Methodenartikel

Ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten aus MASLD-Mäusen

DOI:

10.3791/68782

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18. Juli 2025

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1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie etabliert ein standardisiertes Protokoll für die Isolierung von primären Hepatozyten aus Mäusen mit metabolischer Dysfunktion assoziierter steatotischer Lebererkrankung (MASLD), das krankheitsrelevante Untersuchungen von Steatose und metabolischer Dysfunktion ohne künstliche Lipidbelastung ermöglicht. Die Methode liefert Hepatozyten mit hoher Ausbeute und hoher Lebensfähigkeit, die für mechanistische und therapeutische Studien geeignet sind.

Zusammenfassung

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Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD), die durch eine pathologische Lipidakkumulation (Steatose) in den Hepatozyten gekennzeichnet ist, stellt eine signifikante und wachsende globale Gesundheitsbelastung dar. Primäre Maus-Hepatozytenkulturen dienen als unverzichtbare ex vivo-Modelle zur Aufklärung der MASLD-Pathogenese und therapeutischer Interventionen. Die zuverlässige Isolierung von hochwertigen Hepatozyten aus steatotischen Lebern bleibt jedoch eine technische Herausforderung. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll für die effiziente Isolierung von primären Hepatozyten aus MASLD-Mäusen mit Hilfe der Kollagenase-Perfusionstechnik vor. Dieses Protokoll erzeugt Hepatozyten mit inhärenter Steatose, ohne dass eine künstliche Induktion durch Palmitat- und Ölsäure-Supplementierung erforderlich ist, wodurch ein physiologisch relevanterer Phänotyp erhalten bleibt. Das Protokoll liefert hochlebensfähige und hochreine Hepatozyten und ist universell einsetzbar für die Isolierung großer Mengen von Hepatozyten aus MASLD-Mäusen. Darüber hinaus eignet es sich für die pharmakologische Bewertung oder genetische Interventionsstudien. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung von hochleistungsfähigen, hochreinen und hochlebensfähigen Hepatozyten für nachgelagerte zellbiologische Studien bereitstellen, um die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und Medikamente für MASLD zu erleichtern.

Einleitung

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Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) ist durch eine pathologische Lipidakkumulation in Hepatozyten gekennzeichnet und stellt die weltweit häufigste chronische Lebererkrankungdar 1. Schätzungen zufolge sind 38 % der erwachsenen Weltbevölkerung von MASLD betroffen und haben sich zu einer erheblichen Bedrohung für die menschliche Gesundheitentwickelt 2. Die Mechanismen der MASLD sind noch nicht vollständig geklärt und die Behandlungsmöglichkeiten sind sehr begrenzt. Die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und die Entwicklung zielgerichteter Wirkstoffe für MASLD ist zu einem kritischen klinischen Bedarf geworden. Hepatozyten, als vorherrschender Zelltyp, aus dem die Leber besteht, sind der primäre Ort des hepatischen Glukose-Lipid-Wirkstoff-Metabolismus. Primäre Hepatozyten behalten eine vollständigere Funktion der Hepatozyten als Hepatozytenzelllinien und sind ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von Lebererkrankungen und der Arzneimittelentwicklung3. Die Isolierung und Kultivierung von primären Hepatozyten aus Mäusen mit Fettleber ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung der Pathophysiologie der Leber, einschließlich des Fettstoffwechsels, der Insulinresistenz und der Entzündungsreaktionen. Ein früheres Protokoll, das für die Isolierung von Hepatozyten aus Mausmodellen der Fettlebererkrankung entwickelt wurde, verwendete eine Gradientenzentrifugation, um speziell die Trennung sowohl normaler als auch lipidakkumulierender Hepatozytenpopulationen zu ermöglichen. Diese isolierten lipidbeladenen Hepatozyten stellen somit ein wichtiges in vitro Modellsystem für die Untersuchung der Pathobiologie von Fettlebererkrankungendar 3. Das primäre Ziel dieses Ansatzes ist es, auf einfache und kostengünstige Weise hochlebensfähige und ertragreiche Hepatozyten zu erhalten, die krankheitsspezifische phänotypische Eigenschaften beibehalten und somit in der Lage sind, MASLD in vitro nachzuahmen.

Das allgemeine Verfahren zur Hepatozytenisolierung bei Mäusen besteht aus einem zweistufigen Prozess, der mit dem Spülen des Blutes aus der Leber mit einer isotonischen Perfusionslösung, wie z. B. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), und der anschließenden Verdauung der Leber mit einer kollagenasehaltigen Verdauungslösung beginnt. Jüngste Fortschritte in der Leberperfusion und bei enzymatischen Verdauungstechniken haben die Ausbeute und Lebensfähigkeit von primären Hepatozyten bei weiblichen Mäusen verbessert4. Verbesserungen der traditionellen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsmethoden, wie z. B. die Optimierung der Pufferzusammensetzung und die Verkürzung der Verdauungszeiten, waren entscheidend für die Anpassung der experimentellen Protokolle an Fettleberproben. Primäre Hepatozyten dienen als unverzichtbare Modelle zur Aufklärung der pathophysiologischen Mechanismen, die der MASLD und ihren kardiometabolischen Komplikationen zugrunde liegen, insbesondere durch ihre Rolle bei der Vermittlung von Herz-Leber-Crosstalk und Leber-Gefäßachsen-Wechselwirkungen durch endotheliale Mediatoren und angiogene Faktoren 5,6. Diese Zellen liefern wichtige Einblicke in die Multiorgan-Kommunikationsnetzwerke, die das Fortschreiten der Krankheit vorantreiben, wie klinische Assoziationen zwischen MASLD, chronischer Nierenerkrankung und ischämischer Herzkrankheitbelegen 7, und bieten gleichzeitig eine physiologisch relevante Plattform für die Entwicklung zielgerichteter Therapien, die sowohl hepatische als auch kardiovaskuläre Manifestationen des metabolischen Syndroms behandeln. Die derzeitige In-vitro-Forschung zu MASLD stützt sich überwiegend auf Palmitin-/Ölsäure (PA/OA)-stimulierte normale Hepatozyten oder humane Hepatozytenzelllinien (z. B. HepG2 und Huh7), die die pathophysiologischen Eigenschaften von steatotischen Hepatozyten unter erkrankten Bedingungen nur unzureichend replizieren, was ihre translationale Relevanz für die Untersuchung von Herz-Leber-Gefäß-Interaktionen einschränkt. Dieser Ansatz erfasst nicht die chronische metabolische Dysfunktion, die entzündliche Mikroumgebung und die krankheitsspezifische Wechselwirkung zwischen den Organen, die für die MASLD-Progression charakteristisch sind.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Hepatozyten aus MASLD-Mäusen zu isolieren, ohne dass künstlich Palmitin- und Ölsäurebehandlungen hinzugefügt werden müssen. Zusammenfassend stellen wir eine einfache und reproduzierbare Methode zur Gewinnung von Hepatozyten mit hoher Ausbeute und hervorragender Lebensfähigkeit vor, die sich für die nachgelagerte zellbiologische Forschung eignet, um die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele und die Arzneimittelentwicklung für MASLD zu unterstützen.

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Protokoll

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Alle Versuchsschritte wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Science and Technology of China genehmigt. Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden in dieser Studie mehr als 12 Wochen lang mit einer fettreichen Diät (HFD, #12492, Research Diet) gefüttert.

1. Zubereitung einer mit Kollagen beschichteten Kulturplatte oder -schale

  1. 15 mL 100 % EtOH zu 35 mL doppelt destilliertem H2O (ddH2O) geben. Bereiten Sie eine Lösung von Kollagen Typ I 50 μg/ml in 30% EtOH vor. Filter mit einer sterilen 0,22 μm Filterspitze.
  2. Beschichten Sie eine Zellkulturplatte oder -schale mit 30 μl Kollagenlösung pro cm2. 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  3. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette und trocknen Sie die Kulturplatte oder -schale. Bestrahlen Sie das beschichtete Geschirr zur Sterilisation 0,5 h lang mit ultraviolettem Licht. Weniger als 1 Monat bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Die Wellenlänge der UV-Lampe beträgt 254 nm und die UV-Intensität beträgt nicht weniger als 400 mW/m2. Der Abstand der UV-Lampenquelle zu den kollagenbeschichteten Schalen beträgt 1 m.

2. Herstellung der Perfusionslösung

  1. Bereiten Sie einige Tage vor der Isolierung der Hepatozyten die in Tabelle 1 angegebenen Hepatozytenisolationsreagenzien und Kulturmedien vor. Filterperfusionslösung A und B mit einer sterilen 0,22 μm Filterspitze. Weniger als 1 Monat bei 4 °C lagern. Bereiten Sie ein Wasserbad vor und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
  2. Die Perfusionslösungen A und B werden im Wasserbad auf 37 °C vorgeheizt. Geben Sie vor der Operation 40 mg Kollagenase Typ IV zu 80 ml Perfusionslösung B.
  3. Pumpen Sie 75 % EtOH mit einer Rate von 4 ml/min für 5 Minuten mit einer Schlauchpumpe bei RT. Schalten Sie den Pumpenschlauch von 75 % EtOH auf vorgewärmte Perfusionslösung A um.
    HINWEIS: Montieren Sie die beheizte Umlauffülleinheit gemäß der in Abbildung 1A dargestellten Konfiguration.

3. Chirurgischer Eingriff

  1. Betäuben Sie die Maus mit einer zugelassenen Methode. Injizieren Sie Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg) intraperitoneal. Überprüfen Sie den Verlust des Drehreflexes, bevor Sie fortfahren.
  2. Befestigen Sie die oberen und unteren Gliedmaßen der Maus auf einem Sezierbrett. Sterilisieren Sie den Operationsbereich mit 75% Alkohol.
  3. Schneiden Sie die innere und äußere Bauchhaut mit Präparierinstrumenten durch. Schwenken Sie die viszeralen Organe mit einem Wattestäbchen auf die linke Seite der Maus, um die untere Hohlvene (IVC) und die Leberpfortader (PV) freizulegen.
  4. Drücken Sie die untere Hohlvene mit einem Wattestäbchen an, um sie auszubeulen. Führen Sie eine 22-G-Verweilnadel parallel zur unteren Hohlvene ein.
  5. Ziehen Sie den eisernen Teil der Verweilnadel heraus. Lassen Sie den Katheter in der unteren Hohlvene. Verbinden Sie die Nadel mit einer Perfusionsleitung mit einer 0,22 μm Filterspitze.
    HINWEIS: Eine Verweilnadel besteht aus einem Eisennadelteil und einem Kunststoffkatheterteil. Stellen Sie sicher, dass die Hohlvene inferior genau eingeführt wird, und warten Sie, bis sich die Verweilnadel mit Blut füllt. Entfernen Sie alle Luftblasen von der Verweilnadel. Führen Sie den gesamten Eingriff schnell durch, um Thrombosen zu vermeiden.
  6. Stellen Sie die Perfusionsrate auf 5 ml/min Perfusionsflüssigkeit A ein. Beginnen Sie mit der Perfusion und beobachten Sie die Leber, bis sie geschwollen erscheint. Schneiden Sie die Pfortader sofort ab.
  7. Massieren Sie die Leber sanft mit einem Wattestäbchen, um eine gründliche Blutspülung zu gewährleisten. Setzen Sie die Durchblutung fort, bis sich die Leber erdiggelb färbt.
  8. Umstellung auf Perfusionsflüssigkeit B mit 0,05 % Kollagenase Typ IV. Setzen Sie die Durchblutung fort, bis die Leber vollständig verdaut ist.
    HINWEIS: Es dauert mindestens 10 Minuten pro Maus, bis die Leber verdaut ist. Ein Volumen von 80 ml Perfusionslösung B, die Kollagenase enthält, reicht für eine Maus aus, um ihre Leber zu verdauen. Das Lebergewebe durchläuft eine vollständige enzymatische Verdauung, bis eine maximale Erweichung erreicht ist, wobei das kapselumschlossene Parenchym einen Zustand extremer Fragilität erreicht, der anfällig für mechanische Störungen ist.
  9. Entferne die Leber aus dem Bauch der Maus. Legen Sie die Leber in eine 10 cm große Schale, die DMEM enthält.
  10. Gehen Sie in einer Biosicherheitswerkbank vor. Zerkleinern Sie die Leber mit einer Pinzette zu Pulver (eine gut verdauliche Leber setzt leicht Hepatozyten frei).
  11. Filtrieren Sie die Suspension über einen 70-μm-Maschenfilter in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie die Lautstärke mit DMEM-Medium auf 45 mL (pro Maus) ein.
  12. Bei 50 × g 4 min zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand vollständig ab.
  13. Resuspendieren Sie das Pellet mit DMEM-Medium auf ein Endvolumen von 25 mL (pro Maus). Erneut bei 50 × g für 2 min zentrifugieren.
  14. Gießen Sie den Überstand vollständig ab. Resuspendieren Sie das Pellet in 25 ml Kulturmedium, das mit 10 % FBS ergänzt ist.
  15. Mischen Sie die Suspension gründlich. Färben Sie die Zellen zum Zählen mit Trypanblau. Fahren Sie sofort mit der Impfung für die Kultur fort.
    HINWEIS: Geben Sie 2 ml Medium mit 2 × 105 Zellen pro Vertiefung in kollagenbeschichtete 6-Well-Schalen. Ersetzen Sie das DMEM-Medium nach 2 h Zellinokulation.

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Ergebnisse

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Das aktuelle Protokoll wurde an männlichen C57BL/6J-Mäusen durchgeführt, die mehr als 12 Wochen lang mit HFD gefüttert wurden. Die isolierten primären Hepatozyten wurden auf Morphologie und Funktion untersucht. Wir erhielten eine durchschnittliche Ausbeute von 2 × 107 Zellen pro Isolation aus etwa 40 g Mausleber. Die Zellviabilität wurde durch Calcein AM-Färbung lebender Zellen auf 85 % bis 86 % bestimmt. Die Ausbeute aus jeder diätinduzierten adipösen (DIO) Mausisolierung reic...

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Diskussion

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Die Isolierung lebensfähiger Maus-Hepatozyten umfasst ein kritisches zweistufiges Verfahren, das mit einer gründlichen Gefäßperfusion unter Verwendung isotonischer Lösung zur Entfernung von Blutbestandteilen beginnt, gefolgt von einem kontrollierten enzymatischen Verdau mit aktiver Kollagenaselösung 9,10. Eine erfolgreiche Isolierung hängt von der Aufrechterhaltung optimaler physiologischer Bedingungen während des gesamten Prozes...

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Offenlegungen

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Die Autoren berichteten von keinem potenziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [Nr. 82373967] unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
50 mL sterile ZentrifugenröhrchenNest602052
Anti-HNF4&alpha-AntikörperImmunowayYM8517
Anti-IgG-AntikörperProteintech30000-0-AP
BODIPYThermo Fisher ScientificD3922
CaCl2Merck (SigmaAldrich)C5670
ZentrifugeThermo Sorvall ST16R
Kollagen Typ I Corning354236
Kollagenase, Typ 4Sangon BiotechA004186-0001
RückhaltenadelBRAUN4254074B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
EGTA Yeasen60339ES10
EthanolMerck (SigmaAldrich)493511
Fötales RinderserumSigmaF2442
GlucoseMerck (SigmaAldrich)G7021
HEPESGibco15630080
Isoginkgetin MedChemExpressHY-N2117
K2HPO4 Merck (Supelco)PHR2900
KClMerck (SigmaAldrich)P3911
Na2HPO4 · 12H2OMerck (SigmaAldrich)04273
NaClMerck (SigmaAldrich)S9888
NaHCO3Merck (SigmaAldrich)S6014
Nadelfilter 0.22µ MMillex-GPSLGV033RB
NilrotInvitrogenN1142
Penicillin/Streptomycin (100X)Gibco15140122
Rekombinantes AdenovirusObio Technology Corp., Ltd. Rekombinante Adenoviren, die für Flag-getaggte Maus IER2 (Ad-Ier2, NM_010499.4) und Kontroll-Adenoviren (Ad-NC) kodieren, wurden von Obio Technology Corp., Ltd. konstruiert.
Natrium-PentobarbitalMerck (SigmaAldrich)P3761
Sterile Zellsiebe, 100 μ mFisher Scientific22363549
Trypan BlueBeyotimeST2780-5g
Schlauchpumpe mit variablem DurchflussLängerBT100-1F

Referenzen

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HepatozytenisolierungKollagenase Perfusionprim re Hepatozytensteatotische LeberHepatozytenkulturLipidakkumulationEx vivo Modellegenetische Interventionpharmakologische Evaluierung
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