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Methodenartikel

Beurteilung der Atherosklerose in der Aorta durch AAV8-PCSK9-injizierte Mäuse durch Ölrot-O-Färbung

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DOI:

10.3791/68795

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8. August 2025

 , 
1Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Provincial Key Laboratory of Metabolic Health and Panvascular Diseases

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Präparieren, Perfusieren, Färben, Imaging und Quantifizieren von atherosklerotischen Läsionen im Gesicht in Aorten von Mäusen unter Verwendung der Öl-Rot-O-Färbung.

Zusammenfassung

Mausmodelle sind seit langem grundlegende Werkzeuge bei der Erforschung von Atherosklerose und liefern wichtige Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen, die der Plaquebildung, dem Fettstoffwechsel und der kardiovaskulären Entzündung zugrunde liegen. Neben Apoe-/- oder Ldlr-/- Mäusen stellt sich die AAV8-PCSK9D377Y-Injektion in normale C57BL/6J-Mäuse mit gleichzeitiger Fütterung mit westlicher Ernährung als ein häufig verwendetes Modell für die translationale Forschung bei Atherosklerose heraus. Die Öl-Rot-O-Färbung ist eine Eckpfeilertechnik zur Visualisierung der neutralen Lipidakkumulation im Gefäßgewebe. Seine Einfachheit, Kosteneffizienz und hohe Sensitivität bei der Erkennung lipidbeladener Läsionen machen es zum Goldstandard für die Beurteilung der atherosklerotischen Plaquelast in präklinischen Studien. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes, reproduzierbares Protokoll für die Dissektion, Perfusion, Längsöffnung, Öl-Rot-O-Färbung, Bildgebung und halbautomatische Quantifizierung der atherosklerotischen Belastung in der Aorta en face zur Verfügung, ohne dass Stifte oder komplexe Montageschritte erforderlich sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von AAV8-PCSK9D377Y-Injektion und westlicher Diätfütterung bei Mäusen effektiv eine signifikante atherosklerotische Läsionsbildung induziert und dass die Färbung von Oil Red O auf den ersten Gesichtern eine zuverlässige und effiziente Technik zur Beurteilung der Lipidablagerung und Plaquebelastung ist. Darüber hinaus kann dieses Protokoll, obwohl es für das AAV8-PCSK9-induzierte Modell in C57BL/6J-Mäusen optimiert ist, leicht für die Verwendung in anderen Modellen und Spezies angepasst werden, wie z. B. Apoe-/- Mäusen, Ldlr-/- Mäusen und Ldlr-/- goldenen syrischen Hamstern.

Einleitung

Die Atherosklerose, die durch die Ablagerung von Lipiden und Entzündungen in der arteriellen Intima gekennzeichnet ist, stellt die pathologische Grundlage der koronaren Herzkrankheit und eines breiten Spektrums von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) dar, einschließlich Myokardinfarkt und Schlaganfall 1,2,3,4. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die weltweit häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und stellen eine erhebliche globale gesundheitliche und wirtschaftliche Belastung dar 3,5. Als primäre pathologische Grundlage von Herz-Kreislauf-Erkrankungen hat die Atherosklerose umfangreiche Forschungsaufmerksamkeit auf sich gezogen, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken und wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln. Mausmodelle spielen eine zentrale Rolle bei der Aufklärung der Mechanismen, die der Atherogenese zugrunde liegen, und bei der Bewertung möglicher therapeutischer Interventionen6. Die Entwicklung von Tiermodellen hat maßgeblich dazu beigetragen, unser Verständnis der Atherogenese zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, die beteiligten zellulären und molekularen Mechanismen zu entschlüsseln und neue therapeutische Strategien zu evaluieren 6,7. Klassische Mausmodelle der Atherosklerose, wie z. B. Apolipoprotein-E-defiziente (Apoe-/-) und Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-defiziente (Ldlr-/-) Mäuse, werden seit langem eingesetzt, um Hyperlipidämie und robuste Plaquebildung zu induzieren. Die Erzeugung und Pflege dieser genetisch veränderten Linien erfordert jedoch eine umfangreiche Züchtung, die zeitaufwändig sein und die experimentelle Flexibilität einschränkenkann 8,9,10. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat ein alternativer Ansatz unter Verwendung des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 8, der für eine Gain-of-Function-Mutation in der Proproteinkonvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (AAV8-PCSK9D377Y) kodiert, an Bedeutung gewonnen. Bei Verabreichung an Wildtyp-Mäuse mit C57BL/6J in Kombination mit einer fett- und cholesterinreichen Diät des westlichen Typs induziert diese Methode innerhalb eines relativ kurzen Zeitrahmens effizient Hypercholesterinämie und atherosklerotische Läsionen - ohne dass komplexe genetische Kreuzungen oder Rückkreuzungen in atheroskleroseanfällige Hintergründe erforderlich sind 9,11. Trotz seiner Vorteile weist das Modell AAV8-PCSK9 gewisse Einschränkungen auf, die eine Überlegung wert sind. Insbesondere das Ausmaß der Hypercholesterinämie und der Entwicklung atherosklerotischer Läsionen kann durch Variablen wie die Virusdosis und die Art der Verabreichung beeinflusst werden, was zu einer Variabilität zwischen den Tieren führen und die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen kann11.

Um die Krankheitslast in solchen Modellen zu beurteilen, bietet die en face Oil Red O-Färbung der Aorta eine gut etablierte, empfindliche Technik zur Visualisierung und Quantifizierung lipidreicher atherosklerotischer Läsionen entlang der luminalen Oberfläche des Gefäßsystems12,13. Dieser Ansatz bietet sowohl qualitative als auch quantitative Daten und wird in präklinischen Studien häufig verwendet, um die Auswirkungen von genetischer Manipulation, pharmakologischer Intervention oder Ernährungsmodulation zu bewerten14.

In dieser Studie präsentieren wir ein praktisches und reproduzierbares Protokoll für die Isolierung, Perfusion, Längsöffnung, Ölrot-O-Färbung, Bildgebung und halbautomatische Quantifizierung von atherosklerotischen Läsionen in Aorten der gesamten Maus. In diesem Protokoll wird AAV8-PCSK9D377Y in einer Dosis von 5 × 1011 Vektorgenomen (vg) pro Maus durch Schwanzveneninjektion verabreicht. In Kombination mit einer westlichen Diät (WD), die 40 % kcal Fett und 1,25 % Cholesterin enthält, kann innerhalb von 12-16 Wochen eine robuste atherosklerotische Läsionsentwicklung beobachtet werden. Das Protokoll rationalisiert jeden Schritt des Prozesses, wodurch das Anheften von Geweben auf Wachsoberflächen entfällt und stattdessen eine vereinfachte Abflachungstechnik verwendet wird, die die Variabilität und den technischen Aufwand reduziert. Die Methode ist nicht nur für das AAV8-PCSK9D377Y-induzierte Modell in C57BL/6J-Mäusen optimiert, sondern auch auf andere weit verbreitete Modelle der Atherosklerose, einschließlich Apoe-/- und Ldlr-/- Mäuse sowie Ldlr-/- Syrische Goldhamster 15,16,17,18,19, die sich aufgrund ihres menschenähnlichen Fettstoffwechsels als vielversprechendes Modell herausgestellt haben.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der NIH durchgeführt und von der Tierethikkommission der Universität für Wissenschaft und Technologie in China genehmigt (Ethikgenehmigung Nr. USTCACUC27120124102).

HINWEIS: Alle Verfahren, an denen AAV8-PCSK9 beteiligt ist, sollten in einer zertifizierten biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt werden. Das Personal muss eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich eines Laborkittels, Einweghandschuhen und einer Schutzbrille.

1. Induktion von Atherosklerose bei Mäusen

  1. Injizieren Sie einer 8 Wochen alten C57BL/6J-Maus intravenös AAV8-PCSK9D377Y (5 × 1011 vg/Maus über die Schwanzvene).
  2. Setzen Sie die Maus unmittelbar nach der Injektion auf WD (mit 40 % kcal Fett und 1,25 % Cholesterin).
  3. Füttern Sie die Maus 12-16 Wochen lang mit WD, um die Bildung atherosklerotischer Läsionen zu induzieren.
    HINWEIS: Eine 12-wöchige Fütterungsperiode wird häufig verwendet und es hat sich gezeigt, dass sie eine offensichtliche atherosklerotische Plaquebildung induziert, insbesondere in AAV8-PCSK9-induzierten Modellen. Längere Zeiträume (z. B. 16 Wochen) können zu fortgeschritteneren Läsionen führen, und der optimale Zeitpunkt sollte auf der Grundlage der spezifischen experimentellen Ziele ausgewählt werden.
  4. Überwachen Sie regelmäßig das Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand und die Plasmalipidwerte während der gesamten Fütterungsperiode. Für die Erstellung von Lipidprofilen entnehmen Sie Blutproben zu Studienbeginn und zu ausgewählten Zeitpunkten (z. B. alle 4 Wochen) über Unterkiefer- oder Schwanzvenenblutungen unter kurzer Isoflurananästhesie.

2. Euthanasie und Durchblutung

  1. Verabreichen Sie Natrium-Pentobarbital (200 mg/kg, intraperitoneale Injektion), um die Maus einzuschläfern.
  2. Öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen.
  3. Machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhofohr und perfundieren Sie kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, ca. 10 ml) durch den linken Ventrikel mit einer 21-G-Nadel, um das Blut auszuspülen.

3. Aortendissektion

  1. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe wie die Lunge und den Thymus, um die thorakale Aorta vom Herzen bis zum Zwerchfell freizulegen.
  2. Verwenden Sie eine feine Präparierschere und eine Präzisionszange, um das umgebende Fettgewebe um den Aortenbogen herum zu entfernen. Heben Sie das Fettgewebe, das die Basis der thorakalen Aorta in der Nähe des Zwerchfells umgibt, sanft an. Mit einer feinen Präparierschere wird entlang der Wurzel des Fettgewebes exzidiert (um sicherzustellen, dass die Gefäßstruktur nicht beschädigt wird) und die Dissektion nach oben bis zum Aortenbogen fortgesetzt, um das Aortengefäß vollständig freizulegen.
    HINWEIS: Die Dissoziation von perivaskulärem Fettgewebe von der Aorta ist kritisch, und es wird empfohlen, diesen Schritt mit der Aorta in situ durchzuführen (bevor sie aus der Maus geschnitten wird), da die Dissektion von perivaskulärem Fett aus der Aorta technisch schwierig ist, sobald die Aorta präpariert und in PBS platziert wurde.
  3. Das Gefäß an der Basis der thorakalen Aorta mit einer Präzisionsschere durchschneiden. Heben Sie das abgeschnittene Ende mit einer Pinzette an und präparieren Sie es entlang des Gefäßes nach oben in Richtung des Aortenbogens. Trennen Sie die drei Hauptäste der Aorta in angemessenem Abstand.
  4. Transektieren Sie an der Aortenwurzel, um die thorakale Aorta vom Herzen zu trennen und das gesamte Segment für die weitere Analyse zu isolieren.
  5. Das exzidierte Gefäß in eine vorgekühlte 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung überführen und über Nacht (12-16 h) bei 4 °C inkubieren. Um die Handhabung zu standardisieren und die Chargenverarbeitung zu erleichtern, legen Sie einzelne Aorten während der Fixierung in Vertiefungen einer 24-Well- oder 48-Well-Platte.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine längere Fixierung (über 24 h), da eine übermäßige Inkubation in PFA zu einer Verhärtung des Gefäßes führen kann, die das Längsschnitten und die weitere Analyse behindert.
    ACHTUNG: 4% PFA ist ein giftiges und flüchtiges Fixiermittel, das das Risiko einer Exposition der Atemwege und der Haut birgt. Alle Schritte, die mit der PFA-Fixierung verbunden sind, müssen in einem Abzug mit PSA durchgeführt werden, einschließlich Nitrilhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt. Die verwendete PFA-Lösung sollte in dafür vorgesehenen Formaldehydabfallbehältern gesammelt, deutlich gekennzeichnet und von einem institutionellen oder lizenzierten Entsorgungsdienst für chemische Abfälle als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.

4. Ölrote O-Färbung

  1. Waschen Sie die fixierten Aorten dreimal mit PBS, um PFA-Reste zu entfernen.
  2. Wie in Abbildung 1 gezeigt, öffnen Sie die Aorta unter einem Präpariermikroskop mit einer feinen Schere in Längsrichtung, beginnend von der Aortenwurzel entlang der inneren Krümmung. Alternativ können Sie die Aorta vor der Fixierung öffnen, was das Entfalten und Ausrichten des Gefäßes während der Montage erleichtern kann. Falls erforderlich, öffnen Sie die großen Äste des Aortenbogens in Längsrichtung - wie die Arteria brachiocephalica (BCA), die rechte Halsschlagader (RCA) und die linke Arteria subclavia -, um zusätzliche Regionen freizulegen11. Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig, da sich Plaques in diesen Bereichen ablösen oder beschädigt werden können.
    HINWEIS: Beide Ansätze können je nach Vorliebe des Bedieners und dem Zustand des Gewebes ausgewählt werden.
  3. Bereiten Sie die Oil Red O-Arbeitslösung vor, indem Sie die 0,5%ige Stammsubstanz in Isopropanol mit deionisiertem Wasser im Verhältnis 3:2 (v/v, Endkonzentration 0,3%) verdünnen. In einem 37 °C warmen Wasserbad 5 min inkubieren, um den Farbstoff vollständig aufzulösen.
  4. Filtern Sie durch eine 0,22-0,45 μm Membran, um Ausfällungen zu entfernen. Bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung im 37 °C warmen Wasserbad auf.
  5. Entfernen Sie PBS aus jeder Vertiefung. Fügen Sie Oil Red O Arbeitslösung hinzu, um die Aorten vollständig einzutauchen. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  6. Nach der Inkubation die Lösung aspirieren und sofort 1 ml 60% Isopropanol in jede Vertiefung geben. Stellen Sie die Platte auf einen Shaker und rühren Sie sie vorsichtig um, um sie zu waschen.
  7. Nach etwa 30 s, wenn die Nicht-Läsionsbereiche des Gefäßes durchscheinend erscheinen, stoppen Sie die Wäsche, indem Sie das Isopropanol aspirieren. Spülen Sie die Proben zweimal mit PBS.
  8. Nach der Färbung mit Oil Red O das verbleibende perivaskuläre Fettgewebe bei Bedarf weiter kürzen. In diesem Stadium ist das Fettgewebe in der Regel gut gefärbt und visuell unterscheidbar, was eine genauere Identifizierung und Entfernung ermöglicht, ohne die Integrität der Gefäßwand zu beeinträchtigen.
  9. Öffnen Sie die Aorta nach der Ölrot-O-Färbung in Längsrichtung und montieren Sie sie vorsichtig flach auf einem Objektträger, um sie sofort unter einem Stereomikroskop abzubilden.
  10. Alternativ können die Proben vor der Bildgebung kurzfristig in PBS bei 4 °C gelagert werden. Bei Arterien, die schwer zu glätten sind, stecken Sie die Gefäße mit feinen Nadeln auf eine schwarze Wachsplatte, um eine optimale Positionierung und Klarheit zu gewährleisten. Für die Langzeitkonservierung montieren Sie die bemalten Gefäße auf Objektträger, versiegeln sie mit Glyceringelatine und belichten sie dann direkt.
    HINWEIS: Übertragen Sie verschmutzte Aorten zum Waschen auf eine neue Platte, um eine Kontamination durch Reste von Oil Red O zu vermeiden.
    ACHTUNG: Oil Red O ist ein lipophiler Farbstoff, der typischerweise in Isopropanol hergestellt wird, das brennbar und reizend ist. Behandeln Sie ORO-Lösungen in einem chemischen Abzug, um das Einatmen von Dämpfen zu vermeiden. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. Ölrot-O-Färbelösungen sollten getrennt in Behältern für brennbare chemische Abfälle gesammelt werden. Entsorgen Sie gemäß den örtlichen Vorschriften zur Entsorgung von Sonderabfällen.

5. Bildgebung

  1. Montieren Sie die fleckigen Aorten auf weißem Hintergrund, um den Kontrast zu erhöhen. Bewahren Sie die Flexibilität des Schiffes.
    HINWEIS: Ein kontrastreicher Hintergrund ermöglicht eine effizientere Plaque-Erkennung mit Hilfe von Bildanalysesoftware. Je nach Benutzerpräferenz können auch andere Hintergrundfarben verwendet werden.
  2. Bilden Sie die gesamte Aorta mit einem Flachbettscanner oder einem Präpariermikroskop mit einer hochauflösenden Kamera.
  3. Stellen Sie eine gleichmäßige Beleuchtung und konsistente Vergrößerung über alle Proben hinweg sicher (z. B. 6- bis 8-fache Vergrößerung). Wenn die Aorta während der Bildgebung trocknet, rehydrieren Sie sie mit Kochsalzlösung oder PBS-getauchten Kiwi-Tüchern.

6. Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen

  1. Öffnen Sie das Bild in ImageJ. In den folgenden Schritten wird das Analyseverfahren am Beispiel von ImageJ beschrieben.
    HINWEIS: Je nach Benutzerpräferenz und Verfügbarkeit können auch andere Bildanalysesoftware (z. B. Zeiss Zen, Fidschi) verwendet werden.
  2. Legen Sie die Skala mit einer bekannten Referenz (z. B. Maßstabsleiste oder Lineal) fest. Verwenden Sie das Werkzeug Geradlinig, um über die bekannte Entfernung zu zeichnen. Gehen Sie zu Analysieren > Maßstab festlegen, geben Sie die Entfernung und die Einheiten ein, wählen Sie Global und klicken Sie auf OK.
  3. Verwenden Sie das Polygon- oder Freihandauswahlwerkzeug , um den gesamten Aortenbereich zu umreißen.
  4. Messen Sie die Fläche mit Analysieren > Messen.
  5. Identifizieren Sie atherosklerotische Plaquebereiche mit Image > Adjust > Color Threshold. Passen Sie Sättigung und Helligkeit an, um O-positive Bereiche in Ölrot zu isolieren.
  6. Klicken Sie auf Auswählen , um eine binäre Auswahl der gefärbten Bereiche zu generieren. Messen Sie die ausgewählten Bereiche mit Analysieren > Messen. Wenden Sie dieselben Schwellenwerteinstellungen auf alle Bilder in einem Stapel an.
    HINWEIS: Angesichts der Tatsache, dass Restfett oder Artefakte zu falsch-positiven Färbungen führen können, können Benutzer Plaque-Regionen basierend auf ihren spezifischen experimentellen Anforderungen und der Bildqualität manuell oder halbautomatisch definieren. Die manuelle Verfolgung des Plaquebereichs kann mit der gleichen Methode durchgeführt werden wie die Definition der gesamten Gefäßfläche.
  7. Exportieren Sie die Ergebnisse (Datei > Speichern unter > Ergebnissen) als .csv zur weiteren Analyse.
  8. Exprimieren Sie die Plaquefläche als Plaquefläche/gesamte Aortenfläche × 100%. Um eine genauere Beurteilung der atherosklerotischen Plaquebelastung zu erhalten, quantifizieren Sie die Plaquefläche nach anatomischen Regionen (z. B. Aortenbogen, insbesondere die kleinere Krümmung, und die gesamte Aorta) und drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Plaquefläche im Verhältnis zur Gesamtoberfläche der jeweiligen Region aus: Plaquefläche (%) = (Plaquefläche / Gesamtfläche der Region) × 100%.
    HINWEIS: Um mögliche Verzerrungen zu minimieren, wird eine verblindete Analyse empfohlen. Bei der Analyse einer großen Anzahl von Bildern kann der gesamte Arbeitsablauf von der Schwellenwertbestimmung bis zur Messung mit dem Makrorekorder (Plugins > Makros > Record) automatisiert und mit Process > Batch > Macro in großen Mengen verarbeitet werden. Dies ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Hochdurchsatzanalyse.

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Ergebnisse

Um das Ausmaß der Lipidablagerung in der Aortenwand zu beurteilen, wurde eine en face Oil Red O-Färbung an Aorten durchgeführt, die von männlichen C57BL/6J-Mäusen isoliert wurden, denen AAV8-PCSK9D377Y injiziert und 12 Wochen lang mit westlicher Diät gefüttert wurde, zusammen mit altersgleichen Kontrollmäusen. Nach systemischer Perfusion mit PBS und sorgfältiger Dissektion wurden die gesamten Aorten sorgfältig in Längsrichtung präpariert und mit Oil Red O gefärbt, um lipidbeladene atherosklerotische Läsionen s...

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Diskussion

Die in dieser Studie beschriebene En-face-Öl-Rot-O-Färbemethode bietet einen robusten, reproduzierbaren und zeiteffizienten Ansatz zur Bewertung der atherosklerotischen Läsionslast in der gesamten Aorta. In dieser Studie wählten wir speziell den Aortenbogen und die thorakale Aorta als interessierende Regionen für die Plaqueanalyse aus und nicht die gesamte Aorta. Diese Entscheidung wurde von der Natur des AAV8-PCSK9D377Y Modells20 geleitet, das im Vergl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 82370444) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6J MäuseGemPharmatech NR. N000013
  4% ParaformaldehydBeyotimeP0099Zur Fixierung von Gewebegewebe
AAV8-PCSK9D377Y Viruspartikeln WzbiopAV208001Zur Induktion von Atherosklerose
Feine PinzetteFine Science ToolsNr. 11254-20Für die Aortendissektion
ImageJNIH1.47
IsopropanolSangon biotechA600918Zur Reinigung des überschüssigen Öls rotes
Öl Rot O 0,5% Lösung in IsopropanolPoly Scientific R& D CorpS1849-32OZFür Ölrot O-Färbung
Phosphatgepufferte KochsalzlösungServicebioG4202Für die Durchblutung und Reinigung von Aorten
FederschereFine Science ToolsNr. 15003-08Für die Aortendissektion
Stereoskopisches MikroskopMshotMZ62Für die Aortendissektion und Bildgebung
Westliche Ernährung Forschung DiätD12108CZur Induktion von Arteriosklerose

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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