen Sie das LED-Array-Gerät 24 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die LEDs wie vorgesehen aufleuchten und dass die Drähte nicht gespannt sind, wenn der Inkubator versiegelt ist.

4. Vorbereitung der Durchflusszytometrie

  1. Nehmen Sie die OptoPlate heraus und legen Sie die Platte in eine Biosicherheitswerkbank
    HINWEIS: Optional können die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie betrachtet werden, um die Lichtinduktion visuell zu bestätigen.
  2. Saugen Sie alle Medien vorsichtig aus jeder Vertiefung an.
  3. Die Zellen werden mit 30 μl 0,05 % Trypsin-EDTA abgetrennt und 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  4. Mischen Sie jede Vertiefung mit 100 μl kaltem FACS-Puffer (1 % FBS in PBS), bis sie einzellig ist.
  5. Übertragen Sie jede Probe in eine 96-Well-Platte mit V-Boden.
  6. Die 96-Well-Platte mit V-Boden bei 164 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  7. 80 μl Überstand aspirieren, ohne das Pellet zu stören.
  8. Fügen Sie 200 μl kalten FACS-Puffer hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren.
  9. Wickeln Sie die 96-Well-Platte mit V-Boden in Aluminiumfolie ein, um eine leichte Isolierung zu gewährleisten.
  10. Legen Sie die Platte für den Transport in eine Styroporbox mit Eis.

5. Durchflusszytometrie-Gating und Datenerfassung

  1. Schalten Sie das Durchflusszytometer über den Schalter auf der Rückseite ein und öffnen Sie die entsprechende Durchflusszytometrie-Software auf dem Computer.
  2. Führen Sie das Systemstartprogramm aus und laden Sie 2 mL DI-Wasser in den Probenlader (Ergänzende Abbildung 1A).
  3. Führen Sie die Qualitätskontrolle (QC) mit den mitgelieferten QC-Kügelchen durch (Ergänzende Abbildung 1B).
  4. Stellen Sie sicher, dass sich das Durchflusszytometer im Plattenprobenahmemodus befindet (Ergänzende Abbildung 1C).
  5. Einrichten und Spezifizieren von Probenvertiefungen (Ergänzende Abbildung 1D).
  6. Erstellen Sie die folgenden Streudiagramme und Tabellen (Ergänzende Abbildung 2A).
    1. Seitliche Streuung (SSC-A) vs. Vorwärtsstreuung (FSC-A).
    2. SSC-H gegen SSC-A.
    3. SSC-A gegen FITC-A.
    4. FITC-A-Statistiktabelle (Ergänzende Abbildung 2B).
  7. Lassen Sie die V-Bodenplatte in den Plattenlader des Zytometers einrasten.
  8. Wählen Sie eine nicht transfizierte Vertiefung aus und klicken Sie auf Initialisieren und dann auf Ausführen.Stellen Sie sicher, dass die Volumenabtastrate 10 μl/min beträgt (Ergänzende Abbildung 2C).
  9. Passen Sie die SSC- und FITC-Spannungen an, um die interessierende Grundgesamtheit im Diagramm SSC-A vs. FSC-A zu zentrieren (ergänzende Abbildung 2C).
    1. Erstellen Sie ein Polygon, um die gesunde Zellpopulation, die Sie interessieren möchten, einzugrenzen (Ergänzende Abbildung 2D).
    2. Erstellen Sie ein Polygon, das für die Unterscheidung zwischen Dubletten im Diagramm SSC-H und SSC-A unterschieden werden soll.
    3. Passen Sie die FITC-Spannung an, um nicht transfizierte Zellen links vom Diagramm SSC-A vs. FITC-A zu platzieren (Ergänzende Abbildung 2D).
  10. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden nicht transfizierten Vertiefungen, und notieren Sie die mittleren FITC-A-Daten.
  11. Wählen Sie ein CMV-eGFP-Transfikant aus und klicken Sie auf Ausführen.
  12. Passen Sie die FITC-Spannung an, um sowohl autofluoreszierende als auch fluoreszierende Zellen im SSC-A- vs. FITC-A-Diagramm zu erfassen.
    1. Erstellen Sie ein Polygon, um die fluoreszierenden Zellen gegen die nicht fluoreszierenden Zellen zu koppeln, während das anfängliche Gate in nicht transfizierten Zellen referenziert wird (Ergänzende Abbildung 2E).
  13. Automatische Aufzeichnung von Proben bei 60 μl/min, bis 200 s erreicht sind und/oder Ereignisse 10.000 erreicht haben (Ergänzende Abbildung 2F).
  14. Exportieren Sie Mean FITC als CSV-Datei und analysieren Sie die Daten.
  15. Reinigen Sie das Durchflusszytometer mit der Option "Tägliche Reinigung" (Ergänzende Abbildung 2G).

6. Optimierung der LED-Intensität

  1. Bearbeiten Sie das Mikrocontroller-Skript, um die gewünschten LED-Intensitäten zu testen (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200-215).
    HINWEIS: Äquivalente LED-Intensitäten in Bezug auf die Werte im Mikrocontroller-Skript werden an anderer Stelleangegeben 38. Bei der Verwendung unterschiedlicher LEDs kann eine Selbstkalibrierung erforderlich sein.
  2. Stellen Sie sicher, dass das Skript die folgenden Werte in (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200-215) enthält, wie in Tabelle 2 beschrieben, und laden Sie den Code auf den Mikrocontroller hoch.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1-5.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Verwendung von Workflow-Elementen aus der früheren Literatur 37,38,55 fügten wir eine simultane Hochdurchsatzbeleuchtung von der OptoPlate-96 hinzu und demonstrierten eine Pipeline zur schnellen Optimierung eines lichtinduzierbaren Genexpressionssystems in Säugetierzellen (Abbildung 1).

Bei induzierbaren Genexpressionssystemen sind ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll demonstriert die optogenetische Kontrolle einer mehrkomponentigen transienten Genexpression in Säugetierzellen und ermöglicht es anderen Forschern, modulare optogenetische Systeme schnell und gleichzeitig mit einem fluoreszierenden Reporter zu charakterisieren.

In diesem Fall wurde ein lichtinduzierbares System mit zwei Plasmiden für die Expression von eGFP in HEK293T Zellen optimiert. Für eine erfolgreiche Co-Transfektion ist es unerlässlich,...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird vom Translational Research Institute durch das NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A und vom Good Foods Institute unterstützt. Dieses Projekt wurde vom UC Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory mit technischer Unterstützung von Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke und Ashley Karajeh unterstützt, mit finanzieller Unterstützung des NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) und S10OD018223 (Beckman Coulter "Cytoflex" Zytometer).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL MikrozentrifugenröhrenVWR10025-724
10-mL-Reagenzien-ReservoirsVWR77395-252
10 ml serologische PipettenVWR75816-100
1000 & mu; L-FilterspitzenVWR76322-154
15 mL  Hochleistungs-Zentrifugenröhren, flache KappeVWR89039-664
1931-C optischer LeistungsmesserNewport1931–C
2-mL serologische PipettenVWR75816-104
20 & mu; L-FilterspitzenVWR76322-134
200 & mu; L-FilterspitzenVWR76322-150
50 mL Hochleistungs-Zentrifugenröhren, FlachkappeVWR89039-656
96-Well-V-BodenplattenMARKENSCHILDER781661
A21, LED-rote GlühbirneBluex BulbsN/ARote Lichtquelle
Arduino IDE SoftwareArduinoN/A
Biosicherheitsschrank, Klasse IINuAireN/A
Bright-Line-HämozytometerHausser Scientific3110
Zellzähl-FolienBioRad1450016
Zellkulturplatte 96-Well, #1,5H GlasbodenplatteCellvisP96-1,5H-N
CytExpert-SoftwareBeckman CoulterN/A
CytoFLEX Ready-to-Use tägliche QC-FluorosphärenBeckman CoulterC657194 & Grad; C
CytoFLEX-S Flusszytometer (4 violette, 2 blaue, 4 gelbgrüne, 3 rote Kanäle)Beckman CoulterC09766
Dulbeccos Phosphatpuffer-Kochsalzpulver, ohne Kalikum, ohne MagnesiumFisher Scientific21600069Raumtemperatur
Eppendorfer Zentrifuge 5804Eppendorf  022622501V-Bodenplatten-Zentrifugenschritt
Eppendorfer Zentrifuge 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research Plus, 8-Kanal, variables Volumen, 30 - 300 μ LEppendorf3125000052
Eppendorf Research Plus, Einzelkanal, variables Volumen, 100 - 1000 μ LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus, Einkanal, variables Volumen, 2 - 20 & mu; LEppendorf3123000039
Eppendorf Research Plus, Einkanal, variables Volumen, 20 - 200 μ LEppendorf3123000055
Allzweck-Labor-EtikettierbandVWR89097-920
Gibco DMEM, Pulver, hoher BlutzuckerFisher Scientific121000614 & Grad; C
Gibco Trypan Blue Solution, 0,4 %Fisher Scientific15-250-061Raumtemperatur
Gibco Value Heat inaktiviert FBSFisher ScientificA5256901-20 &°F; C
Gibco, Trypsin-EDTA (0,05 %), mit EDTA, tierischen Ursprungs, 1X, Phenol Red, 500 mlGibco25300062-20 &°F; C
HEK293T ZellenATCCCRL-11268-80 & Grad; C, flüssiger Stickstoff
Labormarker, MicronovaVWR89205-944
Metall-SchreibtischlampeEinfache EntwürfeN/ALampe für rotes Licht
OptoPlate-96LABmakerN/A
Pipet-Aid-XPDrummond4-000-101
Plasmid: CIBN-gRNAN/AN/A-20 &°F; C
Plasmid: CMV-eGFPN/AN/A-20 &°F; C
Plasmid: CRY2-eGFPN/AN/A-20 &°F; C
PolyJet DNA In vitro TransfektionsreagenzFisher ScientificNC15361174 & Grad; C
T-75 ZellkulturkolbeVWR10062-860
Wasserummantelter CO2 InkubatorVWR10810-884

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Optogenetische Systemeinduzierbare GenexpressionCRISPR EffektorDurchflusszytometrieHigh Throughput ScreeningBlaulichtaktivierungHEK293T ZellenFluoreszenzbildgebung

Verwandte Artikel