Method Article

Aktualisiertes Protokoll für den Aufbau und die Verwendung des Minibioreaktor-Arrays (MBRA)

DOI:

10.3791/68788

⸱

September 5th, 2025

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Alkek Center for Metagenomics & Microbiome Research, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

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Das Minibioreactor Array (MBRA) ist ein anpassbares Hochdurchsatz-Kultursystem mit kontinuierlichem Durchfluss, das die Kultivierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften ermöglicht und parallele Experimente zur Untersuchung der Mikrobiomdynamik, therapeutischer Wechselwirkungen und mikrobieller Reaktionen auf Umweltfaktoren unterstützt.

Abstract

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Das menschliche Mikrobiom besteht aus vielfältigen und dynamischen mikrobiellen Gemeinschaften, die eine wesentliche Rolle für die Gesundheit des Wirts spielen. Das Verständnis dieser Gemeinschaften und ihrer Reaktionen auf Umweltfaktoren ist entscheidend für die Weiterentwicklung von Mikrobiom-basierten Therapeutika. Traditionelle In-vitro-Modelle zur Kultivierung von Mikrobiota menschlichen Ursprungs sind oft nicht skalierbar und erfordern umfangreiches technisches Know-how, was ihre Zugänglichkeit und ihren Durchsatz einschränkt. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir das Minibioreactor Array (MBRA)-System entwickelt – eine modulare, einstufige Plattform mit kontinuierlichem Durchfluss für die Hochdurchsatz-Kultivierung mikrobieller Gemeinschaften. Dieses System ermöglicht die parallele Kultivierung von bis zu 48 verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften und unterstützt die experimentelle Flexibilität bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des stabilen Wachstums komplexer Ökosysteme. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zur Herstellung, Montage, Sterilisation und zum Betrieb von MBRA. Der modulare Aufbau des Systems ermöglicht eine einfache Integration in anaerobe Kammern und unterstützt die Anpassung an eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen. Es wurde verwendet, um mikrobielle Reaktionen auf Antibiotika, Nahrungsbestandteile und die Invasion von Krankheitserregern zu untersuchen und nach pathogenresistenten Gemeinschaften zu suchen. Mit seiner Zugänglichkeit, Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit stellt das MBRA ein leistungsfähiges Modellsystem dar, um mikrobielle Interaktionen zu untersuchen und die Mikrobiomforschung voranzutreiben.

Introduction

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Das menschliche Mikrobiom ist ein komplexes Ökosystem von Mikroorganismen, das eine entscheidende Rolle bei zahlreichen physiologischen Prozessen spielt und die menschliche Gesundheit tiefgreifend beeinflusst. Das menschliche Mikrobiom erstreckt sich über viele anatomische Stellen in unserem Körper, von denen jede dynamische mikrobielle Gemeinschaften enthält, die aktiv interagieren, und zwar auf eine Weise, die wir noch nicht vollständig verstanden haben1. Die Erweiterung unseres Wissens über die Beteiligung mikrobieller Gemeinschaften an Gesundheit und Krankheit hängt von unserem Verständnis der mikrobiellen Wechselwirkungen ab, die in diesen Umgebungen stattfinden1. Um diese komplizierten Systeme effektiv zu therapeutischen Zwecken zu untersuchen und zu manipulieren, ist ein reduktionistischer Ansatz erforderlich. Die Erforschung einzelner mikrobieller Interaktionen mit vereinfachten Modellsystemen ermöglicht ein besseres Verständnis der gesamten Komplexität des Mikrobioms2.

Eine Vielzahl von Modellsystemen steht zur Verfügung, um vom Menschen stammende mikrobielle Gemeinschaften zu züchten. Diese Systeme haben unser Verständnis der mit dem Menschen assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften erweitert und reichen von einstufigen Chargenkulturen bis hin zu komplexeren mehrstufigen kontinuierlichen Flusssystemen. Modellsysteme, wie der Simulator des menschlichen mikrobiellen Darmökosystems3, das einstufige Chemostat-System4 mit zwei Gefäßen und das Umweltkontrollsystem für die intestinale Mikrobiota5 , replizieren die physiologischen Bedingungen spezifischer anatomischer Stellen und liefern in vitro genaue Annäherungen an mikrobielle Umgebungen. Ihre Akzeptanz durch Mikrobiologen ist jedoch begrenzt, da sie kostspielig sind, ein hohes Maß an technischem Fachwissen für den Betrieb und die Wartung erfordern und einen begrenzten Durchsatz haben.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir das Minibioreactor Array (MBRA)-System entwickelt – ein einstufiges Kultursystem mit kontinuierlichem Fluss, das das stabile Wachstum mikrobieller Gemeinschaften aus verschiedenen Quellen in einer kontrollierten Umgebung erleichternsoll 6,7,8. Das MBRA-System unterscheidet sich von anderen Darmmodellen durch seine einfache Montage und Bedienung, kombiniert mit Hochdurchsatzfähigkeiten, die die gleichzeitige Kultivierung mehrerer mikrobieller Gemeinschaften ermöglichen und so die experimentelle Effizienz steigern. Darüber hinaus ermöglicht die einfache und kompakte Beschaffenheit dieses Systems den Betrieb in anaeroben und mikrooxischen Kammern, um das Wachstum von Bakterien aus anaeroben und hypoxischen Stellen, wie dem Magen-Darm- und Vaginaltrakt, zu erleichtern. Die Vielseitigkeit dieses Systems wurde für das Screening von Clostridioides difficile-resistenten gastrointestinalen Gemeinschaften9 sowie für die Untersuchung der Auswirkungen von Antibiotika10,11 und diätetischen Substraten12 auf mikrobielle Gemeinschaften genutzt.

MBRAs werden durch 3D-Druck oder additive Fertigung hergestellt, wobei bei der Materialauswahl Klarheit und Wasserbeständigkeit im Vordergrund stehen (siehe Materialtabelle für Polymerinformationen). Jedes Array enthält sechs einzelne Kammern, die alle mit Anschlüssen für den Medienimport, den Abfallexport und die Probenentnahme ausgestattet sind. Frisches Medium wird kontinuierlich in das System eingespeist, während gleichzeitig die Abfälle abgesaugt werden, wobei die Durchflussmengen von zwei Schlauchpumpen präzise gesteuert werden. Der Inhalt in der Anlage wird mit Hilfe von Rührstäben und einer 60-Punkt-Rührplatte ständig gerührt, um homogene Kulturen zu ermöglichen. Das hier beschriebene Protokoll ist für ein Arbeitsvolumen von 15 mL pro Kammer optimiert, obwohl jeder Bioreaktor je nach experimentellen Anforderungen einen Bereich von 1 bis 20 mL aufnehmen kann. Die Peristaltikpumpe und der Pumpenschlauch können Durchflussraten von 0,016 bis 2,9 mL/min aufnehmen, was einer Umsatzrate von ca. 15,63 bis 0,09 h entspricht. Obwohl das System mit einer Vielzahl von Medienformulierungen und diätetischen oder ernährungsphysiologischen Zusätzen kompatibel ist, müssen einige praktische Überlegungen berücksichtigt werden: Hochviskose Medien können eine Neukalibrierung der Durchflussraten erfordern, und das Vorhandensein von ungelösten Partikeln oder unlöslichen Bestandteilen kann die Pumpenschläuche oder engen Anschlüsse verstopfen, insbesondere bei niedrigeren Durchflussraten. Die Modularität des Systems ermöglicht eine schnelle und einfache Anpassung von Experimenten durch Anpassung der Medienauswahl, der Probenentnahme, der Flussraten und des Arbeitsvolumens. In Verbindung mit vier 24-Kanal-Peristaltikpumpen und zwei 60-Punkt-Rührplatten kann das System 48 separate Kammern pro Experiment in einer einzigen anaeroben Kammer betreiben und so ein anaerobes Screening mit hohem Durchsatz unterstützen.

Dieses Protokoll dient als visueller Leitfaden und aktualisierte Version einer zuvor veröffentlichten MBRA-Assemblierungs- und Betriebsmethode, die von unserem Laborentwickelt wurde 4. Es wurden mehrere wichtige Verbesserungen vorgenommen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, den Arbeitsablauf zu rationalisieren und Kontaminationen zu minimieren. Zunächst werden die PTFE-Halme nun chemisch geätzt, um zu verhindern, dass sie sich lösen und in die Bioreaktorkammern fallen. Zweitens wurde den Zuleitungen ein Medienstrohhalm hinzugefügt, um den Medienfluss in den Boden der Kammern zu leiten und zu verhindern, dass das Medium an den Kammerwänden heruntertropft. Dies war eine bekannte Quelle für die Bildung von Biofilmen. Drittens wurden die C-Flex-Schlauchlängen standardisiert und verkürzt, und ein 3D-gedruckter Schlauchhalter wurde entwickelt, um ein kompakteres, organisierteres Setup zu schaffen. Schließlich werden Bioreaktoren bei jedem Gebrauch nicht mehr vollständig zerlegt, was den Zeit- und Materialaufwand, der mit wiederholten Experimenten verbunden ist, erheblich reduziert. Diese und andere inkrementelle Verfeinerungen spiegeln die iterative Optimierung wider, die auf dem umfangreichen Einsatz des Systems in mehreren Projekten in unserem Labor basiert.

Protocol

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HINWEIS: Dieses Protokoll dient zur Vorbereitung und Assemblierung eines einzelnen MBRA-Streifens (Abbildung 1). Jeder MBRA besteht aus einem 3D-gedruckten Bioreaktor, Schläuchen, um den Zufluss eines Wachstumsmediums zu erleichtern, und Schläuchen, um den Ausfluss von Abfällen aus den Bioreaktorkammern zu erleichtern. Eine vollständige Liste der Teile, aus denen ein einziger MBRA besteht, einschließlich Bilder, ist in Tabelle 1 zu finden. Zu den zusätzlich erforderlichen Geräten gehören zwei Schlauchpumpen und eine Rührplatte (siehe Materialtabelle für Gerätespezifikationen).

1. Vorbereitung der Montage

  1. Ätzen von Polytetrafluorethylen (PTFE)
    HINWEIS: Obwohl die chemischen Eigenschaften von PTFE es ideal für den Einsatz in diesem MBRA-System machen, macht es seine Schmierfähigkeit unmöglich, sich mit anderen Bioreaktorteilen allein mit Epoxidharz zu verbinden. Um den PTFE-Schlauch in den Gewinde-Außengewinde zu befestigen, muss er zunächst chemisch geätzt werden, um die Verklebung von Epoxidharz zu ermöglichen. Es wird ein Fluorkohlenstoff-Ätzmittel verwendet (siehe Materialtabelle). Abbildung 2A dient als visuelle Anleitung zum Abkleben des PTFE-Schlauchs, um diesen Ätzprozess zu erleichtern.
    1. Schneiden Sie zwölf PTFE-Schläuche mit einem Längen von 25 mm. Sechs davon werden nach dem Ätzen in zwei Hälften geschnitten und dienen als Halme für die Zuleitungen ("Medienstrohhalm").
      HINWEIS: Es sollte nur der zu verklebende Abschnitt geätzt werden. Um ein Einätzen der Innenfläche und unerwünschter Bereiche zu verhindern, müssen die Schläuche an beiden Enden abgeklebt und abgedichtet werden.
    2. Wickeln Sie das Klebeband mit einem Allzweck-Labor-Beschriftungsband (19 mm Breite) vollständig um die Oberseite und bedecken Sie ~5 mm des PTFE-Schlauchs (Abbildung 2A). Bringen Sie einen weiteren Abschnitt Klebeband um die Unterseite an und decken Sie ~10 mm des PTFE-Schlauchs ab (Abbildung 2A).
    3. Drücken Sie die Enden des Klebebandes fest zusammen, um zu verhindern, dass die Ätzlösung das Innere des PTFE erreicht (Abbildung 2A). Dadurch sollten ~10 mm PTFE-Schlauch zum Ätzen freiliegen.
    4. Bereiten Sie vier Lösungen vor: Die auf 55 °C erhitzte Fluorkohlenwasserstoff-Ätzlösung (Einzelheiten zur Fluorkohlenstoff-Ätzlösung siehe Materialtabelle ), 100 % Ethanol (EtOH), destilliertes H2O erhitzt auf 70 °C und destillierte H2O + 2-5 % Essigsäure, die auf 70 °C erhitzt wird.
      ACHTUNG: Die Fluorkohlenstoff-Ätzlösung ist stark korrosiv. Führen Sie alle Arbeitsschritte in einem Abzug mit PSA aus. Entsorgen Sie Chemikalien gemäß den institutionellen Richtlinien.
    5. Alle Lösungen werden auf die in Schritt 1.1.4 angegebenen Temperaturen erhitzt. Die Fluorkohlenstoff-Ätzlösung sollte in einem Wasserbad erhitzt werden, die anderen Lösungen können auf einer Heizplatte erhitzt werden. Gießen Sie Lösungen in 4 separate Glasbehälter, die tief genug sind, um den abgeklebten Schlauch vollständig zu untertauchen.
    6. Tauchen Sie alle PTFE-Schläuche in die Fluorkohlenstoff-Ätzlösung. Schwenken, um eine gleichmäßige Oberflächenbelichtung zu gewährleisten. 1 Minute einweichen, bis die geätzte Oberfläche braun wird.
      HINWEIS: Ein Abschäumersieblöffel aus Metall kann verwendet werden, um PTFE-Schläuche zwischen Lösungen zu übertragen.
    7. Übertragen Sie den Schlauch für 5-20 s in das EtOH-Bad.
    8. Übertragen Sie den Schlauch für 15-30 s in das 70 °C H20 Bad.
    9. Schlauch für 1 min in das 70 °C H20 + 2-5%ige Essigsäurebad überführen.
    10. Entfernen Sie den Schlauch und legen Sie ihn auf ein saugfähiges Pad in den Abzug. Lassen Sie den geätzten Schlauch über Nacht (mindestens 16 h) trocknen. Entfernen Sie nach dem Trocknen das Klebeband von den geätzten Schläuchen.
    11. Das geätzte PTFE ist bereit für die Verklebung und bleibt bei Lagerung bei Raumtemperatur mehrere Monate lang verklebbar. Sobald die braune Färbung auf den Ätzflächen verblasst, ist sie nicht mehr verklebbar.
      HINWEIS: Setzen Sie das geätzte PTFE keinem UV-Licht aus, da dies die Ätzung beeinträchtigt.
    12. Schneiden Sie 6 der geätzten PTFE-Schläuche in zwei Hälften, um sie als Strohhalme für die Zuleitungen zu verwenden (Abbildung 2A).
  2. Epoxidabfälle und Medienstrohhalme
    1. Setzen Sie jeweils einen der 6 geätzten PTFE-Abfallhalme und 6 geätzten PTFE-Medienstrohhalme in den jeweiligen Gewinde-Luer ein. Stellen Sie sicher, dass die geätzten Oberflächen mit der Unterseite des männlichen Luers ausgerichtet sind (Abbildung 2).
    2. Epoxidharz und Härter im Verhältnis 1:1 in einer Waage oder Petrischale mischen. Tragen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze Epoxidharz um die Basis des Gewinde-Luers auf, wo er auf den PTFE-Schlauch trifft.
    3. Positionieren Sie jedes Stück vertikal und lassen Sie das Epoxidharz 24 h lang aushärten.
      HINWEIS: Eine leere Pipette mit 1 ml Spitzendose eignet sich gut, um sie aufrecht zu halten.

2. MBRA-Montage

  1. MBRA und Teilevorbereitung
    1. Stellen Sie sicher, dass die Minibioreaktor-Array-Streifen 3D-gedruckt sind (siehe Zusatzdatei 1) und 6 unabhängige Bioreaktorkammern enthalten. Jede Kammer enthält drei 1/4-Zoll-Anschlüsse, die zum Einsetzen von Verschraubungen mit einem Gewinde versehen werden müssen. Führen Sie das Gewindeschneiden mit einem 1/4 Zoll-28NF-Fraktionsgewindebohrer mit einem T-Griff-Gewindebohrer durch.
      HINWEIS: Beim Einfädeln der Anschlüsse wird die Verwendung einer Gewindeführung empfohlen, um ein Lotgewinde zu gewährleisten.
    2. Waschen Sie nach dem Gewinde jede Bioreaktorkammer mit Wasser aus, um alle Kunststoffreste zu entfernen. Geben Sie einen 10 x 3 mm großen Magnetrührstab und 1 ml destilliertes Wasser in jede Kammer. Das Wasser unterstützt den Sterilisationsprozess während des Autoklavierens.
    3. Positionieren Sie eine Gummischeibe auf jedem Anschluss des Bioreaktors. Schrauben Sie für jede Kammer 1 Abfall-Luer mit Strohgewinde, 1 Medien-Luer mit Strohgewinde und 1 leeres Luer mit Gewinde in jeden der Anschlüsse, wie in Abbildung 2B gezeigt.
    4. Setzen Sie 6 Gummisepten auf 3/32 Zoll weibliche Luer-Widerhaken ein. Falte den oberen Ärmel der Septen nach unten, um den Hals zu bedecken. Befestigen Sie diese an den Anschlüssen jeder Kammer, die in Abbildung 2B dargestellt sind.
    5. Schneiden Sie C-Flex-Schlauchstreifen der folgenden Länge: 2 3/8 Zoll, 3 11/16 Zoll, 5 1/4 Zoll, 6 1/2 Zoll, 7 13/16 Zoll und 9 Zoll und 9 Zoll (zwei von jeder Länge werden sowohl für die Ablaufleitungen als auch für die Zuleitungen benötigt). Befestigen Sie nach dem Schneiden einen 1/8-Zoll-weiblichen Luer-Widerhaken an einem Ende und einen männlichen Luer-Lock-Anschluss am gegenüberliegenden Ende jedes Schlauchabschnitts.
      HINWEIS: Die hier verwendeten Längen sind optimiert, um Unordnung zu reduzieren und für Pumpen, die ~1 Zoll von der Rührplatte entfernt platziert sind. Je nach gewünschtem Setup können auch längere Längen erforderlich sein.
    6. Führen Sie einen 1/16-Zoll-Luer-Widerhaken in jedes Ende des roten 2-Stopp-E-Lab-Schlauchs (1,14 mm ID) und des orangefarbenen 2-Stopp-E-Lab-Schlauchs (0,89 mm ID) ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal für jeden MBRA-Streifen.
      HINWEIS: Um das Einführen des 1/16-Zoll-Luer-Widerhakens zu erleichtern, tauchen Sie die Enden des E-Lab-Schlauchs kurz in fast kochendes Wasser, um den Kunststoff weicher zu machen.
    7. Verbinden Sie den E-Lab-Schlauch mit dem in Schritt 2.1.5 vorbereiteten C-Flex-Schlauch. Jede der 6 Längen C-Flex-Schläuche sollte über weibliche Luer mit einer roten und einer orangefarbenen E-Lab-Leitung verbunden werden.
    8. Schneiden Sie einundzwanzig 1-Zoll-Stücke, ein 2-Zoll-Stück, drei 3-Zoll-Stücke und ein 12-Zoll-Stück C-Flex-Schlauch. Befestigen Sie einen 1/8-Zoll-weiblichen Luer-Widerhaken und einen männlichen Luer-Lock-Anschluss an den Enden eines 3-Zoll-Stücks und des 12-Zoll-Schlauchstücks. Befestigen Sie an den verbleibenden Schläuchen männliche Luer-Lock-Anschlüsse an beiden Enden. Diese Teile bestehen aus den Baugruppen der Abfallleitung und der Zuleitungsleitung.
  2. Baugruppe von Abfalllinienbäumen
    1. Befolgen Sie das 3D-Diagramm in Abbildung 3B , um den Abfalllinienbaum zusammenzustellen.
    2. Befestigen Sie die freiliegenden Enden des roten E-Lab-Schlauchs mit 2 Stopps (1,14 mm ID) an den männlichen Luer-Schlössern des montierten Abfallleitungsbaums. Befestigen Sie diese in aufsteigender Reihenfolge, basierend auf der Länge des C-Flex-Schlauchs, der an den 2-Stopp-E-Lab-Schlauch befestigt ist. Befestigen Sie den 3-Zoll-C-Flex-Schlauch mit dem 1/8-Zoll-weiblichen Luer-Widerhaken und dem männlichen Luer-Lock-Anschluss an der Oberseite des Abfallleitungsbaums.
  3. Montage des Zuleitungsleitungsbaums
    1. Befolgen Sie das 3D-Diagramm in Abbildung 3A , um den Zuleitungsbaum zusammenzubauen.
      HINWEIS: Die Zuleitungsbäume enthalten nicht die Stecker-zu-Stecker-Luer-Anschlüsse, die im Abfallleitungsbaum verwendet werden. Unserer Erfahrung nach sind diese Konnektoren anfällig für Undichtigkeiten und können sich leicht lösen, was das Risiko einer Kontamination sowohl in den Bioreaktorkammern als auch in den Medienflaschen erhöht. Um dies zu vermeiden, wird der Zuleitungsbaum ohne diese Komponenten erstellt.
    2. Befestigen Sie die freiliegenden Enden des orangefarbenen E-Lab-Schlauchs mit 2 Stopps (0,89 mm ID) an den männlichen Luer-Locks am montierten Zuleitungsbaum. Befestigen Sie diese in aufsteigender Reihenfolge, basierend auf der Länge des C-Flex-Schlauchs, der an den 2-Stopp-E-Lab-Schlauch befestigt ist. Befestigen Sie den 12-Zoll-C-Flex-Schlauch an der Oberseite des Zuleitungsbaums.
  4. Komplette Montage: Kombinieren Sie die vorbereiteten Komponenten in das MBRA Kultursystem.
    1. Befestigen Sie den C-Flex-Schlauch mit variabler Länge am Ende des Zuleitungsbaums in aufsteigender Reihenfolge am Bioreaktor, wobei sich die kürzeste Leitung auf der linken Seite des Bioreaktorstreifens und die längste auf der rechten Seite befindet.
    2. Befestigen Sie den C-Flex-Schlauch mit variabler Länge am Ende des Abfallleitungsbaums in absteigender Reihenfolge mit der längsten Leitung links und der kürzesten rechts am Bioreaktorstreifen. Die kürzeste Abfallleitung befindet sich auf der rechten Seite des Bioreaktorstreifens, da sie der Abfallpumpe am nächsten ist. Im Gegensatz dazu befindet sich die längste Förderleitung auf der rechten Seite, da sich die Förderpumpe auf der linken Seite befindet (Abbildung 1).
  5. Sterilisation von zusammengesetzten Arrays: Bereiten Sie das zusammengesetzte System für die Sterilisation vor.
    1. Bündeln Sie alle C-flex-Zuleitungen auf der linken Seite des MBRA und sichern Sie sie mit einem Kabelbinder. Machen Sie dasselbe für die Abfalllinien auf der rechten Seite des Streifens.
    2. Bilden Sie mit dem orangefarbenen 2-Stopp-E-Lab-Schlauch eine Schlaufe zwischen den C-Flex-Leitungen. Sichern Sie die Schlaufe mit Autoklavenband. Machen Sie dasselbe für den roten 2-Stopp-E-Lab-Schlauch auf der Abfallseite des Bioreaktorstreifens. Dies spart Platz beim Autoklavieren.
    3. Decken Sie den weiblichen Luer am Ende der Abfallleitung und des Zuleitungsbaums mit einem Stück Folie ab, um eine Kontamination nach der Entnahme aus dem Autoklaven zu vermeiden. Lösen Sie die Luer mit Außengewinde mit den Septen an jeder Bioreaktorkammer, damit der Dampf während des Autoklavierens entweichen kann.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass der Dampf während des Autoklavierens aus dem Bioreaktor entweichen kann. Bei unsachgemäßer Entlüftung kann es zu Rissen in den Bioreaktorkammern kommen.
    4. Legen Sie den MBRA in einen Autoklavbehälter und strecken Sie die Zuleitungs- und Abfallleitungsbäume in separate Behälter neben dem Behälter mit den MBRAs aus. Wenn der E-Lab-Schlauch in der Nähe der 1/16-Zoll-Luer-Widerhaken oder Teile des C-Flex-Schlauchs während des Autoklavierens geknickt werden, kann der Schlauch verstopfen und den Medien- oder Abfallfluss behindern.
    5. Autoklav bei 121 °C, ≥ 15 psi für 25 min. Verwenden Sie ein langsames Absaugprogramm, das für Flüssigkeitszyklen typisch ist. Lassen Sie den Bioreaktor nach dem Autoklavenzyklus auf Raumtemperatur abkühlen. Nachdem der MBRA ausreichend abgekühlt ist, ziehen Sie die Gewinde-Luers mit den Septen wieder fest.
      HINWEIS: Autoklavierte Bioreaktorstreifen werden formbar und neigen zu Rissen, wenn sie zusammengedrückt werden. Lassen Sie ausreichend Zeit zum Abkühlen, bevor Sie die Verschraubungen festziehen.
      HINWEIS: Der orangefarbene 2-Stopp-E-Lab-Schlauch neigt während des Autoklavenvorgangs zu Rissen und kann sich von der 1/16-Zoll-Luer-Widerhaken lösen. Wenn Risse auftreten, besprühen Sie beide Enden mit 70% Ethanol, schneiden Sie dann das rissige Ende mit einem sterilen Rasierer ab und befestigen Sie den Schlauch wieder an der Luer-Widerhaken. Alternativ können zusätzliche E-Lab-Schläuche mit angeschlossenen 1/16-Zoll-Luern separat in einem Autoklavenbeutel sterilisiert werden, und der gesamte Schlauch kann ausgetauscht werden.

3. Montage von Medien- und Abfallflaschen

  1. Montage von Medienflaschen
    HINWEIS: Im vorliegenden Beispiel wird das gesamte System mit einer einzigen 2-Liter-Flasche beschickt. In Abbildung 4A finden Sie ein Bild der Medienflaschenverschlussbaugruppe.
    1. Schrauben Sie Dibafit Adapter (Flaschenverschlussadapter) in die beiden Gewindeanschlüsse oben auf dem Flaschenverschluss der Q-Serie. Fügen Sie einem der Adapter einen 3-Zoll-Abschnitt C-Flex-Schlauch und dem anderen einen 12-Zoll-Abschnitt C-Flex-Schlauch hinzu. Fügen Sie am Ende jedes Schlauchabschnitts einen männlichen Luer-Lock-Anschluss hinzu.
      HINWEIS: Die Länge des Schlauchs, der erforderlich ist, um den Zuleitungsbaum des MBRA zu erreichen, kann variieren und entsprechend angepasst werden.
    2. Schneiden Sie ein 12-Zoll-Stück PTFE-Schlauch ab, das als Strohhalm dient, aus dem das Medium entnommen wird. Schneiden Sie das Ende mit einer Rasierklinge in einem 45°-Winkel ab, um ein Verstopfen an der Seitenwand der Flasche zu vermeiden. Führen Sie das PTFE in das kleine Loch an der Unterseite des Flaschenverschlusses ein, das mit dem 12-Zoll-Abschnitt des C-Flex-Schlauchs verbunden ist.
    3. Schneiden Sie ein 2-Zoll-Stück C-Flex-Schlauch ab und befestigen Sie an einem Ende einen weiblichen Luer-Widerhaken und am anderen Ende einen männlichen Luer-Lock-Anschluss. Befestigen Sie diesen Schlauch an dem 12-Zoll-Schlauchabschnitt, der schließlich mit dem Zuleitungsbaum verbunden wird. Befestigen Sie das 2-Zoll-Stück mit einem Pinchcock. Platzieren Sie die Schlaufe des Pinchcock um den 3-Zoll-Schlauch des Flaschenverschlusses. Dies dient als temporärer Stopfen, um ein Austreten von Medien während und nach dem Autoklavieren zu verhindern.
    4. Bereiten Sie das gewünschte Medium vor. Montieren Sie den fertig montierten Flaschenverschluss auf der Medienflasche. Wickeln Sie den 12-Zoll-C-Flex-Schlauch um die Flasche und befestigen Sie das Ende mit dem Pinchcock auf dem 2-Zoll-Schlauch, wie oben beschrieben. Schrauben Sie den Deckel nicht fest, sondern lösen Sie ihn leicht, um einen Druckaufbau beim Autoklavieren zu vermeiden.
    5. Verwenden Sie Folie, um das Ende des 3-Zoll-Schlauchs abzudecken, der vom Flaschenverschluss abgeht. Autoklavieren Sie für eine Zeit, die dem Protokoll des Mediums entspricht. Entfernen Sie nach der Sterilisation die Folie vom 3-Zoll-Schlauch und schrauben Sie einen 0,22 μm Spritzenfilter in den männlichen Luer-Lock-Anschluss. Dies ermöglicht den Luftstrom in die Medienflasche während des Pumpens, verhindert aber eine Kontamination.
      HINWEIS: Stellen Sie vor dem Gebrauch sicher, dass die Flaschenverschlüsse der Q-Serie fest auf den Flaschen verschlossen sind, da eine unsachgemäße Versiegelung den ordnungsgemäßen Durchfluss verhindern kann.
  2. Montage der Abfallflaschen: Um zu vermeiden, dass die Abfallflaschen jeden Tag gewechselt werden, hat das Labor ein abgestuftes Abfallsammelsystem (Abbildung 4B) entwickelt, das es ermöglicht, während des Experiments mehrere 2-Liter-Flaschen mit Abfall zu befüllen. Der Aufbau dieses abgestuften Abfallsystems ist wie folgt:
    1. Schrauben Sie die Flaschenverschlussadapter in die beiden Gewindeanschlüsse an der Oberseite eines Flaschenverschlusses der Q-Serie. Wiederholen Sie dies für 2-4 Flaschenverschlüsse, abhängig von der Anzahl der benötigten Abfallbehälter.
    2. Schneiden Sie für jeden Flaschenverschluss ein 2 Zoll großes Stück PTFE ab. Setzen Sie dieses Stück in den Flaschenverschluss in das Loch ein, das für die Entfernung von Abfällen zur nächsten Flasche im System vorgesehen ist.
    3. Schneiden Sie ein Stück C-Flex-Schlauch ab, das lang genug ist, um es zwischen dem Abfallleitungsbaum, der von der Pumpe stammt, bis zum Standort des Abfallflaschensystems zu erstrecken. Befestigen Sie einen männlichen Luer-Lock-Stecker an dem Ende neben dem Ablaufleitungsbaum und verbinden Sie das andere Ende mit dem Flaschenverschlussadapter, ohne dass der PTFE-Schlauch am Flaschenverschluss vorhanden ist.
    4. Schneiden Sie ein zweites Stück C-Flex-Schlauch ab, um die Flaschenverschlüsse an der ersten und zweiten Abfallflasche zu verbinden. Befestigen Sie den Schlauch am Flaschenverschlussadapter mit dem PTFE-Strohhalm an der ersten Flasche und am Flaschenverschlussadapter ohne PTFE-Strohhalm an der zweiten Flasche.
      HINWEIS: Jede Flasche in der abgestuften Abfallflaschenkaskade muss über der ersten positioniert werden, damit die Schwerkraft den Fluss von einer Flasche zur nächsten unterstützen kann (Abbildung 4B). Es wird empfohlen, alle Flaschen in einen Sekundärbehälter (z. B. einen offenen Plastikbehälter) zu stellen und sie mit Steigstufen, wie z. B. umgedrehten Behältern für scharfe Gegenstände, in absteigender Reihenfolge anzuordnen.
    5. Diese Kette für so viele Flaschen wie gewünscht fortsetzen. Befestigen Sie an der letzten Flasche ein 3-Zoll-C-Flex-Schlauchsegment mit einem männlichen Luer-Lock-Anschluss an den kostenlosen Flaschenverschlussadapter. Schließen Sie dann eine 20-ml-Spritze an, um ein Vakuum zu erzeugen und die Abfallkaskade zu erleichtern.

4. MBRA-Anschluss, Betrieb und Demontage

  1. Anbringen an Pumpen
    1. Entfernen Sie das Autoklavenband, mit dem die E-Lab-Schläuche sowohl für die Abfall- als auch für die Zuleitungen zusammengehalten werden. Löse die Bündel mit den C-Flex-Schläuchen.
    2. Positionieren Sie den MBRA zwischen den beiden Pumpen auf der Rührplatte. Er kann mit den 3D-gedruckten Halterungen auf die Platte gespannt werden (siehe Zusatzdatei 2). Stellen Sie sicher, dass es mit den auf der Rührplatte angegebenen Rührpositionen ausgerichtet ist.
    3. Befestigen Sie den E-Lab-Schlauch der Zuleitung an den Kartuschen der Schlauchpumpe. Positionieren Sie die Anschläge des E-Lab-Schlauchs in den Schlitzen an den Kartuschen. Machen Sie dasselbe für den E-Lab-Schlauch der Ablaufleitung an der Pumpe rechts von der Rührplatte.
    4. Verriegeln Sie die Patronen der Schlauchpumpe in der Pumpe. Stellen Sie sicher, dass die Patronen vollständig an der Pumpe anliegen und sich der Schlauch im Kanal der Patronen befindet.
      HINWEIS: Verriegeln Sie die Kartuschen nur dann an den Pumpen, wenn Sie beabsichtigen, den Durchfluss innerhalb von 24 h zu starten. Wenn die Rohre länger als 24 Stunden ohne Medienfluss eingespannt bleiben, können sie zusammengedrückt und verstopft werden. In diesem Fall entfernen Sie einfach die Klemme und massieren Sie den Schlauch vorsichtig an der Kompressionsstelle.
    5. Räumen Sie den C-Flex-Schlauch mit den 3D-gedruckten Schlauchhaltern auf (Ergänzungsdatei 3).
    6. Befestigen Sie das Ende des Abfallleitungsbaums an den Schläuchen, die zu den Abfallflaschen führen.
      HINWEIS: Wenn Sie mehrere MBRAs betreiben, müssen die Abfallleitungsbäume zusammengegabelt werden, bevor sie an den Rohren befestigt werden, die zu den Abfallbehältern führen. Dies kann erreicht werden, indem für jeden zusätzlichen MBRA ein einfacher Verzweigungsbaum erstellt wird.
    7. Befestigen Sie die Luer-Buchse am Einführungsschlauch der Zuleitung an den Stecker des 12-Zoll-Schlauchs vom Verschluss der Medienflasche.
      HINWEIS: Beide Enden sollten zu diesem Zeitpunkt steril sein. Vermeiden Sie es, sie mit einer potenziellen Kontaminationsquelle zu berühren. Bei Verdacht auf eine Kontamination weichen Sie jedes Ende 10 Minuten lang in 10 % Bleiche ein, bevor Sie es anschließen.
    8. Schalten Sie beide Pumpen ein, um den Medienfluss zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Pumpen in die richtige Richtung fließen (beide auf den Uhrzeigersinn ("CW") eingestellt, wenn sich der Abfall rechts von den Pumpen befindet).
    9. Beobachten Sie die Größe und Kadenz der Medientröpfchen, die in jede Bioreaktorkammer fallen. Große Unterschiede können auf eine Variabilität der Durchflussrate hinweisen. Wenn eine Variabilität beobachtet wird, wird empfohlen, alle orangefarbenen E-Lab-Zuführschläuche mit 2 Stopps, die mit der betreffenden Bioreaktorkammer verbunden sind, auszutauschen. Dies wird dazu beitragen, die Variabilität der Durchflussrate im Versuchslauf zu begrenzen.
      HINWEIS: Dies ist der Zeitpunkt, um Lecks im System zu diagnostizieren und zu beheben, also überwachen Sie den ersten Befüllungsprozess genau.
    10. Sobald die Bioreaktorkammern ihre Kapazität erreicht haben, schalten Sie beide Pumpen ab und lassen Sie die Bioreaktoren 24-48 Stunden lang stehen. Dieser Schritt ist wichtig, um die Kammern vor Beginn des Experiments auf mögliche Verunreinigungen zu überprüfen.
  2. MBRA-Impfung
    HINWEIS: Hier beschreiben wir das grundlegende Protokoll für die Sterilisation der Septen und die Injektion eines Inokulums.
    1. Bereiten Sie das Inokulum gemäß den gewünschten Spezifikationen vor.
    2. Tragen Sie eine frisch hergestellte 10%ige Bleichlösung mit einer Plastikpipette auf die Oberseite der Septen auf jede Bioreaktorkammer auf. Tragen Sie so viel Bleichmittel auf, dass die Oberseite der Septen vollständig bedeckt ist. 10 min ziehen lassen. Trocknen Sie die Septen mit einem sterilen Labortuch.
    3. Mit einer 3 Zoll langen 22-G-Nadel und einer Spritze mit der Probe stechen Sie in die Mitte der Septen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel das Medium in der Kammer berührt, und injizieren Sie dann das Inokulum in die Bioreaktorkammer. Spülen Sie die Spritze, indem Sie das Medium entfernen und wieder in die Kammer injizieren. Entferne die Nadeln aus den Septen und entsorge sie in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
    4. Lassen Sie das Inokulum für einen angemessenen Zeitraum wachsen, basierend auf dem Versuchsplan, bevor Sie mit dem Fluss beginnen. Zum Beispiel benötigen fäkale Bakteriengemeinschaften ein anfängliches Chargenwachstum von 4-16 Stunden, um eine ausreichende Biomasse zu erhöhen8.
    5. Schalten Sie beide Pumpen auf die gewünschte Fördermenge ein, abhängig von der erforderlichen Wechselzeit. Weitere Informationen zu den Durchflussraten finden Sie im Handbuch der Schlauchpumpe.
      HINWEIS: Unabhängig von der gewünschten Durchflussmenge sollte die Abfallpumpe immer mit einer höheren Drehzahl als die Medienpumpe betrieben werden, um sicherzustellen, dass die Bioreaktorkammern nicht überlaufen. Für die Kultivierung unserer gastrointestinalen Bakteriengemeinschaft verwenden wir eine Umsatzrate von 1,92 mL/h, die erreicht wird, indem die Medienpumpe auf 1,0 U/min und die Abfallpumpe auf 2,0 U/min eingestellt wird.
    6. Beobachten Sie auch hier die Größe und Kadenz der Medientröpfchen, die in jede Bioreaktorkammer fallen, da große Unterschiede darin auf eine Variabilität der Durchflussrate hinweisen können. Wenn eine Variabilität beobachtet wird, wird empfohlen, alle orangefarbenen 2-Stopp-E-Lab-Zuführschläuche, die an die betreffende Bioreaktorkammer angeschlossen sind, auszutauschen. Dies wird dazu beitragen, die Variabilität der Durchflussrate bei Versuchsläufen zu begrenzen.
  3. MBRA-Probenahme
    1. Tragen Sie eine 10%ige Bleichlösung auf die Oberseite der Septen auf jede Bioreaktorkammer auf, genug, um die Oberfläche vollständig zu beschichten. 10 min ziehen lassen. Trocknen Sie die Septen nach 10 Minuten mit einem sterilen Labortuch.
    2. Durchstechen Sie mit einer 3 Zoll langen 22-Gauge-Nadel und einer Spritze die Mitte der Septen und führen Sie die Nadel vollständig in die Bioreaktorkammer ein. Halten Sie die Spritze fest und ziehen Sie den Kolben zurück, um die Probe aus der Kammer zu entfernen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, mehr als 20 % des Gesamtvolumens der Bioreaktorkammer auf einmal zu entfernen. Die Entfernung von mehr als diesem Wert kann die mikrobielle Gemeinschaft stören, da der Abfallabfluss unterbrochen wird, bis frische Medien die Kammer wieder auf den PTFE-Abfallstrohgehalt auffüllen.
    3. Entfernen Sie die Nadel und geben Sie die Probe in einen geeigneten Behälter. Entsorgen Sie die Nadel in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
  4. MBRA Demontage und Aufarbeitung
    HINWEIS: Nach den Experimenten muss das MBRA sterilisiert und für zukünftige Experimente vorbereitet werden.
    1. Schalten Sie den Medieneingang mit 1 l 10 % Bleiche in deionisiertem (DI) Wasser um. Erhöhen Sie die Durchflussmenge an beiden Pumpen auf maximal, um den Inhalt der Bioreaktorkammern mit der Bleichlösung zu verdrängen.
    2. Sobald die Kammern klar sind (alle Medien wurden durch Bleichmittel ersetzt), drehen Sie den MBRA um, um ihn 5 Minuten lang oberhalb der Fülllinie zu desinfizieren. Richten Sie nach 5 Minuten den Streifen wieder auf und warten Sie weitere 5 Minuten auf die Sterilisation.
      HINWEIS: Lassen Sie das Bleichmittel nicht länger als 10 Minuten wie oben beschrieben einwirken, da dies zu einer Verfärbung des Kunststoffs und einer Schwächung des Mediums und des Abfallschlauchs führt.
    3. Ersetzen Sie die 10%ige Bleichlösung durch 1 l DI-Wasser. Spülen Sie das System mit DI-Wasser, bis das gesamte Wasser durchgelaufen ist. Trennen Sie die E-Lab-Schläuche des Bioreaktors von den Pumpen und entfernen Sie die MBRAs.
    4. Entfernen Sie zur Aufarbeitung die gebrauchten Septen und alle bis auf 1 ml Wasser aus jeder Kammer.
    5. Tauschen Sie die Septen und den orangefarbenen 2-Stopp-E-Lab-Schlauch aus und befolgen Sie die vorherigen Schritte zur Vorbereitung des Autoklavierens (Schritte 2.5.1 bis 2.5.5) bis zu 3 Mal. Nach der dritten Wiederverwendung sollte der MBRA komplett zerlegt, der C-Flex-Schlauch ausgetauscht und jedes einzelne Teil mit 70% EtOH sterilisiert oder bei Bruch ausgetauscht werden. Das Epoxidharz, das den Abfall und das zugeführte PTFE hält, wird nach mehreren Autoklavenzyklen spröde und muss erneut aufgetragen werden.
      HINWEIS: Der orangefarbene E-Lab-Schlauch mit 2 Stopps wird zwischen jedem Lauf ausgetauscht, um die Variabilität der Durchflussrate zu begrenzen, die durch Verschleiß und wiederholte Autoklavenzyklen verursacht wird.

Results

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Um das Wachstum von anaeroben Bakterien, wie sie im Magen-Darm-Trakt vorkommen, zu erleichtern, kann der MBRA in anaeroben Kammern aufgestellt und betrieben werden. Um die Fähigkeit zu demonstrieren, komplexe Bakteriengemeinschaften direkt von relevanten Stellen im menschlichen Körper zu züchten, wurde eine menschliche Stuhlprobe vorbereitet und in diesem System gezüchtet. Alle Arbeiten wurden in einer anaeroben Kammer durchgeführt, die auf 37 °C eingestellt war, und die Kulturen wurden in unserem Bioreaktormedium BRM37 gezüchtet.

Die Fäkalaufschlämmung wurde hergestellt, indem menschlicher Stuhl anaerob aufgetaut und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 25 Gew.-% gemischt wurde. Nach Bestätigung der Sterilität wurden neun Bioreaktorkammern mit jeweils 3 ml desselben Stuhlgeldes beimpft. Mikrobielle Gemeinschaften wurden über Nacht ohne Medieneinsatz oder Abfallentsorgung gezüchtet, was zu getrennten Chargenkulturen über einen Zeitraum von 16 Stunden führte. Dann wurden die Förderpumpen eingeschaltet und auf eine Fördermenge von 1,92 mL pro h eingestellt. Nach vier Tagen kontinuierlichen Flusses wurden Proben aus den Bioreaktoren entnommen und mittels 16S rRNA-Gensequenzierung auf Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft analysiert, gefolgt von der Rauschunterdrückung mit Deblur und der taxonomischen Klassifizierung mit der SILVA 138 SSU-Datenbank in QIIME 213. Insgesamt wurden 65 Gattungen in allen neun Replikaten nachgewiesen, aber die Bioreaktoren wurden von nur 18 Gattungen dominiert, die jeweils mindestens 2 % der Häufigkeit in einem der neun Replikate aufwiesen (Abbildung 5). Die Bioreaktoren zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit, so dass 22 der 65 Gattungen in allen neun Replikaten nachgewiesen werden konnten und weitere 17 Gattungen in mindestens der Hälfte der Replikate nachgewiesen wurden. Die Mehrzahl der Gattungen, die in mindestens einem Reaktor fehlten (37 von 43 Gattungen), waren seltene Spezies, jede mit einer relativen Abundanz von weniger als 2 % in Bioreaktoren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kontinuierlichen MBRA-Kulturen komplexe, reproduzierbare mikrobielle Gemeinschaften unterstützten, die aus derselben Stuhlprobe stammten, selbst nach separaten Chargenkulturen für 16 Stunden in jeder Bioreaktorkammer.

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Abbildung 1: Das Minibioreactor Array (MBRA). Fertig montierter MBRA, einschließlich Etiketten für den Schlauchbaum der Zu- und Ableitung, die Bioreaktorkammern und den Bioreaktorstreifen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: PTFE-Ätzführung und MBRA-Anschlussanordnung. (A) Flussdiagramm für das Ätzen der Medien und PTFE-Abfallhalme. (B) Jede Bioreaktorkammer enthält einen Anschluss für einen Medienstrohhalm + männlichen Luer mit Gewinde, einen Abfallstrohhalm + männlichen Luer mit Gewinde und ein Septum + männlichen Luer mit Gewinde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: MBRA Futter- und Abfallleitungsbäume. Repräsentative Bilder, die bei der Assemblierung von (A) Zuleitungsbaum und (B) Abfallleitungsbaum zu befolgen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Medienflaschenverschluss und Abfallstufensystem. (A) Ein Beispiel für einen zusammengebauten Flaschenverschluss der Q-Serie, der zum Ansaugen von Medien in die MBRAs verwendet wird. (B) Ein Bild des abgestuften Abfallsammelsystems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Relative Abundanz von Bakteriengattungen. (A) Das gestapelte Balkendiagramm zeigt die relative Abundanz aller Gattungen, die in einer der angezeigten Stichproben eine Abundanz von mindestens 2 % aufweisen. (B) Alpha-Diversitätsmetriken der beobachteten OTUs und der Shannon-Diversität zwischen allen neun Bioreaktorkammern. Alle neun Bioreaktorkammern wurden mit der gleichen Fäkalaufschlämmung beimpft, die aus menschlichem Stuhl hergestellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: MBRA-Komponenten. Bilder und Beschreibungen aller Einzelteile, die für den vollständigen Zusammenbau des MBRA erforderlich sind, zusammen mit der für jedes Bauteil benötigten Menge. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Leitfaden zur Fehlerbehebung. Häufige Probleme, die beim Ausführen des MBRA auftreten, zusammen mit den möglichen Ursachen und empfohlenen Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Stl-Datei für den 3D-Druck der Minibioreaktor-Array-Streifen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: STL-Datei für den 3D-Druck der Bioreaktorhalter, mit denen die Bioreaktoren an den Rührplatten verankert sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 3.: Stl-Datei für den 3D-Druck der Schlauchhalter, die zur Organisation des C-Flex-Abfalls und der Zuführschläuche verwendet werden, die von den MBRAs ausgehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt den vollständigen Zusammenbau und den grundlegenden Betrieb eines Minibioreaktor-Arrays (MBRA) für die Hochdurchsatz-Kultivierung von Bakteriengemeinschaften und enthält einige wichtige Verfeinerungen der zuvor veröffentlichten Methode. Das MBRA-System ist nach wie vor ein vielseitiges und kostengünstiges Werkzeug, das es Forschern ermöglicht, komplexe mikrobielle Ökosysteme zu kultivieren und gleichzeitig zahlreiche experimentelle Replikationen parallel zu unterstützen. In dieser aktualisierten Version führen wir Verbesserungen ein, die die Reproduzierbarkeit verbessern, den Arbeitsablauf rationalisieren und das Kontaminationsrisiko verringern. Dazu gehören chemisch geätzte PTFE-Halme (Abbildung 2), um ein Ablösen zu verhindern, ein Zuführhalm auf der Medienleitung (Abbildung 2) zur Minimierung der Biofilmbildung, standardisierte Schlauchlängen mit einem begleitenden 3D-gedruckten Schlauchhalter (Supplementary File 3) für einen kompakteren und organisierteren Aufbau und ein optimiertes Wiederverwendungsprotokoll, das eine vollständige Demontage zwischen den Experimenten überflüssig macht. Zusammengenommen stellen diese Verfeinerungen iterative Verbesserungen dar, die durch den umfassenden Einsatz des MBRA-Systems in verschiedenen experimentellen Anwendungen in unserem Labor entwickelt wurden. Indem sowohl kritische Assemblierungsschritte als auch praktische Verbesserungen angesprochen werden, unterstreicht diese Diskussion den Nutzen des MBRA als sich ständig weiterentwickelndes Modellsystem für die Mikrobiomforschung.

Der Erfolg des MBRA-Systems hängt stark von der präzisen Montage und Sterilisation der Komponenten ab, um einen kontaminationsfreien Betrieb zu gewährleisten. Zu den wichtigsten Schritten gehört die korrekte Montage der Kappen, Schläuche und Anschlüsse der Q-Serie, die eine modulare Montage erleichtern und die Medieneingabe und Abfallsammlung ermöglichen. Die Gewährleistung einer dichten Abdichtung zwischen Medienflaschen, Abfallbehältern und Bioreaktorkammern ist unerlässlich, um Leckagen zu vermeiden und sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Überprüfung der Durchflussraten der peristaltischen Pumpen vor dem Experiment, da Inkonsistenzen zu einer ungleichmäßigen Medienförderung führen und die Dynamik des mikrobiellen Wachstums beeinträchtigen können. Die meisten Mehrkanal-Schlauchpumpen, die Kassetten verwenden, verfügen über einen Okklusionseinstellmechanismus, der zur Feinabstimmung der Durchflussrate jedes Kanals verwendet werden sollte. Selbst bei richtiger Kalibrierung bleiben die E-Lab-Schläuche eine Hauptquelle für Variabilität. Um dies zu mildern, ist es wichtig, die Häufigkeit und Größe der Medientröpfchen, die in jede Bioreaktorkammer eintreten, sowohl während der ersten Befüllung als auch während des Experimentbeginns visuell zu überwachen. Diese visuellen Kontrollen ermöglichen die frühzeitige Erkennung von Inkonsistenzen der Durchflussrate, die andernfalls die experimentelle Reproduzierbarkeit beeinträchtigen könnten. Tabelle 2 enthält Problembehandlungsstrategien für häufige Probleme, die bei der Assemblierung und Verwendung von MBRAs auftreten. Diese Schritte zur Fehlerbehebung gewährleisten die Reproduzierbarkeit über alle Experimente hinweg und verhindern Unterbrechungen während der Langzeitkultivierung.

Trotz seiner Stärken weist das MBRA-System gewisse Einschränkungen auf, die bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden müssen. Im Gegensatz zu fortschrittlicheren Systemen fehlen dem MBRA aktive Überwachungsfunktionen, wie z. B. Echtzeit-Messungen der optischen Dichte (OD), pH-Kontrolle und Temperaturregelung. Dieses Fehlen aktiver Messungen schränkt die Fähigkeit des Systems ein, dynamische Veränderungen des mikrobiellen Wachstums und der Stoffwechselaktivität in Echtzeit zu überwachen. Darüber hinaus unterstützt das System zwar die anaerobe Kultivierung innerhalb von Kammern, verfügt jedoch nicht über eine integrierte Gasregelung, was Anwendungen einschränken kann, die präzise mikroaerophile oder CO2 -angereicherte Umgebungen erfordern. Für Studien, die eine solche Regelung erfordern, können alternative Systeme mit eingebauter Gasregelung besser geeignet sein.

Das MBRA-System bietet entscheidende Vorteile gegenüber bestehenden Bioreaktormodellen, einschließlich hohem Durchsatz, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz, während es gleichzeitig die Fähigkeit beibehält, komplexe Bakteriengemeinschaften unter kontinuierlichem Fluss zu kultivieren, um dynamische Umgebungen wie den menschlichen Magen-Darm-Trakt nachzuahmen 6,8,10. Sein kompaktes, modulares Design ermöglicht den gleichzeitigen Betrieb mehrerer Bioreaktoren und eignet sich daher ideal für Hochdurchsatzstudien wie das Screening von fäkalen Gemeinschaften auf Resistenz gegen die Invasion von Krankheitserregern9. Dieser modulare Aufbau bietet umfangreiche experimentelle Flexibilität: Jeder Streifen kann von einer einzelnen Medienflasche versorgt werden, wie in diesem Protokoll gezeigt, oder von bis zu sechs verschiedenen Medienquellen, eine für jede Bioreaktorkammer. Das Arbeitsvolumen wird durch die Länge eines schlanken PTFE-Abfallhalms bestimmt, der in die Abfallöffnung jeder Kammer eingeführt wird und die Flüssigkeitshöhe einstellt. In diesem Protokoll behalten 25-mm-Halme ein Arbeitsvolumen von 15 ml bei, aber Volumina zwischen 1 und 20 mL können durch Trimmen oder Verlängern des Halms erreicht werden. Zusätzlich werden kürzere Futterhalme in den Medieneinlass eingeführt, um den Zufluss in Richtung des Kammerbodens zu leiten, wodurch verhindert wird, dass das Medium an den Kammerwänden heruntertropft, und die Biofilmbildung über der Fülllinie reduziert wird. Auch die Pumpendrehzahl oder der Durchmesser der Pumpenschläuche können angepasst werden, um die Umschlagsleistung des Systems zu verändern. Bisher wurde das MBRA-System in großem Umfang verwendet, um die funktionellen und zusammengesetzten Veränderungen mikrobieller Gemeinschaften als Reaktion auf eine Vielzahl von Faktoren zu untersuchen, darunter Antibiotika10, Krebsmedikamente14 und verschiedene Nahrungsbestandteile 12,15,16,17 . Durch den einfachen, modularen Aufbau eignet er sich ideal für die Anpassung an verschiedene experimentelle Bedürfnisse. Zum Beispiel wurde das MBRA modifiziert, um Biofilme unter chemostatähnlichen Bedingungen zu untersuchen18, was seine Vielseitigkeit für mikrobielle Ökologiestudien über planktonische Kulturen hinaus demonstriert.

Zukünftige Iterationen des MBRA-Systems könnten von zusätzlichen technischen Upgrades profitieren, die seine Funktionalität, Präzision und sein Durchsatzpotenzial erweitern. Eine dieser Verbesserungen ist der Einbau zusätzlicher Öffnungen in jede Bioreaktorkammer. Diese Ports könnten zur aktiven Überwachung von Umgebungsparametern wie pH-Wert, Temperatur, Gas oder optischer Dichte verwendet werden. Dies würde eine der größten Einschränkungen des Modells beheben, indem es Echtzeit-Feedback und -Überwachung ermöglicht. Verbesserungen an der Kammer- oder Anschlussgeometrie könnten eine gründlichere und zugänglichere Reinigung ermöglichen, die Ansammlung und Verfärbung von Rückständen reduzieren und die langfristige Wiederverwendbarkeit verbessern. Die Integration zusätzlicher Peristaltikpumpen mit programmierbaren Timern würde gepulste oder tagesaktive Medieneingaben ermöglichen und so wirtsassoziierte Umgebungen, wie z. B. Ernährungszyklen im menschlichen Darm, besser simulieren. Schließlich kann der 3D-Druck mit alternativen Materialien, wie z. B. chemisch beständigen, autoklavierbaren Polymeren, eine längere Haltbarkeit und Kompatibilität mit einer breiteren Palette von Reagenzien ermöglichen. Zusammengenommen könnten diese Verbesserungen den experimentellen Umfang und die Genauigkeit der MBRA-Plattform erheblich erweitern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das MBRA eine leistungsstarke Hochdurchsatzplattform für die Kultivierung und Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften unter kontrollierten Bedingungen bietet. Obwohl es Einschränkungen bei der aktiven Überwachung und pH-Kontrolle aufweist, ist es aufgrund seiner Flexibilität, Skalierbarkeit und Kosteneffizienz ein unschätzbares Werkzeug für eine Vielzahl von mikrobiologischen Studien, insbesondere für solche, die eine hohe Replizierbarkeit und einen experimentellen Durchsatz erfordern. Wichtig ist, dass das System durch sein modulares Design und seinen Fertigungsansatz von Natur aus anpassungsfähig ist. Forscher haben das MBRA an eine Vielzahl von experimentellen Zielen angepasst und können dies auch weiterhin tun. Diese Anpassungsfähigkeit stellt sicher, dass sich das MBRA mit neuen wissenschaftlichen Fragestellungen und Technologien weiterentwickeln kann und seine Relevanz als vielseitige Plattform für die Mikrobiomforschung beibehält.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das NIH T32 Molecular Basis of Infectious Disease Predoctoral Fellowship, das NIH T32DK007664 und das NIH U19AI157981 Microbiome Discovery and Mechanisms to Combat Antibiotic Resistance at Mucosal Surfaces unterstützt.

Die Autoren danken Hayden Curnyn für seine Beiträge zur Konstruktion und Herstellung der in diesem System verwendeten Bioreaktorhalter und Schlauchhalter.

Abbildung 2 und Abbildung 3 wurden teilweise in https://BioRender.com

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  V-Gewindebohrerführung, Standardgrößen 0-80 bis 5/8"Große Gator-WerkzeugeSTD500NP 
0,22 μm M SpritzenvorsatzfilterFischerSLGVR33RS
2mag MIXdrive 60 Rührantrieb (nur Antrieb)2MAGMF 41060
Air-tite Injektionsnadeln, 22G x3"VWR89219-274
BD 1mL Slip Tip Sterile Spritzen SterilFischer14-823-434
BioreaktorProto-LaboreNA3D-gedruckt aus DMS Somos Watershed Plastic. Siehe ergänzende Datei 1 zur Vorlage
Bioreaktor-HalterungenProto-LaboreNA3D-gedruckt aus PA 12 Black. Siehe ergänzende Datei 2 für die Vorlage.
Diba Omnifit Q-Serie Lösemittel-Flaschenverschluss, GL38/38-430 (Glas), 2 UNF(F) Anschlüsse ohne Ventile, BlauCole ParmerArtikel-Nr.: EW-21942-86
Diba Omnifit Schlauch, PTFE, 1/8" (3,2 mm) AD x 1,5 mm IDCole ParmerArtikel-Nr.: EW-21942-76
Dibafit Adapter, 1/4"-28 UNF(M) flacher Boden auf 3,2 mm ID, PEEKCole ParmerArtikel-Nr.: EW-21941-49
IRWIN 12001ZR Windeisen #0-1/4" T-GriffAmazonasB00004YOB0
Irwin Hanson SAE-Fraktionsgewindebohrer aus kohlenstoffreichem Stahl 1/4 Zoll 1 Stk.ZoroG7695682
Loctite Heavy Duty Epoxy Quick Set 8-Flüssig-Unzen-FlascheAmazonasB0044F59N0
Stecker auf Stecker Luer-Lock-AnschlussDarwin MikrofluidikDM-MM-LUER-PP Alternativ: Strategic Applications Inc Stecker auf Stecker Luer-Anschluss - 10/Stück - Fisher - NC9876577
Masterflex Adapter Fittings, Luer auf Luer, Nylon, AvantorVWRMFLX45502-56
Masterflex-Verschraubung, Nylon, gerade, weiblicher Luer-auf-Schlauch-Tüllenadapter, 1/16" IDVWRMFLX45502-00
Masterflex Verschraubung, Nylon, gerade, weiblicher Luer-auf-Schlauch-Tüllenadapter, 3/32" IDVWRMFLX45502-02
Masterflex Verschraubung, Nylon, gerade, weibliche Luer-auf-Schlauch-Tülle, 1/8"VWRMFLX45502-04
Masterflex Verschraubung, Nylon, gerade, männlicher Luer-Lock-auf-Schlauch-Tülle-Adapter, 1/8VWRMFLX45505-04
Masterflex Fitting, Nylon, gerade, männlich Luer x 1/4-28 UNFVWRMFLX45505-82
Masterflex-Verschraubung, Polypropylen, Winkel, Luer-auf-Luer-Buchse AdapterVWRMFLX45508-26
Masterflex Ismatec Pumpenschlauch, 2-Stopp, Tygon S3 E-Lab, 0.89 mm IDVWRMFLX96460-26
Masterflex Ismatec Pumpenschläuche, 2 Stopps, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm InnendurchmesserVWRMFLX96460-30
Masterflex® Transferschlauch, C-Flex, undurchsichtig weiß, 1/8" ID x 1/4" AD; 25 FußVWRMFLX06424-67
Mohr' s Pinchcock für Tubing VWR470201-374
Neopren Gummi Kotflügel Unterlegscheiben ½ ” OD x ¼ ” Innendurchmesser x 1/16" Dicke AmazonasB01A29F1R0
Präzisionsdichtung GummiseptenSigma AldrichZ553905
Spinbar Mikro-RührstäbchenVWR58948-375
Tetra-ÄtzenR.S. Hughest UnternehmenTE-500
SchlauchhalterProto-LaboreNA3D-gedruckt aus PA 12 Black. Siehe ergänzende Datei 3 für die Vorlage.
Watson-Marlow 205S Mehrkanal-KartuschenpumpeWatson-MarlowArtikel-Nr.: 020.3724.00AReduziert, alternativ: Ismatec IPC Digital Schlauchpumpen MFLX7800142 - FISHER - 113-200-014 oder Masterflex Ismatec IPC Schlauchpumpe, 0,1 bis 11,25 U/min, 24-Kanal, 115/230 VAC, Avantor, VWR, MFLX78006-48-CH

References

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  18. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).">Jens, J. N., et al. MBRA-2: A modified chemostat system to culture biofilms. Microbiol Spectr. 11 (1), e02928-e03022 (2023).

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