Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Werkzeuge der synthetischen Biologie wie induzierbare Genexpressionssysteme haben einen bedeutenden Beitrag zur biologischen Forschung geleistet. Ihre Fähigkeit, die Genexpression auf abstimmbare, reversible und präzise Weise zu regulieren, kann die Kontrolle der Proteinproduktion 1,2,3,4,5,6, der Zellmorphologie 7,8,9,10,11,12 und der Stoffwechselwege 13,14,15 verbessern ^,16,17,18 und andere Ziele für die Bioproduktion und therapeutische Anwendungen. Chemisch induzierbare Systeme können^Rest-19,20 oder Off-Target-Effekte haben. Chemische Additive können auch sehr teuer und aufgrund zusätzlicher nachgelagerter Reinigungsprozesse industriell schwer zu skalieren^sein 21,22,23. Lichtinduzierbare Genexpressionssysteme können eine skalierbare und präzise Methode für Bioproduktionspraktiken bieten 24,25,26,27.

Viele lichtinduzierbare Genexpressionssysteme wurden als nützliche Werkzeuge der synthetischen Biologie in einer Vielzahl von Anwendungen^{entwickelt 28,29,30,31,32,33,34,35,36} und Wellenlängen von Blau 35,37,38, Rot/Fernrot ^12,39,40 oder grünes^41-Licht. Im Falle der CRISPR-basierten optogenetischen Genregulation kann die Modifikation der Menge der einzelnen abgegebenen Guide-RNAs (gRNAs) die mRNA-Expression endogener Gene beeinflussen⁴² und muss für verschiedene Zelllinien optimiert werden. Transaktivierungsproteine wie VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴ oder Fusionen von ihnen⁴⁷ können ebenfalls verwendet werden, wodurch die Modularität optogenetischer Systeme erhöht wird. Um komplexe und miteinander verflochtene biologische Signalwege 12,40,48,49,50,51,52,53 zu untersuchen, können verschiedene Kombinationen dieser bekannten Komponenten getestet werden. Darüber hinaus können verschiedene Zelllinien Unterschiede in der Induktion mit demselben System^{aufweisen 52}. Unterschiedliche Induktionsniveaus können zu einer unzureichenden Genexpression oder Sensitivität bei der präzisen Kontrolle der Genexpression führen, was strenge Tests erfordert, um ein optimales optogenetisches System in neuen oder biologisch relevanteren Zelllinien zu finden. Mit zunehmendem Tempo und zunehmender Anwendbarkeit der optogenetischen Genregulation ist es unerlässlich, diese verschiedenen Systeme schnell zu charakterisieren.

Aktuelle Methoden zur Charakterisierung optogenetischer Werkzeuge verwenden entweder eine stabile oder eine transiente Expression von Genen^12,54. Die Generierung stabil exprimierender Zelllinien und die Optimierung der Systemdynamik für eine maximale Expression kann zeitaufwändig und damit kostspielig sein. Die transiente Expression ermöglicht schnelle und wertvolle Erkenntnisse, insbesondere bei der Prüfung optogenetischer Mehrkomponentensysteme. Hier haben wir das Blaulicht-aktivierte CRISPR-dCas9-Effektor (LACE)^37-System verwendet, das aus Cryptochrom 2 (CRY2) und Cryptochrom-interagierendem basic-helix-loop-helix N-Terminal (CIBN) besteht. Es wurde verwendet, um die Genexpression in Säugetierzellen wie HEK293T (menschliche embryonale Nierenzellen^)37,38, CHO-DG44 (Eierstockzellen des chinesischen Hamsters⁾⁵⁵ und C2C12 (Myoblastenzellen der Maus)³⁸ zu kontrollieren. Sein modularer Aufbau ist ideal für die schnelle Charakterisierung der Systemleistung durch transiente Expressions- und Hochdurchsatzmethoden. Zum Beispiel können Mehrkomponentensysteme wie LACE eine Optimierung der Massenverhältnisse erfordern, um die Induktion zu verbessern, ein Schritt, der normalerweise bei der charakterisierung optogenetischer Systeme nicht angewendet wird.

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Optimierung und Charakterisierung von zwei Plasmid-LACE (2pLACE)^38-Systemen. In diesem Aufbau steuert 2pLACE die Expression eines fluoreszierenden Reporters, eGFP (enhanced green fluorescent protein), in HEK293T Zellen. Die Aktivierung erfolgt in schwarzen 96-Well-Platten mit Glasboden unter Verwendung einer OptoPlate-96, einem 3D-gedruckten LED-Array, das von Lukasz Bugaj und seinen Kollegen 56,57,58,59 entworfen und konstruiert wurde. Dieses Protokoll optimiert speziell die maximale Expression mit unterschiedlichen Massenverhältnissen des Zwei-Plasmid-Systems. Es enthält auch einen benutzerfreundlichen Code zur Steuerung verschiedener Lichtintensitäten, um die Abstimmbarkeit des Systems und seinen vollen Dynamikbereich zu untersuchen. Die Durchflusszytometrie wird zur Datenerfassung und -analyse eingesetzt. Protokolle zur Generierung von Plasmidkonstrukten und 3D-Druckmaterialien für das LED-Array finden Sie in früheren Publikationen^54,56. Diese Methoden unterstreichen eine schnelle Hochdurchsatz-Pipeline für die Charakterisierung lichtinduzierbarer Genexpressionssysteme.

1. Plattieren HEK293T Zellen in einem 96-Well-Format

1. In einer Biosicherheitswerkbank werden ein Behälter für Bleichmittelabfälle, serologische Pipetten, Pipettenhilfe, Dulbecco-Phosphatpuffersalzlösung (DPBS), Dulbecco-modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und ein T-75-Zellkulturkolben mit konfluenten HEK293T Zellen gesammelt. Das Medium auf 37 °C vorwärmen.
2. Überprüfen Sie in einem T-75-Kolben durch ein inverses Mikroskop, ob die Konfluenz zu etwa 80 % bis 100 % konfluent ist.
3. In der Biosicherheitswerkbank wird das verbrauchte Medium mit einer serologischen Pipette aus dem Zellkulturkolben abgesaugt. Vermeiden Sie es, die Oberfläche oder den Kunststoff des Kolbens zu berühren. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und den Absauger im Abfallbehälter.
4. Die Zellen werden vorsichtig mit etwa 10 ml DPBS gewaschen, indem man es in eine Ecke des Kolbens aspiriert und vorsichtig um die Oberfläche herum wirbelt. Saugen Sie das DPBS aus dem Kolben an und entsorgen Sie die Wäsche und den Aspirator im Abfallbehälter.
5. 1,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA werden zugegeben, um die Oberfläche des Kolbens zu bedecken, und 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
6. 8,5 ml frisches DMEM in den Kolben geben. Die Zellen werden resuspendiert und mit einer serologischen Pipette gemischt, bis alle Aggregate durch Auf- und Absaugen aufgebrochen sind.
7. Sammeln Sie 9 ml Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   1. 9 ml frisches DMEM werden in den Kolben gegeben und in einen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ gegeben.
8. Mischen Sie mit einem Hämozytometer 10 μl suspendierte Zellen mit 10 μl Trypanblau-Farbstoff im Verhältnis 1:1, um die Konzentration der Zellen zu berechnen. Verwenden Sie diesen Wert, um genügend Zellen für die Aussaat auf der Platte vorzubereiten.
9. ~35.000 Zellen in 100 μl für jede Vertiefung einer schwarzen Hochleistungs-96-Well-Glasbodenplatte #1,5 aussäen und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator stellen.

2. Optimierung der 2pLACE-Transfektion

1. Für eine Vertiefung und einen Überschuss von 10 % aliquotieren Sie 11 μl warmes serumfreies DMEM (SFM) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Unter Verwendung eines CRY2-eGFP: CIBN-gRNA-Plasmid-Massenverhältnisse gleich 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 und 9:1 aliquotiert 110 ng für jede Vertiefung der Gesamt-DNA zu den Aliquoten der SFM (Tabelle 1).
3. Als Positivkontrolle aliquotiert die gleiche Masse des CMV-eGFP-Plasmids auf verschiedene Aliquote von SFM.
4. Für jede Vertiefung aliquotieren Sie 11 μl SFM für die Verdünnung des Transfektionsreagenzes.
5. Bereiten Sie das Transfektionsreagenz in einem Verhältnis von 1:3 (μg) zu Volumen (μL) von DNA und Transfektionsreagenz vor.
6. Geben Sie verdünntes Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA und inkubieren Sie es 12 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Transfektionskomplexe zu erzeugen.
7. Geben Sie ~20 μl des Transfektionskomplexes in jede Vertiefung. Achten Sie darauf, dass es die Wände des Brunnens nicht berührt.
8. Wickeln Sie die Platte in Alufolie ein und legen Sie sie für 24 h bei 37 °C und 5% CO₂ in einen Inkubator.

3. 2pLACE-Aktivierung

1. Ändern Sie den Mikrocontroller-Eingabecode, um die gewünschten Wells mit diesen Einstellungen zu beleuchten (Supplementary Coding File 1, Zeilen 147 - 158).
   1. LED-Intensität: 9,27 mW/cm² (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200 - 215).
   2. Impulslänge: 1 s (Ergänzende Kodierungsdatei 1, Zeilen 280 - 290).
   3. Impulsfrequenz: 0,067 Hz (alle 15 s) (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 264 - 278).
      HINWEIS: Die Wellenlängeneinstellungen werden durch die Art der installierten LEDs bestimmt.
2. Besprühen Sie den 3D-gedruckten Deckel der OptoPlate mit 70% Ethanol und lassen Sie ihn in einer Biosicherheitswerkbank trocknen.
3. Schalten Sie eine Rotlichtlampe in der Dunkelkammer ein, legen Sie die 96-Well-Platte in eine Biosicherheitswerkbank und ersetzen Sie den Deckel durch den getrockneten 3D-gedruckten Deckel.
   HINWEIS: Optional können die CMV-eGFP-Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie betrachtet werden, um die Transfektionseffizienz abzuschätzen.
4. Nehmen Sie die 96-Well-Platte und setzen Sie sie auf das LED-Array, um das LED-Array-Gerät zu bauen. Stellen Sie sicher, dass die Platte einrastet.
5. Schließen Sie den Mikrocontroller, die LED und die Lüfteranschlüsse an eine Stromquelle an.
6. Sprühen Sie die Drähte vorsichtig mit 70 % Ethanol ein und wischen Sie sie trocken.
7. Stellen Sie das LED-Array-Gerät 24 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die LEDs wie vorgesehen aufleuchten und dass die Drähte nicht gespannt sind, wenn der Inkubator versiegelt ist.

4. Vorbereitung der Durchflusszytometrie

1. Nehmen Sie die OptoPlate heraus und legen Sie die Platte in eine Biosicherheitswerkbank
   HINWEIS: Optional können die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie betrachtet werden, um die Lichtinduktion visuell zu bestätigen.
2. Saugen Sie alle Medien vorsichtig aus jeder Vertiefung an.
3. Die Zellen werden mit 30 μl 0,05 % Trypsin-EDTA abgetrennt und 1 Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Mischen Sie jede Vertiefung mit 100 μl kaltem FACS-Puffer (1 % FBS in PBS), bis sie einzellig ist.
5. Übertragen Sie jede Probe in eine 96-Well-Platte mit V-Boden.
6. Die 96-Well-Platte mit V-Boden bei 164 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
7. 80 μl Überstand aspirieren, ohne das Pellet zu stören.
8. Fügen Sie 200 μl kalten FACS-Puffer hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren.
9. Wickeln Sie die 96-Well-Platte mit V-Boden in Aluminiumfolie ein, um eine leichte Isolierung zu gewährleisten.
10. Legen Sie die Platte für den Transport in eine Styroporbox mit Eis.

5. Durchflusszytometrie-Gating und Datenerfassung

1. Schalten Sie das Durchflusszytometer über den Schalter auf der Rückseite ein und öffnen Sie die entsprechende Durchflusszytometrie-Software auf dem Computer.
2. Führen Sie das Systemstartprogramm aus und laden Sie 2 mL DI-Wasser in den Probenlader (Ergänzende Abbildung 1A).
3. Führen Sie die Qualitätskontrolle (QC) mit den mitgelieferten QC-Kügelchen durch (Ergänzende Abbildung 1B).
4. Stellen Sie sicher, dass sich das Durchflusszytometer im Plattenprobenahmemodus befindet (Ergänzende Abbildung 1C).
5. Einrichten und Spezifizieren von Probenvertiefungen (Ergänzende Abbildung 1D).
6. Erstellen Sie die folgenden Streudiagramme und Tabellen (Ergänzende Abbildung 2A).
   1. Seitliche Streuung (SSC-A) vs. Vorwärtsstreuung (FSC-A).
   2. SSC-H gegen SSC-A.
   3. SSC-A gegen FITC-A.
   4. FITC-A-Statistiktabelle (Ergänzende Abbildung 2B).
7. Lassen Sie die V-Bodenplatte in den Plattenlader des Zytometers einrasten.
8. Wählen Sie eine nicht transfizierte Vertiefung aus und klicken Sie auf Initialisieren und dann auf Ausführen.Stellen Sie sicher, dass die Volumenabtastrate 10 μl/min beträgt (Ergänzende Abbildung 2C).
9. Passen Sie die SSC- und FITC-Spannungen an, um die interessierende Grundgesamtheit im Diagramm SSC-A vs. FSC-A zu zentrieren (ergänzende Abbildung 2C).
   1. Erstellen Sie ein Polygon, um die gesunde Zellpopulation, die Sie interessieren möchten, einzugrenzen (Ergänzende Abbildung 2D).
   2. Erstellen Sie ein Polygon, das für die Unterscheidung zwischen Dubletten im Diagramm SSC-H und SSC-A unterschieden werden soll.
   3. Passen Sie die FITC-Spannung an, um nicht transfizierte Zellen links vom Diagramm SSC-A vs. FITC-A zu platzieren (Ergänzende Abbildung 2D).
10. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden nicht transfizierten Vertiefungen, und notieren Sie die mittleren FITC-A-Daten.
11. Wählen Sie ein CMV-eGFP-Transfikant aus und klicken Sie auf Ausführen.
12. Passen Sie die FITC-Spannung an, um sowohl autofluoreszierende als auch fluoreszierende Zellen im SSC-A- vs. FITC-A-Diagramm zu erfassen.
    1. Erstellen Sie ein Polygon, um die fluoreszierenden Zellen gegen die nicht fluoreszierenden Zellen zu koppeln, während das anfängliche Gate in nicht transfizierten Zellen referenziert wird (Ergänzende Abbildung 2E).
13. Automatische Aufzeichnung von Proben bei 60 μl/min, bis 200 s erreicht sind und/oder Ereignisse 10.000 erreicht haben (Ergänzende Abbildung 2F).
14. Exportieren Sie Mean FITC als CSV-Datei und analysieren Sie die Daten.
15. Reinigen Sie das Durchflusszytometer mit der Option "Tägliche Reinigung" (Ergänzende Abbildung 2G).

6. Optimierung der LED-Intensität

1. Bearbeiten Sie das Mikrocontroller-Skript, um die gewünschten LED-Intensitäten zu testen (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200-215).
   HINWEIS: Äquivalente LED-Intensitäten in Bezug auf die Werte im Mikrocontroller-Skript werden an anderer Stelle^{angegeben 38}. Bei der Verwendung unterschiedlicher LEDs kann eine Selbstkalibrierung erforderlich sein.
2. Stellen Sie sicher, dass das Skript die folgenden Werte in (Ergänzende Codierungsdatei 1, Zeilen 200-215) enthält, wie in Tabelle 2 beschrieben, und laden Sie den Code auf den Mikrocontroller hoch.
3. Wiederholen Sie die Schritte 1-5.

Unter Verwendung von Workflow-Elementen aus der früheren Literatur 37,38,55 fügten wir eine simultane Hochdurchsatzbeleuchtung von der OptoPlate-96 hinzu und demonstrierten eine Pipeline zur schnellen Optimierung eines lichtinduzierbaren Genexpressionssystems in Säugetierzellen (Abbildung 1).

Bei induzierbaren Genexpressionssystemen sind hohe Dynamikbereiche neben der absoluten Ein- und Aus-Expression (Leaky) ein kritischer Leistungsmarker. Mit der Fluoreszenzbildgebung von transfizierten Zellen kann der Unterschied in der eGFP-Expression zwischen den lichtaktivierten Zellen und den im Dunkeln gehaltenen Zellen qualitativ beobachtet werden (Abbildung 2). Ein Verhältnis von 1:9 führt sichtbar zu einer geringeren maximalen eGFP-Expression im Vergleich zu einem Verhältnis von 5:5. Es kann auch beobachtet werden, dass es zu einer erhöhten Undichtigkeit im Verhältnis 5:5 kommt. Die Fluoreszenzbildgebung von konstitutiv exprimierenden eGFP (CMV-eGFP) transfizierten Zellen und untransfizierten Zellen ist eine wertvolle Positiv- und Negativkontrolle, um die Transfektionseffizienz bzw. die induzierte bzw. undichte Expression des Systems zu kontextualisieren. Die Verwendung von Fluoreszenzbildgebung ermöglicht es den Benutzern, die erfolgreiche Transfektion und Aktivierung der Genexpression mit blauem Licht schnell zu sehen und zu validieren, was einen wertvollen Kontrollpunkt vor der Durchflusszytometrie darstellt. Die Durchflusszytometrie kann dann zur Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) und des Dynamikbereichs verwendet werden.

Nach der Lichtaktivierung der Zellen werden sie mit FACS-Puffer aufbereitet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. HEK293T Zellen sind etwa 11-15 μm groß, was zu einem FSC-Gewinn von 500 und einem SSC-Gewinn von 125 führt (Ergänzende Abbildung 2C), um die gesunden Zellpopulationen zu zentrieren. Höhere Spannungen führen zur Analyse von Ablagerungen und nicht von gesunden Zellpopulationen. Unsere Läufe haben konstant über ~60 % der Ereignisse im ersten Populationstor (P1) (Abbildung 3A-D). Sobald die gesunden Zellpopulationen die meisten Ereignisse im SSC-A- vs. FSC-A-Diagramm ausmachen, kann auch die Ereignisdichte überprüft werden, um die Mehrheit der Population zu identifizieren (Ergänzende Abbildung 3A). Dann kann die Dublett-Unterscheidung durch das SSC-H- vs. SSC-A-Diagramm durchgeführt werden, was für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse entscheidend ist60,61. In diesem System fanden wir im Allgemeinen mehr als 95 % der Ereignisse in P1 als Einzelstücke (Abbildung 3A-D). Im SSC-A- vs. FITC-A-Diagramm befinden sich nicht transfizierte Zellen im Allgemeinen links von der Mitte des Diagramms und werden so eingestuft, dass sie eine Population von <0,1 % aufweisen (Abbildung 3A). Dann bevölkern eGFP-positive Zellen das Gate, das in der nicht transfizierten Probe leer war, was zu Einzelzellanalysemessungen von MFI führt (Abbildung 3B). Sobald die negativen und positiven Kontrollen gesammelt wurden, um die richtigen Gates und Spannungen einzustellen, können Proben mit 2pLACE mit denselben Gates analysiert werden, um autofluoreszierende Zellen zuverlässig auszuschließen (Abbildung 3C,D). Hier betrug die prozentuale Population für eGFP-positive Zellen ~99% für CMV-eGFP und ~57% für 2pLACE-transfizierte Zellen. Ein Final Gate kann auch auf dem PE-A-Kanal verwendet werden, um sicherzustellen, dass hochfluoreszierende Zellen erfasst werden (Ergänzende Abbildung 3B).

Ein weiteres Verhältnis, das zum Testen gewählt wurde, war 3:7. Als Validierungsschritt wurden Fluoreszenzmikroskopiebilder vor der Durchflusszytometrie angefertigt und eine erfolgreiche Transfektion für die Induktion der eGFP-Expression mit 2pLACE beobachtet, die erwartungsgemäß geringer war als bei CMV-eGFP (Abbildung 4A). Nach der Erhebung von durchflusszytometrischen Daten von 2pLACE kann die durch blaues Licht aktivierte Genexpression mit der undichten Genexpression verglichen werden (Abbildung 4B). Mit den in Schritt 3.1 aufgeführten Einstellungen konnten wir eine ~3-fache Steigerung der Expression nach der Aktivierung von blauem Licht beobachten, die dem erhöhten Fluoreszenzsignal entspricht, das durch die Mikroskopie qualitativ gesehen wurde. Darüber hinaus kann die Transfektionseffizienz indirekt durch Messung des prozentualen Anteils der eGFP-positiven Population oder des prozentualen Elternteils bei ~60% gesunder Einzelzellen gemessen werden (Abbildung 4C).

Durch die vollständige Implementierung dieses Protokolls können optimale Massenverhältnisse (Abbildung 5A) und Lichtintensitäten (Abbildung 5B) für einen maximalen Dynamikbereich und einen einstellbaren Ausdruck identifiziert werden. Massenverhältnisse kleiner als 6:4 wiesen einen größeren Dynamikbereich (3,5-4,5) auf, während Massenverhältnisse über 6:4 einen verringerten Dynamikbereich aufgrund des erhöhten Hintergrunds und der verringerten maximalen eGFP-Expression aufwiesen. Sowohl für maximalen Ausdruck als auch für einen hohen Dynamikbereich wird ein Verhältnis von 3:7 bevorzugt. Verhältnisse unter 3:7 zeigten ähnliche Falteninduktionen, wiesen aber insgesamt eine geringere maximale Ausprägung auf. Mit unseren zuvor kalibrierten Lichtintensitätswerten38 (Tabelle 2) kann man das Genexpressionsniveau in Bezug auf verschiedene Lichtintensitäten charakterisieren. Die Lichtintensität steuerte auch die Expressionsniveaus von eGFP, wobei MFI bei ~3 mW/cm2 sättigt. Lichtintensitäten darüber hinaus können unterschiedliche MFI-Werte aufweisen, wahrscheinlich aufgrund von Photobleiche in einigen Proben, wie bei ~9 und 11 mW/cm2 zu sehen ist.

Abbildung 1: Allgemeine Pipeline von Hochdurchsatzexperimenten zur Erprobung optogenetischer Systeme. Die Zellen werden für 24 Stunden in eine schwarze 96-Well-Platte ausgesät. Dann werden die Zellen mit einer 12-minütigen Inkubationszeit von DNA und Transfektionsreagenz transfiziert. 24 h nach der Transfektion wird die Platte zur Blaulichtaktivierung auf die OptoPlate-96 gelegt. Nach der gewünschten Dauer der Blaulichtaktivierung werden die Zellen in einer Rotlichtumgebung für die Durchflusszytometrie vorbereitet. Die Daten der Durchflusszytometrie werden als Diagramme der mittleren Fluoreszenzintensität von eGFP-positiven Zellen im Dunkeln oder mit blauem Licht behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von 2pLACE im Ein- und Aus-Zustand in HEK293T Zellen. Verschiedene Massenverhältnisse von CRY2-eGFP: CIBN-gRNA wurden auf die eGFP-Expression getestet. Die Zellen wurden 24 Stunden lang blauem Licht ausgesetzt (EIN) oder im Dunkeln (AUS) gehalten. Der Maßstabsbalken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Durchflusszytometrie-Streudiagramme von untransfizierten (UT), CMV-eGFP und 2pLACE HEK293T Zellen. Die Durchflusszytometrie wurde mit der Plattenladerfunktion durchgeführt. (A) HEK293T Zellen wurden auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC-A) und Seitenstreuung (SSC-A) gestoppt. Die Konzentration von Ereignissen auf SSC-A- vs. FSC-A-Diagrammen kann mit Hilfe eines Konturdiagramms (Ergänzende Abbildung 3A) visualisiert werden, um das Gating gesunder Populationen zu unterstützen. Die Dublett-Unterscheidung wurde an einem SSC-H- vs. SSC-A-Plot unter Verwendung eines linearen Gatters durchgeführt. Das letzte Diagramm gated fluoreszierende Zellen, indem es sich auf die nicht transfizierte Probe bezieht. (B) Die Zellen wurden wie in (A) gated und zeigen die Fluoreszenzpopulation und die Fluoreszenzintensität in der Statistiktabelle (Ergänzende Abbildung 2B). (C,D) 2pLACE-transfizierte Zellen wurden separat durch das P3-Gate gegated. Die magentafarbene Population repräsentiert alle eGFP-positiven Zellen (Ergänzende Abbildung 3B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Qualitative und quantitative Analyse der lichtinduzierten eGFP-Expression in HEK293T Zellen. (A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder von HEK293T Zellen, die entweder mit 2pLACE- oder CMV-eGFP-Plasmiden transfiziert wurden. (B) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von eGFP in Zellen, die unter Blaulicht- oder Dunkelbedingungen gehalten werden. (C) Prozentsatz der eGFP-positiven Zellen, gemessen durch Durchflusszytometrie-Gating-Analyse. Das Gating führte dazu, dass <0,1 % der nicht transfizierten Zellen innerhalb der eGFP-positiven Schwelle lagen. Die Daten der Durchflusszytometrie stellen Mittelwerte dar, und die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen von vier technischen Replikaten an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Durchflusszytometrie repräsentativer Massenverhältnisse von 2pLACE und Blaulichtintensitäten. (A) Verschiedene Massenverhältnisse von CRY2-eGFP: CIBN-gRNA wurden in HEK293T Zellen transfiziert, die dann blauem Licht ausgesetzt oder im Dunkeln gehalten wurden, wobei die gleichen Einstellungen wie in Schritt 3 des Protokolls verwendet wurden. Jede Bedingung ist der Mittelwert von 3 biologischen Replikaten. (B) Repräsentativer Trend der Genexpression in Abhängigkeit von der Intensität des blauen Lichts. Jede Bedingung ist der Mittelwert von 6 technischen Replikaten. Die mittlere Fluoreszenzintensität wird durch das Durchflusszytometer-Gating von Zellen, die eGFP exprimieren, quantifiziert. Alle Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Für Plasmidverhältnisse wurde die statistische Signifikanz des MFI mit Hilfe eines Einweg-t-Tests berechnet, bei dem die Hell- und Dunkelheit eines Plasmidverhältnisses verglichen wurde. Für die Lichtintensitäten wurde die statistische Signifikanz mit einer unidirektionalen ANOVA und dem Tamhane-T2-Post-hoc-Test im Vergleich zum dunklen (OFF) Zustand berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 und ns ist nicht signifikant. Diese Abbildung wurde von Garimella et al.38 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Menge an CRY2-eGFP- und CIBN-gRNA-Plasmiden pro Vertiefung unter Verwendung von Beispielkonzentrationen. Die Volumenmengen gelten pro Vertiefung und können basierend auf der Anzahl der Proben oder Wiederholungen in einem Experiment geändert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Empfohlene Werte für die Intensitäten des blauen Lichts. Der Code befindet sich in der ergänzenden Codierungsdatei 1 (Zeilen 215-228). Äquivalente Intensitätswerte werden anhand von Kalibrierdaten berechnet, die zuvor mit einem optischen Leistungsmesser gemeldet wurden. Jede Intensitätsstufe verfügt über 6 technische Replikate. Die Reihen G und H sind für CMV-eGFP und nicht transfizierte Kontrollvertiefungen vorgesehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Schritte 5.1-5.5 des Protokolls. (A) Ausführen des Systemstartprogramms. (B) Standardisierung der Qualitätskontrolle unter Verwendung von Fluorophorkügelchen. (C) Umschalten von der Röhrchenprobenahme auf den Plattenlader-Modus. (D) Auswahl der Vertiefungen, die als Probenbohrungen gekennzeichnet werden sollen; Für dieses Beispiel wurden 35 Bohrungen ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Schritte 5.6-5.14 des Protokolls. (A) Einrichten von Lichtstreudiagrammen: FSC-A vs. SSC-A für das Gating gesunder Zellpopulationen, SSC-A vs. SSC-H für die Dublettenunterscheidung und SSC-A vs. FITC-A für das Gating von autofluoreszierenden und eGFP-positiven Zellen. (B) Einrichten der Statistiktabelle zur Erfassung von FITC-A-Daten zur Messung der mittleren Fluoreszenzintensität. (C) Hervorheben von Stoppregeln auf der Registerkarte Anzuzeigende Ereignisse. Stellen Sie eine langsame Probendurchflussrate sicher, werfen Sie die Platte aus und laden Sie sie, initialisieren Sie die Durchflusszytometersonde und stellen Sie die Erfassungsspannungen ein. (D) Erstellen von Polygonen, um jede Population wie gezeigt zu begrenzen. (E) Hinzufügen der entsprechenden Anzahl von Vertiefungen. (F) Klicken Sie auf Automatische Aufnahme , sobald die Einstellungen und Gates abgeschlossen sind. (G) Klicken Sie auf Tägliche Reinigung , nachdem alle Proben gesammelt und die Statistiken exportiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Validierung aller Zellen innerhalb des erfassten Gates, visualisiert durch grüne Ereignisse in P4 (magenta). (A) Konturdiagramm der gesunden Population innerhalb des eGFP-positiven Populationsgates (P3). Die Zellen konzentrieren sich hauptsächlich in den roten Zonen und nehmen nach außen hin ab. (B) SSC-A- vs. PE-A-Diagramm für das Gating von P4, mit einer zusätzlichen Prüfung, um sicherzustellen, dass alle Fluoreszenzereignisse im FITC-A-Diagramm berücksichtigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Beispiel-Arduino-Code, der alle im obigen Protokoll beschriebenen Eigenschaften implementiert. Diese Datei aktiviert alle LED-Positionen mit den empfohlenen LED-Intensitätswerten in Tabelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.